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Universidad de La Salle Universidad de La Salle 
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle 
Biología Escuela de Ciencias Básicas y Aplicadas 
2023 
Evaluación del efecto del extracto etanólico de Lippia dulcis Trevir Evaluación del efecto del extracto etanólico de Lippia dulcis Trevir 
sobre promastigotes de Leishmania panamensis sobre promastigotes de Leishmania panamensis 
María Gabriela Torres Ibáñez 
Universidad de La Salle, Bogotá, mtorres52@unisalle.edu.co 
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Torres Ibáñez, M. G. (2023). Evaluación del efecto del extracto etanólico de Lippia dulcis Trevir sobre 
promastigotes de Leishmania panamensis. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/biologia/151 
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Evaluación del efecto del extracto etanólico de Lippia dulcis 
Trevir sobre promastigotes de Leishmania panamensis. 
 
 
 
 
 
 
 
María Gabriela Torres Ibáñez 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Universidad De La Salle 
Departamento de Ciencias Básicas 
Programa de Biología 
Bogotá D.C., Colombia 2023 
 
 
Evaluación del efecto del extracto etanólico de Lippia dulcis 
Trevir sobre promastigotes de Leishmania panamensis. 
 
Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de biólogo 
María Gabriela Torres Ibáñez 
 
 
Directora 
Diana Carolina Ochoa 
Bióloga 
Profesora cátedra 
 
 
Codirectora 
Yenny Yolanda Lozano Jiménez 
Química y Bacterióloga, Doctora en ciencias farmacéuticas 
Profesora asociada 
 
 
 
 
Universidad De La Salle 
Departamento de Ciencias Básicas 
Programa de Biología 
Bogotá D.C., Colombia 2023 
Agradecimientos 
 
Estaré profundamente agradecida con: 
 
Mi directora de proyecto de grado, Diana Carolina Ochoa quien influyo inconmensurablemente en 
mi formación como bióloga, enseñándome cómo se lleva a cabo una investigación. Desde los 
cimientos de la teoría, en el reconocimiento del problema, planteamiento de objetivos y desarrollo 
de la pregunta, hasta el área práctica, con su conocimiento en el manejo de cultivo y técnicas para 
la medición de variables biofísicas, siempre con paciencia, respeto y entrega. Siempre supo 
transmitir su pasión por esta bellísima profesión y no me dejó perder el rumbo aun cuando todo 
parecía muy difícil. 
 
Mi codirectora la Dra. Yenny Yolanda Lozano Jiménez, por instruirme en lo profesional en la 
técnica para la medición de viabilidad celular (MTT) y en lo personal por su inmensa paciencia 
para resolver mis inquietudes siempre con la mejor actitud y darme la oportunidad de realizar el 
proyecto. 
 
El Dr. Abelino Vargas Jiménez, por su constante acompañamiento en los espacios de laboratorio, 
donde fue un asesor en temas referentes a las mediciones de las variables biofísica y siempre me 
permitió ver la investigación desde diferentes puntos de vista, para poder cuestionarme a mí misma 
y poder hacer un mejor ejercicio de análisis. 
 
Mi compañero de vida, Nicolás Lozano a quien me faltan palabras para agradecerle por todo lo 
que ha hecho por mí en este proceso tan arduo. Por su tiempo, entrega, amor, paciencia, respeto y 
empatía. Por las noches de desvelo a mí lado siempre con la mejor actitud y palabras de aliento, 
cuidando de mí física y emocionalmente. 
 
Mi familia por hacer tantos esfuerzos para que yo pudiese llevar a cabo este proyecto, dándome 
siempre un amor incondicional y ganas para seguir. En especial Carolina Ibáñez, Daniel Martínez 
y Gabriel Martínez Ibáñez. Y con mis amigos, quienes me acompañaron incondicionalmente hasta 
altas horas de la noche y estuvieron dispuesto a aprender conmigo, los llevo conmigo siempre. 
Especialmente a Manuela Restrepo, quien me apoyó cuando más perdida me sentía y puso su 
conocimiento a mi disposición. 
 
Finalmente, a las instituciones que hicieron posible el desarrollo de este proyecto de grado. 
 
La Universidad de La Salle, por la formación en el pregrado de biología, proporcionando los 
espacios requeridos para mi desarrollo profesional. La Universidad Nacional de Colombia, 
laboratorio de biofísica, por facilitarme los espacios y equipos necesarios para llevar a cabo este 
estudio. Y, finalmente, a mis compañeros Daniela Paz, Lissa Vargas y Omar Fuerte por su 
paciencia, colaboración y perspectiva. 
Tabla de Contenido 
 
Resumen ................................................................................................................................................................. 6 
Abstract .................................................................................................................................................................. 7 
Introducción ........................................................................................................................................................... 8 
Biología de Leishmania ....................................................................................................................................... 10 
Antecedentes de actividad leishmanicida del extracto etanólico de Lippia spp ................................................... 12 
Objetivos .............................................................................................................................................................. 13 
Objetivo general .......................................................................................................................................... 13 
Objetivos específicos .................................................................................................................................. 13 
Materiales y Métodos ........................................................................................................................................... 13 
Obtención del extracto. ............................................................................................................................... 13 
Estudio fitoquímico preliminar. .................................................................................................................. 14 
Manutención de cultivos ............................................................................................................................. 15 
Medición de variables biofísicas ................................................................................................................. 16 
Resultados ............................................................................................................................................................ 18 
Caracterización fitoquímica preliminar del extracto etanólico L. dulcis ..................................................... 18 
Medición de las variables Biofísicas ........................................................................................................... 24 
Discusión ............................................................................................................................................................. 29 
Conclusiones ........................................................................................................................................................33 
Recomendaciones ................................................................................................................................................ 34 
Referencias ........................................................................................................................................................... 34 
Anexos ................................................................................................................................................................. 41 
Anexo 1 ....................................................................................................................................................... 41 
Anexo 2 ....................................................................................................................................................... 41 
Anexo 3 ....................................................................................................................................................... 42 
Anexo 4 ....................................................................................................................................................... 42 
Anexo 5 ....................................................................................................................................................... 45 
Anexo 6 ....................................................................................................................................................... 50 
Anexo 7 ....................................................................................................................................................... 56 
Anexo 8 ....................................................................................................................................................... 63 
Anexo 9 ....................................................................................................................................................... 64 
 
 
Tabla de Figuras 
Figura 1. Ciclo de vida de Leishmania spp ................................................................................................................. 11 
Figura 2. Diagrama de dispersión de los porcentajes de viabilidad celular de los promastigotes de L. panamensis.(24 
horas) ........................................................................................................................................................................... 19 
Figura 3. Diagrama de dispersión de los porcentajes de viabilidad celular de los promastigotes de L. panamensis.(48 
horas) ........................................................................................................................................................................... 20 
Figura 4. Diagrama de dispersión de los porcentajes de viabilidad celular de los promastigotes de L. panamensis. (72 
horas) ........................................................................................................................................................................... 20 
Figura 5. Comparación entre de las concentraciones de dimetilsulfóxido y Lippia dulcis con el control negativo en el 
tiempo .......................................................................................................................................................................... 22 
Figura 6. Diagrama de concentración inhibitoria del cincuenta por ciento de la población de promastigotes de L. 
panamensis expuestos durante 24 horas a anfotericina B ............................................................................................ 22 
Figura 7. Diagrama de concentración inhibitoria del cincuenta por ciento de la población de promastigotes de L. 
panamensis expuestos durante 48 horas a anfotericina B ............................................................................................ 22 
. 
Figura 8. Diagrama de concentración inhibitoria del cincuenta por ciento de la población de promastigotes de L. 
panamensis expuestos durante 72 horas a anfotericina B ............................................................................................ 22 
Figura 9. Diagrama de caja de comparación entre el control negativo, DMSO y L .dulcis exposición de 72 horas 
donde solo están los promastigotes .............................................................................................................................. 23 
Figura 10. imágenes tomadas en el microscopio invertido Zeiss de los promastigotes de L panamensis expuestos a las 
diferentes concentraciones de L. dulcis y DMSO a las 24 horas de exposición ........................................................... 25 
Figura 11. imágenes tomadas en el microscopio invertido Zeiss de los promastigotes de L. panamensis expuestos a 
las diferentes concentraciones de L. dulcis y DMSO a las 48 horas de 
exposición ................................................................................................................................................................... 26 
Figura 12. imágenes tomadas en el microscopio invertido Zeiss de los promastigotes de L.panamensis expuestos a las 
diferentes concentraciones de L. dulcis y DMSO a las 72 horas de exposición ........................................................... 27 
Figura 13. Imágenes tomadas para la comparación de tamaños de los promastigotes de L. panamensis expuestos a L. 
dulcis y DMSO a las 72 horas de exposición ............................................................................................................... 28 
Figura 14. Imágenes tomadas de los promastigotes de L. panamensis a las 72 horas para poder identificar el número 
de rosetas presentes en cada caso ................................................................................................................................. 28 
Figura 15. Imagen de los gradientes de densidad con Percoll® .................................................................................. 29 
 
