Introduccion_genomica_funcional

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Introducción a la genómicaIntroducción a la genómica
funcionalfuncional
Curso de Genética Molecular
Ciencias Biológicas
Universidad de Jaén
Antonio Caruz Arcos
Dpto. Biología Experimental, Área de Genética
Universidad de Jaén
La era de la genómica estructuralLa era de la genómica estructuralLa era de la genómica estructural
EspecieEspecieEspecie
Número estimado
de genes
Número estimadoNúmero estimado
de genesde genesTamaño genomaTamaño genomaTamaño genoma
Homo sapiensHomo sapiensHomo sapiens 25,000 - 40,00025,000 25,000 -- 40,00040,0003.2 Gbp3.2 Gbp3.2 Gbp
Mus musculusMus musculusMus musculus ­ 3.2 Gbp­ 3.2 Gbp­ 3.2 Gbp (10-15% secuenciado)(10(10--15% 15% secuenciado)secuenciado)
Drosophila melanogasterDrosophila melanogasterDrosophila melanogaster 14,00014,00014,000116 Mbp116 Mbp116 Mbp
Caenorhabditis elegansCaenorhabditis elegansCaenorhabditis elegans 19,00019,00019,00097 Mbp97 Mbp97 Mbp
Arabidopsis thalianaArabidopsis thalianaArabidopsis thaliana 25,50025,50025,500115 Mbp115 Mbp115 Mbp
Saccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiaeSaccharomyces cerevisiae 6,2006,2006,20012 Mbp12 Mbp12 Mbp
Escherichia coli (K12)Escherichia coli (K12)Escherichia coli (K12) 4,3004,3004,3004.6 Mbp4.6 Mbp4.6 Mbp
Desarrollo tecnológico:
sistemas de detección de la expresión génica
Desarrollo tecnológico:Desarrollo tecnológico:
sistemas de detección de la expresión génicasistemas de detección de la expresión génica
El pasado: Técnicas tradicionales para medir la expresión
génica, northern, RT-PCR, etc.
El presente: Genómica estructural, mapeo genómico y proyectos
a gran escala de secuenciación y anotación génica.
El futuro: Genómica funcional, differencial display, suppression
sustractive hybridization y microarrays de ADN.
La era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcional
Definición:DefiniDefiniciónción:: Genómica funcional incluye cualquier aproximación 
experimental que cuantifica la expresión de 
cientos/miles de genes al mismo tiempo. (1).
Genómica funcionalGenómica funcional incluye cualquier aproximación incluye cualquier aproximación 
experimental que cuantifica la expresión de experimental que cuantifica la expresión de 
cientos/miles de genes al mismo tiempo. cientos/miles de genes al mismo tiempo. (1)(1)..
Objetivo:ObjetivoObjetivo:: Generar un catálogo de todos los genes y de su 
función. Comprender el comportamiento de los 
sistemas biológicos y de los algoritmos genéticos 
que permiten el funcionamiento celular y el 
desarrollo de los organismos(2).
Generar un catálogo de todos los genes y de su Generar un catálogo de todos los genes y de su 
función. Comprender el comportamiento de los función. Comprender el comportamiento de los 
sistemas biológicos y de los algoritmos genéticos sistemas biológicos y de los algoritmos genéticos 
que permiten el funcionamiento celular y el que permiten el funcionamiento celular y el 
desarrollo de los organismosdesarrollo de los organismos(2)(2)..
1. Staudt, L.M. and Brown P.O. (�2000) Annu. Rev. Immunol. 18; 829-859.1. Staudt, L.M. and Brown P.O. (�2000) 1. Staudt, L.M. and Brown P.O. (�2000) Annu. Rev. Immunol.Annu. Rev. Immunol. 18;18; 829829--859.859.
2. Lockhart, D.J. and Winzeler, E.A. (2000) Nature 405; 827-836.2. Lockhart, D.J. and Winzeler, E.A. (2000) 2. Lockhart, D.J. and Winzeler, E.A. (2000) NatureNature 405;405; 827827--836.836.
PlanteamientoPlanteamientoPlanteamiento
ClásicaClCláásicasica GenomicaGenomicGenomicaa
Dirigida por una hipótesisDirigida por una hipótesisDirigida por una hipótesis
Limitada en el número de genes
estudiados
Limitada en el número de genesLimitada en el número de genes
estudiadosestudiados
Información sobre 
miles de genes
Información sobre Información sobre 
miles de genesmiles de genes
No hay hipótesis de partidaNo hay hipótesis de partidaNo hay hipótesis de partida
La era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcional
Métodos: Tecnologías de alta procesividadMétodosMétodos:: Tecnologías de alta Tecnologías de alta procesividadprocesividad
La era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcionalLa era de la genómica funcional
-Dependientes de conocimiento previo
Microarrays de ADN
--Dependientes de conocimiento previoDependientes de conocimiento previo
MMicroarraysicroarrays de ADNde ADN
-Independientes de conocimiento 
previo: 
Differential display, SAGE, SSH, 
Proteómica (geles 2D, Doble híbrido, 
etc.)
--Independientes de conocimiento Independientes de conocimiento 
previo: previo: 
DifferentialDifferential display, SAGE, SSH, display, SAGE, SSH, 
Proteómica Proteómica ((geles geles 2D, Doble híbrido, 2D, Doble híbrido, 
etc.)etc.)
