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PATOLOGIA DEL APARATO LOCOMOTOR, 2006 VOL. 4 Nº 3: 202-207 INVESTIGACION
RESUMEN
Objetivo: revisar la composición del tejido óseo, sus propiedades
y estructura, para formular materiales adecuados para regenera-
ción ósea.
Materiales y métodos: en este estudio se utilizó la microscopía
electrónica de barrido en los huesos de los conejos intervenidos y
la porosimetría de mercurio de las membranas de chitosano.
Resultados: los procesos de liofilización de las membranas de
chitosan no parecen afectar al tamaño de sus poros, por lo que
se apoya el uso de tejidos porosos y entramados de polímeros
alternativos, como el PLLA y PLGA, mediante electrohilado para
regeneración de la parte orgánica del hueso rica en colágeno.
También se recomiendan composiciones altas en hidroxiapatita
para mimetizar la parte mineral de los huesos, y añadiendo factor
de diferenciación y crecimiento humano como en los fluidos de
los tejidos. 
Palabras clave: Chitosan, PLLA, PLGA, colágeno, hidroxiapatita.
ABSTRACT
Objective: collect information over the bone´s composi-
tion, as well as its properties and structure, to synthesize
materials for bone regeneration.
Materials and methods: in this study, it was used the
scanning electron microscopy in the rabbit´s bones and
mercury porosimetry in the chitosan membranes. 
Results: the lyophilization processes of the chitosan
membranes does not seem to affect the size of the poro-
sity, therefore it is recommended the use of porous mate-
rials or scaffolds trough electrospinning techniques of
alternative polymers such as PLLA, PLGA for the regenera-
tion of the collagen rich organic fraction of the bone, and
high hydroxyapatite compositions to mimic the mineral
fraction, and adding growth and differentation factor as in
the tissue fluids.
Keywords: Chitosan, PLLA, PLGA , collagen, hydroxyapatite.
Estudio de la composición ósea 
para su apropiada regeneración con 
materiales implantados
Bone composition study for an appropriate 
regeneration with implanted materials
Correspondencia:
E. Bernabeu Martinez: 
Facultad de Ciencias Físicas. 
Universidad Complutense de Madrid
Ciudad Universitaria 
28040 Madrid
Bernabéu Martínez, E. 1
López-Oliva Muñoz, F. 2
Larena Pel le jero, A. 3
Tur Gil , A. 3
de la Piedra Gordo, Mª. C. 4
Montero Escobar, M. 4
1 Departamento de Óptica de la Facultad de Ciencias
Físicas Universidad Complutense de Madrid.
2 Servicio de Traumatología del Centro de Prevención
y Rehabilitación FREMAP de Majadahonda.
3 Departamento de Ingeniería Química Industrial,
Universidad Politécnica de Madrid.
4 Laboratorio de Fisiología Ósea, Fundación Jiménez
Díaz, Madrid.
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INTRODUCCIÓN
Los huesos son auténticas matrices de nanocom-
puestos, principalmente nanocristales de hidroxia-
patita en una matriz rica de colágeno, muy complejos
y con formas altamente especializadas para dar
soporte mecánico y también sirven de reserva de
minerales, en particular de calcio y fosfato (1).
La matriz del hueso está compuesta por dos fases
principales a escala nanométrica: orgánica (proteínas)
e inorgánica (minerales) y sus composiciones serán en
términos globales (tabla I).
El mineral óseo esta compuesto principalmente
por hidroxiapatita y la parte proteínica de colágeno.
El colágeno actúa como base en la cual diminutos cris-
tales planos de hidroxiapatita se unen para formar el
hueso. El colágeno del hueso tiene una estructura
fibrosa típica, cuyo diámetro varía entre 100 y 2000
nm. De manera similar, la hidroxiapatita en el mine-
ral del hueso está en forma de nanocristales de
dimensiones entre 4x50x50 (nm). Los minerales
del hueso están también enriquecidos con algunos ele-
mentos sueltos para varias funciones metabólicas
entre los que están los carbonatos, citratos, sodio,
magnesio, fluoruros, cloruros y potasio. 
