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CARACTERIZACIÓN QUIMICO-ENERGETICA PROVISTA POR LOS CONTENIDOS EN CARBOHIDRATOS, LIPIDOS, Y PROTEINAS, DE LOS QUESOS PERA Y CAMPESINO ELABORADOS EN EL CENTRO DE BIOTECNOLOGIA AGROPECUARIA DEL SENA, Y ALGUNOS DE DIVERSAS MARCAS COMERCIALES MUESTREADAS EN BOGOTA D.C. ESTUDIANTES DE PREGRADO: CRISTIAN LEONARDO GONZALEZ RICAURTE YEISON MAURICIO RIVEROS HERNANDEZ BOGOTA D.C 20/01/2016 DEDICATORIA Dedicamos este trabajo de grado a nuestros padres y familiares quienes fueron y siguen siendo un gran apoyo a lo largo de nuestra carrera y nuestras vidas, a los profesores Javier Perez Cubides y Andrés Suarez Pintor los cuales supieron guiarnos incondicionalmente durante este proceso, y a aquellos amigos que estuvieron siempre presentes. INDICE GENERAL 1. Resumen 2. Introducción 3. Definición del problema 4. Justificación 5. Hipótesis 6. Objetivos 6.1 Objetivo general 6.2 Objetivos específicos 7. Marco contextual 8. Estado del arte 9. Marco teórico 9.1. Composición de la leche bovina 9.1.1 grasas 9.1.2 Proteínas 9.2 Queso 9.2.1 Quesos Frescos 9.3 Factores energéticos de conversión. 9.3.1 Sistema general del factor At- Water 9.3.2 Sistema específico del factor At-Water 9.4 Calorimetría 10 Metodología 10.1 Analisis próximo de leche 10.2 Preparación de queso pera 10.3 Preparación de queso campesino 10.4 Analisis químicos para quesos 10.4.1 Proteínas totales 10.4.2 Lípidos 10.4.2.1 Método Gerber para grasas totales 10.4.2.2 Determinación de ácidos grasos mediante Cromatografia de ga- . ses acoplada a masas 10.4.3 Carbohidratos 10.4.3.1 Desproteinización y extracción de carbohidratos 10.4.4 Calorimetría 11 Resultados 11.1 Porcentaje de humedad 11.2 Valores brutos (g X/ gMS, y J/g) para cada ensayo independiente 11.3 Proteínas totales método Kjeldahl 11.4 Grasas totales, método Gerber 11.5 Carbohidratos solubles 11.5.1 Cuantificación de lactosa 11.5.2 Cuantificación de glucosa 11.6 Conversiones energéticas usando el factor At Water 11.7 Cromatografia 12 Estadística 13. Análisis y conclusiones 14. Recomendaciones 15. Bibliografía INDICE DE TABLAS 1. Lípidos presentes en la leche de vaca 2. Composición química aproximada de un lóbulo de grasa 3. Distribución proteica en la leche de vaca 4. Caracterización organoléptica del queso pera 5. Factor especifico At-Water para algunos alimentos 6. Contenidos químicos principales para la leche fresca 7. Porcentajes de humedad en muestras evaluadas 8. porcentajes calculados de grasa en base seca 9. Gramos de grasa en base seca y energía aportada 10. Gramos calculados de lactosa por gramos de bases seca 11. Energía aportada (J/g de grasa) 12. Gramos calculados de glucosa por gramos de base seca 13. Energía aportada en julios por gramos de lactosa 14. Gramos de proteína por gramos de muestra seca 15. Energía aportada (J/ g Proteína) 16. Gramos de proteínas totales por gramos de materia seca 17. Gramos de grasas totales por gramos de materia seca 18. Curva de calibración para cuantificación de lactosa, por el método . Fenol-Sulfúrico 19. Cuantificación de lactosa (g Lac/ g de materia seca) 20. Curva de calibración cuantificación de glucosa, método de antrona. 21. Cuantificación de glucosa (g glucosa/ g materia seca) 22. Suma de los contenidos energéticos aportados por los distintos . . . componentes nutricionales 23. Comparación entre los valores energéticos de calorimetría y los . . métodos químicos, usando el factor At-Water 24. Contenidos nutricionales en quesos campesinos 25. Contenidos nutricionales en quesos pera 26. Comparación energética entre métodos químicos y calorimétrico . . . para quesos pera 27. comparación energética entre los métodos químicos y calorimétricos, . para quesos campesinos 28. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo campesino . (CBA). 29. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo pera (CBA). 30. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo campesino . (Colactéos). 31. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo campesino . (Colánta). 32. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo pera (Lozárte). 33. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo pera . (Pampanini). 34. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo campesino . (Ubaté). 35. Picos y ácidos grasos más probables para queso tipo pera (Del . Vecchio). INDICE DE GRAFICAS 1. Contenidos nutricionales de quesos campesinos 2. Contenidos nutricionales de quesos pera 3. Comparación entre valores energéticos obtenidos por métodos químico y calorimétrico para quesos pera 4. Comparación entre valores energéticos obtenidos por métodos químico y calorimétrico para quesos campesino 5. comparación energética obtenida para las distintas muestras de quesos, restando la energía obtenida por formación de NO2 6. Grafica de medias para los valores energéticos obtenidos por muestra (A), y por método (B) 7. Grafica de interacciones para los contenidos energéticos, teniendo como factores los métodos químicos empleados y las muestras evaluadas. ÍNDICE DE IMÁGENES 1. Cromatografia queso campesino CBA 2. Cromatografia queso pera CBA 3. Cromatografia queso campesino Colactéos 4. Cromatografía queso campesino Colánta 5. Cromatografía queso pera Lazarte 6. Cromatografia queso pera Pampanini 7. Cromatografia queso campesino Ubaté 8. Cromatografia queso pera del Vecchio. INDICE DE FIGURAS 1. Estructura composicional de un glóbulo de grasa 2. Estructura composicional de una micela proteica en leche de bovinos. INDICE DE DIAGRAMAS. 1. División de las proteínas en la leche de bovinos. 2. Preparación del queso pera 3. Preparación del queso campesino. 4. Método Kjeldhal 5. Cuantificación de grasas totales por método Gerber 6. Extracción y esterificación de ácidos grasos ABREVIATURAS VE: Valor energético. VTEA: Valor energético total aportado. J/g: Julio por cada gramo. J: Julio. KJ/g: kilojulios por cada gramo. g/Lac: Gramos de lactosa. g/Glu: Gramos de glucosa. BS: Base seca. G MS: Gramos de muestra seca. RT: Resistencia térmica AT: Temperatura de los alrededores CT: Temperaturade celda y sistema de medida D0: Grados Dornic. Nm: Nanómetros. SD: Desviación estandar. Met Quim: Método químico. Met Cal: Método calorimétrico. PC: Fosfatidilcolina. PE: Fosfatidiletanolamina. PI: Fosfatidilinositol. PS: Fosfatidilserina. T.A.G: Triacilgliceroles. D.A.G: Diacilgliceroles. M.A.G: Monoacilgliceroles. H0: Hipótesis nula. H1: Hipótesis alternativa. QP: Queso pera. QC: Queso campesino. 1. RESUMEN. El presente proyecto de investigación está orientado a la determinación y comparación de los aportes nutricionales y energéticos provistos por dos tipos de queso (pera y campesino), elaborados en las instalaciones del Centro de Biotecnología Agropecuaria (CBA), de Mosquera, y otros de tipo comercial muestreados en diferentes almacenes de cadena en la ciudad de Bogotá D.C. Los parámetros químicos que se determinarán dentro del desarrollo metodológico y experimental son: contenido de carbohidratos solubles, contenido de proteínas totales, contenido de lípidos totales, y perfil lipídico de las diversas muestras; además de lo anterior se realizará una estimación calorimétrica con el ánimo de efectuar una comparación de los valores energéticos obtenidos por los métodos químicos (usando conversiones energéticas), y dicho método calorimétrico. Para ello, además de realizar un adecuado manejo de los productos ya terminados (quesos), se pretende efectuar una minuciosa caracterización de la materia prima (leche), así como un muestreo que se considere representativo para cada una de las marcas y tipos de quesos comerciales evaluadas en el estudio. Parte importante del trabajo es realizar análisis y comparaciones con los diferentes quesos pera y campesino presentes en el mercado de distintas empresas lecheras del país, esto con el ánimo de tener referentes composicionales en los diversos parámetros analíticos planteados; Para el desarrollo metodológico se implementarán las técnicas siguientes: determinación de proteínas totales por el método Kjeldhal, método de fenol-sulfúrico y antrona-sulfúrico para cuantificación de carbohidratos, método de extracción Soxhlet para grasas totales, método Gerber para cuantificación de grasa total, y cromatografía de gases acoplado a masas para la caracterización de lípidos; los valores energéticos se determinarán utilizando las metodologías inicialmente establecidas por At-Water referentes a conversiones energéticas de contenidos nutricionales en alimentos, y que posteriormente fueron perfeccionadas por la FAO. 2. INTRODUCCION. El trabajo se realiza con el ánimo de conocer de manera muy cercana los verdaderos contenidos nutricionales y energéticos que aportan los quesos pera y campesino elaborados por el centro de biotecnología Agropecuaria (CBA), de Mosquera, y algunos quesos de marcas comerciales del mismo tipo muestreados en diversos almacenes de cadena de Bogotá D.C. Además de evaluar los aportes energéticos que prestan los quesos elaborados por el CBA, se pretende evaluar los aportes calóricos mayoritarios (conferidos por lípidos, carbohidratos y proteínas), de los quesos de marcas comerciales previamente evaluados y caracterizados; se hace necesario así valorar las muestras individualmente al tiempo que se realiza un comparativo con sus similares de elaboración conocida (aportados por el centro de biotecnología agropecuaria de Mosquera y comerciales muestreados). Por tratarse de quesos sin agregados nutricionales ampliamente consumidos y recomendados por médicos y nutricionistas en el país, se hace fundamental un análisis de la preparación del alimento, de sus propiedades nutricionales, y las variables que pueden afectar la calidad energética del mismo. En aras de una correcta producción, manejo, y análisis industrial que repercuta positivamente en las características nutricionales de un alimento, se deben detallar aspectos como lo son: protocolos de elaboración del alimento, recolección de la materia prima, y análisis en los diferentes estadios de la producción del mismo, en este sentido el trabajo incorpora de manera específica los criterios mencionados anteriormente, lo cual establece al mismo en un referente analítico para estas variedades de quesos. 