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Página 1 de 35 TRABAJO FIN DE GRADO: ESTUDIO DE LA FRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS EN FÓRMULAS INFANTILES Carlos Sabater Sánchez Tutores: Dra. Antonia Montilla Dr. Marín Pródanov Página 2 de 35 ABSTRACT Human milk oligosaccharides have shown to have a wide range of biological activities including their prebiotic effect. Since breastfeeding is not always possible, infant formulae are supplemented with prebiotic oligosaccharides. Numerous studies point out the benefits of mixtures of galacto- oligosaccharides (GOS) and fructo-oligosaccharides, (FOS) ratio 9/1 to exert similar effects to breastfeed on children Nowadays, a great number of infant formula with prebiotics are disposal in market, however not data have been reported on their composition. Therefore, the determination of mono-, di- and oligosaccharide content of different commercial infant formulas, special infant formula and dairy drinks has been carried out. Initially a precipitation with Carrez as clarifying agent was selected for sample pre-treatment and two complementary chromatographic methods have been applied (GC-FID and HPLC-RID) for the separation and quantification of carbohydrates, showing their advantages, disadvantages and applications. According to the results obtained, GC- FID is a more adequate technique which allows a better qualitative and quantitative determination of carbohydrates of polymerization degree up to 7. Nevertheless, the GC-FID profiles allowed the identification of the specific GOS and FOS commercial mixture that was added during the formulas elaboration. For HPLC analysis, four ratio acetonitrile/water as mobile phase were tested, being 55:45 the best option. HPLC-RID analysis allowed the detection of polymers formed by 16 monomers. However, the individual quantification of single compounds was not possible.. The utilization of both techniques allows an overall characterization of the carbohydrate fraction, including prebiotic oligosaccharides in commercial infant formulae. Página 3 de 35 ÍNDICE Página 1. INTRODUCCIÓN 1.1. La lactancia materna y las fórmulas infantiles 4 1.2. La leche materna 4 1.2.1. Composición de la leche materna 4 1.2.2. La flora intestinal en relación con la leche materna 5 1.3. Las fórmulas infantiles 6 1.3.1. Leche materna y fórmulas infantiles: Diferencias en la flora intestinal 6 1.3.2. Fórmulas infantiles: marco legal 6 1.3.3. Fórmulas infantiles con la fracción de carbohidratos modificada 7 1.3.3.1. Las fórmulas especiales: concepto y finalidad 8 1.3.3.2. Fórmulas infantiles enriquecidas en prebióticos 8 1.4. Los compuestos prebióticos 9 1.4.1. Los fructo-oligosacáridos (FOS) 9 1.4.2. Los galacto-oligosacáridos (GOS) 9 1.4.3. Mezclas de prebióticos comerciales 11 1.4.4. Fuentes alternativas de prebióticos 11 1.4.5. Regulación del uso de prebióticos en fórmulas infantiles 12 1.5. Análisis de la fracción de carbohidratos de Fórmulas Infantiles 12 1.5.1. Cromatografía en fase Líquida de Alta Eficacia (HPLC) 12 1.5.2. Cromatografía en fase Gaseosa (GC) 13 1.5.2.1. Reacciones que tienen lugar durante la derivatización 13 2. OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO 14 3. MATERIALES Y MÉTODOS 15 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 20 5. CONCLUSIONES 33 6. BIBLIOGRAFÍA 33 Página 4 de 35 1. INTRODUCCIÓN 1.1. La lactancia materna y las fórmulas infantiles De acuerdo con la Organización Mundial de la Salud (OMS) la leche materna constituye el alimento más adecuado para los recién nacidos sanos a término, ya que aporta todos los nutrientes necesarios durante el primer semestre de vida, a excepción de algunos micronutrientes como el hierro en caso de bajo peso al nacer [1]. Además, se aconseja la lactancia materna complementada con otros alimentos hasta los 2 años de vida. Por otro lado, conlleva una mejor regulación metabólica y mayor protección inmunológica, disminuye el riesgo de sensibilidad alérgica y muerte súbita y reduce la incidencia de enfermedades infecciosas y crónicas [2]. A pesar de estas recomendaciones, no siempre es posible la lactancia materna siendo necesario el uso de fórmulas infantiles que la sustituyen total o parcialmente, existiendo en la actualidad una gran demanda de estos productos en el mercado. Su elaboración y contenido en nutrientes deben cumplir una serie de requisitos y adaptarse a la legislación vigente. A medida que se van conociendo las diferentes funciones que la leche humana tiene en el organismo de los recién nacidos se han ido desarrollando ingredientes funcionales encaminados a la obtención de fórmulas infantiles capaces de simularlas. En este sentido, tiene un gran interés el conocimiento de todo el proceso de colonización microbiana [3], poniendo de manifiesto el beneficio potencial derivado de la adición de microorganismos probióticos o de compuestos prebióticos a las fórmulas infantiles [4]. 1.2. La leche materna 1.2.1. Composición de la leche humana Es conocido el hecho de que la leche humana ejerce funciones de gran importancia además de la nutritiva como la contribución al buen desarrollo de la flora intestinal. Posee diversos componentes en capaces de modular el crecimiento de determinados tipos de bacterias. Se ha visto que el efecto bifidogénico de la leche materna es debido al bajo contenido en proteínas y fósforo [5, 6], al alto contenido en nucleótidos, a la presencia de la lactoferrina, (proteína capaz de quelar cationes hierro e inhibir in vitro el crecimiento de algunos microorganismos patógenos [7]) y, especialmente a la elevada concentración de oligosacáridos [8]. Estos últimos se encuentran en cantidades de 8 a 12 g/L, siendo el tercer componente mayoritario en su composición después de la lactosa (60 g/L) y los lípidos (40 g/L). Estas concentraciones son considerablemente mayores en el calostro: de 15 a 23 g/L. En comparación, las leches del resto de mamíferos tienen contenidos en oligosacáridos muy inferiores [9]. Actualmente se conocen casi 200 tipos de oligosacáridos diferentes, de los cuales 80 están caracterizados [10]. Difierenen composición monomérica, tamaño, carga eléctrica y abundancia. Los 5 monosacáridos que los componen (glucosa, galactosa, N-acetil-glucosamina, Página 5 de 35 fucosa y ácido N-acetil-neuramínico o siálico) son capaces de establecer hasta un total de 12 tipos de enlaces glicosídicos α y β. Estos oligosacáridos son producidos por las glándulas mamarias, donde los monosacáridos son unidos a una molécula de lactosa mediante la acción específica de enzimas glicosil-transferasas [10]. También es necesario considerar que, dada su enorme variedad y complejidad estructural, no es posible replicarlos y añadirlos a las fórmulas infantiles [11]. Se ha comprobado que los oligosacáridos de la leche humana son resistentes a la digestión en los primeros tramos del tracto gastrointestinal y sirven como sustrato para el crecimiento de microorganismos en el colon como las bifidobacterias [12]. Hay constancia de que la gran cantidad y diversidad de oligosacáridos que posee la leche humana facilita el desarrollo de una microbiota beneficiosa para el hospedador [3]. La sialización y la fucosilación en los extremos terminales los vuelven inaccesibles a aquellas bacterias intestinales que no poseen las enzimas glicosil-hidrolasas necesarias para cortar los enlaces y utilizar los monosacáridos liberados [12, 13]. Es importante destacar que las bifidobacterias sí son capaces de producir las enzimas fucosidasas y sialidasas que les permiten metabolizar estos compuestos para su crecimiento [3]. Se ha visto en estudios que el metabolismo de determinadas cepas de las especies Bifidobacterium infantis y Bifidobacterium bifidum era diferente en presencia de distintos tipos de oligosacáridos [14]. Además, los oligosacáridos que contienen fucosa y ácido siálico comparten similitudes estructurales con los glicanos del epitelio intestinal, que actúan como receptores de membrana para los microorganismos patógenos [15, 16]. Por ello, algunos patógenos pueden adherirse a esos oligosacáridos evitando su adhesión a la superficie de la mucosa del intestino [12]. 