Biologia de los microorganismos-1068 (1271)

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M É T O D O S D E E S T U D I O E N E C O L O G Í A M I C R O B I A N A 625
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total de organismos en la mayoría de los ambientes, recibe el 
nombre de biosfera rara (Figura 18.16).
Resultados de los análisis filogenéticos por PCR
Los análisis filogenéticos de las comunidades microbianas han 
dado resultados sorprendentes. Por ejemplo, usando como 
diana el gen que codifica el rRNA 16S, los análisis de las comu-
nidades microbianas naturales muestran normalmente que 
existen muchos procariotas filogenéticamente distintos (filoti-
pos) cuyas secuencias de los genes de rRNA se diferencian de 
las de todos los cultivos conocidos (Figura 18.13). Además, con 
métodos adicionales que permiten evaluar cuantitativamente 
cada filotipo, se ha descubierto que con pocas excepciones los 
filotipos más abundantes en una comunidad microbiana natu-
ral son los que hasta el momento se resisten a ser cultivados 
en el laboratorio. Estos sorprendentes resultados dejan claro 
que nuestro conocimiento de la diversidad microbiana a partir 
de los cultivos de enriquecimiento es muy incompleto y que el 
sesgo de enriquecimiento (Sección 18.1) es un problema grave 
en los estudios de biodiversidad basados en técnicas de cultivo. 
De hecho, los ecólogos microbianos estiman que menos del 
0,1 % de los filotipos revelados en los análisis moleculares de las 
comunidades microbianas se han cultivado alguna vez. Es evi-
dente que a los microbiólogos empeñados en entender la diver-
sidad microbiana aún les queda mucho trabajo por hacer.
potencial funcional (Tabla 18.3). No obstante, los secuenciado-
res de última generación no requieren el paso de la clonación, 
de modo que los fragmentos individuales de DNA se separan y 
amplifican en el mismo dispositivo de secuenciación; así, los pro-
ductos de la PCR se pueden usar directamente para la secuen-
ciación. Puesto que en los secuenciadores de última generación 
se llevan a cabo cientos de miles de reacciones de amplificación 
de manera simultánea, el número total de lecturas de secuen-
cias excede con creces las posibilidades de la secuenciación de 
clones individuales obtenidos en las genotecas y realizada uno 
por uno (Figura 18.16). El inmenso volumen de secuencias gene-
radas por las nuevas tecnologías de secuenciación permite rea-
lizar análisis de secuencia extremadamente profundos, lo que 
significa que se pueden encontrar filotipos menores que posi-
blemente habrían pasado desapercibidos con el método más 
limitado de las genotecas (Figura 18.16b). Por ejemplo, imagine-
mos que un filotipo concreto está presente en una genoteca de 
secuencias clonadas en una proporción de tan solo 0,01 %. Sería 
necesario secuenciar más de mil clones, uno por uno, para tener 
una probabilidad razonable de encontrar este filotipo especí-
fico. En cambio, las nuevas tecnologías de secuenciación, más 
potentes, detectarían este filotipo poco abundante junto con sus 
vecinos más numerosos. El conjunto de filotipos con escasa pre-
sencia, que representan una fracción notable de la diversidad 
total, pero solo un componente minoritario de la abundancia 
Tamaño de los fragmentos (pares de bases)
450 500 550 650600 700 750 800 850 900 950 1.000 1.050 1.100 1.150 1.200 1.250400
250
500
750
1.000
0
F
lu
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s
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Región ITS Gen de rRNA 23SGen de rRNA 16S
Cebador de PCR inversoCebador de PCR
directo con marca
fluorescente ( ) Posición 1.513
50-1.500bp
Posición 23
DNA de la comunidad
(a)
(b)
(c)
Posición 1 1.540 1 2.900
PCR del DNA total de 
la comunidad usando 
cebadores ITS
Separar fragmentos por 
tamaño mediante 
electroforesis en gel
Cada fragmento de una longitud 
diferente corresponde a un miembro 
diferente de la comunidad
Figura 18.15 Análisis automatizado del espacio intergénico ribosómico (ARISA). (a) Estructura del operón de rRNA que abarca el gen de rRNA 16S
(posiciones de 1 a 1.540), un espaciador transcrito (ITS) de longitud variable, y el gen de rRNA 23S (posiciones 1 a 2.900). Los cebadores de PCR, uno marcado 
con un colorante fluorescente, son complementarios a secuencias conservadas cerca de la región ITS. (b) Fragmentos de DNA amplificados de diferentes 
longitudes, cada uno de ellos correspondiente a un miembro de la comunidad. (c) Análisis de fragmentos determinado por un secuenciador automatizado de DNA. 
Los picos, que corresponden a distintas regiones ITS, se pueden identificar por clonación y secuenciación de los productos amplificados.
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