Tabla de tablas 
Tabla 1. Protocolo de cromatografía de capa delgada usado en este estudio con base al estudio de Navarrate y 
colaboradores ............................................................................................................................................................... 14 
Tabla 2. Densidad y volumen de las soluciones usadas en los gradientes ................................................................... 16 
Tabla 3. Resultados de la cromatografía de capa delgada para los compuestos de interés del extracto L. dulcis 18 
Tabla 4. Comparación de los valores de IC50 entre el tratamiento con el extracto de L. dulcis y la anfotericina B, 
..................................................................................................................................................................................... 21 
Tabla 5. Registro de los valores promedio de la densidad de los promastigotes ......................................................... 24 
Resumen 
 
La leishmaniasis es un grupo de enfermedades zoonóticas trasmitidas por vectores, causadas por 
parásitos del género Leishmania, las cuales presentan tres manifestaciones clínicas, siendo la 
cutánea la más frecuente a nivel mundial. En Colombia se reportan alrededor de 2.000 casos 
anuales, donde Leishmania panamensis se ha asociado con lesiones más duraderas, complejas y 
con altos niveles de resistencia. El tratamiento actual frente a la leishmaniasis se enfoca en 
fármacos quimioterapéuticos que presentan graves repercusiones en la salud del paciente, además 
se ha demostrado que varias cepas de Leishmania generan resistencia a los mismos, lo anterior 
conlleva a que el tratamiento es menos efectivo. Por ello, la investigación de compuestos vegetales 
como tratamiento alternativo se hace imprescindible; siendo el género Lippia uno de los más 
prometedores porpresentar actividad citotóxica frente a diferentes agentes patógenos. En este 
estudio se caracterizó de forma preliminar el extracto etanólico de Lippia dulcis, a través de 
cromatografía de capa delgada, con el fin de identificar la presencia de metabolitos con actividad 
leishmanicida. Posteriormente para evaluar el efecto del extracto mencionado sobre la viabilidad 
de los promastigotes de Leishmania (V.) panamensis, se utilizó el método de MTT, exponiéndolos 
a seis concentraciones durante 24 ,48 y 72 horas. Además, se tuvo en cuenta la evaluación de las 
propiedades biofísicas de los promastigotes como tamaño y densidad, ya que esto nos ofrece 
información sobre cambios en la morfofisiología del parásito frente a la acción de Lippia dulcis. 
Obteniendo como resultado que el extracto posee gran variedad y expresión de metabolitos, entre 
los que encontramos: esteroles, terpenos y flavonoides, como previamente estaba reportado para 
el género, aunque los últimos presentan expresión moderada. A diferencia de estos, las 
antraquinonas y alcaloides tuvieron una presencia tenue, por lo que se sugieren estudios 
confirmatorios; por otra parte, se obtuvo una reacción negativa para las cumarinas. En cuanto a la 
viabilidad de L. panamensis, se evidenció que el efecto del solvente y el extracto no tiene 
diferencias significativas entre sí, evaluado con un α= 0.001 y que respecto al control negativo no 
disminuye los porcentajes de la misma, se cree que está asociado a la presencia de múltiples 
carbohidratos y proteínas en las membranas celulares del parásito, que dificultan el acceso de los 
metabolitos. Mientras que los cambios en tamaño, densidad y número de rosetas si resultaron 
evidentes para los promastigotes expuestos al extracto a la concentración 200 μg/ml una 
exposición de 72 horas, lo que sugiere una alteración en el volumen del parásito para mantener el 
equilibrio osmótico y evitar su muerte. 
 
Palabras clave: Propiedades biofísicas, extracto vegetal, Leishmania (V.) panamensis, Lippia 
dulcis, actividad leishmanicida. 
 
Abstract 
 
Leishmaniasis is a group of vector-borne diseases caused by Leishmania spp, with the cutaneous 
manifestation being the most reported worldwide. In Colombia, about 12.650 cases were reported 
by 2022, where the Leishmania panamensis species has been associated with evolution to 
mococutanea and high rates of resistance, and current treatment is linked to pentavalent 
antimonials that have serious physiological effects on the patient. For this reason, the investigation 
of plant extracts as an alternative treatment is supported by the World Health Organization; 
specifically, the genus Lippia is one of the most promising because of its microbicidal activity. In 
this study, the ethanolic extract of Lippia dulcis was preliminarily characterized in order to identify 
the metabolites of interest through thin layer chromatography. Subsequently, to evaluate the 
viability of Leishmania (V.) panamensis promastigotes in the presence of the extract, the MTT 
method was used, exposing them for 24, 48 and 72 hours at different concentrations. On the other 
hand, the variation in size and density was taken into account, since this provides information on 
changes in the morphophysiology of the parasite against the action of Lippia dulcis. The result was 
that the extract has a great variety of metabolites such as sterols and/or terpenes, while flavonoids 
have a moderate expression. Unlike these, the anthraquinones and alkaloids were much weaker in 
intensity, so confirmatory studies are suggested, as for coumarins a negative reaction was obtained. 
The results for the viability of L. panamensis showed that the effect of the solvent and the extract 
could not be differentiated between them, although none of these decreased significantly with 
respect to the negative control. These results are associated to the fact that the metabolites cannot 
enter the parasite due to the presence of multiple carbohydrates and proteins in the cell membranes 
of the parasite. While all biosignificant variables were significantly affected for promastigotes 
exposed to 200 ug/ml with a 72-hour exposure, suggesting an alteration in the parasite volume to 
maintain the osmotic equilibrium and avoid its death. 
 
Key wordsBiophysical properties, plant extract, Leishmania (V.) panamensis, Lippia dulcis, 
leishmanicidal activity. 
Introducción 
La leishmaniasis es un conjunto de enfermedades generadas por parásitos intracelulares del género 
Leishmania (Botero y Restrepo, 1998), se presenta en zonas tropicales y subtropicales del planeta, 
siendo transmitida por insectos vectores del género Phlebotomus y Lutzomyia (Torres-Guerrero et 
al., 2017). Esta enfermedad se presenta con mayor frecuencia en poblaciones que presentan 
malnutrición, desplazamientos forzados, malas condiciones de vivienda, debilidad del sistema 
inmunitario y falta de recursos (OMS, 2022). Se encuentra extendida en 89 países a nivel mundial, 
es endémica en América, Asía, África y parte de la zona mediterránea (Torres-guerrero et al., 
2017). De esta enfermedad existen tres manifestaciones clínicas principales: visceral (LV), cutánea 
(LC) y mucocutánea (LMC). Según el reporte del 8 de enero de 2022 de la Organización Mundial 
de la Salud, en América predomina la manifestación cutánea de esta enfermedad, con un 70% de 
los casos reportados globalmente. La leishmaniasis cutánea es una enfermedad que se caracteriza 
por úlceras redondeadas con aspecto granular y bordes eritematosos, que se generan a partir de 
pápulas y son regularmente indoloras; incluso hay reporte de pacientes que nunca presentan dichas 
úlceras, en su lugar las lesiones son laminares o nodulares (Zambrano-Hernández, 2022). 
En Colombia, según lo reportado en la semana epidemiológica 25 del boletín epidemiológico 
semanal del 2022, se han reportado 2.156 casos de LC con una incidencia nacional de 18,6 casos 
por cada 100.000 habitantes en riesgo. La población más afectada son los hombres (77%) de las 
áreas rurales (80%), entre 20 y 29 años (29%), y de bajos recursos (54%) (Zambrano-Hernández, 
2022), lo cual se corresponde con los factores de vulnerabilidad mencionados anteriormente. De 
las nueve especies de Leishmania reportadas en Colombia, L. panamensis del subgénero Viannia, 
se ha asociado con la generación de las lesiones más severas y con el mayor índice de evolución 
de LC a LMC y requieren, por consiguiente, tener un tratamiento metódico (del Rosal et al., 2010). 
Adicionalmente, en el estudio desarrollado por Pineda y colaboradores (2021), se demostró que en 
las cepas de L. panamensis presentes en Colombia, existe un aumento del número de copias de los 
genes relacionados con cambios en la patogenicidad y la resistencia al tratamiento, manifestándose 
un aumento en el tamaño de las úlceras, incremento de la reincidencia y necesidad de adición de 
los ciclos de tratamiento. 
Los tratamientos actuales frente a la leishmaniasis están enmarcados en la quimioterapia con 
fármacos como los antimonios pentavalentes, la anfotericina B, miltefosina y paromomicina (Croft 
y Coombs, 2003), los cuales presentan una eficiencia clínica que oscila entre el 10 y el 75%, estos 
medicamentos presentan manifestaciones tóxicas secundarias, que desencadenan efectos 
fisiológicos como: dolor musculoesquelético, anorexia, dolor abdominal, náuseas, vómito, dolor 
de cabeza, astenia y fatiga (Soto et al., 1993). La variabilidad presente en la efectividad de estos 
medicamentos se debe, entre otros factores, a la resistencia que los parásitos han generado, dejando 
a algunos de estos fármacos como opciones poco efectivas como tratamiento, además, de mostrar 
datos alarmantes de ineficiencia en otros continentes (Hefnawy, 2017); se ha corroborado, 
adicionalmente, que la administración prolongada de estos compuestos puede causar efectos 
adversos, como toxicidad renal, hepáticay cardíaca (Sousa et al., 2019), es por ello que la búsqueda 
de tratamientos alternativos se hace imperativa. 
Es así como se han evaluado métodos alternativos para el tratamiento de esta enfermedad, entre 
ellos el uso de extractos de plantas medicinales, reportados con actividad 
biológica leishmanicida y con otras funciones terapéuticas (Da Silva et al., 2018; Ramírez- 
Moreno, 2017). El objetivo principal de estos estudios es establecer el mecanismo de acción de los 
extractos vegetales contra Leishmania, y como están vinculados con la modulación de la respuesta 
antiparasitaria de la célula huésped (Ghosh et al., 2003). Se ha reportado que el extracto 
de Lippia spp presenta actividad leishmanicida (de Medeiros, 2011), por lo que es un buen 
candidato para obtener los compuestos activos que podrían funcionar como tratamiento 
alternativo. La bioactividad de estos productos naturales se debe a compuestos activos tales como, 
terpenoides, quinolonas, flavonoides, alcaloides y otras sustancias (Gil et al., 2009). En concreto, 
la especie Lippia dulcis se clasificó como sesquiterpenoide, puesto que el 73.8% de sus 
componentes se clasificaron en esta categoría química, los cuales le confieren actividad anti- 
protozoaria. Por otra parte, el d-Cadineno tiene una participación en el extracto de 8,6%, el cual se 
ha propuesto en diferentes estudios como un elemento con propiedades antiinflamatorias y 
antisépticas (Saldarriaga et al., 2010). 
 