3. DEFINICION DEL PROBLEMA. En Colombia el consumo y producción de queso es muy importante tanto en zonas rurales como urbanas dado el contenido alimenticio que brinda para la correcta nutrición de las personas y la facilidad que se presenta en algunas regiones del país para su preparación y comercialización. Dicho esto, aunque las empresas productoras reportan los valores nutricionales en sus respectivas etiquetas, se han identificado incongruencias en los valores para el queso pera y campesino, generando incertidumbre en lo que respecta a los verdaderos aportes nutricionales del alimento, se debe mencionar que los cambios en los contenidos energéticos podrían estar asociados a las condiciones de la materia prima (leche), su procedencia, condiciones climáticas, y los procesos de elaboración del queso; sin embargo los valores reportados para los alimentos deben estar sujetos a estas variables; de esta forma se plantean las preguntas: ¿cuáles son los valores energéticos aportados por quesos pera y campesino elaborados bajo protocolos establecidos?, ¿los contenidos nutricionales y energéticos de los quesos pera y campesino que recibe el consumidor, son realmente los reportados por las industrias?, ¿Los valores energéticos obtenidos por los métodos químicos, se pueden contrastar con los valores obtenidos calorimétricamente?; En este aspecto es importante tener en cuenta que cada empresa tiene la facultad de estandarizar diversos métodos de producción de acuerdo a sus necesidades y recursos, pero sin importar esto se deben seguir protocolos generales mínimos para la correcta preparación y comercialización del mismo, es así como se pretende responder a las preguntas de investigación mediante el análisis de los alimentos ofrecidos comercialmente por diversas empresas de lácteos en el país, y los quesos suministrados por el Centro de Biotecnología Agropecuaria (CBA). 4. JUSTIFICACIÓN. El objeto del presente trabajo experimental está basado en la necesidad de conocer de manera más precisa dos variedades de uno de los alimentos que más consumimos actualmente, y establecer una relación directa entre las variables que pueden llegar a influir en el estado específico de este alimento, hablamos de los quesos pera y campesino. Para dicho fin se deben examinar sus procesos de elaboración desde la recolección de sus materias primas, pasando por sus procedimientos de preparación específicos, sus métodos de análisis y beneficios energéticos otorgados por cada uno de ellos, siendo esto un aporte a nuestra salud y buena nutrición; además de convertirse el estudio en un parámetro de referencia para el correcto análisis de dichos alimentos, se puede mencionar adicionalmente que el queso pera y campesino al ser sugerido por nutricionistas y médicos como alimento de buen aporte proteico y con bajas repercusiones en la salud, debe estar debidamente analizado respecto a sus propiedades químicas y energéticas; Colombia por ser un país que depende en gran medida económica y alimentaria de su producción interna, debe ser prioridad la buena producción y análisis de alimentos en general. Con los resultados del trabajo investigativo se pretende establecer un parámetro analítico que relacione la influencia de las condiciones de la materia prima y método de elaboración. De igual manera se pretende establecer un patrón de análisis que sea referente y que garantice un buen análisis y fiabilidad respecto a los aportes energéticos y nutricionales para los quesos mencionados. 5. HIPOTESIS. Mediante los diversos métodos químicos y de análisis calorimétricose deben obtener valores energéticos similares para los quesos de las mismas variedades. Los valores energéticos y nutricionales dados al consumidor por parte de las industrias, no corresponden adecuadamente a las propiedades reales del alimento. 6. OBJETIVOS. 6.1. Objetivo general. Caracterizar química y energéticamente los contenidos nutricionales provistos por lípidos, proteínas y carbohidratos en quesos pera y campesino producidos por el CBA de Mosquera. 6.2. Objetivos específicos. Comparar la variabilidad en los contenidos de grasas, lípidos y carbohidratos que se presentan entre los dos tipos de queso analizados. Determinar los cambios en los valores energéticos obtenidos mediante los métodos químicos, en contraste con el método calorimétrico. Reportar valores de los contenidos energéticos reales para las variedades de queso analizadas, tanto comerciales como las muestras problema, que se constituyan en un aporte real de información para las personas. Elaborar quesos pera y campesino bajo protocolos establecidos por el Centro de Biotecnología Agropecuaria (CBA) del Sena de Mosquera, que se constituyan como parámetro de referencia para análisis de quesos de marcas comerciales en el país. 7. MARCO CONTEXTUAL. El muestreo se realizará en diversos almacenes de cadena en la ciudad de Bogotá D.C, y además se contara con los quesos elaborados por el SENA sede Mosquera. Se reunirán muestras de diversas marcas de cada una de las variedades de queso a estudiar con la finalidad de obtener los valores de cada uno y contrastarlos frente a los valores de las demás muestras; las mediciones se realizarán dentro de los laboratorios de química de la universidad Distrital Francisco José de Caldas, y los laboratorios del Centro de biotecnología agropecuaria. 8. ESTADO DEL ARTE. Dentro de los avances que se han realizado para el conocimiento de la difusión de macromoléculas constitutivas del queso, se han implementado técnicas como la fluorescencia de recuperación o FRAP, en este sentido establecer una relación directa entre las variables mencionadas, se constituye en un aporte al entendimiento de la organización de la red de proteínas durante los procesos de elaboración y maduración de los quesos mediante la medición de los coeficientes de difusión efectivos para un grupo de dextranos; se logró determinar para algunos quesos de tipo blando y duro que la difusión de los dextranos era dependiente principalmente en la fracción '' libre '' de fase acuosa presente en el queso, lo cual como se menciona anteriormente se relaciona con el proceso de elaboración del alimento, además de relacionar estos macro- polisacáridos con las redes de proteínas conformadas dentro del alimento 1 . Podemos encontrar trabajos destinados al estudio del cambio de los parámetros fisicoquímicos del queso durante su periodo de almacenamiento, bajo condiciones establecidas, como es el caso del queso con probióticos bajo en sodio, y sometido a la adición de Arginina con la finalidad de evaluar la acción sobre los organismos presentes en los quesos y sus propiedades fisicoquímicas; se halló que las diferentes clases de bacterias presentes en los quesos no sufrían ninguna clase de daño o disminución gracias a la adición de arginina y la baja presencia de sodio, pero en contraste se observó una proteólisis más elevada y una disminución en la dureza, elasticidad y firmeza, así como un aumento de ácido láctico, cítrico, y de ácido acético 2,3 . Dentro de las técnicas instrumentales se encuentra una cantidad considerable de aplicaciones para el análisis de diversos parámetros químicos de los alimentos, una de las técnicas más utilizadas es la Cromatografia de gases, técnica utilizada con el propósito de identificar y cuantificar los componentes presentes en una muestra problema. Para el tema que nos involucra podemos mencionar el trabajo: Perfil de ácidos grasos libres y características sensoriales de quesos reggianito elaborados con diferentes fermentos, que se desarrolló en Venezuela y cuyo objetivo es evaluar los perfiles lipídicos de quesos elaborados bajo parámetros distintos con la finalidad de mejorar los procesos de producción 3 ; encontramos también el uso de la espectroscopia FT-Raman con el propósito de identificar las muestras de queso para untar que contienen almidón a través del análisis discriminante de cuadrados. En la investigación realizada por (Romano R., Giordano A. 2011) sobre el contenido de triglicéridos, ácidos grasos