Todo depende de la Extracción de ARNmTodo depende de la Extracción de ARNm
Síntesis de ADNc primera cadena requiere:
• RNAm
• dNTPs
• primer (oligodT, pDn6 ala azar o específico de un gen)
• Transcriptasa reversa
1. rTth (DNA pol Thermus thermophilus recombinante)
2. RT AMV (Virus de mieloblastosis de aves)
3. RT MMLV (Virus de la leucemia murina de Moloney)
La síntesis de ADNcLa síntesis de La síntesis de ADNcADNc
Oligos para la síntesis de la primera cadenaOligos Oligos para la síntesis de la primera cadenapara la síntesis de la primera cadena
Síntesis de la segunda cadena: autoprimingSíntesis de la segunda cadena: Síntesis de la segunda cadena: autoprimingautopriming
Bloqueo función Bloqueo función 
génicagénica
Expresión diferencial II:Expresión diferencial II:
con conocimiento previocon conocimiento previo
Microarrays de Microarrays de ADNADN
ProteómicaProteómica
KnockKnock--outsouts
siRNAsiRNA
IVET (in vivo IVET (in vivo expression technologyexpression technology))
STM (STM (signature tagged mutagenesissignature tagged mutagenesis))
SAGESAGE
SSHSSH
DifferentialDifferential displaydisplay
Expresión Expresión 
diferencial I:diferencial I:
sin conocimientosin conocimiento
previoprevio
Técnicas Técnicas 
genómicasgenómicas y y 
función génicafunción génica
BIOINFORMÁTICA
Doble híbridoDoble híbrido
InmunoprecipitaciónInmunoprecipitación
Detección de genes con expresión diferencial:
Differential display
Detección de genes con expresión diferencial:Detección de genes con expresión diferencial:
Differential Differential displaydisplay
Colección de oligos diferentes (3´)
Colección de oligos aleatorios (5´)
Detección de genes con expresión diferencial:
Differential display
Detección de genes con expresión diferencial:Detección de genes con expresión diferencial:
Differential Differential displaydisplay
Células 
control Células tumorales
La tecnología SAGE (serial analysis gene expression)La tecnología La tecnología SAGESAGE (serial (serial analysis analysis gene gene expressionexpression))
en 1995 por V.E. Velculescu, B. Vogelstein and K.W. 
Kinzler(1) (Johns Hopkins University, Baltimore, MD. 
Patentado por Genzyme Corporation®).
enen 1995 1995 porpor V.E. Velculescu, B. Vogelstein and K.W. V.E. Velculescu, B. Vogelstein and K.W. 
KinzlerKinzler(1)(1) (Johns Hopkins University, Baltimore, MD. (Johns Hopkins University, Baltimore, MD. 
PatentPatentadoado porpor Genzyme Corporation®).Genzyme Corporation®).
1. Velculescu, V.E. et al., (1995) Science 270; 484-487.1. Velculescu, V.E. 1. Velculescu, V.E. et al.,et al., (1995) (1995) ScienceScience 270;270; 484484--487.487.
Generación de Tags de secuencias (10-14bp).Generación de Generación de Tags Tags de secuenciasde secuencias (10(10--14bp).14bp).
Ligación de los tags para obtener concatémeros que 
pueden ser clonados y secuenciados.
Ligación de los Ligación de los tags tags para obtener para obtener concatémeros concatémeros que que 
pueden ser clonados y secuenciados.pueden ser clonados y secuenciados.
Comparación de los datos de secuencia para 
determinar las diferencias en la expresión de los 
genes.
Comparación de los datos de secuencia para Comparación de los datos de secuencia para 
determinar las diferencias en la expresión de los determinar las diferenciasen la expresión de los 
genes.genes.