El principal papel de los minerales es dotar de
dureza y rigidez al hueso, mientras que el colágeno lo
dota de resistencia al la tracción y flexibilidad. Se pien-
sa que la clave para la resistencia de los huesos es la
compleja estructura jerárquica en la cual se organi-
zan con un auto-ensamblado. Es importante pun-
tualizar que los minerales no están directamente
ligados al colágeno, sino ligados a través de las pro-
teínas no colágenas. Las proteínas no colágenas
suponen entre un 3 % y un 5 % de la composición del
hueso, y proveen enplazamientos activos para la
biomineralización y unión celular. 
La cantidad de agua presente en los huesos es un
factor importante para determinar su comporta-
miento mecánico. Los lípidos también son necesarios
para las funciones celulares y suponen un 2 % del
hueso, además juegan un papel importante en la
biomineralización. El grado de biomineralización el
factor más importante para determinar las capaci-
dades mecánicas del hueso (Tabla II).
El hueso puede ser considerado como la unión de
varios niveles de unidades estructurales jerárqui-
cas, diseñadas elegantemente en varias escalas, de
macro a nano, para cumplir múltiples funciones.
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Estudio de la composición ósea 
para su apropiada regeneración con 
materiales implantados
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TABLA I. Composición genérica de los huesos (1).
Estas composiciones pueden variar ligeramente
para distintas especies y para distintos huesos
Fase inorgánica % Peso Fase orgánica
Hidroxiapatita 60 Colágeno
Carbonato 4 Agua
Citrato 0.9
Proteínas no 
colágenas 
(osteocalcina,
steonectina, 
osteopontina, 
trombospondina, 
proteínas orfogenéticas,
sialoproteínas, 
proteínas de suero)
Sodio 0.7
Magnesio 0.5
Cl-, F-, K+ Sr2+, Polisacáridos, lípidos, 
Pb2+, Zn2+, citoquinas
Cu2+, Fe2+
Células óseas primarias:
osteoblastos, osteocitos,
osteoclastos
Tabla II. Propiedades mecánicas de los huesos (1)
Propiedades Medidas
Hueso cortical Hueso trabecular
Módulo de Young (GPa) 14-20 0.05-0.5
Límite a tracción (MPa) 50-150 10-20
Límite a compresión (MPa) 170-193 7-10
Resistencia a la fractura 2-12 0.1
(MPa m1/2)
Rotura a tracción 1-3 5-7
Densidad (g/cm3) 18-22 0.1-1.0
Densidad aparente (g/cm3) 1.8-2.0 0.1-1.0
Volumen superficie/hueso 2.5 20
(mm2/mm3)
Volumen total del hueso 1.4 ˘ 106 0.35 ˘ 106
(mm3)
Superficie interna total 3.5 ˘ 106 7.0 ˘ 106
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Cuando el hueso se deposita inicialmente es estruc-
turalmente débil y desorganizado. Pero al cabo de
pocos días el hueso original se convierte en hueso
laminar. A nivel macroestructural el hueso laminar
maduro se distingue en compacto y esponjoso.
Como indican sus nombres se diferencian en su
densidad y se organizan con poros a múltiples nive-
les, de macro a nano, para el establecimiento de
múltiples funciones, incluido el transporte de nutrien-
tes, oxígeno y fluidos corporales. 
El hueso esponjoso o trabecular ocupa cerca del
20% del hueso total. Es más ligero, tiene mayor
porosidad y concentración de vasos sanguíneos que
el hueso compacto. El diámetro de los poros puede ser
de micrómetros a milimétros. El hueso compacto es
mucho más denso y ocupa el 80% del hueso total.
Tiene menor porosidad y concentración de vasos san-
guíneos. Los poros tiene diámetros de 10-20 µm y
están separados por intervalos de 200-300 µm. 