y ácidos linoleicos conjugados en queso italiano mozzarella di Bufala Campana se demostró la influencia de la temporada del año con respecto al contenido de grasa en la leche. También se utilizó en la investigación la técnica de cromatografía de gases para desarrollar el perfil lipídico 4 . (Marrone R., Balestrieri A. 2014) investigaron la Composición físicoquímica, el perfil de ácidos grasos y el colesterol contenido en el queso pecorino Carmusciano, el cual es un producto lácteo tradicional en Italia. Obtuvieron como resultado un contenido relativamente alto de ácido grasos monoinsaturados (MUFA) y ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) y una relación favorable de n-6 a n-3 ácidos grasos. Algo importante en este estudio es también la presencia del ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, los cuales estuvieron presentes en cantidades promedio de 0,26% y 0,21%, respectivamente; adicional a esto, el ácido linoleico conjugado total fue de 0.5% 5 . Rincón A., Pino V. 2014) Utilizaron la técnica (MHS-SPME) para la cuantificación de los ácidos grasos libres volátiles en nueve quesos, en conjunto, con la cromatografía de gases y detección de ionización de llama (GC-FID), resultando ser un excelente método con reproducciones favorables. Cabe resaltar que es la primera vez que la técnica MHS-SPME se ha aplicado a los compuestos volátiles en los quesos 6 . Por otra parte (Lesic T., Pleadin J. 2016) Realizaron un estudio sobre la composición química y de ácidos grasos en leche de vaca y oveja para quesos en un saco de piel de cordero, y además investigaron las influencias del período de maduración (0, 15, 30 y 45 días) y los diferentes cultivos iniciadores en la composición de ácidos grasos y la química de estos quesos. Los quesos fueron producidos de tres maneras: a partir de leche cruda sin la adición de un cultivo, a partir de leche pasteurizada con los cultivos iniciadores comerciales y con cultivos iniciadores autóctonos (Lactococcus lactis S1 o Lactobacillus plantarum B o una mezcla de ambos). Encontraron que el tiempo de maduración afectó significativamente todos los parámetros químicos básicos y no tuvo efecto significativo sobre los grupos de ácidos grasos investigados, además no hallaron una diferencia significativa en función de los cultivos iniciadores utilizados y el tipo de queso analizado. Por otra parte, los ácidos grasos más representativos que identificaron en los quesos analizados fueron palmítico, oleico y ácido esteárico 7 . 9. MARCO TEORICO. Los alimentos diarios tienen un gran efecto sobre la salud humana, por su puesto se incluye entre estos el queso considerado como uno de los alimentos más populares en todo el mundo, las aportaciones dadas a la nutrición humana por parte de este alimento están constituidas principalmente por macromoléculas como lo son: carbohidratos, lípidos, y proteínas, en este sentido se debe mencionar que las cantidades presentes de estos compuestos están dadas de manera primaria por factores como: las características genéticas de los animales, características ambientales, lugares de localización, y los tipos de pasto que se utilicen para su alimentación 8 Cuando se habla de queso se piensa de manera prioritaria en el suplemento energético y alimenticio que sus componentesaportan, pero los contenidos de grasas se han asociado a problemas como aparición de ciertas formas de cáncer, aparición de arteriosclerosis, disfunción coronaria, y presión de sangre elevada 9 , esto ha generado una cultura selectiva respecto al contenido de grasas que se ofrecen en los alimentos del mercado; aun cuando este es una argumento válido para la disminución de estas en los alimentos en general, se encuentra que la disminución en quesos afecta negativamente algunas características del alimento como: Textura, firmeza, dureza, sabor, y sequedad, además de esto se debe considerar que en los procesos de maduración y degradación, exactamente en el proceso de lipolisis, los ácidos grasos sirven como precursores de sustancias como esteres, alcoholes, cetonas, aldehídos y lactonas que le dan diferentes características físicas y químicas al alimento 9 , este proceso se ve propiciado por enzimas lipolíticas como es la Milk lipasa, cuya efectividad de acción se dará por la temperatura a la cual se traten las muestras de leche.7, en el proceso se presentan además bacterias del fermento natural de suero, y las bacterias lácticas no pertenecientes al fermento (NSLAB) 10 . Dichos procesos de maduración se ven afectados también por la forma en la cual se degradan las proteínas, de esta manera la proteólisis se da por la transformación principalmente de la caseínas en péptidos más cortos o aminoácidos 11 , también se asocia el estado de la leche objeto de cambios en los contenidos propios de un queso, un cambio especifico se da cuando la estabilidad de las micelas de caseína se ve alterada negativamente con la concentración de calcio iónico en la misma, esto varía de acuerdo al estado metabólico y nutricional de las vacas lecheras 11 Antes de ahondar en cualquier especificación de orden teórico se debe hacer claridad respecto a la definición de la leche, como lo menciona González R, la leche es un sistema coloidal constituido por una solución acuosa de lactosa, sales y muchos elementos constitutivos en estado de disolución, en donde podemos encontrar a las proteínas en estado de suspensión, y la materia grasa en estado de emulsión 12 , se pueden mencionar la composición probable de la leche pero solo es posible determinarla realizando los análisis químicos correspondientes. 9.1. Composición de la leche bovina. 9.1.1 Grasas. Las grasas constituyen de un 3 a 5% tanto para las leches de bovinos como para humanos, existen como glóbulos emulsionados de 2 a 4 micrómetros de diámetro, los fosfolípidos son cerca del 1 a 5 % del total de lípidos, mientras que los esteroles comprenden del 2 al 5% 13 . Por los efectos en ocasiones adversos que presentan los compuestos grasos sobre el organismo, se ha propuesto llevar los valores calóricos de la dieta a no más del 30% aportado por los mismos, 14 pero claro esto en gran medida depende de las condiciones mismas de los productos que se encuentran en el mercado, muchos de ellos derivados lácteos. Los lípidos contenidos en la leche se encuentran en un gran número de sustancias, todas ellas solubles en disolventes orgánicos, la mayor cantidad de lípidos se encuentran en un porcentaje del 96-98% que corresponde a triacilgliceroles. Los lípidos que se encuentran en menor concentración son los diacilgliceroles, monoacilgliceroles, fosfolípidos, ácidos grasos libres, y esteroles; se ha mencionado la acción perjudicial de las grasas saturadas en la leche, pero se ha descrito también la acción benéfica de ácidos grasos, tanto de cadena larga como de cadena corta (FA y CLA), sustancias como: lípidos polares (fosfolípidos y esfingolípidos), tienen influencia en la disminución del riesgo cardiometabólico. 15 Los lípidos polares en la leche son los principales constituyentes de la membrana de los glóbulos de grasa de la leche, constituido principalmente por fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilinositol (PI), fosfatidilserina (PS) y esfingomielina 15 Se debe mencionar de forma adicional que los glóbulos de grasa en la leche cruda tienen un tamaño de 2-8 micrómetros con una membrana constituida por diversidad de lípidos, proteínas y algunas sales (en menor proporción), para hablar de los lípidos se han identificado más de 400, pero es de resaltar que alrededor del 96% del total lo forman un grupo de 14 ácidos dentro de los cuales destacan el mirístico, palmítico y oleico 16 A continuación se presenta una tabla con la composición general de lípidos en la leche de vaca: Tabla 1. Lípidos en la leche de vaca 16 Tipo de lípido % Total de lípidos Concentración en g/L T.A.G 96-98 31.0 D.A.G 2.10 0.72 M.A.G 0.08 0.03 P.L 1.10 0.35 AG. Libres 0.20 0.15 E.C Rastros Rastros Modificado de: González R et al 16 Mostramos a continuación una imagen de la estructura de un glóbulo de grasa de leche bovina, y sus principales elementos químicos constituyentes. Fig 1. Estructura composicional general de un glóbulo de grasa de bovino. Figura tomada de: Angulo J et al, Mahecha L et al, Olivera M et al 17 En la siguiente tabla se describe la composición cuantitativa aproximada de dicho glóbulo de grasa. Tabla 2. Composición química aproximada de un glóbulo de grasa. Componentes Glóbulo de grasa. Núcleo MFGM Proteínas --- 350 Glicéridos --- --- Triglicéridos 3800 670 Diglicéridos 100 Trazas Monoglicéridos 10 Trazas Fosfolípidos Trazas 210 Esfingolípidos Trazas 80 AG 25 Trazas Esteroles 100 15 Vitaminas (A,E,D,K) 2 --- Agua 60 80 Otros 30 --- *MFGM: proteínas de la membrana del glóbulo de grasa de leche. Tabla Modificada de: Angulo J et al, Mahecha L et al, Olivera M et al. Se ha establecido que los ácidos grasos que se presentan en mayor proporción en la membrana del glóbulo de grasa son los siguientes: C-14 Mirístico (11%) C-16 Palmítico (26%) C-18 Esteárico (10%) C-18:1 Oleico (20%) Los anteriores son A.G de cadena larga, de cadena corta se reportan: C-4 Butírico C-6 Caproico C-8 Caprílico C-10 Cáprico Comprendiendo estos un 11% del total de ácidos grasos presentes en el glóbulo. 