Inventada:InventadaInventada::
Tres principios básicos:Tres principios básicosTres principios básicos::
---
---
---
La tecnología SAGE La tecnologíaLa tecnología SAGE SAGE 
TTTTTTTTTTTTTTT
Extracción de 
ARNm
Retrotranscripción 
hasta ADNc
Utilizando oligodT 
con biotina
Extracción de Extracción de 
ARNmARNm
Retrotranscripción Retrotranscripción 
hasta hasta ADNcADNc
Utilizando Utilizando oligodT oligodT 
con con biotinabiotina
AAAAAAAAAAAAAAA
AEAEAE
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTT
AEAEAE
BBB
BBB GATCGATCGATC
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTT
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTTGATCGATCGATC
SSS
Corte con una enzima que 
genera
extremos cohesivos(AE)
Unión a bolas de 
estreptavidina
Corte con una enzima que Corte con una enzima que 
generagenera
extremos cohesivosextremos cohesivos(AE)(AE)
Unión a bolas de Unión a bolas de 
estreptavidinaestreptavidina
Dividir en dos alícuotas y ligar
A dos adaptadores A & B
Dividir en dos alícuotas y ligarDividir en dos alícuotas y ligar
A dos adaptadores A dos adaptadores A & BA & B
Rotura con otra enzima 
(etiquetado,TE)
Generación extremos
romos
Rotura con otra enzima Rotura con otra enzima 
(etiquetado,(etiquetado,TE)TE)
Generación extremosGeneración extremos
romosromos
CTAGCTAGCTAG
GATCGATCGATC
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTT
TETETE
AAA
CTAGCTAGCTAG
GATCGATCGATC
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTTTTTTTTTT
TETETE
BBB
Ligar y amplificar con 
oligosA & B
Ligar y amplificar con Ligar y amplificar con 
oligosoligosA & BA & B
GATCXXXXXXXXXXGATCGATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
CTAGXXXXXXXXXXCTAGCTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Tag 1Tag 1Tag 1
AAA
Tag 2 Tag 2 Tag 2
GATCOOOOOOOOOO GATC GATCOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO BBBCTAGOOOOOOOOOO CTAG CTAGOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO
GATCXXXXXXXXXXGATCGATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
CTAGXXXXXXXXXXCTAGCTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
OOOOOOOOOOGTACOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOGTACGTAC
OOOOOOOOOOCTAGOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCTAGCTAG
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
WWWWWWWWGTACWWWWWWWWWWWWWWWWGTACGTAC
WWWWWWWWCTAGWWWWWWWWWWWWWWWWCTAGCTAG
Tag 1Tag 1Tag 1 Tag 2Tag 2Tag 2 Tag 4Tag 4Tag 4Tag 3Tag 3Tag 3
-- -- -- -- --
-- -- -- -- --
-- -- -- -- --
-- -- -- -- --
Clonar
Secuenciar
Análisis bioinformático
ClonClonarar
SeSecuenciarcuenciar
Análisis Análisis bioinformáticobioinformático
Corte con AE
Aislamiento de ditags y empalme
Corte con AECorte con AE
Aislamiento de Aislamiento de ditags ditags y empalmey empalme
DitagDiDitagtag
GATCXXXXXXXXXXGATCGATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
CTAGXXXXXXXXXXCTAGCTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
OOOOOOOOOOGTACOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOGTACGTAC
OOOOOOOOOOCTAGOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOCTAGCTAGAAA BBB
La tecnología SAGE La tecnologíaLa tecnología SAGE SAGE 
Ligar y amplificar con 
oligosA & B
Ligar y amplificar con Ligar y amplificar con 
oligosoligosA & BA & B
GATCXXXXXXXXXXGATCGATCXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
CTAGXXXXXXXXXXCTAGCTAGXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
Tag 1Tag 1Tag 1
AAA
Tag 2 Tag 2 Tag 2
GATCOOOOOOOOOO GATC GATCOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO BBBCTAGOOOOOOOOOO CTAG CTAGOOOOOOOOOO OOOOOOOOOO
La tecnología SAGE La tecnología La tecnología SAGE SAGE 
VentajasVentajasVentajas Problemas:ProblemasProblemas::
Determina el nivel de expresión 
para cada gen.
Determina el nivel de expresión Determina el nivel de expresión 
para cada genpara cada gen..
Problemas técnicos como digestión 
incompleta con la enzima que 
genera extremos cohesivos, 
problemas con la secuenciación 
masiva
Problemas técnicos como digestión Problemas técnicos como digestión 
incompleta con la enzima que incompleta con la enzima que 
genera extremos cohesivos, genera extremos cohesivos, 
problemas con la secuenciación problemas con la secuenciación 
masivamasiva
Muy laborioso, laboratorios 
especializados y complejidad 
análisis de los datos
Muy laborioso, laboratorios Muy laborioso, laboratorios 
especializados y complejidad especializados y complejidad 
análisis de los datosanálisis de los datos
No es bueno para experimentos de 
dosis respuesta. No se pueden 
clusterizar los genes
No es bueno para experimentos de No es bueno para experimentos de 
dosis respuesta. No se pueden dosis respuesta. No se pueden 
clusterizar clusterizar los geneslos genes
Contribuye al descubrimiento de 
nuevos genes (proyectos de 
secuenciación de EST)
Contribuye al descubrimiento de Contribuye al descubrimiento de 
nuevos genes (proyectos de nuevos genes (proyectos de 
secuenciación de Esecuenciación de ESTST))
Muy buena correlación con la 
abundancia de ARNm en la célula
Muy buena correlación con la Muy buena correlación con la 
abundancia de ARNm en la célulaabundancia de ARNm en la célula
Ligación alícuota 1
con adaptador A 
ARN total
células control
ARNm
células control
Síntesis ADNc
(DRIVER)
Ligación alícuota 2
con adaptador B
1ª hibridación
driver+tester
2ª hibridación: 
mezclar muestras y
añadir DRIVER desnaturalizado
fresco
ARN total células tratadas
ARNm células tratadas
Síntesis ADNc(TESTER)
Dividirlo en dos alícuotas
La tecnología SSH (hibridación supresiva sustractiva) ILa tecnología La tecnología SSSH (hibridación SH (hibridación supresiva supresiva sustractiva) Isustractiva) I
Rellenar los extremos
añadir oligos y 
amplificar por PCR
no amplificación
amplificación lineal
no amplificación amplificación exponencial
La tecnología SSH (hibridación supresiva sustractiva) IILa tecnología La tecnología SSSH (hibridación SH (hibridación supresiva supresiva sustractiva) IIsustractiva) II
ResultadosResultados
Clonación 
genes 
específicos
Microarrays de ADNMMicroarraysicroarrays de ADNde ADN
Sondas:SondasSondas::
Definición:DefDefinicióninición:: Técnica de genómica funcional que permite la 
medida simultánea de los niveles de expresión 
de miles de genes (sondas) en un solo 
experimento de hibridación con una mezcla 
compleja de ARN o ADN.