Para poder medir el efecto de los extractos sobre los parásitos existen diferentes abordajes, siendo 
el más habitual la medición de la viabilidad celular mediante pruebas de tinción celular (Escobar, 
Rivera y Aristizábal, 2010). Sin embargo, la medición en el cambio de las variables biofísicas, 
como el tamaño y la densidad, permite establecer no solo el posible efecto citotóxico, sino también 
las afectaciones sobre el desarrollo del parásito y el cambio de sus parámetros morfofisiológicos 
como el tamaño y la densidad. 
En concreto, la medición del cambio del tamaño del parásito ofrece información sobre cambios en 
su metabolismo, dado que el cambio entre el volumen y la superficie que limita su membrana 
celular, afecta directamente el intercambio de nutrientes con el exterior y su método de expulsión 
de desechos, haciendo que el organismo deba reducir su tasa metabólica o hacer un esfuerzo mayor 
con el fin de mantener constante el flujo entre los desechos y nutrientes para preservar su equilibrio 
osmótico (Duarte et al., 2014). Teniendo en cuenta que el tamaño de una célula en una población 
posee una alta variabilidad natural, no es un buen parámetro de medida al momento de realizar el 
análisis correspondiente, por lo que es importante realizar el cálculo de la densidad, como un 
parámetro de medición más preciso; por que guarda una relación con el contenido químico de su 
célula y es una proporción definida entre la masa celular y el volumen contenido, lo cual varía en 
la misma proporción que el tamaño (Duarte et al., 2014). 
Por ende, se plantea este estudio con el objetivo de resolver la pregunta ¿cuáles son los efectos que 
tiene el extracto de Lippia dulcis sobre los promastigotes de Leishmania panamensis?, con la 
finalidad de abrir la posibilidad para futuras investigaciones de un nuevo método alternativo de 
tratamiento y medición de sus efectos celulares frente a la leishmaniasis cutánea. 
Biología de Leishmania 
 
Los protozoos del género Leishmania pertenecientes a la familia Trypanosomatidae del orden 
Kinetoplastida, tienen numerosas especies con morfología y ciclos de vida similares (Botero y 
Restrepo, 1998). Dichos ciclos se caracterizan por ser dimórficos, donde los promastigotes se 
presentan en estadio extracelular, se multiplican y se desarrollan dentro del tracto digestivo de los 
flebótomos, mientras que los amastigotes son intracelulares, residen y multiplican dentro de las 
vacuolas fagolisosomales de los fagocitos de vertebrados (Mougneau et al., 2011). Cuando el 
flebótomo hembra inocula al mamífero con el protozoo en su forma de promastigote, el sistema 
inmune reacciona con la fagocitosis de éstos a través de los macrófagos y de las células dendríticas 
de la piel (Van-Assche et al.,2011). 
Una vez dentro de la célula hospedera, la superficie celular de lipofosfoglicano del parásito retrasa 
la formación del fagolisosoma (Myler y Fase, 2008), lo que le permite dar inicio al proceso de 
diferenciación hacia la forma amastigote, la cual, es más resistente ante las condiciones del 
microambiente ácido y de temperatura más alta del fagolisosoma (Muskus y Marín-Villa, 2002); 
allí duran entre 12-24 horas, continuando su crecimiento y división (Van-Assche et al,2011). La 
entrada del parásito al macrófago desencadena una serie de reacciones incluida la producción de 
enzimas de degradación fagolisosomales, generación de ráfagas oxidativas y producción de óxido 
nítrico, que lo convierten en una célula efectora que tiene como finalidad la eliminación del 
parásito invasor (Van-Assche et al., 2011). Sin embargo, Leishmania spp. tiene la capacidad de 
desarrollarse incluso en ese entorno hostil. Una vez dentro del macrófago éste pasa por cuatro 
etapas, las cuales permiten la maduración del amastigote promoviendo cambios en la expresión de 
genes que preparan al parásito para su supervivencia en la célula hospedera (Muskus y Marín- 
Villa, 2002). 
Completando el ciclo de vida (fig. 1), el vector toma sangre del hospedero mamífero, la cual 
contiene los macrófagos con los amastigotes de Leishmania. Posteriormente, en el tracto digestivo, 
inician su proceso de diferenciación para volver a su forma flagelada y móvil, en donde pasa por 
varias etapas, proceso conocido como metaciclogénesis, siendo las etapas procíclica y metacíclica 
las más estudiadas (Bates, 2007). Los promastigotes procíclicos tienen una tasa de replicación muy 
alta, y baja movilidad, mientras que, los promastigotes metacícliclos son más infecciosos y móviles 
(Muskus y Marín-Villa, 2002), finalizada la metaciclogénesis, los promastigotes metacíclicos 
están aptos para ser inoculados en un nuevo hospedero vertebrado. 
 
Figura 1. Ciclo de vida de Leishmania spp (Teixeira et al.,2013) La hembra del vector (1) pica a un hospedero 
vertebrado infectado durante la comida de sangre ingiriendo (2) macrófagos infectados con parásito en (3) forma 
amastigote. (4) Los amastigotes se transforman en promastigotes procíclicos (5) los cuales se multiplican en el 
intestino medio. (6) inician un proceso de migración hacia el intestino medio anterior y reinician la división celular. 
(7) Allí finalmente los promastigotes se transforman en promastigotes metacíclicos infecciosos. (8) El vector hembra 
libera los promastigotes metacíclicos en un nuevo hospedador a través de la regurgitación durante la ingesta de sangre. 
(9) Los promastigotes metacíclicos (10) infectan a los macrófagos. (11) Estos se transforman en amastigotes, (12) los 
cuales se adhieren a la membrana de la vacuola parasitófora. (13) posteriormente los amastigotes se multiplican en la 
vacuola. (14) aumentando su taza de división. Finalmente (15) se liberan los amastigotes fuera del macrófago. (16) 
en forma de amastigote. (17) el cual infecta un nuevo macrófago. 
Luego de comprender el ciclo de vida de los parásitos de Leishmania spp, es importante determinar 
en cuál de las diferentes etapas dentro de su desarrollo, es en la que pueden ser utilizados 
compuestos de origen vegetal para afectar la viabilidad del parásito, por lo que su acción sobre los 
promastigotes debe ser estudiada y vista desde la prevención y posible uso sobre las poblaciones 
de vectores. Sin embargo, es crucial tener en cuenta que, para estudios posteriores, se debe evaluar 
el extracto sobre el estadio amastigote para evaluar el uso de este extracto como una alternativa a 
la manifestación clínica de la enfermedad.Antecedentes de actividad leishmanicida del extracto etanólico de Lippia spp 
 