18 9.1.2. Proteínas Como ha descrito Frankel M et al 15 las proteínas en la leche por sus características se encuentran: a) De acuerdo a su estado de dispersión: son caseínas que representan 80% del total, y b) Las proteínas del suero o sueroproteínas: son el 20% restante; debido a la estabilidad de las proteínas y la caseína dentro de la conformación de la leche se han establecido parámetros para su separación, así encontramos separación mediante acción por cambios de pH, temperatura, y uso de agentes químicos 19 La estabilidad de las proteínas se constituye en un hecho de vital importancia para las fábricas lecheras a la hora de realizar los procedimientos térmicos aplicados a la diversidad de productos, principalmente se ha querido evitar la coagulación de la leche durante el tratamiento térmico 13 , y también la gelificación, procesos en los que se ven involucradas las proteínas, se puede mencionar que aún se utiliza la prueba de estabilidad de etanol – leche, para dicho fin 20 En la leche podemos encontrar la micela de caseína conformada por subunidades (α, β, y κ), que son interconectadas por fosfato de calcio micelar 20 , el calcio se puede encontrar en la leche como un ion o lo que se conoce como calcio libre, esta forma del calcio se encuentra relacionada de manera negativa con la micelas de caseína; se ha descrito como la elevación en las concentraciones de calcio iónico (ICA) en las leches afectalas repulsiones electrostáticas entre ellas, lo que reduce la resistencia de la caseína para formar coágulos durante la interacción con el etanol 11 . Aun cuando se ha descrito que la α- y β- caseínas son inestables en presencia de altas concentraciones de calcio iónico (ICA) en muestras de leche, Se observa que la κ- caseína se encuentra en la capa externa de la micela mostrando un carácter hidrofílico, y estabilidad a la reacción posible con el calcio Iónico en elevadas concentraciones, por lo tanto protegería el núcleo hidrofóbico micelar (compuesto de α y β caseínas) del contacto con el agua y el IC (calcio iónico) 21 Por lo dicho anteriormente la disposición estructural de α, β, y κ caseínas en la micela, las concentraciones de cationes divalentes de la leche, y la fuerza de repulsión electrostática entre las micelas pueden determinar la estabilidad micelar al calor, y otros posibles agentes no destructivos. 20 Fig 2. Estructura composicional de una micela proteica en leche de bovinos. Figura tomada de: Baró, Jiménez, Martínez - Férez, Bouza 18 Determinada cantidad del calcio y magnesio presentes en la leche, forman con las caseínas y demás compuestos proteicos libres, micelas, dentro de una suspensión coloidal, la cantidad restante de sales de calcio, magnesio, potasio, y sodio, al igual que carbohidratos como lactosa se encuentran como una solución acuosa verdadera 18 . A continuación presentamos la distribución de las proteínas en la leche de vaca. Tabla 3. Distribución proteica en la leche de vaca. Proteína % de proteína Peso molecular # de aminoácidos P.I. Caseínas (80%) α s1 34 23.612 199 4.1 α s2 8 25.228 207 β 25 23.980 209 4.5 κ 9 19.005 169 4.1 γ 4 5.8 Proteínas de suero (20%) Β-lactoglobulina 9 18.263 162 5.3 α- lactoglobulina 4 14.174 123 5.1 Proteosa peptona 4 4.000-200.000 Inmunoglobulinas 2 150.000*10 6 4.5-8-3 Seroalbumina 1 69.000 4.701 Tabla modificada de: Badui D et al 19 Para las fracciones proteicas más importantes de la leche se han establecido una serie de técnicas que se resumen en el siguiente diagrama explicativo: En el diagrama se mencionan las técnicas más usadas en la separación de fracciones proteicas en la leche de bovinos, los números en paréntesis indican el porcentaje obtenido de cada una de ellas. Diagrama 1. División de las proteínas en la leche. Los números indicados dentro del paréntesis equivalen a los porcentajes de cada fracción proteica Efectos de la pasteurización y la homogenización en la leche de bovinos. Con lo anterior pretendemos dar a conocer algunas de las propiedades más relevantes de la leche, pero es interesante conocer si estas cambian con la ejecución de algunos de los procesos utilizados comúnmente en la industria como lo son la agitación con el fin de homogenizar, o procesos de calentamiento como la pasteurización para la eliminación de bacterias perjudiciales para el ser humano, es claro que cada uno de los procesos se aplica de manera necesaria en el flujograma de elaboración de un producto y en esta medida se hace inevitable llevarlo a cabo . De esta forma se debe tener claro que para efectos del presente trabajo los protocolos de elaboración para los quesos Pera y Campesino incluyeron entre otros calentamiento y agitación de la materia prima, según Phoebe X, Daxi Ren, Yingping Xiao, Peggy M. Tomasula los procesos de Pasteurización y UHT combinados con agitación mecánica pueden llevar a la desnaturalización de las proteínas presentes en la leche, se han descrito daños en la hoja-β antiparalela y hélice- α 22 , así como la disminución en los contactos de la estructura terciaria. En este sentido se puede pensar en un posible cambio estructural de los contenidos proteicos en las muestras de queso elaboradas, asi como en las muestras de tipo comercial, esto no sería un factor interferente en la cuantificación de proteínas ya que se realizó mediante el análisis Kjeldhal una valoración total de nitrógeno, de esta forma la desnaturalización no se convertiría en un interferente en los resultados finales 22 . 9.2. Queso. Como describe Eck A 23 , el queso es el resultado propio de la coagulación de la leche cruda o pasteurizada cuyo componente principal son la caseínas, de acuerdo al Codex alimentarius de la FAO/OMS (2008) el queso es un producto semisólido, madurado o fresco en el cual el valor de la relación suero-proteínas/caseínas no supera al de la leche y que es obtenido mediante procesos de coagulación ya sea totales o parciales, y por la acción de cuajo u otros agentes coagulantes 19 ; desde un punto de vista fisicoquímico podemos decir que el queso se considera un sistema tridimensional tipo gel formado por un complejo de caseinato y fosfato cálcico, en el cual por un proceso de coagulación se pueden encontrar glóbulos de grasa, agua, lactosa, albúminas, globulinas, y minerales mayormente 24 ; para la ejecución de dicho proceso se lleva a cabo lo que conocemos como la separación del suero de la leche el cual también es rico en algunas proteínas como la albúmina y las globulinas (ver diagrama 1), la variedad de quesos que existen es tan diversa que de acuerdo a la leche y variación en la técnica de producción de estos se puede dar origen a un queso diferente; de esta forma podemos mencionar que se han registrado alrededor de 1000 variedades de queso 19 Se ha establecido que partir de 10 litros de leche se puede llegar a la obtención de entre 1 a 2 kg de queso y de 8 a 9 kg de suero de leche en dicho suero existen principalmente dos tipos que se diferencian por el procedimiento de obtención 19 , ellos son: a) Suero dulce: que proviene de la fabricación con renina. b) Suero ácido: que proviene del uso de ácido acético para la precipitación. 9.2.1. Quesos Frescos. Un queso fresco es aquel que no sufre procesos de maduración posterior a su proceso de fabricación, es decir se consume en estado fresco. Estos quesos presentan un gran porcentaje de humedad en su composición debido a la coagulación de la leche por la acción de la acidificación, también a las condiciones del prensado, de la materia prima, o incluso a la adición de sal 16 Dependiendo de la cantidad de grasa los quesos pueden ser magros o grasos, siendo aquellos que presenten valores bajos en grasa considerados como quesos dietéticos y de aportaciones alimenticias importantes al correcto estado cardiovascular 16 , dentro de estos se ha clasificado el queso pera, del cual realizamos la siguiente descripción: Queso pera: esta variedad de queso se ha considerado como un queso fresco, ácido, de pasta semi-cocida e hilada, no madurado, característico por su consistencia semidura-plástica, elaborado a partir de leche entera e higienizada de vaca, con acidificación moderada de la cuajada 25 y posterior hilado en agua o suero. Tiene un sabor suave, ligeramente dulce y ácido aunque es la sal la sustancia que aporta el sabor al producto 26 En el queso hilado se ha descrito que el paracaseinato dicálcico es transformado por acción del ácido láctico en paracaseinato monocálcico que tiene la propiedad de dar una consistencia suave y una textura plástica al ser tratado por calor en el proceso de hilado 27 , como queso bajo en grasa, se puede asumir que es mayor la velocidad con la cual el agua se evapora perdiendo humedad durante la maduración y causando resequedad excesiva y por tanto endurecimiento 28 ; Para hacer una descripción más amplia acerca de las características organolépticas del queso pera a continuación presentamos la siguiente tabla: Tabla 4. Características organolépticas del queso Pera. Característica Descripción