Técnica de genómica funcional que permite la Técnica de genómica funcional que permite la 
medida simultánea de los niveles de expresión medida simultánea de los niveles de expresión 
de miles de genes (sondas) en un solo de miles de genes (sondas) en un solo 
experimento de hibridación con una mezcla experimento de hibridación con una mezcla 
compleja de ARN o ADN.compleja de ARN o ADN.
Secuencias de ADN (oligonucleótidos o productos 
de PCR) inmobilizadas ordenadamente sobre una 
superficie sólida
Secuencias de ADN (Secuencias de ADN (oligonucleótidosoligonucleótidos o productos o productos 
de PCR) de PCR) inmobilizadasinmobilizadas ordenadamente sobre una ordenadamente sobre una 
superficie sólidasuperficie sólida
Muestra problema:Muestra problemaMuestra problema:: Muestra de ADNc marcada cuya abundancia será 
determinada por hibridación
Muestra de Muestra de ADNc ADNc marcada cuya abundancia será marcada cuya abundancia será 
determinada por hibridacióndeterminada por hibridación
Resultados:ResultadosResultados:: Basados en el concepto de “culpable por 
asociación”: genes que son co-regulados (patrón 
similar de comportamiento) es probable que 
estén funcionalmente relacionados formando 
parte del mismo proceso biológico.
Basados en el concepto de “culpable por Basados en el concepto de “culpable por 
asociación”asociación”:: genes que son genes que son coco--regulados (regulados (patrón patrón 
similar de comportamientosimilar de comportamiento) ) es probable que es probable que 
estén funcionalmente relacionados formando estén funcionalmente relacionados formando 
parte del mismo proceso biológicoparte del mismo proceso biológico..
GeneChip®: La tecnología de AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología de La tecnología de AffimetrixAffimetrix
Sondas:SondasSondas::
Para cada secuencia existen dos sondas, una de homología perfecta 
de 25 b y otra con una mutación en la zona central. 
Para cada secuencia existen dos sondas, una de homología perfectPara cada secuencia existen dos sondas, una de homología perfecta a 
de 25 b y otra con una mutación en la zona central. de 25 b y otra con una mutación en la zona central. 
20 parejas de sondas específicaspor cada gen. 
Sobrerrepresentación extremos 3´de los ARNm y seleccionadas 
para maximizar las temperaturas de hibridación y la especificidad.
20 20 parejas de sondas específicas por cada gen. parejas de sondas específicas por cada gen. 
SobrerrepresentaciónSobrerrepresentación extremos 3´de los ARNm y seleccionadas extremos 3´de los ARNm y seleccionadas 
para maximizar las temperaturas de hibridación y la especificidapara maximizar las temperaturas de hibridación y la especificidad.d.
Por cada sonda hay Por cada sonda hay Por cada sonda hay 
­ 107 moléculas­ 10­ 1077 molmoléculaséculas
10µm x 10µm1010µµm x 10m x 10µµmm
ChipChipChip
Hasta to 4 x 105
posiciones
Hasta Hasta to 4 x 10to 4 x 1055
posicionesposiciones
1.3cm x 1.3cm1.3cm x 1.3cm1.3cm x 1.3cm
La presencia de numerosos genes de control permite una casi 
perfecta normalización entre diferentes experimentos.
La presencia de numerosos genes de control permite una casi La presencia de numerosos genes de control permite una casi 
perfecta normalización entre diferentes experimentos.perfecta normalización entre diferentes experimentos.
Síntesis In situ sobre una superficie de cristalSíntesis Síntesis In situIn situ sobre una superficie de cristalsobre una superficie de cristal
GeneChip®: La tecnología AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología La tecnología AffimetrixAffimetrix
Síntesis In situ mediante fotolitografía(1)Síntesis Síntesis In situIn situ mediante fotolitografíamediante fotolitografía(1)(1)
1. Caviani Pease, A. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91; 5022-5026.1. Caviani Pease, A. 1. Caviani Pease, A. et al.,et al., (1994) (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USAProc. Natl. Acad. Sci. USA 91;91; 50225022--5026.5026.