Los efectos adversos de los antimoniales descritos como los medicamentos de primera línea para 
la atención de LC, son irritación local, anorexia, náuseas, vómitos, mialgia, artralgia, aumento de 
las enzimas hepáticas, de urea, creatinina, y alteraciones electrocardiográficas (Torres-guerrero et 
al., 2017), además de altos índices de resistencia que varían dependiendo de la especie de 
Leishmania (Hendrickx, et al., 2016). Con la finalidad de controlar los efectos adversos ya 
mencionados, la Organización Mundial de la Salud (OMS) propone que los tratamientos alternos 
deben surgir de productos vegetales, puesto que ofrecen un alto nivel de seguridad y confiabilidad 
(Rocha et al., 2005). Siguiendo esta propuesta se han desarrollado múltiples ensayos clínicos, que 
demuestran que los extractos vegetales de algunas plantas de uso popular han tenido efecto como 
agentes antimicrobianos (Bekhit et al., 2018; Milena et al., 2013). Para Colombia se reportan varios 
extractos promisorios, los cuales tienen índice de selectividad mayor de 10, lo que sugiere que son 
útiles como anti protozoarios (Weniger et al., 2001) y podrían tener un efecto citotóxico sobre los 
parásitos de Leishmania. 
Dentro de los registros de plantas con actividad leishmanicida, se destacan los aceites esenciales 
extraídos del género Lippia, ya que poseen moléculas hidrófobas que pueden difundirse fácilmente 
a través de las membranas celulares y, en consecuencia, afectar el metabolismo intracelular 
(Hassan et al., 2021); sin embargo, los extractos etanólicos han demostrado un potencial 
antimicrobiano elevado gracias a la presencia de mayor variedad de metabolitos, debido a su 
polaridad intermedia (Navarrete-Barragán et al., 2020). Por lo que explorar este tipo de extractos 
como alternativas terapéuticas es relevante. 
En un estudio de Medeiros y colaboradores (2011), encontraron que Lippia sidodes es un extracto 
activo frente a la especie Leishmania amazonensis, con una dosis de IC50 de 19.47 µg/ml, en un 
tiempo de exposición de 48 horas; el efecto leishmanicida del extracto fue debido a la acumulación 
de gotas lipídicas grandes, localizadas en proximidad a la membrana plasmática, generando la 
ruptura de la misma. Sin embargo, cuando el extracto fue probado sobre macrófagos, este tuvo un 
índice de selectividad de 1.92, indicando que tiene un efecto citotóxico sobre los mismos, por lo 
que se sugiere realizar el fraccionamiento del compuesto extraidopara evaluar si algún componente 
evidencia tener una acción específica sobre el parásito, sin afectar la célula hospedera. En esta 
misma planta, se ha reportado actividad frente a Leishmania chagasi siendo altamente activo frente 
a amastigotes con una dosis de IC50 5.07 µg/ml y activo frente a promastigotes con 19.76 µg/ml, 
donde se le atribuye su acción a daños estructurales y funcionales en la membrana celular y su 
acción directa sobre la síntesis y la actividad de la ATPasa. 
Adicionalmente, se evaluó el efecto de L. lupilina sobre el macrófago y se vio que su viabilidad 
celular disminuyó hasta un 78.45% (Rondon et al., 2012), lo que reitera que es importante trabajar 
más sobre fracciones del extracto que con el uso de la planta completa, para poder identificar cuáles 
son los compuestos con actividad mayor y más específica. 
Otro estudio que relaciona al género Lippia como posible tratamiento contra la leishmaniasis, es 
el extracto de las raíces de L. lupulina, el cual, tuvo un efecto en la diminución de la viabilidad 
de L. amazonensis, clasificándose como moderadamente activo con IC 50 con dosis entre 54.5 y 
95.4 µg/ml, siguiendo la clasificación de Osorio y colaboradores (2007), este estudio asocia el 
efecto en la disminución de la viabilidad con la presencia de múltiples flavonoides en L. lupilina 
(Funari et al., 2016). 
Haciendo hincapié en L. dulcis, la planta de interés de este estudio, presenta una ventaja sobre los 
extractos de las especies mencionadas previamente, puesto que se clasifican como 
quimiotipo citral debido a que no contiene timol (Neira et al., 2018). Lo cual es relevante porque 
en el diseño de un biofármaco es importante tener en cuenta no sólo la capacidad que tienen sus 
componentes de inhibir o destruir los parásitos de Leishmania sino el riesgo de producir 
reacciones adversas y la quimio tipo citral es aquel que no obtuvo resultados irritantes al aplicarse 
puro sobre la piel (Neira et al., 2018). Por estas características el estudio de L. dulcis sobre 
Leishmania panamensis es prometedor. 
 
 
Objetivos 
Objetivo general 
 
 Evaluar el efecto in vitro del extracto completo de Lippia dulcis sobre parásitos en estadío 
promastigote de Leishmania panamensis. 
Objetivos específicos 
 
 Caracterizar fitoquímicamente de forma preliminar el extracto etanólico de L. dulcis 
 Determinar la viabilidad celular del parásito de L. panamensis expuesto a diferentes 
concentraciones del extracto etanólico de L. dulcis. 
 Evaluar el tamaño y la densidad de L. panamensis en condiciones normales de cultivo y en 
presencia del extracto etanólico de L. dulcis. 
 
Materiales y Métodos 
 
Extracto de Lippia dulcis 
 
Obtención del extracto. 
 
Para el desarrollo de este proyecto el extracto etanólico de L. dulcis fue suministrado por la 
profesora Sara Giraldo del semillero de investigación FitoMeT. El cual fue obtenido a partir de 
material vegetal fresco adquirido en la plaza de mercado “Paloquemao” en Bogotá, en el mes de 
enero de 2020, y pudo ser identificado taxonómicamente en el herbario forestal de la Universidad 
Distrital Francisco José de Caldas, se hizo uso de las partes áreas de la planta: tallos, hojas y flores 
sanos que se seleccionaron a partir de material fresco (Bocanegra., 2021), como se había realizado 
en otros en estudios previos (Giraldo et al., 2013); posteriormente se llevó a secado en estufa a 40 
°C durante cinco días para obtener material vegetal seco, al cual se le realizó el procedimiento de 
extracción sólido-líquido, utilizando etanol al 96% como solvente en proporción 1:3. Se realizaron 
cuatro extracciones totales y mediante una rotaevaporador a vacío (IKA RV 10 digital) el extracto 
y el líquido se filtró y concentró. Finalmente, el extracto seco se almacenó bajo refrigeración 
protegida de la luz y la humedad (Bocanegra., 2021). 
 
Estudio fitoquímico preliminar. 
 
A pesar de que los investigadores que suministraron el extracto hicieron una evaluación 
fitoquímica preliminar, es importante realizar nuevamente algunos estudios fitoquímicos dado el 
tiempo de almacenamiento tan prolongado que tuvo antes de volver a ser usado, ya que se ha 
demostrado que el tiempo de almacenamiento tienen efectos en la actividad de algunos extractos 
etanólicos (Infante et al., 2015). 
Con esta finalidad, se realizó cromatografía de capa delgada sobre placas de sílica gel, empleando 
10.0 mg/ml para el extracto y alrededor 1.0 a 5.0 mg para los patrones, según lo descrito en el 
protocolo de Navarrete-Barragán y colaboradores (2020) consignado en la tabla 1; sin embargo, 
se realizaron algunas modificaciones en las fases móviles con el fin de mejorar la elución y la 
resolución en las machas, lo que logró una mejor separación entre ellas, específicamente se hizo 
uso de acetato de etilo (70): hexano (30) en lugar de acetato de etilo (60): hexano (40). La medición 
de los resultados se hizo evaluando la apreciación subjetiva de la intensidad del color: Coloración 
intensa: (+++); coloración claramente observable: (++); coloración débil (+); reacción negativa 
y/o no se observa coloración (-), según estos mismos autores. 
Tabla 1. 
Protocolo de cromatografía de capa delgada modificado de Navarrate y colaboradores. 
 
Fases móviles 
Compuesto a 
evaluar 
Patrones Revelado 
 
Hexano (60): acetato de etilo (40) 
Esteroides y/o 
Terpenoides 
 
β-sitoesterolVainillina 1% y H₂SO₄ 5 % 
UV (255nm) 
VIS y 110°C 
 
Acetato de etilo (70): hexano (30) 
 
Flavonoides 
 
Quercetina 
NP y Polietilenglicol 50% 
VIS 
UV (366nm) 
 
Cloroformo (90): metanol (10) 
 
Alcaloides 
 
Quinidina 
Dragendorff de 
precipitación 
VIS 
 
Hexano (60): acetato de etilo (40) 
Antraquinonas y/o 
Cumarinas 
 
7- hidroxycumarina 
Bornträger 
VIS +luz UV (366nm) 
Calentando y sin calentar 
 
Manutención de cultivos 
 
Cultivo de L. panamensis en estado promastigote. 
Los parásitos fueron cultivados en medio RPMI 1640 a pH 7.1, suplementado con Suero Fetal 
Bovino (SFB) al 10%, a temperatura de 27°C. El cambio de medio se realizó por centrifugación a 
200 g por 5 minutos, para decantar los parásitos muertos y retirarlos, posteriormente, se realiza 
una segunda centrifugación a 500 g por 5 minutos para reconcentrar los vivos, se descarta el medio 
metabolizado y se resuspende el pellet en 10 ml de medio fresco, esto se realiza cuando la 
confluencia del cultivo llega al 80% y está muy alta la presencia de rosetas, (modificado por Ochoa 
desde Cortázar et al.,2006). 
 
Ensayo de viabilidad de promastigotes de L. panamensis 
 
Para determinar los efectos del extracto etanólico de L. dulcis en los promastigotes de L. 
panamensis , se determinó la viabilidad celular mediante el método del bromuro de tetrazolio 3- 
(4, 5 dimetiltiazol-2-il)-2, 5-difenil (MTT), midiendo la absorbancia a través del cálculo de la 
longitud de onda en un lector de placas de ELISA, el cual muestra una relación directamente 
proporcional entre la intensidad del color y la actividad metabólica de la mitocondria (Najm et al., 
2021), para conocer el valor exacto del porcentaje de viabilidad que muestran las células frente al 
tratamiento, al solvente y al control positivo se reemplaza el valor de absorbancia obtenida en la 
Ecuación 1. 
 
𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑣𝑣𝑒𝑛𝑡𝑜 − 𝐴𝑏𝑠 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑚𝑣𝑣𝑒𝑛𝑡𝑜 (𝐴) 
% 𝑑𝑒 𝑣𝑣𝑣𝑎𝑏𝑣𝑣𝑙𝑣𝑣𝑑𝑎𝑑 = 
𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑣𝑣𝑣𝑜(𝐵) − 𝐴𝑏𝑠 𝑑𝑒𝑙 𝑏𝑙𝑎𝑛𝑐𝑜 𝑡é𝑐𝑛𝑣𝑣𝑐𝑎(𝐶) 
𝑥100
 
Ecuación 1. Se utiliza para hallar el porcentaje de viabilidad del tratamiento en sus diversas concentraciones, respecto 
a los controles utilizados. Tratamientos = parásitos + medio de cultivo RPMI 1640 + 5 µL del extracto de Lippia 
dulcis a una concentración determinada. A = medio de cultivo RPMI 1640 + 5 µL del extracto de la concentración de 
Lippia dulcis a una concentración determinada. B = parásitos + medio de cultivo RPMI 1640. C = medio de cultivo 
RPMI 1640. 
 