Color Blanco-marfil Olor Aqueso fresco Textura Consistente-semidura Sabor Bajo en sal Tabla modificada de: Lechería Campo real (ficha técnica) Queso campesino: Se ha clasificado como un queso blanco de conservación muy baja en tiempo, pero de gran valor nutricional, no ácido, de gran aporte proteico, representante de la variedad de quesos frescos, además es de fácil preparación, pero como es claro dicha preparación puede diferir en los procedimientos de acuerdo a la empresa o productor que elabore el queso 29 , aun así se deben respetar parámetros mínimos en la elaboración del alimento, para dicha preparación se debe llevar un proceso de coagulación de la leche entera pasteurizada (ha sido llevada a altas temperaturas para eliminar microorganismos no deseados), Posteriormente al proceso de cuajado que se realiza mediante la acción de una enzima, el queso es escurrido, moldeado y prensado para eliminar el exceso de agua; el queso campesino conserva una cantidad mayor de líquido en comparación con otros tipos de quesos ya que en su elaboración no es llevado a cocción o maduración lo cual permite que se conserve más agua en su interior y asi su tiempo de consumo se ve disminuido. La temperatura del almacenamiento de este producto debe ser de 4 +-2ºC, bajo estas condiciones puede ser apto para el consumo hasta 20 días después de abierto el empaque, por supuesto debe consumirse en el menor tiempo posible 30 . La elaboración de queso campesino es un proceso físico y químico-biológico, en el cual se obtiene un producto por coagulación de la leche gracias a la acción de tres factores: a) Acción de una enzima (cuajo) b) Control adecuado de la acidez. c) Control adecuado de la temperatura. La interacción de los tres factores produce un alimento de fácil conservación y de gran aporte nutricional 31 . 9.3. Factores de conversión energéticos. 9.3.1. Sistema general del factor At-Water. Para la identificación de los valores energéticos dentro de los alimentos que son aporte principalmente de constituyentes primordiales como carbohidratos, lípidos, y proteínas, presentes en los mismos, se han establecido parámetros de referencia energéticos específicos al tipo de alimento teniendo en cuenta la cantidad encontrada de nutrientes y su respectivo valor energético aportado. El sistema de factores fue desarrollado inicialmente a finales del siglo XIX por WO Water y sus colegas en el departamento de agricultura de los estados unidos, el sistema es basado en los calores de combustión de proteínas, grasas e hidratos de carbono, que son corregidos teniendo en cuenta pérdidas ocurridas durante los procesos de digestión, absorción y excreción urinaria, el factor se aplica a cada sustrato alimenticio de manera independiente a la fuente de donde provengan, los valores energéticos están dados así: 7 kJ / g (4,0 kcal / g) para la proteína, 37 kJ / g (9,0 kcal / g) para grasas, y 7 kJ / g (4,0 kcal / g) para carbohidratos 31 . 9.3.2. Sistema específico del factor Atwater. Este sistema fue propuesto como una precisión al sistema general anteriormente descrito; es así como se afirma que las composiciones difieren de acuerdo al alimento de interés, a manera de ejemplo podemos contemplar el contenido proteico de una patata y una muestra de arroz, sin duda cambiarán por su composición en aminoácidos, también se proponen cambios de acuerdo a procesos sufridos por el tratamiento de los alimentos, como ejemplo se puede mencionar dos muestras de harina de trigo una mucho más molida que la otra, presentará variaciones en sus contenidos nutricionales es así como se proponen los factores de conversión de AtWater específicos para cada alimento, y que presentamos a continuación: Tabla 5. Factores específicos Atwater para algunos alimentos 32. Grupo de Alimentos Alimento especifico Proteína kcal/g (kJ/g) Grasa kcal/g (kJ/g) Carbohidrato total kcal/g (kJ/g) Huevos, productos cárnicos, productos lácteos Huevos 4,36 (18,2) 9,02 (37,7) 3,68 (15,4) Carne / pescado 4,27 (17,9) 9,02 (37,7) * Leche / P. lácteos 4,27 (17,9) 8,79 (36,8) 3,87 (16,2) Grasas y aceites Mantequillas 4.27 (17.9) 8.79 (36.8) 3.87 ((16.2) Margarina vegetal 4.27 (17.9) 8.84 (37.0) 3.87 ((16.2) Otras grasas y aceites ----- 8.84 (37.0) ---- Frutas Todas excepto limones y limas 3.36 (14.1) 8.37 (35.0) 3.60 (15.1) Jugo de frutas excepto limón y limas 3,36 (14.1) 8.37 (35.0) 3.92 (16.4) Limón y limas 3.36 (14.1) 8.37 (35.0) 2.48 (10.4) Jugo de limón, jugo de lima 3.36 (14.1) 8.37 (35.0) 2.70 (11.3) Cereales y productos derivados Cebada perlada 3.55 (14.9) 8.37 (35.0) 3.95 (16.5) Harina de maíz 2.73 (11.4) 8.37 (35.0) 4.03 (17.9) Avena, y harina de avena 3.46 (14.5) 8.37 (35.0) 4.12 (17.2) Arroz integral 3.41 (14.3) 8.37 (35.0) 4.12 (17.2) Tabla modificada de: Reyes, Gómez, Espinoza, Bravo y Ganoza. 2009 32 Por su puesto se involucra dentro de la determinación de los factores específicos a cada alimento, las posibles pérdidas energéticas que se dan durante los diversos procesos metabólicos en el organismo, en este sentido se debe tener claridad que al aceptar la utilización de los factores establecidos para el cálculo de la energía metabolizable (EM) en un alimento, se aceptan también las siguientes asunciones 33, 34 : 1. La energía bruta de diferentes proteínas, lípidos y carbohidratos es constante en todos los alimentos. 2. Las medidas de digestibilidad aparente dan una indicación exacta de la energía disponible 3. Los coeficientes de digestibilidad aparente son constantes para todos los alimentos 4. La digestibilidad no varía de manera de manera significativa entre individuos 5. Las pérdidas a través de la orina excretada no varían de manera significativa entre individuos 6. Las perdidas gaseosas son poco significativas 7. Las contribuciones de carbohidratos no disponibles son prácticamente nulas. Valores de Energía: expresados en kilocalorías (kcal) y en kilojulios (kJ), correspondiendo la equivalencia de 4.184 kJ por 1 kcal 33 . a) Cuando se cuenta con el dato de fibra dietaría, se consideran los carbohidratos disponibles. b) Cuando no se tiene el dato de fibra dietaría, se consideran los carbohidratos totales. Proteína: valores calculados a partir del valor de nitrógeno total determinado por Kjeldhal, multiplicado por el factor específico según el alimento. Lípidos: corresponde a los lípidos totales (triglicéridos, fosfolípidos, esteroles y compuestos relacionados), extraídos con solvente orgánicos, en una muestra previamente desecada. Carbohidratos totales: Se pueden obtener restando de 100, el peso en gramos de los macro componentes, según la siguiente fórmula: Carbohidratos totales (g) = 100 – (proteína + grasa + agua + ceniza + alcohol) Carbohidratos disponibles: hace referencia a aquellos que pueden ser digeridos por las enzimas humanas, absorbidos y que entran al metabolismo (no incluyen fibra dietaría, se obtiene mediante la fórmula: Carbohidratos disponible (g) = 100 – (proteína + grasa + agua + ceniza + alcohol + fibra dietaría) 9.4. Calorimetría. La calorimetría se puede definir como la ciencia que se ocupa de la investigación de las propiedades termodinámicas de las sustancias, específicamente de la medición precisa de la energía y la entalpia, para la medición calorífica de las muestras establecidas en el presente trabajo se utilizara el calorímetro IKA-C2000 BASIC, el equipo presenta diversas variables para el manejo de muestras, y condiciones de medición de las mismas 35 Un calorímetro es básicamente un recipiente con dos cámaras. La primera cámara tiene la sustancia a medir, mientras la segunda cámara tiene un volumen medido de agua. Estas dos cámaras están separadas por una paredde metal que conduce el calor de la reacción con el agua sin dejar que se mezclen. Ambos están aislados por lo que el calor se queda dentro del calorímetro tanto como sea posible. Un termómetro mide la temperatura del agua, este termómetro es sellado alrededor del calorímetro para evitar que el calor y el agua se escapen. El sistema calorímetro IKA C 2000 se utiliza habitualmente para la determinación del poder calorífico bruto de sustancias sólidas y líquidas. El sistema se caracteriza por el manejo de los siguientes factores: 35 Dispone de procedimientos automatizados de medición. llenado de oxígeno integrado. Detección automática del recipiente de disgregación (DV) Funcionamiento sin la unidad de refrigeración: La conexión a un grifo de agua; temperatura oscilar 12 ° C - 28 ° C; consumo de agua por medición sobre 4 l; presión del agua 1 bar máx. 1,5 bar; a presiones más altas, utilice C 25. Funcionamiento con unidad de refrigeración activa Medición y cálculo del valor calorífico bruto según la norma DIN 51900, ISO 1928, ASTM D240, ASTM D4809, ASTM D5865, ASTM D1989, ASTM D5468, ASTM E711 Cálculo del valor calorífico neto de acuerdo con la norma DIN 51900, ASTM D240, ASTM D4809, ASTM D5865, ASTM D1989, ASTM D5468, ASTM E711 Rango de medición: max. 40000 J El modo de funcionamiento está basado en el principio isoperibólico o dinámico A 25 ° C o 30 ° C. Un calorímetro isoperibólico mantiene constante la temperatura de los alrededores mediante el uso de un