1.2.2. La flora intestinal en relación con la leche materna Como ya se ha comentado, los niños amamantados son menos susceptibles a padecer enfermedades infecciosas. Este hecho podría estar relacionado con la presencia temprana de bifidobacterias y lactobacilos en sus tractos gastrointestinales capaces de inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos mediante la producción de ácidos grasos de cadena corta y ácido láctico. Esto conlleva un descenso del pH en el medio que impide el desarrollo de patógenos [17-19]. Por el contrario, las fórmulas infantiles favorecen el desarrollo de una flora que favorece un pH neutro en el colon. Además, bifidobacterias y lactobacilos compiten con patógenos tanto por la captación de nutrientes como por la adhesión al epitelio intestinal. La microflora también contribuye a la regulación del sistema inmune y la respuesta inflamatoria [20]. Página 6 de 35 1.3. Las fórmulas infantiles 1.3.1. Leche materna y fórmulas infantiles: Diferencias en la flora intestinal El desarrollo de la flora intestinal en los seres humanos es un proceso gradual. Antes del nacimiento el tracto gastrointestinal permanece estéril, pero al cabo de las horas es colonizado por diferentes tipos de bacterias, fundamentalmente coliformes y estreptococos [21] cuyo origen puede ser materno o ambiental [22-24], que consumen de manera progresiva el oxígeno del medio. Los niños nacidos por la vía vaginal desarrollan rápidamente una flora intestinal en la que predominan las bacterias anaerobias, Bifidobacterium, Bacteroides y Clostridium, [25] mientras que los niños nacidos mediante cesárea tardan más tiempo en desarrollar este tipo de flora [22]. Generalmente, en los niños amamantados las especies del género Bifidobacterium se convierten rápidamente en las predominantes [21]. Existen estudios que no encuentran diferencias significativas entre la alimentación con leche materna o fórmulas infantiles [26], aunque la mayoría sugieren que la primera induce el crecimiento de lactobacilos y bifidobacterias [27-29] mientras que una alimentación a base de fórmulas infantiles favorece el desarrollo de una flora rica en enterobacterias y otros microorganismos Gram-negativos [30]. La introducción de alimentos complementarios durante el destete es un punto crítico en este proceso de colonización ya que conduce a un patrón adulto en la composición de la flora al reducirse el número de bacterias como Escherichia coli y Clostridium spp y aumentarse el de cocos anaerobios Gram-positivos y el de bacterias del género Bacteroides [31, 32]. Finalmente, a los 18 meses de vida se considera que la microflora se ha desarrollado completamente [33]. En un estudio relativamente reciente se ha visto que la flora intestinal de un individuo adulto contiene entre 1000 y 1500 especies bacterianas diferentes [34]. Teniendo en cuenta los beneficios que conlleva una flora intestinal rica en bifidobacterias se han desarrollado diferentes estrategias para el control de la colonización bacteriana en aquellos bebés alimentados con fórmulas infantiles, ya sea mediante la administración de probióticos, prebióticos o la combinación de ambos (simbióticos) [4]. 1.3.2. Fórmulas infantiles: marco legal Las fórmulas infantiles han evolucionado mucho a lo largo del tiempo. En la Unión Europea la nomenclatura utilizada es: “fórmula o preparado de inicio” para designar al producto que sustituye la alimentación del lactante hasta los 4-6 meses de vida y “fórmula o preparado de continuación” para los productos de este tipo administrados a partir de esta edad [35]. Por el contrario, el Comité de Nutrición de la Academia Americana de Pediatría no realiza distinción entre ambos términos y habla solamente de “fórmulas infantiles”, Cuando se elaboran utilizando leche de vaca como materia prima a la que se añade una serie de ingredientes también se puede denominar “leche para Página 7 de 35 lactantes” y “leche de continuación”, atendiendo a las edades a las que esté destinado [35], este tipo de productos son los mayoritariamente elaborados. Existen diversos organismos internacionales encargados de elaborar las recomendaciones y normativas que deben cumplir estos productos. El “American Academy of Pediatric Committee on Nutrition” (AAPCON) y el Comité de Nutrición de la ”European Society for Paediatric Gastroenterology, Hepatology and Nutrition” (ESPGHAN) son los dos organismos principales que se ocupan de redactar listados con recomendaciones de carácter orientativo, siendo otras organizaciones como el “Scientific Committee on Food” (SCF) de la Comisión Europea los que dictan la normativa de obligado cumplimiento. Todo ello ha sido elaborado teniendo en cuenta las consideraciones previas realizadas por la Comisión del Codex Alimentarius de la “Food and Agriculture Organization” (FAO), la OMS y la “United Nations International Children´s Emergency Fundation” (UNICEF) [36]. En cuanto al contenido en carbohidratos, la Legislación Europea de 1991 estableció que los únicos permitidos eran la lactosa, maltosa, sacarosa, maltodextrinas y almidón pretostado o gelatinizado. En las leches de continuación la cantidad de sacarosa, fructosa o miel añadida no debía superar el 20% de los hidratos de carbono totales para evitar sabores dulces. Y, en todos los casos, los ingredientes que contenían gluten se excluían de la composición de ambas [37]. Esta legislación ha cambiado y en Europa la adición de compuestos prebióticos a las fórmulas infantiles está regulada según la Directiva 2006/141/CE, que ha sido transpuesta a la legislación española mediante el Real Decreto 867/2008 [38]. El marco legal de estos productos condiciona su comercialización. 1.3.3. Fórmulas infantiles con la fracción de carbohidratos modificada Existe en el mercado un número importantede fórmulas infantiles en la que se ha modificado su composición en carbohidratos. Uno de los compuestos más ampliamente utilizados son las maltodextrinas, que son polímeros de α-glucosa unidos mediante enlaces α-glicosídicos. Se clasifican dentro del grupo de los α-glucanos y su papel en la nutrición humana es, fundamentalmente, servir como sustrato de energía fácilmente asimilable. Además, presentan algunas ventajas respecto a otros α-glucanos como el almidón como su mayor solubilidad en agua, su menor carga osmótica y su rápida digestión en el intestino. No obstante, se ha visto que las también tienen un importante papel fisiológico ya que podrían ayudar a tratar algunos trastornos digestivos como la intolerancia a la lactosa o el reflujo gastroesofágico y prevenir el estreñimiento, el cáncer colorrectal y la diabetes [39]. Página 8 de 35 1.3.3.1. Las fórmulas especiales: concepto y finalidad Las fórmulas especiales son aquellas que han sido diseñadas para el tratamiento nutricional de problemas asociados con la intolerancia y/o alergia a algunos componentes de las fórmulas convencionales que, a su vez, están relacionados con el desarrollo de enfermedades tanto congénitas como adquiridas a lo largo de la infancia [39]. Se caracterizan por estar modificadas en uno o varios de sus principios inmediatos: hidratos de carbono, proteína y grasa. Algunos de los productos incluidos dentro de esta clasificación son las fórmulas sin lactosa y de soja [40]. La intolerancia a la lactosa es debida a un déficit en la producción de la enzima lactasa y entre sus síntomas más frecuentes se encuentran la diarrea, el vómito y los dolores abdominales [39]. La galactosemia es producida por un déficit en la enzima galactosa-1-fosfato uridil transferasa y entre sus síntomas más conocidos destacan la ictericia, hepatomegalia, vómitos, hipoglucemia e incluso convulsiones [41]. En caso de intolerancia a la lactosa pueden utilizarse fórmulas sin lactosa que utilizan como fuente de hidratos de carbono las maltodextrinas u otros polímeros de glucosa cuya digestión depende de otras enzimas diferentes a la lactasa, como la sacarasa-isomaltasa y maltasa- glucoamilasa [39]. Este tipo de fórmulas suele utilizarse de forma transitoria (4 ó 6 semanas) ya que la malabsorción de lactosa más frecuente es debida a una lesión en la mucosa intestinal y pasajera en el tiempo. En un ensayo clínico de 2009 se vio que la alimentación con fórmulas sin lactosa favorecía la remisión de la diarrea de manera significativa, además de reducir la posible alteración de la flora intestinal en comparación con las fórmulas convencionales [42]. El tratamiento de la galactosemia consiste en la eliminación de la galactosa de la dieta, siendo necesario utilizar leches de soja que carecen de lactosa (y por tanto de galactosa) [40]. 1.3.3.2. Fórmulas infantiles enriquecidas en prebióticos Existe otro tipo de fórmulas infantiles cuya fracción de carbohidratos ha sido enriquecida en oligosacáridos prebióticos. Los prebióticos se definieron originalmente como “ingredientes alimentarios no digeribles que estimulan el crecimiento y/o actividad de un número limitado de bacterias en el colon y como consecuencia se produce una mejora en el estado de salud del hospedador” [43]. Como indica su definición un compuesto prebiótico debe ser resistente a la digestión y absorción, alcanzar el intestino grueso y ser fermentado selectivamente por una serie de microorganismos promotores de la salud como las bifidobacterias y los lactobacilos [44]. Existen tres tipos de oligosacáridos no digeribles que cumplen plenamente estos criterios: la inulina y los fructo-oligosacáridos (FOS), los galacto-oligosacáridos (GOS) y la lactulosa [45], aunque hay numerosos oligosacáridos con claras evidencias de ejercer efecto prebiótico [46]. En general, se puede considerar que la adición de prebióticos es una manera más natural de modificar la flora Página 9 de 35 intestinal que la adición de microorganismos probióticos [47]. Muchos de los estudios con prebióticos se han centrado en las bifidobacterias como principales especies de interés aunque, atendiendo a la propia definición de prebiótico, no se especifica el tipo de microorganismos beneficiosos cuyo crecimiento se debe promover [12]. No obstante, los prebióticos pueden ser fermentados por gran variedad de microorganismos. Se sabe que cuando se utilizan fructanos derivados de la inulina aumenta la producción de acetato y butirato, y dado que las bifidobacterias no son grandes productoras de este último compuesto, se pone de manifiesto el crecimiento de otras especies bacterianas [48]. La producción de ácido butírico es muy positiva ya que neutraliza la actividad de algunos compuestos carcinógenos como las nitrosaminas [49]. Además del efecto bifidogénico, se ha sugerido que la utilización de prebióticos podría incrementar la biodisponibilidad de calcio y mejorar la mineralización ósea, incrementar la resistencia a patógenos gastrointestinales, modular la respuesta inmune y alérgica, mejorar la función intestinal, reducir el colesterol y el riesgo a padecer cáncer de colon [44]. En Europa y Estados Unidos los principales prebióticos añadidos a los alimentos son los fructanos, (inulina y FOS), y los GOS. En Japón también se utilizan compuestos como los isomaltooligosacáridos, α-galactósidos, gentioligosacáridos y xilooligosacáridos [50]. 