Superficie de cristal tratada 
con un grupo protector 
fotolábil
Superficie de cristal tratada Superficie de cristal tratada 
con un grupo protector con un grupo protector 
fotolábilfotolábil
Desprotección por 
iluminación a través de la 
fotomáscara
Desprotección por Desprotección por 
iluminación a través de la iluminación a través de la 
fotomáscarafotomáscara
Acoplamiento
químico
AcoplamientoAcoplamiento
químicoquímico
LavadoLavadoLavado
Adición de una 
sopa de un 
nucleótido 
específico
Adición de una Adición de una 
sopa de un sopa de un 
nucleótido nucleótido 
específicoespecífico
2525
cciiclclooss
Sondas:SondasSondas::
Fotomáscara
Imagen de intensidad de FluorescenciaImagen de intensidad de FluorescenciaImagen de intensidad de Fluorescencia
Probe PairProbe PairProbe Pair No hibridaciónNo hibridaciónNo hibridación
Hibridación correctaHibridación correctaHibridación correcta
Oligo hibridación perfectaOligo Oligo hibridación perfectahibridación perfecta
Oligo con mutación en la mitadOligo Oligo con mutación en la mitadcon mutación en la mitad
1 Gene1 Gene1 Gene
Vista magnificada de un GeneChip
de ratón con 6,000 genes
Vista magnificada de unVista magnificada de un GeneChipGeneChip
de ratón con de ratón con 6,000 genes6,000 genes
Secuencia de referenciaSecuencia de referenciaSecuencia de referencia
GeneChip®: La tecnología AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología La tecnología AffimetrixAffimetrix
1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) Methods 10; 283-288.1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) 1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) MethodsMethods 10;10; 283283--288.288.
Dianas:DianasDianas:: ARNc fragmentados y biotinilados 
complementarios aislados después de amplificación 
lineal 
ARNc ARNc fragmentados y fragmentados y biotinilados biotinilados 
complementarios aislados después de amplificación complementarios aislados después de amplificación 
lineal lineal 
HibridaciónHHibridaciónibridación
TTTTTnTTTTTTTTTTnn
AAAAAnAAAAAAAAAAnn T7T7T7
GeneChip®: La tecnología AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología La tecnología AffimetrixAffimetrix
AAAAAAAAAAAAAAA
ARNm (0.2-1µg)ARNmARNm (0.2(0.2--11µµg)g) 5’- TTTTTn-3’5’5’-- TTTTTTTTTTnn--3’3’T7T7T7
Síntesis de la cadena + del ADNcSíntesis de la cadena + del Síntesis de la cadena + del ADNcADNc
UsandoUsandoUsando
Síntesis de la segunda cadena del ADNcSíntesis de la segunda cadena del Síntesis de la segunda cadena del ADNcADNc
T7T7T7
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTnTTTTTTTTTTnn
Transcripción In Vitro utilizando T7 
ARN polimerasa y Biotin -UTP & -
CTP (amplificación x20-50)
Transcripción Transcripción In Vitro In Vitro utilizandoutilizando T7 T7 
ARN ARN polimerasapolimerasa yy Biotin Biotin --UTP & UTP & --
CTPCTP (amplifica(amplificacciióón x20n x20--50)50)
UUUUUnUUUUUUUUUUnnUUUUUnUUUUUUUUUUnnUUUUUnUUUUUUUUUUnnUUUUUnUUUUUUUUUUnn
Fragmentación de los ARNcFragmentación de los Fragmentación de los ARNcARNc
UU
UU
U n
UU
U
UU
UU
UUU
nnUU
UUU
n
UUUU
UU
UU
UU
nn
Hibridación 16hrs a 40-45°CHibridaciónHibridación 16hrs a 4016hrs a 40--45°C45°C
15µg de ARNc 
fragmentado
1515µµg g de de ARNc ARNc 
fragmentadofragmentado
Cocktail de ARN controlCCocktailocktail de ARN controlde ARN control
(Estándares)((EstándaresEstándares))
GeneChip fluidicsGeneChip fluidicsGeneChip fluidics
Procedimiento automatizado de 
lavado y marcaje
Procedimiento automatizado de Procedimiento automatizado de 
lavado y marcajelavado y marcaje
Station 400Station 400Station 400
Amplificación con oligos 
biotinilados y captura con 
estreptavidina-Ficoeritrina
AmplificaAmplificación ción con con oligos oligos 
biotinilados biotinilados y captura con y captura con 
estreptavidinaestreptavidina--FicoeritrinaFicoeritrina
EscánerEscánerEscáner
HP GeneArrayHP GeneArrayHP GeneArray
scannerscannerscanner
Análisis de datosAnálisis de datosAnálisis de datos
GeneChip SoftwareGeneChip SoftwareGeneChip Software
Cuantificación de los datosCuantificación de los datosCuantificación de los datos
Normalización de los ChipsNormalización de los Normalización de los ChipsChips
Con estándaresCon estándaresCon estándares
GeneChip®: La tecnología AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología La tecnología AffimetrixAffimetrix
VentajasVentajasVentajas Problemas:ProblemasProblemas::
Diseño rígido (fotomascaras)Diseño rígidoDiseño rígido ((fofotomastomascaras)caras)
Sondas diseñadas sólo para genes 
conocidos o ESTs.
Sondas diseñadas sólo para genes Sondas diseñadas sólo para genes 
conocidos o conocidos o ESTsESTs..
Pocos tipos de arrays en el mercadoPocos tipos de Pocos tipos de arrays arrays en el mercadoen el mercado
Detalles importanes no accesibles al 
usuario (normalización steps, 
secuencias de los oligos)
Detalles Detalles importanes importanes no accesibles al no accesibles al 
usuariousuario (normaliza(normalizacciióón stepn steps, s, 
secuencias de los secuencias de los oligosoligos))
Carísimo (GeneChips®, equipo: 
fluidics station, escáner, etc...)
