Biologia de los microorganismos-1068 (1295)

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M É T O D O S D E E S T U D I O E N E C O L O G Í A M I C R O B I A N A 637
U
N
ID
A
D
 4
Si el objetivo del estudio con benzoato fuera caracterizar la 
filogenia de los organismos que lo catabolizan, se podría utili-
zar la amplificación por PCR y el análisis de los genes de rRNA 
16S en el 13C-DNA (Figuras 18.13 y 18.14). No obstante, ade-
más de los análisis filogenéticos, una vez obtenido el 13C-DNA 
se pueden buscar los genes funcionales. Así por ejemplo, se 
ha empleado el SIP en estudios de filogenia y metabolismo en 
metilótrofos, organismos especializados en el catabolismo de 
compuestos C
1
 ( Sección 13.23) en entornos naturales. En 
estos estudios se usó metano (13CH
4
) o metanol (13CH
3
OH) 
marcado para marcar el DNA de los metilótrofos, seguido 
de amplificación por PCR de genes de rRNA 16S y genes que 
codifican funciones específicas de oxidación de metano (Tabla 
18.3) a partir del 13C-DNA. También es posible analizar el 
genoma completo usando el SIP. Por ejemplo, en un segundo 
estudio con metilótrofos se usó SIP combinado con análisis 
metagenómicos (Sección 18.7), y los resultados señalaban a un 
metilótrofo previamente desconocido como la especie funda-
mental para el catabolismo de compuestos C
1
 en ese entorno 
concreto.
También se puede realizar SIP con N marcado. En este caso, 
el isótopo pesado de N, 15N, compite con el isótopo más abun-
dante y ligero, el 14N. Para estudiar la fijación de nitrógeno, por 
ejemplo, se suministra 15N
2
 a una muestra, y los organismos que 
pueden fijar N
2
 ( Sección 3.17) incorporarán 15N
2
. Parte del 
15N
2
 terminará en el DNA del organismo, que será entonces iso-
tópicamente «pesado»; este DNA se puede separar del que es 
isotópicamente más ligero (14N-DNA) por ultracentrifugación 
(Figura 18.31) y analizarse en busca de genes específicos.
Genómica de células individuales
Un gran escollo en el método de recuperación de genes basado 
en PCR es la necesidad de identificar antes del análisis un gen 
específico que reaccione con los cebadores usados en la ampli-
ficación. En la actualidad se están desarrollando métodos nove-
dosos de amplificación de DNA que ofrecen una alternativa 
para asociar genes específicos con un organismo concreto sin 
los problemas y los errores asociados con la PCR. Estos méto-
dos hacen uso de la genómica de células individuales ( Sec-
ción 6.10 y Explorando el mundo microbiano del Capítulo 6, 
«Genómica, una célula a la vez»), una de las herramientas más 
18.11 Vínculo de genes y funciones 
con organismos específicos: 
sondeo de isótopos estables 
y genómica de células 
individuales 
En la sección anterior hemos visto que la combinación de FISH 
con MAR o de FISH con NanoSIMS permite realizar análi-
sis combinados de diversidad y actividad microbiana. Se trata 
de métodos eficaces para conectar poblaciones microbianas 
específicas con una actividad o un nicho ecológico concreto, 
pero en ambos casos hay que conocer la filogenia de los orga-
nismos para poder desarrollar la sonda FISH (Sección 18.4). 
Un método alternativo de acoplar la diversidad a la actividad 
es el sondeo con isótopos estables (SIP), un método que usa 
isótopos estables como 13C o 15N, o incluso 18O para marcar 
el DNA de organismos en una comunidad. Además del SIP, 
las mejoras en la tecnología de secuenciación del DNA per-
miten aplicar la genómica a células individuales obtenidas del 
ambiente. A continuación analizaremos la eficacia de ambos 
métodos.
Sondeo con isótopos estables
¿En qué consiste un experimento de SIP? Supongamos que el 
objetivo de un proyecto de investigación es caracterizar orga-
nismos capaces de catabolizar compuestos aromáticos en los 
sedimentos de un lago. Con benzoato como compuesto aro-
mático modelo, añadimos benzoato enriquecido con 13C a una 
muestra de sedimento e incubamos durante el tiempo nece-
sario; a continuación extraemos el DNA total de la muestra 
(Figura 18.31). Como se observa en la Figura 18.13, este DNA pro-
cede de todos los organismos de la comunidad microbiana. No 
obstante, los organismos que incorporen 13C-benzoato sinteti-
zarán DNA que contenga 13C. El 13C-DNA es más pesado que 
el 12C-DNA, si bien solo ligeramente, pero la diferencia es sufi-
ciente para separarlos mediante una técnica especial de centri-
fugación (Figura 18.31). Una vez que se ha aislado el 13C-DNA, 
se puede analizar usando diversas técnicas genómicas para los 
genes de interés.
Figura 18.31 Sondeo con isótopos estables. La comunidad microbiana de una muestra natural se alimenta con un sustrato marcado con 13C. Los
organismos que lo metabolizan producirán un 13C-DNA a medida que crecen y se dividen, que se puede separar del DNA más ligero (con 12C) mediante 
centrifugación en gradiente de densidad (fotografía). Al DNA aislado se le analiza un gen concreto o todo el genoma.
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