1.4. Los compuestos prebióticos 1.4.1. Los fructo-oligosacáridos (FOS) Tradicionalmente la investigación en el campo de los prebióticos se ha centrado, en buena parte, en la inulina [51]. Los FOS son polímeros lineales que se producen mediante la transfructosilación de la sacarosa mediada por enzimas β-fructosidasas e invertasas, [52]. Estos compuestos carecen de extremo reductor y contienen un residuo de glucosa y dos o más de fructosa [53]. Los FOS también se obtienen por hidrólisis enzimática de la inulina, presente en numerosos vegetales, y están compuestos mayoritariamente por moléculas de fructosa unidas por enlace β(2→1). Hay numerosos estudios en humanos sobre diversos efectos fisiológicos beneficiosos, como efecto prebiótico, mejora de la absorción de minerales, disminución del nivel de colesterol y triglicéridos en sangre [8] [54]. 1.4.2. Los galacto-oligosacáridos (GOS) Recientemente, se ha prestado un mayor interés en los GOS a la hora de elaborar fórmulas alimentarias enriquecidas en compuestos prebióticos. Los GOS son polímeros que se sintetizan a partir de la lactosa utilizando enzimas β-galactosidasas, que hidrolizan una molécula de lactosa para transferir la galactosa a otra molécula de lactosa en una reacción de transgalactosilación. Se obtienen mezclas complejas, difíciles de caracterizar [55], en las que están presentes los enlaces Página 10 de 35 β(1→2), β(1→3), β(1→4) y β(1→6) y los grados de polimerización (GP) están comprendidos entre 2 y 8, aunque en estudios recientes se han detectado GOS con GP 15 [56]. Una característica importante de estos compuestos es que las estructuras formadas dependen de la fuente de la que se obtiene la enzima [55]. En general, las distintas β-galactosidasas favorecen un tipo particular de enlaces, así el enzima de Bacillus circulans favorece el enlace β(1→4), el de B. infantis β(1→3) y Kluyveromyces lactis y Aspergillus oryzae enlaces β(1→6) [12]. Este hecho permite sintetizar mezclas de GOS con distintas propiedades fermentativas y así potenciar la selectividad que se exige a los prebióticos [12]. Los GOS están presentes, aunque en muy pequeñas cantidades, de manera natural en la leche humana, por lo que han sido considerados como GRAS (Generally Regarded As Safe) en EEUU y FOSHU (Food For Special Health Use) en Japón [57]. Los GOS han mostrado ser unos componentes muy interesantes para su adición a fórmulas infantiles [21, 58] al poder ser metabolizadosselectivamente por distintas especies de bifidobacterias [3]. En estudios previos in vitro se han apreciado diferencias en el efecto bifidogénico dependiendo del preparado comercial de GOS. Utilizando un simulador gastrointestinal los preparados Vivinal® y Bimuno® ejercían su efecto en diferentes regiones del colon [59, 60]. Ambos, al ser suministrados a individuos voluntarios producían un incremento significativo de las bifidobacterias en comparación con un placebo de maltodextrinas [61]. En una revisión reciente de 2014 se han recopilado los efectos in vivo de diferentes mezclas de GOS comerciales como el Vivinal, Bimuno, Purimuno y mezclas de GOS con otros compuestos como FOS, apreciándose diferencias entre ellos, aunque, en general, todos ejercían efecto prebiótico [62]. En otros estudios se ha visto que los GOS mejoran la absorción de minerales [63] y estimulan el sistema inmune, aunque no se ha podido determinar su impacto en la susceptibilidad a padecer enfermedades atópicas [64]. También disminuyen la incidencia de la diarrea del viajero [65] y mejoran los síntomas del síndrome del colon irritable [66]. A la vista de su potencial interés para la salud humana se ha registrado un gran número de patentes fruto de la investigación en este campo. Se ha consultado la base de datos online de la Oficina de Patentes Europea (EPO) [67] utilizando como criterio de búsqueda la palabra clave “galactooligosaccharide” y, tras comprobar la existencia de un número importante de patentes recientes, se han clasificado en función de su diferente finalidad como muestra la Figura 1. Destacan aquellas relacionadas con la obtención de GOS (que suponen un 29% del total), la elaboración de fórmulas alimentarias (siendo un 22%) y la mejora en el estado de salud (19%). Cabe señalar que solamente dos de las patentes encontradas hacen referencia a una separación cromatográfica para la purificación de estos compuestos y una indica expresamente el uso de lactosuero como fuente de estos compuestos. Página 11 de 35 Figura 1. Clasificación de un total de 187 patentes registradas en la Oficina de Patentes Europea (EPO) relativas a GOS en función de sus diferentes usos (última vez accedido 30 enero de 2014). En la elaboración de fórmulas alimentarias se han distinguido aquellas que contienen solamente GOS añadidos, las que contienen GOS junto a otros componentes como FOS, y las fórmulas alimentarias en las que se declara explícitamente una contribución a la mejora de la salud intestinal. A su vez los métodos de obtención de GOS se han dividido en métodos fermentativos utilizando microorganismos vivos, uso de enzimas aisladas y aislamiento y purificación por métodos instrumentales. 1.4.3. Mezclas de prebióticos comerciales Como ya se ha comentado, los GOS y los FOS son estructuras más simples que los oligosacáridos presentes en la leche humana y sus características funcionales se complementan. Una de las mezclas más estudiada está compuesta por GOS y FOS en una proporción 9:1, y ha demostrado incrementar el número de bifidobacterias en las heces de los bebés y reducir la incidencia de patógenos [68], así como reducir la consistencia de las heces y el tiempo de tránsito intestinal [69]. También se ha demostrado que los efectos de esta mezcla son mayores cuanto menor sea el tiempo de vida del bebé [70]. Algunos de los preparados comerciales más conocidos son el Vivinal® y la Raftilosa®, los cuales han demostrado estimular el crecimiento de bifidobacterias y lactobacilos [71]. 1.4.4. Fuentes alternativas de prebióticos Una fuente alternativa a partir de la cual obtener oligosacáridos con actividad biológica potencial, son los subproductos de la industria láctea. El permeado obtenido del suero de quesería es de especial interés dadas las enormes cantidades en que se genera y permitiría obtener oligosacáridos que se parecen más a los de la leche humana. Se ha sugerido que su producción a gran escala podría Prevención/tratamiento de enfermedades 8% Mejora de una función corporal 2% Uso específico como prebiótico 9% Mejora de la acción de otro prebiótico 1% Fórmulas alimentarias para mejora de salud intestinal (GOS + Otros) 12% Fórmulas alimentarias en general (GOS + Otros) 7% Fórmulas alimentarias (sólo GOS) 3% Fórmulas alimentarias (GOS obtenidos a partir de lactosuero) 1% Métodos instrumentales de purificación de GOS 2% Métodos de obtención de GOS a partir de lactosuero 2% Métodos de obtención de GOS mediante fermentación 16% Métodos de obtención de GOS cone enzimas aisladas 11% Aditivo en medios de cultivo 1% Aditivo en fórmulas alimentarias 6% Aditivo para la mejora de propiedades tecnológicas 3% Reducción de patógenos en animales 1% Aditivo en piensos 7% Cosmética 2% Otros 8% Patentes de la EPO relativas a GOS Página 12 de 35 realizarse empleando tecnologías de membrana [72]. Numerosas líneas de investigación están dedicadas a mejorar los prebióticos actuales, siendo la búsqueda de fuentes alternativas uno de los puntos clave [12]. Los oligosacáridos presentes en la leche de animales domésticos tienen estructuras menos complejas, con menos isómeros y menor proporción de fucosa y ácido siálico que los de la leche humana [73]. Estas diferencias y similitudes deben ser tenidas en cuenta a la hora de desarrollar productos destinados a mimetizar a la leche humana. 1.4.5. Regulación del uso de prebióticos en fórmulas infantiles El SCF de la Comisión Europea declaró que la adición de una mezcla de GOS/FOS en una proporción 9/1 y a una concentración de 0,8 g/100 ml a las fórmulas infantiles no implicaba riesgos graves y destacó las limitaciones de los ensayos clínicos realizados hasta la fecha [74]. Por otro lado, en una revisión realizada por el Comité de Nutrición de la ESPGHAN se llegó a la conclusión de que los datos publicados en cuanto a actividad prebiótica son limitados y no se puede recomendar de manera su uso generalizado con fines preventivos o terapéuticos [4]. En general, las distintas revisiones concluyen que son necesarios más ensayos clínicos correctamente diseñados [75]. También se debe estandarizar las cantidades suplementadas [64]. A pesar de ello, la constancia de su seguridad y la presencia de compuestos similares en la leche materna (GOS) y en vegetales (FOS) avalan la tendencia actual a incluirlos en las fórmulas infantiles [76]. 1.5. Análisis de la fracción de carbohidratos de Fórmulas Infantiles Aunque la variedad y complejidad estructural de los carbohidratos que se encuentran en las fórmulas infantiles es mucho menor que la de los oligosacáridos de leche humana se requieren técnicas de alto poder de resolución para su análisis, como son las técnicas cromatográficas. 