termostato, mientras que la temperatura del sistema de medida puede variar con el tiempo. Existe una resistencia térmica RT, de magnitud definida entre los alrededores y la celda donde se realiza la medida, de tal forma que el intercambio de calor depende de la diferencia de temperatura entre estos (AT es igual a la temperatura de los alrededores y CT igual a la temperatura de la celda y sistema de medida); como AT es constante entonces el flujo de calor es una función de TC. Si la generación de calor dentro de la celda se termina, la temperatura TC se aproxima a la temperatura de los alrededores TA. 10. METODOLOGIA. A continuación se describen los principales aspectos metodológicos que se desarrollaron para la preparación de las muestras de alimentos y ensayos químicos de análisis, para la determinación de las aportaciones energéticas de lípidos, carbohidratos y proteínas para las muestras comerciales y CBA. 10.1. Análisis próximo de la leche. Para realizar una caracterización inicial de la leche se lleva a cabo lo que es conocido como análisis proximal, este análisis consiste en una serie de análisis que son implementados con la finalidad de conocer las características más importantes del alimento, dentro de dichos parámetros encontramos: a. Porcentaje de Proteínas. b. Contenido de grasa. c. Densidad. d. Extracto seco. El análisis proximal de la leche se realizara haciendo uso del analizador de leche Lactosan, proporcionado por el laboratorio de microbiología del Centro de Biotecnología de los Alimentos (CBA), del Sena de Mosquera, los resultados obtenidos fueron: Tabla 6. Contenidos químicos principales para leche fresca. Valores químicos obtenidos para Leche fresca Parámetro Analítico. Valores Grasa 4.24% Solidos no grasos 8.23% Densidad 31.17% Proteína 3.05% Lactosa 4.48% Agua adherida 1.17% Solidos 0.58% Punto de congelación 0.513 0 C T muestra 13 0C 10.2. Preparación de queso pera (CBA) La muestra de queso pera se elaboró a partir del uso de 200 litros de leche fresca y una adición de 0.28 litros de ácido láctico calculado mediante cuadrado de Pearson; posteriormente el cuajo actuó bajo agitación lenta ya a una temperatura a 35centigrados durante una hora, una vez la acidez llega a los 24 ± 2 grados D 0 el queso se hilo en salmuera (600 g de sal/10L de suero) a una temperatura de 70 C 0 Diagrama 2. Preparación del queso pera. 10.3. Preparación de queso campesino (CBA) El queso campesino se elaboró a partir de 60 litros de leche fresca con una acidez de 18 D 0 , la temperatura se llevó posteriormente a 50 C bajo agitación constante, se dejó reposar hasta disminuir la temperatura a 40 C, momento en el cual se agregó 12 g de CaCl2 (0,2 g / L de leche), se dejó disminuir la temperatura hasta 35 C y se adiciono 3 ml de cuajo (0,05 ml de cuajo / L de leche), se dejó reposar a 35 C durante 40 minutos, se cortó la cuajada, posteriormente se de-suero adicionando 1.3 g de sal / L de leche, seguido a esto se llevó a prensado durante una noche. Diagrama 3. Preparación del queso Campesino. 10.4. ANALISIS QUIMICOS DE QUESOS. 10.4.1. Proteína total. Método Kjeldhal. El siguiente es el método Kjeldhal tradicional para aplicación en muestras sólidas, este consta de 3 pasos fundamentales: digestión, destilación, y valoración, a continuación se describe la metodología de cada una de las fases del proceso: Digestión. Pesar 1 / 0.2g de muestra e introducir en un tubo de Kjeldhal, y agregar 0.15g de sulfa- to de cobre pentahidratado, 2.5g de sulfato de potasio o sulfato de sodio y 10 mL de ácido sulfúrico concentrado. Calentar hasta total destrucción de la materia orgánica, es decir hasta que el líquido quede transparente, con una coloración azul verdosa. A continuación se debe permitir un enfriamiento parcial de los tubos. 36 Destilación. En un matraz Erlenmeyer de 250 mL adicionar (según se indique) 50 mL de HCl 0.1N y unas gotas de indicador rojo de metilo .1% o bien 50 mL de ácido bórico 4% con indicadores Conectar el equipo de destilación y esperar unos instantes para que se ge- nere vapor. Colocar el tubo de digestión con la muestra diluida y las sales disueltas en un volumen no mayor de 10 mL de agua destilada, en el aparato de destilación cuidan- do de introducir la alargadera hasta el fondo de la solución 32 . Titular el exceso de ácido (en el caso de recibir el destilado en HCl 0.1N) con una so- lución de NaOH 0.1 N. En el caso de recibir con ácido bórico, con una solución de HCl 0.1N. Calcular el % de proteína considerando las reacciones que se llevan a cabo. 36, 37. Ecuaciones de reacción involucradas en el método Kjeldhal Digestión. (1) n - C -NH2 + mH2SO4 → CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2 Proteína calor→ Neutralización y destilación. (2) (NH4)2SO4 + 2 NaOH → 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O (3) NH3 + H3BO3 (ácido bórico) → NH4 + H2BO3- (Ión borato) Titulación. (4) H2BO3- + H+ → H3BO3 Diagrama 4. Método Kjeldhal. 10.4.2. LÍPIDOS. Métodos de extracción y cuantificación de lípidos. Podemos mencionar que se encuentran diversos métodos de extracción, para hablar de aquellos con disolventes orgánicos encontramos: método Soxhlet, método Goldfish, método mojonnier, además se pueden encontrar métodos desarrollados según las pro- piedades de los lípidos en sí, adicionalmente se encuentran técnicas instrumentales (infrarrojo, densidad, Cromatografia). Método de Soxhlet. El método soxhlet se utilizó únicamente para la extracción de grasas destinadas a este- rificación, y posterior análisis cromatográfico. Para ello se empleó el equipo extractor Buchi, provisto de cuatro cámaras de extracción independientes, con sistema de calen- tamiento para balón y cámara y control automatizado digital. Se empleó como solvente éter de petróleo grado analítico (60 mL por cámara), y 3 gramos de muestra triturada, el calentamiento se realizó aproximadamente por dos horas a 9 grados de calentamiento para el balón y 2 grados de calentamiento para la cámara de muestra hasta que el éter tomó un color amarillo. De esta solución se toma- ron las muestras para el proceso de esterificación. 10.4.2.1. Método Gerber para grasas. El método de Gerber se basa en la acción delácido sulfúrico sobre la materia orgánica (excepto las grasas) realizando una digestión parcial de la misma, una vez este proceso se ha dado, el alcohol isoamílico reacciona con el ácido sulfúrico formando un Ester, y ayudando a la disminución de la tensión en la interfase entre la grasa y la mezcla de reacción, de esta manera y con ayuda de un butirómetro se puede medir por centrifu- gación el ascenso y separación de los glóbulos de grasa determinando asi el contenido en porcentaje de la misma. 38 Se Pesa directamente en la copa fijada en el tapón del Butirómetro 3 g ± 0.001 g de queso, se mete la copa con la muestra de queso dentro del butirómetro, Por la abertura superior, del butirometro se agrega 10 cm3 de ácido sulfúrico de tal manera que recu- bra todo el queso, se tapa la abertura y colocarlo en baño de agua a 338 K (65ºC) por 30 minutos, agitar cuidadosamente 2 o 3 veces durante ese lapso, para disolver todas las partículas de queso, seguidamente se agrega 1 cm 3 de alcohol isoamílico o amílico y se agita. Se Termina de llenar el butirómetro con ácido sulfúrico hasta que el volumen llegue aproximadamente tres cuartas partes de la columna graduada, se tapa la abertura supe- rior y se sumerge nuevamente al baño de agua por 5 minutos, Se Mezcla muy bien antes de centrifugar a 1,200 r.p.m., durante 5 minutos, Posterior al centrifugado se sumerge nuevamente el butirómetro al baño de agua durante 10 minutos, se realiza la lectura llevando la base de la columna de grasa exactamente al cero por medio de pre- sión en el tapón del butirómetro. La lectura observada en la escala indica directamente la cantidad en porcentaje de la grasa contenida en el queso. 38 Diagrama 5. Cuantificación de grasas totales por el método Gerber. 10.4.2.2. Determinación de ácidos grasos Para la determinación de ácidos grasos se plantean 2 procedimientos generales: la ex- tracción de los ácidos grasos, y su cuantificación, esto se aplicará para todas las mues- tras de quesos tanto las muestras elaboradas en las instalaciones como las comerciales evaluadas; así se proponen los siguientes procedimientos: Extracción y esterificación de ácidos grasos Se plantea para la extracción de grasa el Método Soxhlet (AOAC, 920.39) modificado, y el método cromatográfico (996.06 AOAC). 