En este estudio contrastaremos los datos obtenidos
sobre la estructura ósea de los conejos a los cuales se
les implantaron membranas de chitosan (2) y la
propia estructura del chitosan. Posteriormente, se ana-
lizarán datos sobre la constitución de los huesos y sus
propiedades, para establecer un material que se ase-
meje y permita unos resultados óptimos para la
regeneración de tejidos (3). 
MATERIAL Y MÉTODOS
Estudio de la porosidad de las membranas de
chitosan
Para el estudio de la porosidad de las membranas
de chitosan implantadas se hizo una porosimetría de
mercurio (Micrometrics pore sizer 9310).Se contó
también con dos penetrómetros: uno para las mues-
tras poco porosas y otro para las de porosidades
medias. Una vez calibrados los penetrómetros se
procedió a la medición de las muestras liofilizadas y
no liofilizadas de las membranas desecadas a tem-
peratura ambiente de: 
A. ácido acético 1,5% (20 ml), Glicerol 5% (1,6 ml)
y chitosan (0,3 g) 
B. ácido acético 1,5% (20 ml), Glicerol 5% (1,6 ml)
y chitosan (0,7 g)
Estudio de la estructura ósea en conejos
El estudio de la estructura de ósea de conejo en
muestras decalcificadas se hizo por microscopía
electrónica de barrido y por microscopía confocal. A
las muestras para su observación por microscopía
electrónica de barrido se les dio un tratamiento de oro
previo a su observación.
Para el proceso de decalcificación se retiraron con
cincel las esquirlas del hueso, después se lavó con
suero fisiológico. A continuación, se hizo un trata-
miento de desecación en estufa, a 110ºC, y, final-
mente, se cortaron muestras de milímetro y medio con
sierra de diamante.
RESULTADOS
Los resultados más claros y precisos se obtuvieron
con los penetrómetros, obteniendo porosidades
poco abundantes pero de gran tamaño como se
puede observar en la tabla III: 
El proceso de liofilización del chitosan no variaba
de una manera significativa el tamaño de sus poros
y el aumento de la cantidad de chitosan disminuía
ligeramente el tamaño de los poros, pero aumentaba
su número muy significativamente.
Las muestras del hueso decalcificado de los cone-
jos estudiados en observación en sección transversal
presentaron porosidades con diámetros de poros
entre 200 y 400 nm conectados (figura 1). Las imá-
genes obtenidas por microscopía confocal de hueso
en sección transversal descalcificado muestran una
estructura reflejada en la figura 2.
Tanto las muestras liofilizadas como sin liofilizar
de la composición A (baja en chitosan), muestran una
porosidad que dista notablemente de la observada en
la microscopía electrónica de barrido, con porosi-
dades de tamaño superior y menos abundante. En
cambio, en el caso de porosimetría de la muestra B
(alto contenido en chitosan) liofilizada, observa-
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Tabla III. Análisis mediante porosimetría 
de mercurio de dos muestras de chitosan
Área total Radio medio 
de los poros de los poros
(m2/g) (µm)
Muestra a sin liofilizar 0,0473 6,724
Muestra a liofilizada (0,3 g) 0,0995 5,355
Muestra b liofilizada (0,7 g) 0,4109 0,7604
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mos tamaños más cercanos a los reales y mayor
porosidad, pero con una estructura y una composi-
ción química (4) demasiado uniforme para mimeti-
zar el tejido óseo.
DISCUSIÓN
Hay cinco tipos distintos de células asociadas al teji-
do óseo en cuanto a sus funciones: células osteo-
progenitoras, osteoblastos, osteocitos, osteoclastos
y células tapizantes del hueso («bone-lining cells»).
Pero las células responsables de la formación de
hueso nuevo son los osteoblastos, que segregan colá-
geno y después lo recubren con proteínas no colágenas
que pueden retener minerales, principalmente calcio
y fosfato, del riego sanguíneo, creándose así nuevo
hueso. 