Se cultivaron 1×106 parásitos/pozo en placas de 96 pozos durante 24, 48 y 72 horas en placas 
separadas según el tiempo de incubación, con la finalidad de evaluar si el efecto del extracto de L. 
dulcis varía su efectividad en el tiempo, cada experimento se verificó con tres réplicas biológicas 
y tres replicas técnicas, para un n=9. Se evaluaron 6 concentraciones del extracto (200.00 μg/ml, 
100.00 μg/ml, 50.00 μg/ml, 25.00 μg/ml, 12.5 μg/ml y 6.25 μg/ml). Para determinar el efecto que 
tiene únicamente el solvente sobre el cultivo de promastigotes se agregan: 0.1 μg/ml, 0.05 μg/ml, 
0.025 μg/ml, 0.0125 μg/ml, 0.00625 μg/ml, 0.00312 μg/ml de DMSO, ya que este es el contenido 
de solvente que tiene cada tratamiento por disolución del extracto de L. dulcis evaluado; como 
control positivo se utilizó anfotericina B en un gradiente de siete concentraciones para poder hallar 
el IC 50 (0.15625 μg/ml ,0.3125 μg/ml, 0.625 μg/ml ,1.25 μg/ml ,2.5 μg/ml, 5 μg/ml, 10 μg/ml), 
siguiendo los mismos tiempos de exposición de 24, 48 y 72 horas (Najm et al., 2021). 
 
Para analizar los datos obtenidos del ensayo de MTT, se calcularon los valores de inhibición (IC50) 
en Rstudio, además se aplicó una prueba de normalidad de los porcentajes de viabilidad con la 
prueba de Shapiro-Wilk, con valor de p=0.05 y una hipótesis nula que asume la normalidad. Esto 
con la finalidad de poder realizar un ANOVA a una sola vía para evaluar si existe una diferencia 
significativa entre y dentro de las medias de los grupos evaluados (concentraciones y tiempo) 
incluyendo el solvente y el control positivo (Najm et al., 2021) utilizando el software JASP 
0.16.3.0. 
 
Medición de variables biofísicas 
 
En este estudio se evalúan dos variables biofísicas en concreto, el tamaño y la densidad de los 
parásitos, ya que estos ofrecen información de cómo está cambiando el parasito para poder 
adaptarse a las condiciones generadas por un agente externo, en este caso, el extracto etanólico de 
L. dulcis. La primera propiedad se evaluó midiendo 50 parásitos de la concentración y cantidad de 
tiempo que resultó más prometedora y comparándolo respecto al cultivo control, a través de la 
toma de fotografías en un microscopio de reflexión BX51M (Olympus Corp., Tokyo, Japan) con 
una cámara digital Olympus SC100, conectada a un computador con Olympus Stream Basic 1.9 
software. Para hacer el análisis de estos datos se realizó un ANOVA a una sola vía, utilizando el 
software JASP 0.16.3.0, con la finalidad de comparar las medias de control y tratamiento. 
Evaluando la normalidad de los datos utilizando con la misma prueba y criterios mencionados 
anteriormente en el ensayo de viabilidad. 
 
La densidad de L. panamensis fue determinada a partir del uso de gradientes de percoll®, técnica 
por la cual se establece el punto isopícnico de las células con un medio de densidad conocida. Este 
se prepara mezclando RPMI1640 o NaCl 0.15 M, para obtener una solución de Percoll de densidad 
conocida, obteniendo soluciones con diferentes densidades según la proporción de medio agregado 
(tabla 2). De las cuales se toman 150 ± 0,125µl de cada una y se disponen en un eppendorff de 2ml 
a manera de capas, de menor a mayor densidad. Una vez el gradiente está en el recipiente, se 
agregan 150 ± 0,125µl del cultivo de L. panamensis (con y sin el efecto de L. dulcis) y perlas 
marcadoras de densidad, Density Marker Bead, kit DMB -10 Sigma o kit Cospheric en la capa 
superior. Posteriormente se llevan a una centrifuga de rotor fijo y se centrifugan durante 30 minutos 
a 500 g., lo cual permite la formación de agregados de parásitos, se toman registros fotográficos 
teniendo un testigo métrico; a partir de este registro se toma la distancia entre el fondo y la capa 
de parásitos mediante el uso del programa Tracker 4.11.0 (Vargas-Jimenéz, 2019). 
Tabla 2. 
Preparación de las soluciones de densidad conocida a partir de la mezcla entre la Solución Isotónica de Percoll (SIP) 
y el medio de disolución. Cálculos para preparación de 4 ml de soluciones stock de cada densidad Obtenida de (Vargas- 
Jimenéz., 2019). des: densidad deseada en el gradiente, VSIP: Volumen Solución Isotónica de Percoll, Vmed: Volumen 
medio de disolución. 
 
Capa del gradiente des (g/ml) VSIP (ml) Vmed (ml) 
1 1,010 0,182 3,818 
2 1,020 0,508 3,492 
3 1,030 0,858 3,142 
4 1,040 1,186 2,814 
5 1,050 1,534 2,466 
6 1,060 1,864 2,136 
7 1,070 2,209 1,791 
8 1,080 2,542 1,458 
9 1,090 2,885 1,115 
10 1,100 3,220 0,780 
 
Una vez que se obtiene esa distancia se utiliza la expresión consignada en la Ecuación 3, la cual 
relaciona dicho valor con la densidad de los promastigotes a través de una regresión lineal, con la 
distancia en milímetros y la densidad en gramos por mililitro (Vargas-Jimenéz et al., 2022). Puede 
utilizarse esta expresión en concreto puesto que las condiciones del experimento son las mismas 
utilizadas por Vargas-Jimenéz y colaboradores (2022). 
 
 
Ecuación 3. ecuación de regresión lineal para hallar el valor promedio de la densidad, siendo y la distancia del agregado 
y  la densidad celular. Obtenida de (Vargas-Jimenéz et al., 2022) 
El número de rosetas también fue evaluado, ya que es un estadío poco estudiado y recientemente 
reconocido de los parásitos (Iovannisci et al., 2010). Para esto se tomaron fotografías de los 
cultivos,tanto el expuesto a la concentración más prometedora del extracto, como al control 
negativo, teniendo en cuenta además cual fue el rango de tiempo que representó mayor 
disminución en el porcentaje de viabilidad celular. Las fotografías fueron tomadas en un 
microscopio invertido Zeiss, utilizando AxioCam HRm camera, AxioVision software, Rel. 4.8.2. 
Se tuvieron en cuenta 18 campos visuales aleatorios y se contaron las rosetas que allí se 
encontraban. Al igual que con los tamaños se tuvo en cuenta la normalidad de los datos y la 
comparación de medias, usando los mismos estadísticos y software. 
Resultados 
 
Caracterización fitoquímica preliminar del extracto etanólico L. dulcis 
 
A través de la cromatografía de capa delgada (CCD) se pudo evidenciar la presencia de los 
metabolitos evaluados en diferentes proporciones, que se encuentran consignados en la Tabla 3. 
Los cuales se evaluaron con el método semicuantitativo propuesto por Sanabria-Galindo (1983) y 
teniendo en cuenta la relación entre color y metabolito propuesta por Navarrate y colaboradores 
(2020). 
Tabla 3. 
Resultados de la cromatografía de capa delgada para los compuestos de interés del extracto L. dulcis 
 
Metabolito 
Valoración 
semicuantitativa 
Color de las manchas en CCD 
 
Esteroides y/o 
terpenoides 
 
 
+++ 
Varias manchas y con alta pigmentación azul, violeta y roja. 
Manchas con alta pigmentación amarilla en luz visible luego 
de pasar por placa de calentamiento. 
Bajo la luz UV 255 (nm) las manchas son múltiples e 
intensas. 
Flavonoides ++ Manchas naranjas claramente visibles en luz UV. 
Cumarinas y /o 
Antraquinonas 

Manchas de coloración débil rojas en luz visible. 
Y una reacción negativa para las cumarinas en luz UV. 
Alcaloides + Franja naranja de coloración débil a luz visible. 
 
Respecto a los esteroles y/o terpenos se pudo evidenciar la presencia de múltiples manchas de un 
intenso de azul, violeta y rojas a lo largo de placa de sílica gel lo que sugiere la presencia de 
terpenoides. Mientras que las manchas amarillas si bien se presentaron en menor proporción, 
tenían alta pigmentación, relacionado con polifenoles. 
 