CarísimoCarísimo (GeneChips®, (GeneChips®, equipoequipo: : 
fluidics station, fluidics station, escánerescáner, etc...), etc...)
Las sondas permiten una hibridación 
específica (discriminación entre 
miembros de una misma familia, 
variantes de splicing, mutantes, etc.)
Las sondas permiten una hibridación Las sondas permiten una hibridación 
específica (discriminación entre específica (discriminación entre 
miembros de una misma familia, miembros de una misma familia, 
variantes de variantes de splicingsplicing, mutantes, etc.), mutantes, etc.)
Perfecto para caracterización a gran 
escala de Polimorfismos Simples de 
Nucleótido (SNP)
Perfecto para caracterización a gran Perfecto para caracterización a gran 
escala de Polimorfismos Simples de escala de Polimorfismos Simples de 
Nucleótido (SNP)Nucleótido (SNP)
La fabricación mediante fotolitografía 
elimina la contaminación y minimiza la 
variabilidad entre lotes. 
La fabricación mediante fotolitografía La fabricación mediante fotolitografía 
elimina la contaminación y minimiza la elimina la contaminación y minimiza la 
variabilidad entre lotes. variabilidad entre lotes. 
Perfecto para genomas 
completamente secuenciados (ex.: E. 
coli, S. Cerevisiae, H.sapiens)
Perfecto para genomas Perfecto para genomas 
completamente secuenciadoscompletamentesecuenciados (ex.: (ex.: E. E. 
colicoli, , S. CerevisiaeS. Cerevisiae, H., H.sapienssapiens))
Sensibilidad reducida debido al 
tamaño de los oligos
Sensibilidad reducida debido al Sensibilidad reducida debido al 
tamaño de los tamaño de los oligosoligos
GeneChip®: La tecnología AffimetrixGeneChip®: GeneChip®: La tecnología La tecnología AffimetrixAffimetrix
Microarrays de ADNcMicroarrays de Microarrays de ADNcADNc
Microarrays de ADNc (1)Microarrays de ADNc Microarrays de ADNc (1)(1)
Control de calidadControl de calidadControl de calidad
Análisis datosAnálisis datosAnálisis datos
Amplificación por PCRAmplificación por PCRAmplificación por PCR
Genoteca de ADNcGenoteca de ADNcGenoteca de ADNc
ScanningScanningScanning
↖↖↖
Toma de datosToma de datosToma de datosCy5Cy5Cy5
Cy3Cy3Cy3 Combinación 
De datos
CoCombinación mbinación 
De datosDe datos
Impresión robotizadaImpresión robotizadaImpresión robotizada
1. Schena, M. et al., (1995) Science 270; 467-470. 1. Schena, M. 1. Schena, M. et al.,et al., (1995) (1995) ScienceScience 270;270; 467467--470. 470. 
HibridaciónHHibridaciónibridación
DianasDiDianasanas
InterpretaciónInterpretaciónInterpretación
Microarrays de ADNc (1)Microarrays de ADNc Microarrays de ADNc (1)(1)
Tecnologías de impresión de ADNTecnologías de impresiónTecnologías de impresión de ADNde ADN
Efecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctrico
CapilaridadCapilaridadCapilaridad
Tecnologías de impresión de ADNTecnologías de impresiónTecnologías de impresión de ADNde ADN MecánicasMecánicasMecánicas
Ink-jetInkInk--jetjet
Efecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctricoEfecto piezoeléctrico
Agilent Technologies®Agilent Technologies®
Pin and RingPin and RingPin and Ring
Genetic
Microsystems®
GeneticGenetic
Microsystems®Microsystems®
Telechem International®Telechem International®Telechem International®
CapilaridadCapilaridadCapilaridad
Microarrays de ADNc (1)Microarrays de ADNc Microarrays de ADNc (1)(1)
Tamaño del lunarTamaño del lunarTamaño del lunar Ink-jet: 250-1000 lunares/cm2InkInk--jet: jet: 250250--1000 1000 lunareslunares/cm/cm22
Mechanical: >2500 lunares/cm2Mechanical: Mechanical: >2500 >2500 lunareslunares/cm/cm22
Ø: 100 - 300 µmØ: 100 Ø: 100 -- 300 300 µµmm
150 - 300 µm150 150 -- 300 300 µµmm
Cantidad ADN:Cantidad ADN: <10pg de ADN (<100pl)<10pg <10pg de ADNde ADN (<100pl)(<100pl)
Marcaje:Marcaje: Fluorescencia Fluorescencia Fluorescencia Radioactividad(1)RadioactiviRadioactividaddad(1)(1)
Cy3 vs Cy5Cy3 vs Cy5Cy3 vs Cy5 3H vs 35S or 33P or 14C33H vs H vs 3535S or S or 3333P or P or 1414CC
1. Salin H. et al., (2000) J. Histochem Cytochem. 48; 1587-1592.1. 1. Salin H. Salin H. et al.,et al., (2000) (2000) J. Histochem Cytochem.J. Histochem Cytochem. 48;48; 15871587--1592.1592.
Estreptavidina, etc...EEsstreptavidina, etc...treptavidina, etc...