Para el correcto crecimiento y diferenciación de los
osteoblastos (5) se deben encontrar en un entorno
similar al los del tejido a regenerar (1), consiguiéndose
entornos más favorables para su proliferación con
porosidades nanométricas (6), como las que se obtie-
nen con las técnicas de electrohilado modernas de
polímeros sin olvidar los factores de crecimiento
(7).
Apoyaremos tres materiales para la reproducción
de los huesos: hidroxiapatita para la parte mineral de
los huesos, y PLLA o PLGA para la reproducción de
la parte orgánica sustituyendo al colágeno.
La hidroxiapatita (HA) (8) es un tipo de biocerá-
mico basado en fosfato cálcico, usado frecuente-
mente como sustituto en injertos óseos por su parecido
estructural con los minerales del hueso natural. La HA
estequiométrica tiene una composición química
Ca10(PO4)6(OH)2 con una relación Ca/P de 1.67.
La HA, obtenida bien de fuentes naturales o bien de
fuentes sintéticas, se considera una sustancia bioac-
tiva, ya que forma fuertes enlaces químicos con el teji-
do óseo huésped, y por ello, se la reconoce como un
buen material para injertos óseos. La HA no es sólo
bioactiva, también es osteoconductiva, no tóxica, no
inmunogénica, y su estructura es cristalográfica-
mente similar a la de los minerales óseos con el nivel
adecuado de carbonos sustituidos. En la tabla IV se
presentan las propiedades fisioquímicas, mecánicas
y biológicas de la HA.
Se ha informado de un gran número de métodos de
fabricación para la HA. Éstos estudios se concen-
traban en HA a microescala (>1 µm).
Recientemente, la HA de nanoescala ( 10-100 nm)
ha recibido gran atención debido a las mejores pro-
Fig. 1. Microscopía electrónica de barrido (12 µm x 18 µm)
de una muestra de hueso de conejo con una porosidad medi-
da sobre la imagen de 301 nm.
TABLA IV. Propiedades fisioquímicas 
mecánicas y biológicas de la HA (1)
Fig. 2. Microscopía confocal de hueso en sección transversal
Propiedades Datos experimentales
Módulo de Young (GPa) 80-110
Módulo elástico (GPa) 114
Densidad (g/cm3) 3.16
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piedades funcionales sobre su homóloga a microes-
cala, particularmente, reactividad superficial y estruc-
tura ultra fina, que son las características imperativas
para la interacción tejido-injerto tras la implantación.
Durante los últimos años, se ha dedicado un esfuer-
zo investigador al procesado nanoestructural de
HA y sus compuestos, para obtener estructuras
ultrafinas con propiedades físicas, mecánicas, quí-
micas y biológicas superiores a las de microescala, y,
al mismo tiempo, similares a las de los minerales óseos
naturales. Además, se ha demostrado que la nano-
HA, en comparación con la micro-HA convencional,
fomenta la adhesión, diferenciación y proliferación
de osteoblastos, la osteointegración, y la deposi-
ción de minerales cálcicos en su superficie, lo que lleva
a mejorar la formación de nuevo tejido óseo en un
corto período de tiempo.
El colágeno, por su parte, es un polímero natural
usado como biomaterial en diversas aplicaciones
biomédicas. Está presente en la fase orgánica del
hueso y sirve principalmente como proteína estruc-
tural de la matriz extracelular original. Tiene muchas
propiedades funcionales deseables para el creci-
miento celular. El colágeno purificado es biocom-
patible, biodegradable, no tóxico y carece de
antigenicidad que lo convierten en una fuente pri-
mordial y segura de materiales para uso biomédico,
especialmente en ingeniería de tejidos óseos. Es,
además, un agente hemostático y osteoconductor. 