Los flavonoides se encontraron en menor proporción, puesto que fueron evidentes tres manchas 
naranjas, sin embargo, su coloración fue evidente e intensa y permitió identificarlo con claridad. 
Con relación a los alcaloides y antraquinonas la presencia de las manchas es mucho más tenue, 
por lo que se sugieren confirmación, como la prueba precipitación de Dragendorff (Ríos, 2013) y 
Bornträger-Kraus (Carvajal-Rojas et al.,2009) respectivamente. El único metabolito que no se 
pudo evidenciar fueron las cumarinas, ya que solo se veía la mancha del control con un azul intenso 
fluorescente. (Anexo 9) 
Ensayo de viabilidad de promastigotes de L. panamensis 
 
Los valores de viabilidad cumplen con el parámetro de normalidad, evaluado con Shapiro-Wilks 
con un valor de p mucho mayor a 0.001 (Anexo 1), por lo que no se puede rechazar la hipótesis 
nula y se asume normalidad. A partir de allí se realizan el resto de los análisis estadísticos. 
Inicialmente se obtuvieron valores de viabilidad para cada uno de los lapsos de tiempo evaluados, 
donde se puede evidenciarla la dispersión de la misma en la Figura 1, 2 y 3 que corresponden a 24, 
48 y 72 horas respectivamente, tanto para DMSO como para las concentraciones de L. dulcis, esto 
dado que al analizar con el ANOVA la diferencia en la media de la viabilidad entre estos dos 
compuestos no dio un valor de p significativa, es decir no fue menor a 0.01 (Anexo 2) en ninguno 
de los tres lapsos de tiempo evaluados. 
 
 
Figura 2. Diagrama de dispersión de los porcentajes de viabilidad celular de los promastigotes de L. panamensis 
A. Frente a las concentraciones de dimetilsulfóxido B. Frente a las concentraciones de Lippia dulcis. En las 24 horas 
de exposición. 
 
La Figura 2 presenta los valores de variabilidad entre las repeticiones biológicas del experimento, 
donde cada uno cuenta con tres replicas técnicas representadas en cada punto como la media de 
esta, donde no hay una diferencia estadísticamente significativa entre ellos, por lo que los datos 
son replicables y confiables. Además, se hace evidente que los valores de viabilidad se encuentran 
sobre el 100% para la mayoría de las concentraciones y tiempos de exposición evaluados, lo que 
es de relevancia porque muestra una acción del extracto o solvente sobre los promastigotes, 
diferente al de la disminución de la viabilidad. 
 
 
Figura 3. Diagrama de dispersión de los porcentajes de viabilidad celular de los promastigotes de L. panamensis A. 
frente a las concentraciones de dimetilsulfóxido B. Frente a las concentraciones de Lippia dulcis. En las 48 horas de 
exposición 
 
 
El patrón que se encuentra en la Figura 2 se repite en la Figura 3 y 4, aunque los valores de 
viabilidad si disminuyen progresivamente en el tiempo. Es importante recalcar que la aparente 
relación inversamente proporcional entre las concentraciones del solvente, el tratamiento y los 
porcentajes de viabilidad no es significativa, ya que luego de comparar las medias dentro de los 
grupos de 24, 48 y 72 horas se demuestra que no existe una diferencia estadísticamente 
significativa, con valor de p mayor que 0.01 en el ANOVA (Anexo 3), por lo que no se puede 
deducir que existe una relación entre la discusión de la viabilidad y el extracto de L. dulcis. 
 
 
Figura 4. Diagrama de dispersión de los porcentajes de viabilidad celular de los promastigotes de L. panamensis A. 
frente a las concentraciones de dimetilsulfóxido B. frente a las concentraciones de Lippia dulcis. En las 72 horas de 
exposición. 
Respecto al control positivo, se realizó un gradiente de anfotericina B, con la idea de poder 
encontrar los valores de IC50 (figura 6, 7 y 8) y compararlos con los del tratamiento (Tabla 4), 
aunque estos últimos sean de carácter proyectivo, ya que en el experimento no se evidenció ningún 
valor de viabilidad inferior al cincuenta por ciento. En el control positivo se obtuvieron valores de 
IC50 evidentemente menores respecto al tratamiento, logrando una concentración inhibitoria que 
demuestra que es un fármaco altamente activo al tener concentraciones muy inferiores al 10 μg/ml 
(Osorio., et al, 2007) Este resultado confirma que el ensayo de MTT se realizó de manera óptima 
y que los promastigotes de L. panamensis no son resistentes. 
Una vez que se pudieron comparar las medias dentro de los grupos de tiempo, se evaluaron entre 
ellos de manera independiente para el tratamiento, el solvente y el control positivo. Para el extracto 
etanólico se encontró que la concentración y tiempo que presentaban una diferencia significativa 
(p>0.01) fue la de 200 µg/ml, luego de 72 horas de exposición, gracias la prueba post-hoc, Tuckey 
realizada (anexo 5), respecto a las otras concentraciones de 24 y 48 horas. El solvente presenta el 
mismo comportamiento que el tratamiento (anexo 6), lo que concuerda con el dato reportado 
anteriormente de que no existe una diferencia significativa entre ellos. Mientras que el control 
positivo muestra múltiples diferencias significativas en los porcentajes de viabilidad entre las 
concentraciones y el paso de tiempo (anexo 8). 
Tabla 4. 
Comparación de los valores de IC50 entre el tratamiento con el extracto de L. dulcis y la anfotericina B, en los tres 
lapsos de tiempo. El IC50 se mide en µg/ml. 
 
 
HORA 
Lippia dulcis Anfotericina B 
Pendiente IC50 P-value Pendiente IC50 P-value 
24 45.518 3588.993 < 2.2×10-16 0.732 0.4450 6.307×10-13 
48 41.612 3511.456 < 2.2×10-16 0.665 0.3125 9.161×10-13 
72 23.053 1385.770 < 2.2×10-16 0.612 0.1801 4.069×10-8 
 
Para poder evidenciar la acción del tratamiento y el solvente sobre la viabilidad en el tiempo es 
crucial que se compare con el control negativo (Figura 5), ya que esto permite ver si además del 
extracto o el DMSO, si la disminuciónen la viabilidad está relacionada con el crecimiento del 
cultivo y metabolización del medio. En este caso entre las 24 horas y 48 horas existe un 
comportamiento estacionario en el crecimiento, ya que los valores de viabilidad no son 
significativamente diferentes entre ellos (p>0.01) manteniendo valores promedio de 100%, 96.498 
% respectivamente, mientras que para las 72 horas la viabilidad disminuye hasta un valor promedio 
de 74.959 %, lo que se relaciona con la disminución en los porcentajes de viabilidad en este punto 
para el tratamiento y el dimetilsulfóxido. 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Comparación entre de las concentraciones de dimetilsulfóxido y Lippia dulcis con el control negativo en el 
tiempo. A. solvente (DMSO),[1]=0.00312 µg/ml, [2] =0.00625 µg/ml, [3] =0.0125 µg/ml, [4] = 0.025 µg/ml, [5]= 
0.05 µg/ml, [6]=0.1 µg/ml, C = control negativo B. Extracto de Lippia dulcis [1]= 6.25 µg/ml, [2] =12.5 µg/ml, [3] 
=25 µg/ml, [4] = 50 µg/ml, [5]= 100 µg/ml, [6]=200 µg/ml, C = control negativo 
 
 
 
Figura 6. Diagrama de concentración inhibitoria del cincuenta por ciento de la población de promastigotes de L. 
panamensis expuestos durante 24 horas a anfotericina B. 
 
 
 
Figura 7. Diagrama de concentración inhibitoria del cincuenta por ciento de la población de promastigotes de L. 
panamensis expuestos durante 48 horas a anfotericina B. 
 
 
 
Figura 8. Diagrama de concentración inhibitoria del cincuenta por ciento de la población de promastigotes de L. 
panamensis expuestos durante 72 horas a anfotericina B. 
 
 
Una vez expuesto aquí los resultados de las pruebas de comparación de medias dentro y entre los 
grupos de lapsos de horas de exposición, se muestra que la concentración de 200 µg/ml de L. dulcis 
a las 72 horas (lo que implica la concentración de DMSO de 0,1 µg/ml), es la que resulta más 
prometedora dada su diferencia significativa con las otras concentraciones, como se explicó 
anteriormente, la cual se utilizó para evaluar otros parámetros que puedan indiciar viabilidad, que 
no estén relacionados con la actividad mitocondrial. Para esto se expone un diagrama de caja 
(Figura 9), entre el control negativo, la concentración de tratamiento y de solvente, donde se puede 
ver que, aunque estadísticamente no existe una diferencia significativa entre la acción del DMSO 
y el extracto de L. dulcis, este último presenta porcentajes de viabilidad menor. Respecto al control 
negativo se asocia el error a los mencionados anteriormente para la siembra de promastigotes en 
la caja de 96 pozos. 
 
 
 
Figura 9. Diagrama de caja de comparación entre el control negativo, DMSO y L. dulcis exposición de 72 horas, 
donde solo están los promastigotes. 
Medición de las variables Biofísicas 
Para reconocer el cambio de forma de los promastigotes frente a las diferentes concentraciones del 
extracto de L. dulcis y del solvente se utilizaron las fotografías (Figura 10, 11 y 12), y a partir de 
estas poder discernir si además de la medida del porcentaje de viabilidad celular, se puede apreciar 
otro tipo de afectación sobre el parásito, esto en los tres lapsos de tiempo evaluados. Allí se puede 
ver que no hay cambios significativos respecto al control negativo en las primeras 24 y 48 horas 
(Figura 10 y 11), sin embargo, para las 72 horas en la concentración de 200 µg/ml los 
promastigotes parecen redondearse, tomando un aspecto mucho más parecido a los amastigotes 
(Figura 3 C6). 
 
Tabla 5. 
Registro de los valores promedio de la densidad de los promastigotes. 
 