1.5.1. Cromatografía en fase Líquida de Alta Eficacia (HPLC) La cromatografía en fase líquida de alta eficacia (HPLC) con detector de índice de refracción (RID) es una de las técnicas más utilizadas para la determinación cuantitativa de carbohidratos en alimentos. Sus principales ventajas son la sencillez y rapidez de la preparación de muestras y la suficiente resolución para analizar los azúcares más comunes. Como inconveniente cabe destacar que los materiales de la fase estacionaria que se utilizan (grupos amino ligados y de intercambio iónico) pueden reaccionar con compuestos de la matriz alimentaria y reducir su vida útil. También la sensibilidad y selectividad en la detección es baja y por ello, si el carbohidrato de interés se encuentra en pequeña cantidad, es posible que no sea determinado [77] [78]. Página 13 de 35 1.5.2. Cromatografía en fase Gaseosa (GC) La cromatografía en fase gaseosa con detector de ionización de llama (GC-FID) ofrece grandes ventajas en cuanto a resolución, sensibilidad y selectividad, pero su principal inconvenienteradica en la necesidad de transformar los analitos en sus derivados volátiles antes de su separación cromatográfica [79]. No obstante, esta técnica está limitada al análisis de azúcares de baja masa molecular principalmente, mono di y trisacáridos, aunque si se forman los derivados apropiados y se utilizan fases estacionarias que soportan altas temperaturas pueden detectarse carbohidratos de un GP de hasta 12 [80]. El tiempo necesario para preparar los derivados volátiles es un inconveniente aunque, en ocasiones, la extracción y purificación previos necesarios para las determinaciones por HPLC pueden ser igual de laboriosas que la preparación de muestra en GC [81]. La mayor venya de la GC con columnas capilares es su gran resolución, sensibilidad y selectividad, necesarias cuando se quieren estudiar muestras complejas de carbohidratos [82, 83]. 1.5.2.1.Reacciones que tienen lugar durante la derivatización El análisis por GC requiere una preparación para formar derivados volátiles [80, 84]. Los carbohidratos se caracterizan por una escasa volatilidad y elevada reactividad química [85]. Esto facilita reacciones de sustitución de los grupos polares por otros apolares más volátiles (derivatización) [80]. El alto número de grupos funcionales presentes en los azúcares y la presencia de formas tautoméricas pueden dar lugar a cromatogramas muy complejos. Pora simplificarlos, se lleva a cabo una derivatización en dos etapas, oximación y sililación: La reacción de oximación tiene como finalidad el bloqueo del centro anomérico del azúcar a analizar, por medio de la condensación de un aminoalcohol como la hidroxilamina con un grupo aldehído o cetona. Como resultado de esta reacción, los azúcares reductores forman dos isómeros diferentes (denominados E y Z), que presentan una relación isomérica fija, y que dan lugar a dos picos en el cromatograma, mientras que los azúcares no reductores dan un solo pico. La reacción de sililación tiene como objetivo disminuir la temperatura de vaporización de los azúcares a analizar y en ella que hacen reaccionar los grupos hidroxilo de los azúcares con un agente sililante, sustituyéndose cada hidrógeno de dichos grupos por un grupo metil-silil. Los derivados formados se pueden aplicar tanto a aldosas como cetosas y dan cromatogramas relativamente simples [80]. Sin la reacción de oximación previa el centro anomérico permanecería libre, pudiendo un mismo azúcar generar hasta 5 anómeros diferentes y, por tanto, 5 picos diferentes en el cromatograma. Esto supondría un enorme problema a la hora de analizar muestras complejas como son las fórmulas infantiles. Página 14 de 35 2. OBJETIVO Y PLAN DE TRABAJO Dada la importancia que tienen los carbohidratos prebióticos en la modulación de la microbiota intestinal y la relación que tiene ésta con un gran número de funciones del huésped, así como la falta de datos experimentales en cuanto a la composición cualitativa y cuantitativa en prebióticos de las fórmulas infantiles comercializadas en España, el objetivo de este trabajo se centra fundamentalmente en: “la evaluación cualitativa y cuantitativa de la fracción de carbohidratos presente en fórmulas infantiles que, según el etiquetado, contienen prebióticos y fórmulas con la fracción de carbohidratos modificada, tomando como referencia las fórmulas infantiles clásicas”. Para alcanzar este objetivo, se desarrollará el siguiente plan de trabajo dividido en los siguientes apartados: 1. Caracterización básica de las fórmulas infantiles: pH y extracto seco total. 2. Puesta a punto de los métodos de análisis de carbohidratos. Optimización de las condiciones de extracción de la fracción de carbohidratos, así como las de análisis por cromatografía de gases (GC) y cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC). 3. Cuantificación de la fracción de carbohidratos utilizando dos técnicas cromatográficas complementarias: GC, que permite una mejor separación de los carbohidratos de menor peso molecular. HPLC, que permite cuantificar carbohidratos de mayor grado de polimerización. Este plan de trabajo logró cumplirse satisfactoriamente en el plazo establecido, habiéndose podido obtener datos cuantitativos y cualitativos de todas las muestras estudiadas suficientes como para permitir una caracterización detallada de la fracción de carbohidratos presente así como establecer una comparativa entre las diferentes categorías de productos a fin de sacar conclusiones. No obstante, durante el transcurso de su realización surgieron una serie de dificultades en su mayoría relacionadas con la puesta a punto del método: desde la necesidad de escoger entre diferentes procedimientos de preparación de muestra, con el fin de eliminar compuestos interferentes, a la elección de las condiciones de análisis que, si bien pueden no ser óptimas, sí son apropiadas para alcanzar el principal objetivo de este trabajo. Todas las alternativas consideradas a la hora de realizar este proyecto serán explicadas en detalle en los siguientes apartados así como los motivos que han llevado a su aceptación o su descarte. Página 15 de 35 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Muestras estudiadas En este trabajo se han analizado hasta un total de 28 fórmulas infantiles diferentes disponibles en el mercado, 24 de ellas en forma de leche en polvo. Estas muestras comprenden fórmulas de inicio y continuación convencionales, fórmulas de inicio y continuación con prebióticos añadidos, fórmulas de inicio y continuación sin lactosa y fórmulas de soja, dos fórmulas líquidas (una de ellas con lactosa hidrolizada) y dos complementos lácteos a base de yogur. Todos estos productos han sido clasificados en la Tabla 1 junto a las características más relevantes relacionadas con los carbohidratos que aparecen en la etiqueta. 3.2. Medición del pH Para la medición del pH los productos en polvo fueron previamente reconstituidos al 10% en agua. Las fórmulas líquidas y complementos lácteos se midieron directamente. Se utilizó un pHmetro Metler Toledo, modelo Five Easy Plus, previamente calibrado con dos soluciones estándar de pH 7 y 4. Todo el agua utilizada para preparar soluciones era de calidad ultra—pura (18.2 MΩ cm) y fue producida mediante un sistema Milli-Q Synthesis A10 system de Millipore (Billerica, MA, USA). 3.3. Cálculo del Extracto Seco Total Para la determinación del Extracto Seco Total (EST) se pesaron aproximadamente 100 mg de muestra en el caso de los productos sólidos y de 150 a 300 mg para los productos líquidos o semilíquidos, en viales previamente desecados. En el caso de las muestras líquidas fue necesario pesar una cantidad mayor para asegurar un mínimo valor de extracto seco, ya que si la cantidad de muestra seca obtenida fuese excesivamente baja (inferior a 15 mg) el resultado podría no ser significativo. Los viales con las muestras se introdujeron en una estufa a una temperatura de 102 ⁰C durante un periodo de tiempo mínimo de 48 h hasta peso constante. El EST se determinó por diferencia de pesada Página 16 de 35 Tabla 1. Relación de fórmulas infantiles analizadas, características relacionadas con la fracción de carbohidratos que aparecen en la etiqueta y fecha de consumo preferente (FCP). Abreviaturas utilizadas: Fórmula de Inicio (FI), Fórmulas de Continuación (FC), Fórmulas de Soja (FS), Fórmulas con Lactosa Hidrolizada (LH) y Complementos Lácteos (LC) que se han analizado en este trabajo. Las abreviaturas utilizadas según los carbohidratos adicionados son: mdx, maltodextrinas; preb, compuestos prebióticos, SL, si carece de lactosa. Otras abreviaturas utilizadas: HC (hidratos de carbono), la (lactosa), almd (almidón), GOS (galacto- oligosacáridos), FOS (fructo-oligosacáridos), glu (glucosa), ma (maltosa), fru (fructosa), sac (sacarosa), Bf (Bifidobacterias), Lb (Lactobacilos). Clave HC Lactosa Azúcares Prebióticos MaltodextrinasFibra Inositol (mg/100g) Componentes FCP (g/100g) Fórmulas de inicio y continuación convencionales (n=2) FI_1 57,8 57,8 - - - - 80,0 la 01/03/2015 FC_mdx_1 61,7 - 35,1 - - - - la,mdx 01/03/2015 FC_mdx_2 60,0 - 47,7 - 12,3 0,5 - la,almd,mdx,Bf 01/06/2015 FC_mdx_3 55,6 - 25,6 - - - 9,9 la,mdx 22/02/2016 FC_mdx_Lq_4 7,3 3,1 - - 4,3 - 3,3 la,mdx,Lb 14/04/2014 Fórmulas de inicio y continuación disponibles en el mercado con prebióticos (n=16) FC_mdx,preb_1 59,3 41,9 44,9 3,8 - - 24,7 la,mdx,GOS/FOS 25/07/2014 FC_mdx,preb_2 59,3 41,9 44,9 3,8 - - 24,7 la,mdx,GOS/FOS 07/07/2014 FC_mdx,preb_3 59,3 41,9 44,9 3,8 - - 24,7 la,mdx,GOS/FOS 20/06/2014 FI_mdx,preb_1 53,3 - - 5,7 - - 45,0 la,FOS/inulina,mdx 01/05/2015 FC_mdx,preb_4 56,0 - - 3,0 - - 45,0 la,mdx,FOS/inulina,Lb,Bf 01/02/2015 FI_SL,mdx,preb_1 