Existen diversos tipos de colágenos según su
secuencia molecular. Hasta ahora se han identifica-
do 27 tipos distintos con al menos 42 cadenas poli-
péptidas diferentes. A pesar de que existen muchos
tipos de colágenos en un organismo vivo, la forma
más abundante en tejidos conectivos es el tipo I.
Todos los colágenos se componen de tres cadenas
polipéptidas (cadenas que se enrrollan sobre sí mis-
mas en forma de hélice a izquierdas. En general, el
colágeno extraído de tejidos naturales es capaz de
obtener una respuesta inmunogénica tras la implan-
tación; por ello, el uso directo de este tipo de colágeno
es limitado. 
Hoy se fabrica una forma purificada de colágeno
conocida como colágeno reconstituido, por métodos
biomecánicos, y está disponible comercialmente. El
colágeno reconstituido tiene una inmunogenicidad
relativamentemás baja que el colágeno original. El
colágeno también puede ser modificado química-
mente por diversos métodos (por ejemplo, succión)
para aumentar su reactividad superficial, mediante
la introducción de cargas negativas, que a cambio,
hace que se disuelva en pH neutral; ampliando su uso
en biomedicina. No obstante, el colágeno no tiene
dureza y resistencia suficicientes, lo que da ventaja de
los compuestos, como los injertos óseos disponi-
bles comercialmente.
La forma desmineralizada de colágeno óseo ha
sido muy usada para el tratamiento de defectos
óseos adquiridos y congénitos, en combinación con
HA. Los resultados confirmaron la habilidad de
osteoconducción y osteoinducción del injerto. 
Recientemente se han hecho numerosos estudios
con los polímeros PLGA (poli (D,L láctico co-glicó-
lico)) (9) y el PLLA (ácido poli l-láctico) (10), en los
que se observa su capacidad como medio para la pro-
liferación y diferenciación de tejidos de colágeno, en
especial de tipo I, esta alternativa podría ser la más
viable para futuras aplicaciones como sustituto del
colágeno en sí.
El uso de membranas de chitosan para la regene-
ración ósea, puede presentar problemas, desde la toxi-
cidad del ácido utilizado como disolvente a su
fragilidad, a su propia estructura. Usando técnicas de
procesado de liofilización se han consiguido poro-
sidades más cercanas a las de los huesos para for-
mulaciones con porcentajes altos de chitosan. 
Técnicas nanométricas de entramado de tejidos
como el electrohilado pueden dar estructuras similares
a los tejidos que están siendo utilizadas principal-
mente en polímeros, como el PLGA y PLLA, los
cuales ya han demostrado su utilidad para la rege-
neración de tejidos en diversos estudios. 
Pero quizás un solo material sea insuficiente para
conseguir tejidos que puedan provocar fácilmente la
regeneración de los iniciales. Podemos pensar en
llegar a mayores similitudes entre el material rege-
nerador de tejido y el propio tejido a regenerar. En ello
nos puede ayudar el conocer la estructura de los
huesos a sustituir. Los huesos son estructuras jerár-
quicas compuestas de una fase mineral y otra orgá-
nica. El principal representante de la orgánica será el
colágeno tipo 1 en los huesos, este es el componente
que prolifera mejor en los tejidos de PLLA y PLGA;
mientras que la fase mineral está formada princi-
palmente por hidroxiapatita, la cual podrá ser obte-
nida tanto por fuentes naturales como sintéticas,
para formar un material compuesto que se adapte
mejor a la estructura de los tejidos óseos.
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AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a Dª Carmen Bona en la búsqueda de
información y colaboración para el estudio de la
composición de los huesos. La ayuda de D. Juan
Manuel Durán en las determinaciones de la porosi-
metría de mercurio en el centro CIEMAT, a D.
David Cáceres su trabajo mientras estuvo integrado
con nosotros en el estudio para la regeneración ósea
y al profesor Julián Sanz Esponera en la decalcifica-
ción de los huesos. 
Este trabajo ha contado con la financiación de la
FUNDACIÓN MAPFRE a través de sus becas de
investigación.
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