Control perlas de látex Control negativo Lippia dulcis (200µg/ml,) 
𝑔 
𝜌 = 1.053 
𝑚𝑙 
superior inferior 𝑔 𝜌 = 1.074 
𝑚𝑙 𝑔 𝜌 = 1.067 
𝑚𝑙 
𝑔 
𝜌 = 1.081 
𝑚𝑙 
 
Si bien el cambio de la forma puede determinarse de manera subjetiva, es necesario tomar 
mediciones de tamaños para poder hacer certera la aseveración de que hay un cambio vinculado 
con el extracto o el solvente en términos estadísticos. Donde cuando se realiza la comparación del 
largo entre el control negativo, el tratamiento se encontró una diferencia estadísticamente 
significativa, al igual que en el DMSO. Mientras que entre el extracto y el DMSO no se presentan 
cambios significativos en el tamaño (Anexo 8). Además, se puede hacer evidente en la Figura 13 
que permite ver las mediciones. 
 
Otra de las características del cultivo que fueron evaluadas, es la cantidad de rosetas que se forman 
en el control y los 200 µg/ml de L. dulcis (Figura 12). Donde es evidente que en presencia del 
extracto hay una proliferación de la formación de rosetas, lo cual es avalado por el estadístico de 
ANOVA que con un valor de p menor que 0.001 muestra diferencia significativa para los 18 
campos visuales evaluados (anexo 8).Finalmente, en la medición de la densidad se muestra que en 
el control negativo hay dos agregados (Figura 15b), mientras que para los promastigotes expuesto 
a 200 µg /ml durante 72 horas se evidencia un agregado que no se posiciona de manera horizontal 
u homogéneo, sino diagonal a manera de gradiente (Figura 15a). El control de perlas de látex forma 
una franja uniforme horizontal y con valor de la densidad acorde a la reportada por la casa 
comercial (Figura 15c). Los valores de la densidad obtenidos son promedio (Tabla 5) y muestran 
que no existe una diferencia significativa entre la franja superior del control negativo y el 
tratamiento, al contrario de la segunda franja frente a la que si presenta diferencia. 
 
 
 
Figura 10. imágenes tomadas en el microscopio invertido Zeiss de los promastigotes de L. panamensis expuestos a 
las diferentes concentraciones de L. dulcis y DMSO a las 24 horas de exposición A. Control negativo B. expuestas a 
DMSO B1. 0.00312 µg /ml, B2 0.00625 µg /ml, B3 0.0125 µg /ml, B4 0.025 µg /ml, B5 0.05 µg /ml, B6=0.1 µg /ml. 
C. expuestas a L. dulcis C1= 6.25 µg/ml, C2 =12.5 µg /ml, C3 =25 µg /ml, C4 = 50 µg /ml, C5= 100 µg /ml, C6=200 
µg /ml. 
 
Figura 11. imágenes tomadas en el microscopio invertido Zeiss de los promastigotes de L. panamensis expuestos a 
las diferentes concentraciones de L. dulcis y DMSO a las 48 horas de exposición A. Control negativo B. expuestas a 
DMSO B1. 0.00312 µg/ml, B2 0.00625µg/ml, B3 0.0125 µg/ml, B4 0.025 µg/ml, B5 0.05 µg/ml, B6=0.1µg/ml, C. 
expuestas a L. dulcis C1= 6.25µg/ml, C2 =12.5 µg/ml, C3 =25 µg/ml, C4 = 50 µg/ml, C5= 100 µg/ml, C6=200µg/ml 
 
 
Figura 12. imágenes tomadas en el microscopio invertido Zeiss de los promastigotes de L. panamensis expuestos a 
las diferentes concentraciones de L. dulcis y DMSO a las 72 horas de exposición A. Control negativo B. expuestas a 
DMSO B1. 0.00312 µg/ml, B2 0.00625 µg/ml, B3 0.0125 µg/ml, B4 0.025 µg/ml, B5 0.05 µg/ml, B6=0.1 µg/ml. C. 
expuestas a L. dulcis C1= 6.25 µg/ml, C2 =12.5 µg/ml, C3 =25 µg/ml, C4 = 50 µg/ml, C5= 100 µg/ml, C6=200 µg/ml. 
 
 
Figura 13. Imágenes tomadas para la comparación de tamaños en en el microscopio invertido Zeiss y BX51M 
microscopio de reflexión en el modo campo oscuro. (Olympus Corp., Tokyo, Japón) de los promastigotes de L. 
panamensis expuestos a L. dulcis y DMSO a las 72 horas de exposición. A. control negativo B.200 µg/ml de L. dulcis 
C. 0,1µg/ml, DMSO. 
 
Figura 14. Imágenes tomadas en 10x en el microscopio invertido Zeiss de los promastigotes de L. panamensis a las 
72 horas para poder identificar el número de rosetas presentes en cada caso A. control negativo B. extracto de L. dulcis 
200µg/ml. 
 
Figura 15. Imagen de los gradientes de densidad con Percoll® y medición de las distancias de los agregados respecto 
al fondo del eppendorff A. control negativo B. 200 µg/ml de L. dulcis C. control de perlas de látex (Density Marker 
Bead). 
 
Discusión 
 
Según los resultados de la CCD, el extracto de L. dulcis posee una abundante cantidad de terpenos, 
lo cual concuerda con estudios que han caracterizado el extracto previamente (Navarrete-Barragán 
et al., 2020; Bocanegra, 2021), ysigue además la línea de otras especies de su género, que han 
evidenciado la presencia de este metabolito en concentraciones significativas (de Medeiros et al., 
2011; Funari et al., 2016). Lo cual se ha relacionado con un potencial antimicrobiano, como en 
bacterias Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris y Staphylococcus aureus 
(Navarrete-Barragán et al., 2020). En los hongos Candida spp. y Microsporum canis, utilizando 
L. sidoides (Fontenelle et al., 2007) y en otras especies de leishmania y tripanosomatidos como L. 
chagasi y Trypanosoma cruzi empleando extracto de la parte aérea de L. alba, L. citriodora, L. 
micromera y L. origanoides extraidos de las partes aéreas de las plantas (Escobar et al., 2010). 
Esto se debe a que los terpenos son hidrocarburos formados a partir de unidades de isopreno, lo 
que le permite atravesar con facilidad la membrana celular, en específico la capa lipídica, haciendo 
que tenga un efecto directo sobre la diana intracelular (Hassan et al., 2022). Un ejemplo de ello es 
el α-bisabolol que ya ha reportado tener un efecto sobre promastigotes de L. amazonensis generado 
discontinuidad de la membrana nuclear y un aumento del volumen mitocondrial y del cinetoplasto, 
llevando a la muerte de los parásitos (Viana-Colares et al., 2013). 
 
Respecto a los flavonoides se obtuvo una concentración moderada, que concuerda con la 
caracterización previa realizada por Bocanegra (2021). Dentro de las flavonas que se han reportado 
con efecto frente a leishmania se encuentra la dimetilalil-kaempferide la cual se ha asociado a la 
reversión de resistencia de L. tropica frente a la daunomicina, fármaco convencional para su 
tratamiento; esto a través de situarse en el dominio citosólico del transportador multidroga tipo 
Pgp aumentando su expresión e inhibiendo el eflujo del medicamento, lo que dificulta el 
crecimiento del parásito. (Pérez-Victoria, et al,1999); además las fracciones de flavonas EtOAc, 
Gosipetina 3,7,8,4'-tetra-O-metil éter y Kaempferol 3,7-di-O-metil éter, demostraron tener 
actividad citotóxica frente a L. amazonensis, que han generado el bloqueo de la progresión del 
ciclo celular del estado G1a S y finalmente llevando a detención G1 a G0, además de inducir la 
autofagia. (Araújo et al.,2019). Adicionalmente, los flavonoides poseen efectos antinflamatorios 
(Soheila, Crespo y Cabanillas, 2019), por lo que se recomienda estudios más rigurosos sobre los 
flavonoides específicos que contenga L. dulcis. 
 
La cuantificación semicualitativa de las antraquinonas parece ser menor que las reportadas para L. 
dulcis (Navarrete-Barragán et al., 2020; Bocanegra et al., 2021), Sin embargo, corresponden con 
lo reportado para L. multiflora (Ngaibi, et al., 2021) por lo que se sugiere hacer la reacción de 
Bornträger-Kraus para verificar con mayor precisión la presencia o no de dicho grupo de 
metabolitos. Las cumarinas no tuvieron reacción en la CCD en este estudio preliminar, lo cual 
puede deberse a que la son compuestos fotosensibles (Herrera-Fuentes et al., 2017) y pueden sufrir 
proceso de degradación de manera más directa que los demás metabolitos aquí evaluados. Ya que 
hay varias especies del género que si han reportado la presencia de cumarinas como L. alnifolia, 
L. origanoides y L. insignis (Trindade et al., 2021) se sugiere realizar la prueba del hidróxido de 
sodio para verificar su presencia. 
 
La presencia de alcaloides con una baja intensidad en la coloración de las manchas requiere de una 
confirmación con la prueba de precipitación de Dragendorff y el reactivo de Iodoplatinato (Ríos, 
2013), ya que lo reportado por Compadre y colaboradores (1986), es que no hay presencia de este 
metabolito en la parte área de L. dulcis y no es uno de los compuestos evaluados por Navarrete- 
Barragán (2020). Sin embargo, múltiples especies del género poseen alcaloides (Siqueira-Lima et 
al., 2019; Gazola et al.,2004) que le han conferido propiedades microbicidas (Al-Snafi, 2019). 
 