39 Se debe pesar 4 gramos de la muestra de queso, a esta se debe picar finamente y secar durante 2 horas a temperatura no mayor a 40 grados centígrados, posteriormente la muestra se envuelve en un papel filtro cuantitativo, de diámetro adecuad se pone la muestra dentro de la cámara del equipo Soxhlet, Se agrega a continuación éter de pe- tróleo grado analítico, el éter de petróleo se debe dejar circular hasta que esté presente un color amarillento, seguido se toman 4 gotas de la muestra de ácidos grasos extraí- dos, se colocan en un tubo de ensayo, se adicionan 0.8 mililitros de hexano, y 0.5 mili- litros de KOH (solución en metanol 2M), se agita en vortex y se deja reposar por 10 minutos. De la fase de hexano se deben tomar 0.3 mililitros y se diluye con 4 mililitros de he- xano adicional, posteriormente se debe agregar 1 gramo de sulfato de sodio, se agita y se deja reposar nuevamente por 10 minutos; La muestra ya está lista para la inyección, se inyecta 1 microlitro de muestra al cromatógrafo 39 . Diagrama 6. Extracción y esterificación de ácidos grasos. Condiciones del método A continuación se presentan las condiciones generales implementadas en el cromatógrafo de gases acopado a masas, utilizado para la identificación de acidos grasos en las muestras de quesos: Nº de enjuagues con disolvente: 5 Nº de enjuagues con la muestra: 3 Velocidad de succión del émbolo: Alta Velocidad de inyección del embolo: Medio Velocidad de inserción de la jeringa: Alta Modo de inyección: Largo Tiempos de Bombeo: 3 Tiempo de permanencia en puerto de inyección: 0,3 s Velocidad de lavado del émbolo: Alto Volumen de lavado: 8μL Temperatura del horno: 60.0 ° C Temperatura de inyección. : 250.00 ° C Modo de inyección: Splitless Tiempo de muestreo: 1,00 min Modo de control de flujo: Velocidad linear Presión: 72,8 kPa Flujo total: 14.2 ml / min Flujo de la columna: 1,20 ml / min Velocidad lineal: 40,0 cm / s Flujo de purga: 1,0 ml / min Relación de Split: 10.0 Temperatura de la fuente de iones: 230.00 ° C Temperatura de la interface. : 275.00 ° C Tiempo de inicio: 4.00min Tiempo de finalización: 35.00min 10.4.3. Carbohidratos. Métodos de extracción y cuantificación de carbohidratos. Método Fenol-sulfúrico: Este método fue propuesto por Dubois et al en 1956 y su fundamento consiste principalmente en que los carbohidratos son sensibles a ácidos fuertes y altas temperaturas. Por lo cual, surgen diferentes reacciones complejas que sugieren una deshidratación, y consecuentemente la producción de varios derivados del Furano que al condensarse tienden a producir diversos compuestos coloreados de fácil identificación. Es un método muy eficaz y posee un intervalo de sensibilidad de 10-100µg/mL. Todos los oligosacáridos y polisacáridos pueden ser determinados, ya que éstos bajo hidrólisis ácida producen monosacáridos. 10.4.3.1 Desproteinización de las muestras. Se pesan 2g de muestra y se suspenden en 20 mL agua desmineralizada. Posteriormen- te homogenizar. Se Filtra y se toman 10 mL del filtrado, a este luego se le adiciona 1 mL de una solución de Sulfato de Zinc al 10% y 1 mL de NaOH 0.5 N. Se debe man- tener en reposos durante 15 minutos y luego centrifugar a 200 rpm durante 15 minu- tos. El sobrenadante es utilizado para la cuantificación de azúcares totales. Nota: El procedimiento se completa para cada tubo antes de continuar con el siguien- te. Para este método se prepara una solución o suspensión de la muestra en agua teniendo en cuenta el nivel de sensibilidad del método (10-100μg/mL). Posteriormente en tubos de ensayo ya etiquetados, se adiciona 1mL de la solución o suspensión ya preparada, y luego a cada tubo se adiciona 0.6mL de una solución acuosa de fenol al 5%. Y cuida- dosamente se le agrega 3.6mL de ácido sulfúrico concentrado. Dada la mezcla se ho- mogeniza. Se deja enfriar la mezcla a temperatura ambiente por media hora y luego por medio de un espectrofotómetro a 480nm se determina la intensidad del color naranja comparán- dolo con un blanco preparado con agua. La cantidad de carbohidratos presentes se determina a partir de una curva de calibración preparado con el carbohidrato de interés (lactosa) y tratada de la misma manera que la solución problema, teniendo en cuenta el intervalo de sensibilidad del método 19 10.4.4. Calorimetría Procedimiento: para asegurar una muestra que sea aceptada porel calorímetro IKA- C2000 se debe secar previamente de tal forma que las muestra volatilice la mayor parte de agua que pueda contener, se debe tener especial atención en el flujo adecuado de oxígeno y entrada de agua en el equipo. La muestra una vez seca, debe estar lo más fina posible para el proceso de empastillado, se debe obtener una cantidad de muestra de 1 gramo por pastilla. A continuación se sujeta a la parte superior de la bomba calorimétrica la muestra, esto con ayuda de hilos especiales, y haciendo uso exclusivamente de pinzas de acero para dicho fin. La bomba se cierra y se dispone en el equipo calorimétrico. Se ajusta el rango y tiempo de calentamiento, y se espera a la lectura de datos 11. RESULTADOS. 11.1. Porcentaje de humedad. Los valores que se presentan a continuación se calcularon sobre materia en base seca (MBS), para ello se determinaron con anterioridad los valores de humedad a las muestras evaluadas, valores que se presentan en la siguiente tabla: Para la determinación de los valores expresados como materia en base seca (MBS), se empleó la ecuación siguiente: Dónde: (A determinar) La ecuación aplica también para los cálculos de cantidad de proteína y carbohidratos. Tabla 7. Porcentajes de humedad. Muestra Peso de la muestra (g) (Prev.C) Peso de la muestra (g) (Post. C)+ % Humedad Prm SD IC Promedio de humedad Pera CBA 9.28740 9.30200 9.29301 6.1324722 6.1337388 6.1333866 33.97 34.06 34.00 34.01 0.037 34.01±0.062 34.01 % Pera Lozárte 8.83420 8.87840 8.79350 4.5186933 4.5386380 4.4899611 48.85 48.88 48.94 48.89 0.045 48.89±0.075 48.89 % Pera 9.85745 9.89900 9.889096 4.9770265 4.905700 4.9900378 49.51 49.60 49.54 49.55 0.045 49.55±0.075 49.55 % Pampanini Campesino CBA 10.12533 10.06450 10.11322 6.8558609 6.823731 6.8597971 32.29 32.20 32.17 32.22 0.188 32.22±0.316 32.22 % Campesino Colánta 9.66323 9.69654 9.77345 4.7137235 4.7144500 4.6354432 51.22 51.38 51.27 51.29 0.081 51.29±0.136 51.29 % Campesino Colactéos 10.09783 10.20423 10.10999 6.9574048 7.0072447 6.9556731 31.10 31.33 31.20 31.21 0.115 31.21±0.193 31.21 % Campesino Úbate 10.34567 10.01394 10.54987 5.7687455 5.5987938 5.8921023 44.24 44.09 44.15 44.16 0.110 44.19±0.185 44.16 % Pera del Vecchio 9.69999 9.71943 9.87666 6.0760737 6.0843631 6.1729125 37.36 37.40 37.50 37.42 0.072 37.42±0.121 37.42 % Campesino nicolacteos 9.10768 9.15230 9.87792 4.8179627 4.8232621 45.177027 47.10 47.30 47.59 47.33 0.246 47.33±0.414 47.33 % Campesino las delicias 9.78992 9.73354 9.68754 6.7795196 6.73560968 6.6813026 30.75 30.80 31.00 30.85 0.132 30.85±0.222 30.85% Tabla 8. Porcentajes calculados de grasa en base seca (g/BS), para las diversas muestras de queso 11.2. Valores brutos (g X/ gMS, y J/g) para cada ensayo independiente. Tabla 9. Gramos de grasa en base seca y energía aportada por las diversas muestras de queso. Usando: Muestras g grasa/g muestra BS 1 g grasa/g muestra BS 2 g grasa/g muestra BS 3 Energía aporta- da 1 J/g Energía apor- tada 2 J/g Energía aporta- da 3 J/g Pera CBA 0.4799g 0.4949g 0.4950g 17660 18212 18216 Pera Lozárte 0.5252g 0.5247g 0.5332g 19327 19308 19621 Pera Pampanini 0.5997g 0.6600g 0.6452g 22068 24288 23743 Campesino CBA 0.6444g 0.6600g 0.6452g 23713 24288 23743 Campesino Colánta 0.8099g 0.7947g 0.7803g 29804 29244 28715 Campesino Colactéos 0.4652g 0.4503g 0.4500g 17119 16571 16560 Campesino Úbate 0.5393g 0.5399g 0.5705g 19846 19868 20994 Pera Del vecchio 0.6450g 0.6148g 0.6302g 23736 22624 23191 Campesino Nicolacteos 0.3297g 0.3998g 0.3998g 14708 14675 14712 Muestra % de grasa (BH) (Triplicados) SD Muestra BH (g) 1 Muestra BH (g) 2 Muestra BH (g) 3 Muestra BS (g) 1 Muestra BS (g) 2 Muestra BS (g) 3 % G BS 1 %G BS 2 %G BS 3 Pera CBA 16.0 16.5 16.5 0.235 3.0003 3.0002 3.0006 1.9799 1.97983 1.9800 24.24% 25.00% 25.00% Pera Lozárte 17.5 17.5 18.0 0.235 3.0012 2.9988 3.0010 1.5339 1.5329 1.5338 34.24% 34.23% 35.21% Pera Pampanini 20.0 23.0 24.0 1.699 2.9992 3.0002 3.0020 1.5130 1.5136 1.5145 39.64% 45.58% 47.57% Campesino CBA 21.5 22.0 21.5 0.235 2.9985 3.0012 3.0013 2,0323 2.0342 2.0342 31.72% 32.45% 31.72% Campesino Colánta 27.0 26.5 26.0 0.408 2.9999 2.9993 3.0017 1.4612 1.4609 1.4621 55.43% 54.40% 53.37% Campesino Colactéos 15.5 15.0 15.0 0.235 3.0020 3.0018 3.0011 2.0650 2.0649 2.0644 22.53% 21.81% 21.80% Campesino Úbate 18.0 18.0 19.0 0.471 2.9996 3.0010 3.0017 1.6749 1.6757 1.6761 32.20% 32.22% 34.02% Pera Del vecchio 21.5 20.5 21.0 0.408 3.0009 3.0002 3.0016 1.8779 1.8775 1.8784 34.35% 32.75% 33.55% Campesino Nicolacteos 11.0 11.0 11.0 0.000 2.9990 2.9994 2.9998 1.5795 1.5797 1.5799 20.88% 20.88% 20.88% Pera las delicias 19 19 19.5 0.235 2.9994 2.9992 2.9999 2.0740 2.0739 2.0744 27.47% 27.47% 28.19% Pera las delicias 0.5697g 0.5696g 0.5847g 20864 20961 21516 Tabla 10. Gramos calculados de lactosa por gramos de base seca (g Lac/ g BS) Muestra Muestra g/0,02L agua Absorbancias experimentales (triplicados) 1,2,3 Prom A SD Dilución % humedad Concentración (g/L) 1,2,3 g lac/ g muestra (BS) Pera CBA 2,0030 0,534 0,532 0,532 0,5326 9.42*10-4 1 a 5 34.01 % 0.2674325115 5.34865023*10-3 0.2674325106 5.348650212*10-3 0.2674325127 5.348650254*10-3 Pera Lozárte 2,0051 0,320 0,321 0,320 0,3203 4..71*10-4 1 a 5 48.89 % 0.1592704000 3.185408*10-3 0.1592703960 3.18540792*10-3 0.1592704040 3.18540808*10-3 Pera Pampanini 1,9997 0,495 0,491 0,493 0,4930 9.42*10-4 1 a 5 49.55 % 0,2472571930 4.94514386*10-3 0,2472571976 4.945143952*10-3 0,2472571956 4.865143912*10-3 Campesino CBA 1,9980 0,896 0,896 