Tipo de sustratoTipo de sustrato PolyLisinaPolPolyyLLiisinsinaa
SilanoSilSilanoano
SuperaldehidoSuperaldehidSuperaldehidoo Portas recubiertosPortas rPortas recubiertosecubiertos
Membrana de Nylon Membrana de Nylon Membrana de Nylon 
Microarrays de ADNc (1)Microarrays de ADNc Microarrays de ADNc (1)(1)
EspaciadoEspaciadoEspaciado
Marcaje directo de los ARNMarcaje directo de los ARNMarcaje directo de los ARN
Muestra 1MuestraMuestra 11 Muestra 2MuestraMuestra 22
Extracción ARN totalExtracción ARN totalExtracción ARN total
Purificación ARNmPPurificación ARNmurificación ARNm
Retrotranscripción
y marcaje
ReRetrotranscripcióntrotranscripción
y marcajey marcaje
O
pcional
O
pcional
O
pcionalCy3-dU
TP
Cy5
Cy5 -- dU
TP
dU
TP
vice-versavicevice--versaversa
yyy
Microarrays de ADNc: estrategiasMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: estrategias: estrategias
Etiquetado químicoEtiquetado químicoEtiquetado químico
Marcaje indirecto de los ARNMarcaje indiMarcaje indirecto de los ARNrecto de los ARN
Muestra 3MuestraMuestra 33 Muestra 4Muestra 4Muestra 4
RetrotranscripciónRetrotranscripciónRetrotranscripción
O
ptional
O
ptional
O
ptional aa-dUTPaaaa--dUTPdUTP
Purificación ADN marcadoPurificación ADN marcadoPurificación ADN marcado
NHS-Cy3NHSNHS--Cy3Cy3
NHS-Cy5NHSNHS--Cy5Cy5
NHS-Cy3NHSNHS--Cy3Cy3
NHS-Cy5NHSNHS--Cy5Cy5
Extracción ARN totalExtracción ARN totalExtracción ARN total
Purificación ARNmPPurificación ARNmurificación ARNmHibridación
HHibridaciónibridación
LavadoLavadoLavado
LecturaLecturaLectura
PurificaciónPurPurificaciónificación
Microarrays de ADNc: 
Ejemplo respuesta
celular a mitogénicos
Microarrays de ADNc: 
Ejemplo respuesta
celular a mitogénicos
Respuesta transcripcional al suero
experimentos por triplicado:
identificación de patrones comunes
de comportamiento:
DIME CON QUIÉN VAS Y TE DIRÉ 
QUIEN ERES!!
A
lg
or
it
m
o 
ge
né
ti
co
Microarrays de ADNc: último paso!!
CLUSTERING DE LOS DATOS
Microarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: último paso!!: último paso!!
CLUSTERING DE LOS DATOSCLUSTERING DE LOS DATOS
Uso de oligos específicos de cada gen (uno al 
menos)
Uso de oligos específicos de cada gen (uno al Uso de oligos específicos de cada gen (uno al 
menos)menos)
Contaminación de las sondasContaminación de las sondas
1. Halgren, R.G. et al., (2001) Nucleic Acids Res. 29; 582-588.1. 1. Halgren, R.G. Halgren, R.G. et al.,et al., (2001) (2001) Nucleic Acids Res.Nucleic Acids Res. 29;29; 582582--588.588.
Las genotecas de ADNc comerciales están 
contaminadas (ex.: I.M.A.G.E. Consortium(1))
Las genotecas de ADNc comerciales están Las genotecas de ADNc comerciales están 
contaminadas contaminadas (ex.: I.M.A.G.E. Consortium(ex.: I.M.A.G.E. Consortium(1)(1)))
Amplificación con una sola pareja de oligosAmplificación con una sola pareja de oligosAmplificación con una sola pareja de oligos
Necesidad de verificar por secuenciaciónNecesidad de verificar por secuenciaciónNecesidad de verificar por secuenciación
Inserto de ADNcInserto de ADNcInserto de ADNcPlasmidoPlasPlasmidomido PlásmidoPlásmPlásmidoidoHHH
111
AAA
121212
Microarrays de ADNc: problemasMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: problemas: problemas
Placa de 96 pocillos
Impresión 
robotizada
Diferentes tecnologías
Disparidad entre las 
puntas
IImpresión mpresión 
robotizadarobotizada
DifDiferentes tecnologíaserentes tecnologías
DiDisparidad entre las sparidad entre las 
puntaspuntas
Diferente eficiencia en la 
incorporación de Cy-dUTP 
Diferente eficiencia en la Diferente eficiencia en la 
incorporación de Cyincorporación de Cy--dUTP dUTP Diferentes propiedades espectrales
DifDiferentes propiedades erentes propiedades 
espectralesespectrales
¡Variabilidad entre arrays!¡¡VariaVariabilidad entre arrays!bilidad entre arrays!