50,8 SL - 5,7 50,8 - 25,0 mdx,FOS 01/07/2015 FI_mdx,preb_2 - 55,0 1,5 1,5 3,1 51,0 la,GOS,mdx 25/06/2015 FC_mdx,preb_5 62,9 - 41,3 2,2 - - 25,0 la,mdx,GOS 01/08/2014 FI_preb_1 50,1 46,0 46,0 3,5 2,5 - 32,0 la,GOS,glu,ma 19/03/2015 FC_preb_1 59,0 56,5 58,3 3,9 - - 25,0 la,GOS/FOS 14/05/2014 FC_mdx,preb_6 55,7 19,7 23,9 3,8 - - 23,0 mdx/almd,GOS/FOS,la 19/10/2014 FC_mdx,preb_7 53,6 - - 2,9 - 2,0 - mdx,la,GOS/FOS,Lb,Bf 01/11/2014 FI_mdx,preb_3 56,4 - - 1,9 - 1,3 30,0 la,GOS,mdx 01/05/2015 FC_mdx,preb_8 61,7 - - 2,6 - 1,7 26,0 la,mdx,GOS 05/01/2015 FC_mdx,preb_9 55,6 35,6 38,1 2,5 19,4 1,7 24,4 la,mdx,GOS 01/09/2015 FI_mdx,preb_4 50,9 45,3 - 2,8 5,0 1,9 27,2 la,mdx,GOS 03/07/2015 Página 17 de 35 Clave HC Lactosa Azúcares Prebióticos Maltodextrinas Fibra Inositol (mg/100g) Componentes FCP (g/100g) Fórmulas de inicio y continuación sin lactosa (n=2) FI_SL,mdx_1 58,6 SL - - - - 36,0 mdx 01/07/2015 FC_SL,mdx_1 60,8 SL - - 60,8 - 9,9 mdx,Lb 01/03/2015 Fórmulas de soja (n=2) FS_mdx_1 57,6 - - 20,3 36,1 - 47,0 mdx,glu 31/10/2014 FS_mdx_2 55,0 - - - - - 30,0 mdx 14/06/2015 Fórmulas con lactosa hidrolizada (n=1) LH_1 3,2 < 0,01 - - - - 36,0 LH,fru 19/04/2014 Complementos lácteos (n=2) CL_mdx,preb_Lq_1 13,0 5,0 - 0,8 - 1,1 - la,almd,FOS,sac 21/05/2014 CL_mdx_Lq_1 11,0 - 8,5 - - 0,5 - la,sac,almd 01/07/2014 Página 18 de 35 3.4. Preparación de muestra para el análisis cromatográfico. Extracción de la fracción de carbohidratos Se realizaron dos tipos diferentes de precipitaciones durante la preparación de muestra: Precipitación con metanol: Se pesaron 100 mg de una muestra en polvo que fue disuelta en 1 mL de agua y en un matraz aforado se completó hasta 10 mL con metanol. Precipitación con agente clarificante (Carrez): Se pesaron 400 mg de muestras en polvo que fueron reconstituidas en 5 mL de agua mientras que para el resto de fórmulas se diluyeron 3g de producto líquido en 3 mL de agua. Se añadieron 200 µL del reactivo Carrez I [K4Fe(CN)6.3H20 7,2% (m/v)], se agitó y se añadieron 200 µL del reactivo Carrez II [ZnSO4.7H20 14% (m/v)]. Una vez se enrasaron las muestras a 10 mL, se dejó precipitar durante un total de 30 minutos y se centrifugó durante 3 minutos a 10.000 revoluciones por minuto (rpm). Cada muestra fue preparada por duplicado. 3.5. Análisis de carbohidratos por GC Se tomaron 500 µL del sobrenadante resultante de la precipitación con metanol ó 150 µL del sobrenadante resultante de la precipitación con Carrez y se llevaron a un matraz de corazón junto a 200 µL de β-fenilglucósido, utilizado como patrón interno (PI), preparado a una concentración de 0,5 mg/mL. Se llevó a sequedad en un rotavapor a 40 ºC y posteriormente se derivatizó en dos etapas: 1. Adición de 250 µL de cloruro de hidroxilamina al 2,5% en piridina seguido de dos etapas de 15 min de incubación en estufa a 70 ⁰C. 2. Adición de 250 µL de hexametildisilaxano (HMDS) y 25 µL de ácido trifluoroacético seguidos de un periodo de incubación en estufa a 50 ⁰C. Estas etapas se realizaron con pasos de agitación intensa para garantizar una correcta formación de los derivados. Una vez se formaron los derivados se centrifugó la muestra a 10.000 rpm durante 2 minutos y se recogió el sobrenadante en un vial para ser inyectado en el cromatógrafo. El análisis se llevó a cabo utilizando un cromatógrafo Agilent Technologies 7890A gas chromatograph (Agilent Technologies, Wilmington, DE, EEUU) equipado con un detector de ionización de llama (FID) y empleando nitrógeno como gas portador a un flujo de 1 mL/min. Se utilizó una columna capilar SGE HT5 Aluminum Clad Fused Silica Capillary Column de dimensiones 12 m x 0,32 mm x 0,10 µm (North Harrison Road, Bellefonte, EEUU). La temperatura del inyector fue de 280 °C y la del detector 385 °C. La temperatura inicial de análisis fue 150 ºC y Página 19 de 35 la final 380 ºC con una rampa de temperatura de 3 ºC/min. La adquisición y el tratamiento de los datos se llevaron a cabo utilizando el software Agilent ChemStation (Wilmington, DE, EEUU). Para la cuantificación de los carbohidratos presentes en las muestras se prepararon patrones de Galactosa (Ga), Glucosa (Glu), myo-inositol (Myo), lactosa (La), kestosa (Kes) y nistosa (Nis) en un rango de concentraciones de 2,5 a 0,004 mg/mL. Todos ellos fueron obtenidos de la casa comercial Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EEUU). Se calcularon los factores de respuesta (FR) frente al P.I. β-fenilglucósido. Las desviaciones estándar relativas de los FR calculados no superaron el 10 %. Para los azúcares de GP superior a 4 se utilizó el factor de respuesta de la nistosa. 3.6. Análisis de carbohidratos por HPLC Para este análisis la preparación posterior de la muestra fue una simple dilución y filtración [84]. Se tomaron 0,7 mL del sobrenadante obtenido en el paso anterior y se mezclaron con otros 0,7 mL de acetonitrilo. Se dejó reposar durante toda la noche y al día siguiente se filtró con filtros de PVDF de 0,22 µm de tamaño de poro, eliminando así una posible precipitación de la muestra [84]. El análisis de los carbohidratos se llevó a cabo en un equipo de HPLC-RID Agilent Technologies 1220 Infinity LC System – 1260 RID (Boeblingen, Alemania) utilizando una columna Kromasil 100-5NH2 de dimensiones 25 cm x 4,6 mm x 5 µm. (Akzo Nobel, Brewster,NY, EEUU), a 30 ⁰C. Como parte de la puesta a punto del equipo se ensayaron como fase móvil diferentes proporciones de acetonitrilo/agua: 70:30; 60:40; 55:45; 50:50. La adquisición y el procesamiento de datos se llevaron a cabo utilizando el software Agilent ChemStation (Agilent Technologies, Boeblingen, Alemania). Para la cuantificación se prepararon patrones de Fructosa (Fru), Galactosa (Ga), Lactosa (La), Kestosa (Kes) y Nistosa (Nis) (Sigma-Aldrich) en un rango de concentraciones comprendido entre 5,0 y 0,05 mg/mL para el análisis por HPLC. Los valores de R 2 obtenidos para las distintas rectas de calibrado fueron superiores a 0,999. 3.7. Preparación de muestra tipo y patrones comunes a ambas técnicas Además, con fines identificativos, se prepararon otros patrones de lactulosa (Lu), maltosa (Ma), maltulosa (Mu) y maltodextrinas (Mdx) (GP 2-5), (Sigma-Aldrich), y como muestras tipo Raftilosa ® (RFT), FOS ® , Vivinal ® (Vi) y lactosa tratada con enzima β-galactosidasa de Kluyveromyces lactis (Lactozym, Novozyme). Página 20 de 35 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Caracterización de las muestras 4.1.1. Medida de pH Los valores de pH obtenidos para cada una de las fórmulas se muestran en la Tabla 2. Como se puede observar la gran mayoría de ellos se halla cercano a la neutralidad con unos valores comprendidos entre 6,5 y 7,5 tal y como cabría esperar de un producto infantil cuya base es, en numerosos casos, la leche de vaca. Los valores más bajos se encuentran en los dos complementos lácteos analizados ya que ambos productos tienen como base una leche fermentada. Ambos productos han sido pasteurizados después de la fermentación, posiblemente para permitir su conservación a temperatura ambiente,ampliando así el mercado al que va destinado. Este hecho podría explicar en parte que su pH, aun adaptándose a la legislación (según la cual el valor de pH de los yogures deben ser igual o inferior 4,6 [86]) sea ligeramente inferior al que cabría esperar en un yogur convencional. En un yogur común los valores de pH continúan disminuyendo aún más durante el almacenamiento como consecuencia de la acción de las bacterias lácticas que permanecen viables, y que por el contrario son eliminadas durante la pasteurización de estos productos. Este resultado sugiere que puede haberse alargado la etapa fermentativa disminuyendo el pH por debajo de 4,6 para contrarrestar el no poder seguir descendiendo durante el almacenamiento. 4.1.2. Cálculo del Extracto Seco Total (EST) Los valores de Extracto Seco Total (EST) obtenidos para cada una de las muestras analizadas se recogen en la Tabla 2 junto a los valores de pH. Las fórmulas en polvo presentan unos valores de EST comprendidos entre 94 y 98% y las muestras líquidas y semilíquidas tienen unos valores claramente inferiores, de 7,4 a 19%. En el caso de las fórmulas infantiles en polvo era de esperar valores de EST (cercano al 95%), ya que la legislación establece un contenido de agua igual o inferior al 5% para las leches totalmente deshidratadas [87], como consecuencia de haber sido procesadas exclusivamente para este fin: eliminar la máxima cantidad de agua y así aumentar su vida útil y reducir los costes de transporte y almacenamiento. Igualmente los yogures, presentan valores esperables, entre el 18 y 20% ya que se elaboran con leche enriquecida, normalmente con leche en polvo, para facilitar que se forme un gel consistente o en el caso de yogures batidos que tengan una consistencia cremosa. La fórmula infantil líquida tiene el EST equivalente a una leche normal y únicamente el resultado que no concuerda totalmente con lo esperado corresponde a la muestra del producto líquido con lactosa hidrolizada, que presenta un valor excesivamente bajo, 7,4%. Este dato posiblemente se deba a que, según se especifica en la etiqueta parte de la lactosa es hidrolizada enzimáticamente y parte retirada, Página 21 de 35 lo cual lleva a una disminución del EST. Contrastando esta información con la etiqueta del producto, y sumando las cantidades de los componentes mayoritarios (hidratos de carbono, grasa y proteínas) se esperaría un valor mínimo del 8,5%. Tabla 2. Caracterización básica de los 28 productos analizados: valores de Extracto Seco Total (EST) y pH. Clave EST pH (disol 10%) FI_1 a 95,41 ± 0,51 b 6,74 FC_mdx_1 99,16 ± 0,03 6,93 FC_mdx_2 96,12 ± 0,00 6,83 FC_mdx_3 98,28 ± 0,03 6,70 FC_mdx_Lq_4 12,21 ± 0,34 7,21 FC_mdx,preb_1 98,47 ± 0,13 7,12 FC_mdx,preb_2 94,96 ± 0,53 6,80 FC_mdx,preb_3 95,63 ± 0,19 6,68 FI_mdx,preb_1 96,81 ± 0,02 6,89 FC_mdx,preb_4 96,55 ± 0,23 6,80 FI_SL,mdx,preb_1 97,73 ± 0,43 6,96 FI_mdx,preb_2 97,82 ± 0,20 7,22 FC_mdx,preb_5 96,47 ± 0,21 7,00 FI_preb_1 98,00 ± 0,07 7,04 FC_preb_1 96,54 ± 0,17 6,91 FC_mdx,preb_6 98,35 ± 0,22 6,99 FC_mdx,preb_7 97,47 ± 0,75 7,23 FI_mdx,preb_3 98,52 ± 0,41 6,92 FC_mdx,preb_8 94,54 ± 0,59 6,83 FC_mdx,preb_9 96,65 ± 0,38 7,13 FI_mdx,preb_4 96,60 ± 0,40 7,16 FI_SL,mdx_1 96,84 ± 0,04 6,67 FC_SL,mdx_1 97,89 ± 0,17 6,74 FS_mdx_1 98,94 ± 0,02 7,12 FS_mdx_2 97,27 ± 0,13 6,83 LH_1 7,44 ± 0,01 6,83 CL_mdx,preb_Lq_1 19,64 ± 0,04 4,41 CL_mdx_Lq_1 18,10 ± 0,43 4,18 aLas claves de cada muestra han sido asignadas conforme a los criterios de la Tabla 1. bCada muestra fue preparada por duplicado (media ± desviación estándar). 