0,897 0,8963 0.019 1 a 12 32.22 % 1,0865508990 0.021731010 1,0865509070 0.021731018 1,0865509140 0.021731018 Campesino Colánta 2,0100 0,937 0,933 0,937 0,9356 0.095 1 a 12 51.29 % 1,1338711930 0.022677423 1,1338711300 0.022677422 1,1338712560 0.022677425 Campesino Colactéos 2,0053 0,735 0,733 0,733 0,7340 9.42*10-4 1 a 12 31.21 % 0,8880991596 0.017761983 0,8880991497 0.017761982 0,8880991696 0.017761983 Campesino Úbate 2,0019 0,711 0,713 0,713 0,7123 9.42*10-4 1 a 12 44.16 % 0,8615655620 0.017231311 0,8615655721 0.017231311 0,8615655520 0.017231311 Pera las delicias 2,0021 0,466 0,460 0,464 0,4633 2.49*10-3 1 a 5 37.42 % 0,2319728641 4.639457282*10-3 0,2319728652 4.639457304*10-3 0,2319728652 4.639457304*10-3 Pera del Vecchio 1,9991 0,889 0,885 0,888 0,8873 6.01*10-3 1 a 12 47.33 % 1,0755461870 0.0215109230 1,0755462880 0.0215109250 1,0755463890 0.0215109270 Campesino Nicolácteos 1,9987 0,431 0,431 0,433 0,4316 9.42*10-4 1 a 5 30.85 % 0,2159752638 4.319505276*10-3 0,2159752659 4.319505318*10-3 0,2159752680 4.319505360*10-3 Valores experimentales para curva de calibración: r= 0.9995 A= 7.684931507*10-3 B= 9.813972603*10-3 Tabla 11. Energía aportada en Julios por cada gramos de grasa (J/g), usando el factor At- Water Muestra G Lac/ g BS Energía aportada J/g Pera CBA 5.34865023*10 -3 86.6481 5.348650212*10-3 86.6481 5.348650254*10-3 86.6481 Pera Lozárte 3.185408*10 -3 51.6022 3.18540792*10-3 51.6036 3.18540808*10-3 51.6036 Pera Pampanini 4.94514386*10 -3 80.1113 4.945143952*10-3 80.1113 4.865143912*10-3 80.1113 Campesino CBA 0.021731010 352.042 0.021731018 352.042 0.021731018 352.042 Campesino Colánta 0.022677423 367.374 0.022677422 367.374 0.022677425 367.374 Campesino Colactéos0.017761983 287.741 0.017761982 287.741 0.017761983 287.741 Campesino Úbate 0.017231311 279.147 0.017231311 279.147 0.017231311 279.147 Pera las delicias 4.639457282*10 -3 75.1592 4.639457304*10-3 75.1592 4.639457304*10-3 75.1592 Pera del Vecchio 0.0215109230 34.8476 0.0215109250 34.8476 0.0215109270 34.8476 Campesino Nicolácteos 4.319505276*10-6 69.9754 4.319505318*10-6 69.9754 4.319505360*10-6 69.9759 Tabla 12. Gramos calculados de glucosa por gramos de base seca (g Glu/ g BS) Valores experimentales obtenidos para la curva de calibración: Muestra Muestra g/0,02L agua Absorbancias (triplicados) Prom Abs. SD Dilución % H Concentración (g/L) 1,2,3 g lac/ g muestra (BS) Pera CBA 2,0080 0,356 0,357 8.16*10-4 1 a 5 0,355 0.356 34.01 % 0,3083381272 6.166762544*10-3 0,3083381173 6.166762346*10-3 0,3083381374 6.166762748*10-3 Pera Lozárte 1,9991 0,327 0.329 9.42*10-4 1 a 5 0,327 0.3276 48.89 % 0,2827261346 5.65452268*10-3 0,2827261375 5.65452275*10-3 0,2827261314 5.65452628*10-3 Pera Pampanini 2,0011 0,309 0,309 4.96*10-3 1 a 5 0,308 0,3086 49.55 % 0,2655913504 5.311827008*10-3 0,2655914505 5.31182901*10-3 0,2655912506 5.311825012*10-3 Campesino CBA 2,0005 0,472 0,473 4.71*10-4 1 a 5 0,473 0,4736 32.22 % 0,4143934215 8.28786843*10-3 0,4143934115 8.28786823*10-3 0,4143934315 8.28786863*10-3 Campesino Colánta 1,9998 0,424 0,425 4.71*10-4 1 a 5 0,425 0,4246 51.29 % 0,3702037055 7.70407411*10-3 0,3702037156 7.404074312*10-3 0,3702037257 7.404074514*10-3 Campesino Colactéos 2,0013 0,565 0,565 9.42*10-4 1 a 5 0,565 0,565 31.21 % 0,4968207405 9.93641481*10-3 0,4968207504 9.936415008*10-3 0,4968207606 9.936415212*10-3 Campesino Úbate 2,0004 0,411 0,412 0 1 a 5 0,413 0,412 44.16 % 0,3588406384 7.176822768*10-3 0,3588406484 7.176822968*10-3 0,3588406584 7.176813168*10-3 Pera las delicias 2,0023 0,339 0.339 4.71*10-4 1 a 5 0,338 0,3386 37.42 % 0,2926461624 5.852923248*10-3 0,2926462725 5.85292545*10-3 0,2926463526 5.852927052*10-3 Pera del Vecchio 1,9989 0,454 0,455 9.42*10-4 1 a 5 0,453 0,454 47.33 % 0,3967175291 7.934350582*10-3 0,3967175392 7.934350784*10-3 0,3967175493 7.934350986*10-3 Campesino Nicolacteos 2,0045 0,232 0,232 8.16*10-4 1 a 5 0,231 0.2316 30.85 % 0,1961502740 3.92300584*10-3 0,1961503841 3.923007682*10-3 0,1961504942 3.923009884*10-3 r= 0.9994, A= 0,01409756098, B= 5,544277674*10-3 Tabla 13. Energía aportada en Julios por cada gramo de lactosa (J/g BS), usando el factor At-Water Tabla 14. Gramos de proteína por cada gramo de muestra seca (g P/ g BS) Muestra v1 v2 v3 m1 m2 m3 %1 %2 %3 gP/Ms1 gP/Ms2 gP/Ms3 Pera cba 13.5 13.6 13.1 1,00320 0,99810 1,02090 34.6220 35,0567 33,0137 0,2292 0,23089 0,22241 lozarte 12,6 12,2 12,4 1,01030 0,98990 0.99770 41,428 40,939 41,285 0,21391 0,20712 0,21052 pampanini 14,1 14,5 15,0 0,97991 0,89985 1,10752 48,423 54,227 45,578 0,23938 0,24617 0,25466 Camp cba 12,1 12,0 12,0 1,00550 0,99728 1,01072 30,143 30,140 29,739 0,20543 0,20373 0,20373 colanta 11,0 11,2 10,9 0,99485 1,05740 0,98783 38,539 36,918 38,460 0,18675 0,19014 0,18505 colacteos 10,1 10,9 10,4 0,91120 0,99270 1,12250 27,356 27,099 22,866 0,17147 0,18505 0,17656 ubate 10,0 10,0 10,3 1,01575 1,00125 0,99980 29,933 30,366 31,323 0,16977 0,16977 0,17487 Del vec- chio 11,1 11,7 11,3 1,01421 0,99899 0,97750 29,692 31,774 31,362 0,18845 0,19864 0,19184 nicolacteos 11,2 11,2 10,9 1,00569 1,01070 0,99981 35,898 35,720 35,142 0,19015 0,19015 0,18505 Las deli- cias 12,0 12,5 12,1 1,00673 0,99818 1,00019 29,265 30,746 29,702 0,20372 0,21222 0,20542 Tabla 15. Energía aportada en Julios por cada gramo de proteína (J/g BS) muestra gramos Energía J/g Pera CBA 0,2292 4102,68 0,23089 4132,931 0,22241 3981.139 Pera Lozárte 0,21391 3828,989 0,20712 3707,448 0,21052 3768,308 Pampanini 0,23938 4284,902 Muestra g Lac/ g BS Energía aportada J/g Pera CBA 6.166762544*10 -3 0.099901553 6.166762346*10-3 0.099901550 6.166762748*10-3 0.099901556 Pera Lozárte 5.65452268*10 -3 0.091603267 5.65452275*10-3 0.091603268 5.65452628*10-3 0.091603325 Pera Pampanini 5.311827008*10 -3 0.086051597 5.31182901*10-3 0.086051629 5.311825012*10-3 0.086051565 Campesino CBA 8.28786843*10 -3 0.134263468 8.28786823*10-3 0.134263465 8.28786863*10-3 0.134263471 Campesino Colánta 7.70407411*10 -3 0.12480600 7.404074312*10-3 0.119946003 7.404074514*10-3 0.119946007 Campesino Colactéos 9.93641481*10 -3 0.160969919 9.936415008*10-3 0.160969923 9.936415212*10-3 0.160969926 Campesino Úbate 7.176822768*10 -3 0.116264582 7.176822968*10-3 0.116264532 7.176813168*10-3 0.116264535 Pera las delicias 5.852923248*10 -3 0.094817356 5.85292545*10-3 0.094817392 5.852927052*10-3 0.094817418 Pera del Vecchio 7.934350582*10 -3 0.128536479 7.934350784*10-3 0.128536482 7.934350986*10-3 0.128536486 Campesino Nicolácteos 3.92300584*10 -3 0.063552694 3.923007682*10-3 0.063552724 3.923009884*10-3 0.063552760 0,24617 4406,443 0,25466 4558.414 Camp CBA 0,20543 3677,197 0,20373 3646,767 0,20373 3646,767 Colánta 0,18675 3342,825 0,19014 3403,506 0,18505 3312.395 Colactéos 0,17147 3069,313 0,18505 3312.395 0,17656 3160,424 Ubaté 0,16977 3038,883 0,16977 3038,883 0,17487 3130,173 Del Vecchio 0,18845 3373,255 0,19864 3555,656 0,19184 3433,936 Nicolácteos 0,19015 3403,685 0,19015 3403,685 0,18505 3312,395 Las delicias 0,20372 3646,588 0,21222 3798,738 0,20542 3677,018 11.3. Proteínas totales por el método Kjeldhal. Tabla 16. Gramos de Proteínas totales por gramos de materia seca. Muestra Repeticiones de la valoración con HCl (ml)(triplicado) SD Promedio de las repeticiones (mL) IC Peso de las muestras (Promedio) (g) % de nitrógeno en base seca G proteína / g MS Pera CBA 13.5 13.6 13.1 0.216 13.40 1340±0.364 1.00740 34.230 0.2275 Pera Lozárte 12.6 12.2 12.4 0.163 12.30 12.30±0.274 0.99930 41.217 0.21051 Pera Pampanini 14.1 14.5 15.0 0.368 14.50 14.50±0.620 0.99576 49.409 0.24673 Campesino CBA 12.1 12.0 12.0 0.047 12.03 12.03±0.079 1.00450 30.007 0.20429 Campesino Colánta 11.0 11.2 10.9 0.124 11.03 11.03±0.209 1.01336 37.962 0.18731 Campesino Colactéos 10.1 10.9 10.4 0.329 10.46 10.46±0.554 1.00880 25.773 0.17769 Campesino Úbate 10.0 10.0 10.3 0.141 10.10 10.10±0.237 1.00560 30.540 0.17147 Pera del Vecchio 11.1 11.7 11.3 0.249 11.36 11.36±0.419 0.99690 30.942 0.19297 Campesino Nicolácteos 11.2 11.2 10.9 0.141 11.10 11.10±0.237 1.00540 35.586 0.18711 Pera las delicias 12.0 12.5 12.1 0.216 12.20 12.20±0.364 1.00170 29.904 0.2070 La concentración del ácido clorhídrico previamente estandarizado, y que se usó para el anterior análisis fue de 0.10008 N. 11.4. Grasas totales por el método Gerber Tabla 17. Gramos de grasas totales por gramos de materia seca. 11.5. Carbohidratos solubles 11.5.1. Cuantificación de lactosa. Tabla 18. Curva de calibración cuantificación de lactosa, método fenol-sulfúrico Concentración (mg/L) A 10 0.110 30 0.289 50 0.510 70 0.690 90 0.901 100 0.981 r= 0.9995 A= 7.684931507*10 -3 B= 9.813972603*10 -3 Tabla 19. Cuantificación de lactosa, gramos de lactosa por gramos de materia seca. Muestra Muestra g/0,02L agua Absorbancias experimentales (triplicados) A SD IC dilución % Humedad Concentración (g/L) g lac/ g muestra (BS) Pera CBA 2,0030 0,534 0,532 0,532 0,5326 9.42*10-4 1.58*10-3 1 a 5 34.01 % 0.2674325116 4,046551957*10-3 Pera Lozárte 2,0051 0,320 0,321 0,320 0,3203 4..71*10-4 7.94*10-3 1 a 5 48.89 % 0.1592704 3,108301575*10-3 Pera 1,9997 0,495 0,491 0,493 0,4930 9.42*10-4 1.58*10-3 1 a 5 49.55 % 0,2472571955 4,901769864*10-3
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