Hibridación de muestra control y problema sobre el mismo arrayHibridación de Hibridación de muestra control y problema sobre el mismo arraymuestra control y problema sobre el mismo array
Uso de dos fluorocromos diferentes(Cy3 and Cy5)UsUso de dos fluorocromos diferenteso de dos fluorocromos diferentes(Cy3 and Cy5)(Cy3 and Cy5)
↖↖↖
↖↖↖
Marcaje indirecto
(fluorocromos con aminoallyl-
dUTP y NHS-Cy) 
Marcaje indirecto
(fluorocromos con aminoallyl-
dUTP y NHS-Cy) 
Intercambiar muestras y 
fluorocromos
Intercambiar muestras y 
fluorocromos
Problemas: Variabilidad en el sustratoProblemas: Variabilidad en el sustrato
Portas
Diferentes tipos de 
sustratos
Variabilidad entre 
portas preparados a 
la vez
PortasPortas
DifDiferentes tipos de erentes tipos de 
sustratossustratos
VariaVariabilidad entre bilidad entre 
portas preparados a portas preparados a 
la vezla vez
Microarrays de ADNc: problemasMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: problemas: problemas
HibridaciónHibridación
SensibilidadSensibilidad
2. Matz, M. et al., (1999) Nucleic Acids Res. 27; 1558-1560.2. 2. Matz, M. Matz, M. et al.,et al., (1999) (1999) Nucleic Acids Res.Nucleic Acids Res. 27;27; 15581558--1560.1560.
AAAAAAAAAAAAAAA
ARNm (1-2µg)ARNm ARNm (1(1--22µµg)g)
UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCC UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCC UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCC UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCC
Transcripciónin vitro(T7 ARN
polimerasa) (x20-50) 
Transcripción in vitroTranscripción in vitro(T7 (T7 ARNARN
polpolimerasaimerasa)) (x20(x20--50) 50) 
&&&
1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) Methods 10; 283-288.1. 1. Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) Phillips, J. and Eberwine J.H. (1996) MethodsMethods 10;10; 283283--288.288.
5’- TTTTTn-3’5’5’-- TTTTTTTTTTnn--3’3’
Síntesis ADNcSíntesis ADNcSíntesis ADNc
usandouusandosando
yyy
T7T7T7
5’- GGG-3’5’5’-- GGGGGG--3’3’TSTSTS
T7T7T7
AAAAAAAAAAAAAAA
CCCCCCCCC
TTTTTnTTTTTTTTTTnn
EfectoTemplate-Switching(2)EfectoTemplate-Switching(2)
T7T7T7
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTnTTTTTTTTTTnnCCCCCCCCC
GGGGGGGGGTSTSTS
T7T7T7TTTTTnTTTTTTTTTTnnCCCCCCCCC
GGGGGGGGGTSTSTS AAAAAnAAAAAAAAAAnn
Síntesis de la segunda cadena del ADNc con TAQ polimerasaSíntesis Síntesis de la segunda cadena del ADNc con TAQ polimerasade la segunda cadena del ADNc con TAQ polimerasa
UUUUUnUUUUUUUUUUnnCCCCCCCCC
Transcripción usando hexameros
aleatorios & aa-dUTP 
TranscriTranscripción usando pción usando hexameroshexameros
aleatoriosaleatorios & aa& aa--dUTP dUTP 
Purificación y etiquetado 
químico Cy3 & Cy5
Purificación y etiquetado Purificación y etiquetado 
químico químico Cy3 & Cy5Cy3 & Cy5
Amplificación de dianas(1)Amplificación de dianas(1)
Microarrays de ADNc: problemasMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: problemas: problemas
Transcriptoma:
(Sin hipótesis)
TranscriptomTranscriptomaa::
(Sin hipótesis)(Sin hipótesis)
Perfil de expresión global del genoma
Iyer, V.R. et al., (1999) Science 283; 83-87. Hughes, 
T.R. et al., (2000) Cell 102; 109-126.
PerfPerfil de expresión global del genomail de expresión global del genoma
Iyer, V.R. et al., (1999) Science 283; 83-87. Hughes, 
T.R. et al., (2000) Cell 102; 109-126.
Microarrays de ADNc: aplicacionesMicroarrays de ADNcMicroarrays de ADNc: aplicaciones: aplicaciones
Expediciones de Expediciones de 
pesca:pesca:
(Con hip(Con hipótesisótesis))
BBúsqueda de genes implicados en procesos úsqueda de genes implicados en procesos 
biológicos o condiciones experimentales de biológicos o condiciones experimentales de 
interés (pe. tratamiento hormonal, tumores, interés (pe. tratamiento hormonal, tumores, 
factores de crecimiento, etc.factores de crecimiento, etc.))
Ren, B. et al., (2000) Science 290; 2306-2309.
Pollack, J.R. et al., (1999) Nature Genet. 23; 41-46.
Drug-discoveryDrugDrug--discoverydiscovery
Scherf, U. et al., (2000) Nature Genet. 24; 236-244.
Identificación dianas terIdentificación dianas terapéuticas, apéuticas, 
farmacogenéticafarmacogenética, etc..., etc...
Aplicaciones Microarrays de ADNAplicaciones Microarrays de ADNAplicaciones Microarrays de ADN
Entradas
Tejidos normalesTejidos normales
Tejidos enfermosTejidos enfermos
Compuestos a evaluarCompuestos a evaluar
Medida
expresión génica
con Microarrays
Salidas
PrognosisPrognosis
DiagnosisDiagnosis
PatologíaPatología
Dianas drogasDianas drogas
Eficacia drogasEficacia drogas
ToxicologíaToxicología
Detección Detección 
mutacionesmutaciones