4.2. Precipitación de la muestras Una parte muy importante a la hora de analizar los carbohidratos de un alimento es la extracción de los mismos que debe ser completa y lo más selectiva posible, para evitar interferencias en el posterior análisis. De los dos tipos diferentes de precipitación ensayados, la precipitación mediante los reactivos de Carrez resultó ser la más adecuada ya que el cromatograma obtenido en GC al tratar la muestra con metanol presentaba un gran número de picos no identificados que correspondían a Página 22 de 35 otros compuestos diferentes a los carbohidratos y que, por tanto, interferían con los analitos de interés. Estas interferencias podrían ser debidas a ácidos grasos libres que no son precipitados con el metanol y sí con los reactivos de Carrez. La adición de ácidos grasos de cadena larga es frecuente en productos como fórmulas infantiles ya que contribuyen a un correcto desarrollo del recién nacido [88] y, comprobando con el etiquetado, se observa que varias de las muestras contienen ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga como el DHA. Por el contrario, tal y como se muestra en la Figura 3, el cromatograma obtenido con los reactivos de Carrez se hallaba libre de estas impurezas y permitía una mejor identificación y cuantificación de los hidratos de carbono. Figura 3. Comparación de los dos cromatogramas obtenidos en GC según la preparación de muestra: precipitación con metanol (rojo) y precipitación con los reactivos de Carrez (azul). 4.3. Caracterización de la Fracción de Carbohidratos por GC Los resultados de la caracterización de la fracción de carbohidratos presente en cada una de las fórmulas infantiles se recogen en la Tabla 3. El máximo grado de polimerización (GP) que se ha podido detectar en las muestras con esta técnica es 7. Hay que considerar que la respuesta va disminuyendo al aumentar el GP por lo que aunque haya carbohidratos mayores pueden no ser detectados. La lactosa es el carbohidrato mayoritario en la mayoría de las muestras a excepción de, lógicamente, las fórmulas sin lactosa (SL), las fórmulas de soja (FS) y la fórmula con lactosa hidrolizada (LH). Los mayores valores de lactosa se encuentran en la fórmula infantil convencional FI_1, aproximadamente 730 mg/g EST en cuyo etiquetado se indica un contenido prácticamente exclusivo de este azúcar, concordando con los resultados obtenidos analíticamente. En el resto de min10 20 30 40 50 60 70 80 pA 20 40 60 80 100 120 FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\106F0901.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\102F0201.D) min35 37.5 40 42.5 45 47.5 50 52.5 55 57.5 pA 16 18 20 22 24 26 FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\106F0901.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\140214 MUESTRAS Y CARREZ CARLOS 2014-02-14 14-19-58\102F0201.D) tiempo (min) tiempo (min) Página 23 de 35 fórmulas en polvo los valores de lactosa oscilan entre 200 y 500 mg/g EST, indicando una importante variabilidad según el producto, y en los complementos lácteos su contenido es notablemente inferior (100-160 mg/g EST) debido a que este azúcar ha sido metabolizado por las bacterias lácticas. En el producto con lactosa hidrolizada este disacárido ha dado lugar a un elevado contenido en los dos monosacáridos que lo componen: glucosa y galactosa, obteniéndose unos valores de 62 y 57 mg/g EST respectivamente, muy por encima del resto de muestras aunque estos valores ponen de manifiesto que gran cantidad de lactosa ha sido retirada. Por otra parte el menor contenido en galactosa indica que ese monosacárido podría estar formando parte de otros compuestos como los GOS. Los contenidos de glucosa en el resto de muestras oscilan entre 2 y 40 mg/g EST y los de galactosa en torno a 0,1 y 2 mg/g EST, salvo el complemento lácteo CL_mdx_Lq_1, con un contenido de 45 mg/g EST, probablemente debido a que la galactosa debe ser más difícil de metabolizar por las bacterias lácticas que la glucosa. En cuanto a la fructosa, que a diferencia de los otros azúcares mencionados no se encuentra de manera natural en la leche y por tanto ha sido añadida durantela elaboración, se encontró en todas las muestras pero generalmente permanece a bajas concentraciones (inferiores a 1 mg/g EST), destacando el producto líquido con lactosa hidrolizada donde se ha añadido en mayor cantidad (11 mg/g EST) y el complemento lácteo CL_mdx_2. El polialcohol myo-inositol también se encuentra presente de forma natural en la leche de vaca (0,1- 0,3mg/g EST), aunque su contenido es mayor en la leche humana (0.5-4 mg/g EST, [89]), siendo frecuente su enriquecimiento en esta clase de productos infantiles, ya que se ha visto que ayuda al desarrollo del bebé. Los mayores valores se encontraron en el producto de yogur CL_mdx_1 (1,5 mg/g EST) y en la fórmula infantil control FI_1 (1,3 mg/g EST) a la que según la etiqueta le ha adicionado 0,8 mg/g de myo-inositol mientras que en la mayoría de leches en polvo sus valores oscilan entre 0,3 y 0,6 mg/g EST. En cuanto a los disacáridos distintos a la lactosa, la sacarosa permanece a bajas concentraciones (inferiores a 1 mg/g EST en muchos casos) con dos notables excepciones: en los dos complementos lácteos su contenido es muy elevado (150 y 330 mg/g EST), al tratarse de productos azucarados, superior al de las muestras que contienen FOS (con valores comprendidos entre 1,3 y 2 mg/g EST), apreciándose un ligero incremento en aquellas en que se especifica la presencia de inulina. Como consecuencia del tratamiento térmico de estos productos se forma lactulosa por isomerización de la lactosa y maltulosa a partir de la maltosa, ambos disacáridos se han utilizado como indicadores del tratamiento térmico [90]. Como se observa la lactulosa, se encuentra a bajas concentraciones (iguales o inferiores a 1 mg/g EST), destacando su bajo contenido en el Página 24 de 35 complemento lácteo CL_mdx,preb_1 (inferior a 0,1mg/g EST) que corresponde a un yogur líquido, aunque la cuantificación es aproximada ya que el método analítico no es el óptimo [91]. La maltulosa se ha podido determinar en algunas fórmulas (FC_mdx_4 FI_SL, FI_SL_mdx_1, FC_SL-mdx_1, CL_mdx-preb_1, FS_mdx_2, FS_ mdx_3) y sus cantidades oscilan entre 0,5 y 2,5 mg/g EST, encontrándose estos valores dentro del rango de los obtenidos por Morales y col. (0,1-8,4 mg/g producto) en fórmulas infantiles convencionales [90]. Analizando los compuestos de mayor peso molecular, los contenidos en maltodextrinas fueron variables pudiéndose encontrar en concentraciones de 210 mg/g EST en la fórmula convencional FC_mdx_3. No obstante, los mayores valores se encontraron en las fórmulas de soja donde estos compuestos aparecen en concentraciones de hasta 360 mg/g EST (FS_mdx_2). También se apreció que el GP predominante en las fórmulas de soja es 5 mientras que es variable en el resto de productos, siendo los grados 5 y 6 los predominantes en la mayoría de casos. Pero se debe tener presente que con esta técnica no es posible determinar maltodextrinas con GP superior a 6. Entre las muestras enriquecidas con GOS es interesante observar que en su mayoría (FI_preb_1, FC_preb_1, FC_mdx,preb_1, FC_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_3, FI_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_5, FC_mdx,preb_6, FC_mdx,preb_7, FI_mdx,preb_3, FC_mdx,preb_8, FC_mdx,preb_9, FI_mdx,preb_4), según el perfil cromatográfico, estaban enriquecidas con Vivinal® o un producto similar, cuyo compuesto mayoritario es el trisacárido 4’galactosil-lactosa. Este tipo de GOS se puede obtener gracias a la β-galactosidasa de Bacillus circulans [92]. Sin embargo, sólo se pudieron cuantificar en 2 muestras (FI_preb_1 y FC_preb_1 con valores en torno a 32 y 40 mg/g EST). Solamente en dos de las muestras, el preparado con lactosa hidrolizada (LH_1) y el complemento lácteo (CL_mdx,preb_1) que contienen GOS se encontró un perfil similar al de la muestra de referencia de lactosa transgalactosilada con β-galactosidasa de K. lactis, en el que predominan los derivados de lactosa con enlace β(1→6), allolactosa, 6-galactobiosa y 6’galactosil-lactosa, deduciéndose la procedencia del enzima utilizada en el producto hidrolizado. Según los datos de lactosa de este producto (0,1 mg/g EST, ó 7.5 mg/L de producto) podemos observar, en comparación con los obtenidos por Ruiz-Matute y col. [93], para preparados lácteos sin lactosa, que la hidrólisis está muy avanzada y por tanto gran cantidad de GOS han sido hidrolizados presentando contenidos muy inferiores (2,7 mg/g EST ó 201 mg/L de producto) al valor mínimo determinado por dichos autores (602 mg/L). Este hecho pone de manifiesto la importancia de controlar el proceso de hidrólisis durante la elaboración de estos productos bajos en lactosa ya que de lo contrario se originaría una enorme pérdida de compuestos con carácter prebiótico como ocurre en la muestra analizada en este estudio cuyo contenido en GOS es inferior a 0,5 mg/g EST. Página 25 de 35 Cabe destacar que en aquellas fórmulas que contienen tanto GOS como Maltodextrinas añadidas (FC_mdx,preb_1, FC_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_3, FI_mdx,preb_2, FC_mdx,preb_5, FC_mdx,preb_6, FC_mdx,preb_7, FI_mdx,preb_3, FC_mdx,preb_8, FC_mdx,preb_9, FI_mdx,preb_4) y en los complementos lácteos, no se pudieron diferenciar los perfiles correspondientes a cada uno de los compuestos, a partir del GP 3, ya que se superponían tal y como se muestra en la Figura 4. Por ello, en estas muestras se cuantificaron los hidratos de carbono exclusivamente por GP incluyéndose en la categoría “otros”. En estas muestras resultaría necesario utilizar otro tipo de columna con mayor poder de resolución. Figura 4. Perfiles cromatográficos obtenidos al superponer una muestra de referencia de Vivinal (en verde), un patrón de Maltodextrinas (en azul) y una muestra que contiene tanto GOS como maltodextrinas añadidos (en rojo). En las muestras que contienen FOS también se distinguieron dos tipos de perfiles: las fórmulas FI_mdx,preb_1 y FC_mdx,preb_4 poseen un perfil correspondiente a la Raftilosa ® , que proviene de la hidrólisis enzimática de la inulina. Los compuestos mayoritarios son moléculas de fructosa con enlace β(2→1), de inulobiosa (2 moléculas de fructosa F2) a inuloheptosa (F7), siendo minoritarios aquellos con moléculas de glucosa en el extremo terminal como kestosa, nistosa y los derivados mono, di y trifructosilados de la nistosa [94]. Por el contrario, los productos FI_SL,mdx,preb_1, FC_preb_1 y CL_mdx,preb_1 tienen un perfil correspondiente a FOS obtenidos mediante síntesis enzimática a partir de sacarosa, kestosa, nistosa, etc. Los contenidos en FOS fueron variables, pudiéndose encontrar hasta 30 mg/g EST. En las fórmulas de soja se pensaba que podrían encontrarse α-GOS, unos derivados galactosilados de la sacarosa unidos mediante enlaces α(1→6) presentes en las plantas de la familia de las min10 20 30 40 50 60 70 pA 0 200 400 600 800 1000 FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\270214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-27 20-41-56\106F0601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\280214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-28 14-18-45\116F1601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COL...14 CARREZ Y REFERENCIAS CARLOS 2014-02-11 17-41-40\108F0801.D) min32 34 36 38 40 42 pA 0 50 100 150 200 250 300 350 400 FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\270214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-27 20-41-56\106F0601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COLUMNA NUEVA\280214 MUESTRAS CARLOS 2014-02-28 14-18-45\116F1601.D) FID1 A, FID1A, Front Signal (CARLOS\COL...14 CARREZ Y REFERENCIAS CARLOS 2014-02-11 17-41-40\108F0801.D) tiempo (min) tiempo (min) Página 26 de 35 leguminosas. No obstante, no se detectó rafinosa (un α-GOS de GP 3) en ninguna de las fórmulas descartándose la presencia de compuestos de este tipo como posibles impurezas de las proteínas de soja utilizadas en la elaboración. Este tipo de fórmulas es adecuado para niños con alergia a las proteínas lácteas y/o intolerancia a la lactosa,si bien deben ser cuidadosamente testadas a la hora de utilizarlos para niños con galactosemia ya que podría presentar pequeñas cantidades de galactosa como es el caso de la muestra FS_mdx_2. Tabla 3. Caracterización de la fracción de carbohidratos por GC-FID de los 28 productos analizados. Los carbohidratos han sido agrupados en función de su grado de polimerización (GP). Abreviaturas utilizadas: Fru (Fructosa), Ga (Galactosa), Glu (Glucosa), Myo (Myo-inositol), Sac (Sacarosa), Lu (Lactulosa), La (Lactosa), Mu (Maltulosa), Ma (Maltosa), Di-GOS (Di-Galacto-oligosacáridos), Kes (Kestosa), RFT (Raftilosa), Mdx (Maltodextrinas), Vi (Vivinal) Nis (Nistosa), FNis (Fructosil-Nistosa), DFNis (Di- Fructosil.Nistosa). Clave FI_1 FC_mdx_1 FC_mdx_2 FC_mdx_3 FC_mdx_Lq_4 G P = 1 Fru 0,12 ± 0,07 0,22 ± 0,01 0,13 ± 0,01 0,54 ± 0,02 0,03 ± 0,01 Ga 2,27 ± 0,24 2,55 ± 0,11 2,66 ± 0,01 0,49 ± 0,03 0,13 ± 0,01 Glu 2,88 ± 0,29 3,90 ± 0,22 1,56 ± 0,03 16,22 ± 0,40 0,27 ± 0,06 Myo 1,31 ± 0,62 0,30 ± 0,01 0,49 ± 0,01 0,79 ± 0,06 0,13 ± 0,03 G P = 2 Sac - - - - - Lu 0,67 ± 0,32 0,48 ± 0,03 0,74 ± 0,02 0,41 ± 0,03 0,04 ± 0,00 La 729,90 ± 61,11 310,01 ± 17,19 472,82 ± 2,89 226,13 ± 5,99 67,93 ± 1,38 Mu - - - - 0,41 ± 0,00 Ma - 14,40 ± 0,58 2,09 ± 0,03 50,64 ± 1,13 4,32 ± 0,14 Di-GOS - - - - - Otros 8,66 ± 2,69 4,91 ± 0,17 6,33 ± 0,02 5,54 ± 0,00 0,87 ± 0,17 G P = 3 Kes - - - - - RFT - - - - - Mdx - 18,93 ± 0,78 0,87 ± 0,03 50,64 ± 1,03 7,19 ± 0,02 Vi - - - - - Otros 4,76 ± 0,90 3,28 ± 0,50 2,02 ± 0,17 3,39 ± 0,10 0,80 ± 0,04 G P = 4 Nis - - - - - RFT - - - - - Mdx - 20,04 ± 0,04 0,40 ± 0,07 38,73 ± 0,10 6,81 ± 0,21 Vi - - - - - Otros - 6,79 ± 0,14 1,29 ± 0,41 6,33 ± 1,13 2,08 ± 0,30 G P = 5 FNis - - - - - RFT - - - - - Mdx - 18,87 ± 1,21 0,49 ± 0,08 49,82 ± 0,12 6,24 ± 0,37 Vi - - - - - Otros - 6,46 ± 0,33 0,72 ± 0,33 4,94 ± 0,13 1,25 ± 0,11 G P = 6 DFNis - - - - - Mdx - 18,45 ± 0,63 - 71,02 ± 1,10 5,82 ± 0,30 Otros - 5,14 ± 0,46 - 9,63 ± 0,30 1,98 ± 0,10 GP = 7 - 0,39 - 0,42 ± 0,26 0,12 ± 0,04 aLas claves de cada muestra han sido asignadas de acuerdo a los criterios establecidos por la Tabla 1. bCada muestra fue preparada por duplicado (media ± desviación estándar). Página 27 de 35 Clave FC_mdx,preb_1 FC_mdx,preb_2 FC_mdx,preb_3 FI_mdx,preb_1 FC_mdx,preb_4 FI_SL,mdx,preb_1 FI_mdx,preb_2 FC_mdx,preb_5 G P = 1 Fru 0,45 ± 0,00 1,64 ± 2,11 0,33 ± 0,03 3,48 ± 1,67 1,35 ± 0,08 0,48 ± 0,03 0,51 ± 0,01 0,38 ± 0,01 Ga 2,00 ± 0,44 1,82 ± 0,11 1,25 ± 0,14 0,22 ± 0,01 0,80 ± 0,04 1,36 ± 0,06 2,30 ± 0,07 1,30 ± 0,02 Glu 18,59 ± 1,57 6,78 ± 1,45 16,71 ± 1,61 1,97 ± 1,02 1,73 ± 0,08 7,11 ± 0,27 9,36 ± 0,16 12,03 ± 0,01 Myo 0,39 ± 0,02 0,36 ± 0,05 0,31 ± 0,05 0,52 ± 0,04 0,65 ± 0,02 0,32 ± 0,00 0,56 ± 0,01 0,45 ± 0,00 G P = 2 Sac 0,09 ± 0,01 0,49 ± 0,47 0,07 ± 0,01 1,74 ± 0,62 1,31 ± 0,07 1,92 ± 0,09 - - Lu 0,69 ± 0,08 1,00 ± 0,06 0,60 ± 0,07 0,14 ± 0,02 0,99 ± 0,10 - 0,73 ± 0,16 0,87 ± 0,08 La 405,21 ± 37,62 405,75 ± 19,61 354,50 ± 31,03 429,99 ± 16,87 492,22 ± 27,00 - 461,82 ± 8,83 399,30 ± 0,09 Mu - - - - - 0,63 ± 0,03 - - Ma 12,98 ± 2,44 12,00 ± 1,20 12,74 ± 0,86 3,07 ± 0,35 3,80 ± 0,01 29,38 ± 1,30 3,27 ± 0,13 16,29 ± 0,21 Di-GOS - - - - - - - - Otros 19,14 ± 1,31 20,70 ± 2,03 16,88 ± 0,97 4,37 ± 0,48 3,50 ± 0,10 2,48 ± 0,44 11,26 ± 0,02 11,80 ± 0,62 G P = 3 Kes NS NS NS 0,92 ± 0,03 0,84 ± 0,05 18,65 ± 0,93 - - RFT NS NS NS 4,07 ± 0,17 3,95 ± 0,23 - - - Mdx NS NS NS 3,43 ± 0,48 4,32 ± 0,01 45,89 ± 2,01 NS NS Vi NS NS NS - - - NS NS Otros 30,14 ± 1,62 31,65 ± 3,20 28,96 ± 3,50 1,59 ± 0,45 1,62 ± 0,12 3,60 ± 0,01 13,74 ± 0,60 32,82 ± 0,64 G P = 4 Nis NS NS NS 2,65 ± 0,13 2,15 ± 0,10 0,01 ± 0,00 - - RFT NS NS NS 4,17 ± 0,13 4,72 ± 0,08 - - - Mdx NS NS NS 7,44 ± 0,85 5,34 ± 0,07 38,09 ± 1,58 NS NS Vi NS NS NS - - - NS NS Otros 22,70 ± 1,03 28,69 ± 2,29 28,93 ± 1,10 5,95 ± 1,18 10,12 ± 0,00 12,29 ± 0,66 10,91 ± 1,97 34,66 ± 1,47 G P = 5 FNis NS NS NS 2,95 ± 0,07 1,77 ± 0,09 6,18 ± 0,38 - - RFT NS NS NS 1,01 ± 0,08 2,44 ± 0,05 - - - Mdx NS NS NS 3,95 ± 0,28 0,92 ± 0,01 45,97 ± 3,11 NS NS Vi NS NS NS - - - NS NS Otros 13,21 ± 1,04 21,27 ± 2,23 26,23 ± 1,43 2,43 ± 0,31 0,58 ± 0,04 7,03 ± 0,92 8,60 ± 2,14 25,10 ± 1,09 G P = 6 DFNis NS NS NS 2,33 ± 0,10 0,40 ± 0,01 0,46 ± 0,05 - - Mdx NS NS NS 2,60 ± 0,48 - 54,42 ± 2,27 NS NS Otros 8,83 ± 0,25 13,15 ± 2,25 30,45 ± 13,46 7,36 ± 2,75 1,03 ± 0,08 12,28 ± 1,03 3,67 ± 1,91 24,34 ± 2,40 GP = 7 - 0,41 ± 0,06 2,58 ± 0,11 - - 2,80 ± 0,20 0,31 ± 0,17 0,98 ± 0,14 Página 28 de 35 Clave FI_preb_1 FC_preb_1 FC_mdx,preb_6 FC_mdx,preb_7 FI_mdx,preb_3 FC_mdx,preb_8 FC_mdx,preb_9 FI_mdx,preb_4 G P = 1 Fru 0,30 ± 0,06 0,35 ± 0,04 0,76 ± 0,07 0,41 ± 0,01 0,28 ± 0,03 0,33 ± 0,04 0,47 ± 0,02 0,49 ± 0,00 Ga 1,62 ± 0,08 1,28 ± 0,10 1,82 ± 0,07 1,11 ± 0,04 1,26 ± 0,17 1,62 ± 0,15 1,33 ± 0,10 1,67 ± 0,00 Glu 13,16 ± 0,37 16,51 ± 1,37 20,92 ± 0,97 12,49 ± 0,20 8,22 ± 0,90 13,59 ± 1,34 11,26 ± 0,94 13,91 ± 0,25 Myo 0,47 ± 0,01 0,33 ± 0,08 0,33 ± 0,00 0,70 ± 0,05 0,45 ± 0,02 0,43 ± 0,02 0,24 ± 0,01 0,53 ± 0,02 G P = 2 Sac - 0,07 ± 0,00 0,06 ± 0,00 0,38 ± 0,03 - - - - Lu 0,62 ± 0,01 0,62 ± 0,03 0,38 ± 0,03 0,34 ± 0,08 0,89 ± 0,03 0,60 ± 0,01 0,64 ± 0,09 0,32 ± 0,03 La 454,03 ± 10,20 529,41 ± 39,78 194,89 ± 8,76 302,89 ± 5,59 498,06 384,79 ± 34,58 362,25 ± 31,19 478,87 ± 32,22 Mu - - - - - - - - Ma 4,02 ± 0,07 - 21,90 ± 1,11 17,39 ± 0,28 5,48 ± 0,74 16,64 ± 1,67 8,47 ± 0,94 7,48 ± 0,20 Di-GOS 14,59 ± 0,15 21,76 ± 1,69 - - - - - - Otros - - 16,74 ± 0,91 12,10 ± 0,19 10,11 ± 2,69 11,70 ± 0,47 12,12 ± 1,50 14,14 ± 0,64 G P = 3 Kes - 0,04 ± 0,00 NS NS - - - - RFT - - NS NS - - - - Mdx - - NS NS NS NS NS NS Vi 12,16 ± 0,35 13,21 ± 1,13 NS NS NS NS NS NS Otros 3,42 ± 0,21 3,56 ± 0,27 39,76 ± 1,78 35,79 ± 2,05 12,61 ± 1,50 30,26 ± 3,31 23,80 ± 1,67 18,90 ± 0,20 G P = 4 Nis - 0,04 ± 0,00 NS NS - - - - RFT - - NS NS - - - - Mdx - - NS NS NS NS NS NS Vi 3,91 ± 0,19 4,06 ± 0,40 NS NS NS NS NS NS Otros 6,80 ± 0,32 5,71 ± 0,10 29,60 ± 1,26 42,82 ± 0,99 8,47 ± 1,37 29,21 ± 3,21 22,24 ± 0,27 22,60 ± 0,34 G P = 5 FNis - - NS NS - - - - RFT - - NS NS - - - - Mdx - - NS NS NS NS NS NS Vi 1,17 ± 0,07 1,16 ± 0,11 NS NS NS NS NS NS Otros 1,59 ± 0,01 1,45 ± 0,16 24,51 ± 2,55 24,79 ± 0,71 4,31 ± 0,64 26,40 ± 2,66 16,80 ± 0,13 3,11 ± 0,26 G P = 6 DFNis - - NS NS - - - - Mdx - - NS NS NS NS NS NS Otros 0,35 ± 0,26 - 17,09 ± 4,77 21,82 ± 3,90 0,87 ± 0,33 19,18 ± 4,54 12,93 ± 0,72 1,98 ± 0,05 GP = 7 0,13 ± 0,01 - - - - 0,43 ± 0,15 0,20 ± 0,05 - Página 29 de 35 Clave FI_SL,mdx_1 FC_SL,mdx_1 FS_mdx_1 FS_mdx_2 LH_1 CL_mdx,preb_Lq_1 CL_mdx_Lq_1 G P = 1 Fru 0,56 ± 0,01 0,36 ± 0,01 0,26 ± 0,03 0,32 ± 0,03 11,31 ± 0,20 3,07 ± 0,02 7,50 ± 0,20 Ga 0,10 ± 0,02 0,73 ± 0,02 - 0,09 ± 0,03 56,83 ± 0,85 1,06 ± 0,01 44,97 ± 0,06 Glu 13,10 ± 0,39 10,07 ± 0,05 40,07 ± 0,40 15,70 ± 0,06 61,85 ± 1,39 3,61 ± 0,05 10,72 ± 0,05 Myo 0,15 ± 0,00 0,11 ± 0,03 0,32 ± 0,03 0,31 ± 0,01 0,23 ± 0,01 0,14 ± 0,11 1,48 ± 0,25 G P = 2 Sac - - - - 4,14 ± 0,05 153,02 ± 1,47 329,30 ± 6,86 Lu - - - - - 0,07 ± 0,03 0,52 ± 0,07 La - - - - 0,10 ± 0,01 91,23 ± 1,51 167,84 ± 0,02 Mu 2,35 ± 0,05 0,53 ± 0,03 0,83 ± 0,00 0,55 ± 0,02 - - - Ma 59,21 ± 1,99 30,74 ± 0,15 70,96 ± 0,50 52,54 ± 0,14 - - - Di-GOS - - - - 0,40 ± 0,01 0,07 ± 0,01 - Otros 2,14 ± 0,19 2,26 ± 0,23 2,32 ± 0,58 1,96 ± 0,58 0,99 ± 0,01 1,22 ± 0,14 484,85 ± 36,14 G P = 3 Kes - - - - - 0,09 ± 0,00 - RFT - - - - - - - Mdx 72,10 ± 2,36 47,16 ± 0,22 81,54 ± 0,70 60,22 ± 0,19 - 0,52 ± 0,00 - Vi - - - - - - - Otros 4,07 ± 0,13 2,82 ± 0,65 4,03 ± 0,18 3,11 ± 0,48 1,19 ± 0,07 0,78 ± 0,22 15,12 ± 0,15 G P = 4 Nis - - - - - 0,08 ± 0,03 - RFT - - - - - - - Mdx 47,16 ± 2,24 39,16 ± 0,27 51,75 ± 0,67 55,58 ± 1,41 - 0,73± 0,47 - Vi - - - - - - - Otros 10,37 ± 0,01 9,88 ± 0,48 8,18 ± 0,49 8,33 ± 1,25 - 1,15 ± 0,87 - G P = 5 FNis - - - - - 0,08 ± 0,00 - RFT - - - - - - - Mdx 107,67 ± 5,14 44,29 ± 1,43 140,46 ± 2,31 83,70 ± 1,81 - 0,21 ± 0,03 - Vi - - - - - - - Otros 8,68 ± 0,85 5,86 ± 0,09 9,58 ± 0,09 9,31 ± 1,12 - 0,45 ± 0,20 - G P = 6 DFNis - - - - - - - Mdx 61,53 ± 11,88 54,91 ± 1,29 92,08 ± 2,07 77,15 ± 7,87 - - - Otros 12,66 ± 2,11 10,77 ± 0,44 11,89 ± 0,49 16,50 ± 2,33 - 0,91 ± 0,68 - GP = 7 1,32 ± 0,21 1,49 ± 0,27 0,52 ± 0,19 3,16 ± 0,30 - - - Página 30 de 35 4.4. Caracterización de la Fracción de Carbohidratos por HPLC Puesta a punto del método Se ensayaron hasta un total de 4 fases móviles utilizando diferentes proporciones de acetonitrilo (AcN)/agua: 70:30; 60:40; 55:45; 50:50. La mejor resolución de los carbohidratos de bajo peso molecular se produjo utilizando una fase móvil de AcN/Agua 70:30, con ella era posible separar los monosacáridos Fructosa y Galactosa, sin embargo, tras un tiempo de análisis de 50 minutos sólo se podían detectar compuestos hasta un GP 7. Por otra parte la separación y sensibilidad conseguida para compuestos con un GP entre 1 y 6 era muy inferior a la alcanzada con GC y con la técnica de HPLC la fracción que más nos interesaba era la de alto peso molecular. Al aumentar la proporción de agua en la fase móvil 50:50 el tiempo de análisis era muy breve los monosacáridos eluían con el frente impidiendo su distinción (dado su fuerte carácter hidrofílico), y el GP máximo detectado era 14indicando que había compuestos que coeluían. Según se pudo comprobar la mejor separación de los carbohidratos, para el fin de este trabajo, se produjo utilizando una fase móvil AcN/agua 55:45 ya que los compuestos se separaban de forma adecuada según su GP y se detectaban compuestos hasta un GP máximo de 17. Caracterización En esta técnica los carbohidratos presentes en las muestras solamente pudieron separarse en función de su GP. El mayor GP encontrado fue 17 en la muestra FI_SL,mdx,preb_1, que carece de lactosa y ha sido enriquecida en maltodextrinas, lo cual explica la presencia de polímeros de elevado peso molecular. En la mayoría de muestras se encontraron GP de 11-12, siendo la fórmula convencional FI_1 y las muestras de lactosa hidrolizada LH_1 las que menores GP presentaban, 3 y 4 respectivamente a concentraciones mínimas, inferiores a 0,7 mg/g EST. Como ya se ha comentado, el gran avance de la hidrólisis de la lactosa en la muestra LH_1 ha supuesto la degradación de la casi totalidad de los GOS que se forman en las primeras etapas del proceso. Mientras que en la fórmula convencional parece haber una cantidad ínfima de trisacáridos. Como cabía esperar, las muestras en las que se ha encontrado un mayor GP son aquellas enriquecidas en maltodextrinas en muchas de las cuales se podía apreciar fácilmente GP de 11 a 13. También en las fórmulas de soja se observaron GP elevados. Estas fórmulas junto a la muestra sin lactosa enriquecida en prebióticos (FI_SL,mdx,preb_1) presentaban las mayores concentraciones de polímeros de GP 10 y superior (de 17 a 34 mg/100g). En las muestras con maltodextrinas también se puede ver que, en general, los compuestos derivados de la maltosa más abundantes son los de GP Página 31 de 35 entre 3 a 7, a partir de este GP la tendencia general indica que la concentración de los compuestos disminuye al aumentar dicho GP. Comparación entre los valores del etiquetado y los obtenidos por HPLC y GC: Finalmente, para concluir este trabajo se realiza un análisis comparativo de los resultados obtenidos por las dos técnicas cromatográficas utilizadas comparándolos entre sí y contrastándolos con la información disponible en el etiquetado. Para ello se tendrán en cuenta los contenidos en Hidratos de Carbono totales, azúcares, lactosa y prebióticos: Hidratos de Carbono totales: En líneas generales, como era de esperar, los valores de carbohidratos cuantificados por GC son menores que los que figuran en la etiqueta, estas diferencias son especialmente reseñables para las muestras sin lactosa, incluidas las fórmulas de soja, así como las muestras con alto contenido en maltodextrinas como FI_SL,mdx,preb_1, FS_mdx_1 o FI_SL,mdx_1. La única excepción destacable es la fórmula infantil convencional FI_1, en la que se obtiene un valor de lactosa muy elevado, aunque comparable con valores de una leche humana. En cuanto a los valores de carbohidratos obtenidos por HPLC son, en general más parecidos a los de la etiqueta, e incluso algunos más altos. Hay que tener en cuenta que se desconoce la técnica utilizada por los laboratorios de análisis en el control de calidad de estos productos y, dada la compleja preparación de muestra que hay que seguir para el análisis por GC, es poco probable que esta técnica haya sido empleada de manera rutinaria en la industria, siendo un equipo de HPLC la opción más probable. Además, dependiendo del método seguido y la fase móvil escogida pueden detectarse compuestos de distinto peso molecular. También puede ocurrir que el análisis de haya, centrado solamente en los compuestos mayoritarios, como la lactosa, dependiendo del criterio escogido. En la determinación de carbohidratos por HPLC únicamente se obtienen valores mucho más bajos que los que aparecen en la etiqueta para las fórmulas a base de maltodextrinas, sin lactosa, pudiéndose esto deber en parte al uso de una técnica que permita detectar compuestos de mayor grado de polimerización a las aquí utilizadas, más específica para este tipo de productos. Por otro lado hay que considerar que no todos los lotes de productos son iguales, como se puede observar en el análisis realizado de las muestras FI_mdx,preb_1, 2 y 3 en las que se aprecia una variación importante especialmente en el contenido en lactosa de la muestra 3, a pesar de que en la etiqueta aparecen los mismos valores. Página 32 de 35 Lactosa: En el análisis de la lactosa los valores más fiables son los obtenidos por GC, ya que en HPLC no se pueden dar valores de lactosa aislada, correspondiendo estos valores realmente al total de disacáridos presentes en la muestra, y dependiendo del porcentaje que suponga la lactosa en la composición (generalmente mayoritaria) podría dar lugar a grandes diferencias entre unos valores y otros. En los productos en los que aparece el valor de lactosa en el etiquetado se puede observar una muy buena correlación con los valores obtenidos por GC, siendo mayor la diferencia en la muestra FC_mdx,preb_3, posiblemente debido a la variabilidad de los lotes, y la muestra FI_1 que, como ya se ha comentado presenta un contenido en lactosa muy elevado. En todos los casos hay que tener en cuenta que no todos los laboratorios de análisis utilizan la misma técnica para la determinación de carbohidratos y que los criterios a la hora de elaborar el etiquetado no son exactamente iguales en todas las empresas, siendo frecuente dar el valor de un azúcar mayoritario como la lactosa como el valor total de azúcares o incluso de hidratos de carbono, lo cual puede generar grandes diferencias a la hora de comparar unos productos y otros. 5. CONCLUSIONES - Para analizar fórmulas infantiles con la fracción de carbohidratos modificada es necesario la utilización de 2 técnicas cromatográficas complementarias: CG-FID y HPLC-RID - GC-FID es una técnica más exacta que aporta una mejor resolución y mayor información cualitativa aunque solo se pueden cuantificar compuestos de GP ≤ 7. - Es posible diferenciar el tipo de compuesto prebiótico añadido (GOS y FOS) y su origen enzimático. - La técnica HPLC-RID con una fase móvil AcN/agua 55:45 posibilita la separación de los carbohidratos por su GP detectándose y cuantificándose compuestos con 17 monómeros. - En líneas generales, los resultados obtenidos concuerdan con los que aparecen
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