La presencia de metabolitos secundarios y su concentración en las plantas está directamente 
relacionada con el entorno al que se desarrolla, puesto que se ha vinculado con los métodos de 
defensa química frente a microrganismos patógenos, heridas en la superficie de la planta y 
procesos de herbívora (Navarrete et al., 2020; Souto-Bachiller et al., 1997; Sepúlveda-Jiménez et 
al, 2004). Dentro de estos compuestos de bajo peso molecular que se acumulan en estas 
condiciones se encuentran muchos del grupo de los alcaloides, terpenoides y compuestos fenólicos 
como las cumarinas (Sepúlveda-Jiménez et al., 2004; Ávalos-García y Carri, 2009), por lo que 
haber utilizado de manera indistinta las partes áreas de la planta hace que la concentración de 
dichos metabolitos se pueda ver afectada y por consiguiente tenga un reflejo sobre su acción 
leishmanicida. 
 
En cuanto a los resultados del ensayo de MTT se evidencia que los porcentajes de viabilidad son 
superiores a lo esperado para la prueba de MTT (Grela, Kozłowska y Grabowiecka, 2018) lo cual 
se cree puede deberse a tres posibles causas. Primero el error asociado con la cámara de Neubauer 
que es oscila entre el 20% y 30%, el cual se debe al pipeteo, a la posibilidad de que la muestra sea 
poco representativa y errores en la carga de la cámara respecto a la variación del volumen 
(Bastidas, 2000), por lo que es posible que un mayor número de promastigotes fuesen dispuestos 
por pozo haciendo que aumente este valor. En segundo lugar, hay que tener en cuenta que la 
medida de la viabilidad que este ofrece se puede ver afectada por las condiciones de la 
metodología, ya que cada línea celular posee propiedades metabólicas únicas que deben ser 
caracterizadas para determinar parámetros experimentales tales como tiempo de incubación, 
densidad celular y concentración del compuesto (Escobar, Rivera y Aristizábal, 2010). 
 
Por último, es importante recordar que el método MTT evalúa la actividad mitocondrial y lo 
relaciona directamente con la viabilidad (Grela, Kozłowska y Grabowiecka, 2018), 
específicamente lo vincula con el cambio de coloración el cual depende de las oxidorreductasas 
que se encuentran en la mitocondria (Mosmann, 1983), teniendo en cuenta esto, se puede hablar 
de que cualquier cambio en la mitocondria afecta los resultados en los porcentajes de viabilidad. 
Dichos cambios pueden ser provocados por la presencia de fármacos o extractos, como en el caso 
de este estudio, ya que los niveles de estrés que presenta el parasito hace que haya síntesis de 
proteínas relacionada con expresión de bombas de eflujo, trasportadores ABC y otras proteínas 
que regulan osmóticamente el parásito, haciendo que la actividad mitocondrial aumente 
(Zeuthen,1994) o también generar daños a nivel estructural desde la despolarización de la 
membrana mitocondrial hasta la inhibición de la síntesis de ADN mitocondrial (ADNm) 
(Albarracín-Toalombo, 2020). 
 
Teniendo en cuento lo anterior se puede afirmar que no existe una relación entre la disminución 
de la viabilidad de los promastigotes de L. panamensis y la exposición a las concentraciones el 
extracto etanólico de L. dulcis. Si bien este posee metabolitos secundarios asociados con actividad 
antimicrobiana, al haber utilizado tallos, hojas y flores de manera indistinta puede haber afectado 
la concentración de estos. Otra hipótesis es que las condiciones de crecimiento de la planta 
cambiaran los metabolitos secundarios, es decir que si bien en la CCD, se evidencia la presencia 
de terpenos, alcaloides, antraquinonas y flavonoides, pueden no estar desarrollados compuestos 
específicos de estos grupos relacionados con actividad citotóxica sobre Leishmania (Sepúlveda- 
Jiménez et al., 2004). 
 
Otra posible causa de la falta de acción directa del extracto sobre los porcentajes de viabilidad 
arrojados por el ensayo de MTT, es que la mayoría de estos agentes patógenos, del grupo de lostripanosomátidos, poseen sus superficies celulares están cubiertas por complejos revestimientos 
ricos en proteínas o carbohidratos, que si bien cumplen un papel esencial para su supervivencia e 
infectividad en sus respectivos insectos vectores y mamíferos huéspedes, pueden ser elementos 
que dificulten la adherencia de los metabolitos (McConville et al., 2002). En concreto el estadio 
de promastigotes metacíclico de Leishmania, presenta un cambio en la expresión de proteína que 
aumenta las glicoproteínas (g43) y el incremento de la molécula de LPG, conformada por cuatro 
dominios: un lípido de anclaje, un núcleo hexacárido, una unidad repetitiva fosforilada y un 
dominio terminal (Muskus y Marín-Villa, 2002) que puede llegar complicar la acción de los 
metabolitos de L. dulcis. 
 
Adicionalmente es relevante remarcar el comportamiento que presenta el cultivo de los 
promastigotes de L. panamensis en ausencia de tratamiento, solvente o anfotericina B, este parece 
tener ser estacionario entre las 24 y 48 horas y un declive en las 72 horas, lo cual no puede 
compararse con curvas de crecimiento de la especie, puesto que dentro de la literatura consultada 
no hay ningún informe, sin embargo, hay registro de otras especies del mismo género, con las 
cuales no concuerda (Montalvo-Álvarez et al., 2000). Es por ello que hay que analizar este patrón 
de crecimiento de L. panamensis a partir del ciclo de vida del mismo, donde se ha reportado que 
la forma metacíclica del promastigote es mucho más habitual en la fase estacionaria del desarrollo 
(Muskus y Marín-Villa., 2002; Sacks 1989), lo que podría sugerir que se encuentran en esa etapa 
del ciclo de vida. Otro de los factores a tener en cuenta es la población de parásitos por pozo 
respecto a la disponibilidad de nutrientes en el medio de cultivo, ya que para el millón de 
promastigotes solo se contó con 90 ul de medio para los tres días de exposición, donde 
normalmente se evalúa solo en la fase exponencial (Bocanegra et al., 2021; Rondón et al., 2012 
;de Medeiros et al., 2011), evitando así que los parásitos metabolicen todo el medio e inicie una 
deprivación y senescencia de los promastigotes, por lo que la disminución en la viabilidad puede 
deberse a este último. 
 
Una vez se tiene claro el papel del extracto de L. dulcis sobre los promastigotes, hay que hacer 
evidente que no se reflejó una diferencia significativa entre este y el dimetilsulfóxido utilizado 
como solvente, a pesar de que las concentraciones utilizadas en el ensayo, según la literatura no 
representan un efecto citotóxico sobre las células (Marín et al., 2018). Esto podría estar relacionado 
con los efectos citotóxicos del DMSO que fueron evaluados para el ensayo de MTT por Hsiao y 
colaboradores (2000), demostrando que tiene la capacidad de disolver partículas finas menores de 
2,5 μm (PM2.5), que se encuentran en el aire, que contienen principalmente materias de origen 
antropogénico, incluyendo sulfato, nitrato, amonio, metales, compuestos orgánicos compuestos 
orgánicos, la cuales pueden incidir sobre su actividad citotóxica. Haciendo que el uso prolongado 
de dosis no letales pueda acumular mutaciones a nivel de ADN y generen efectos citotóxicos sobre 
las células (Hsiao et al., 2000). 
La primera variable que se evaluó fue el tamaño, dando como resultado un cambio significativo 
para el control respecto al tratamiento y el solvente, lo que sugiere que un cambio del volumen 
respecto a su superficie, lo cual se ha reportado junto con la hinchazón de los parásitos a un 
comportamiento apoptótico (Valdivieso et al, 2008). Por otro lado, puede estar vinculado con el 
inicio de la transformación a su etapa de amastigote, ya que toma forma circular cambiando el 
largo del cuerpo de los parásitos, dado que son susceptibles al cambio en el pH en el medio 
(Muskus y Marín-Villa, 2002), lo cual podría estar relacionado con la presencia del extracto y el 
solvente.Otra de las mediciones a tener en cuenta es el número de rosetas que se forman, puesto 
que expresan glucano el cual contiene PSA/NeuPSA, sustancias asociadas en otros patógenos a la 
evasión inmunitaria del huésped .Por consiguiente podría estar relacionado con un signo de estrés 
frente a cambios en su ambiente de desarrollo (Iovannisci et al, 2010) como es el caso al introducir 
el extracto de L. dulcis o el DMSO, ya que no se puede relacionar esta actividad únicamente al 
tratamiento. 
Por último, la densidad de los parásitos representa un valor promedio dado que existen porcentajes 
de error asociados al valor final obtenido (Vargas-Jimenéz et al., 2022), así pues, el control 
negativo se presentan dos agregados, dando dos valores de densidad, se sugiere que el primero 
puede estar asociado a parásitos libre de L. panamensis puesto que concuerdan con los datos del 
grupo de investigación aun no publicados por la investigadora Diana Carolina Ochoa , en donde 
la densidad promedio oscila el valor de 1.07 g/ml, lo cual está acorde con los valores obtenidos 
para este experimento. Mientras que segundo se cree está relacionado con el conjunto de rosetas 
ya que son más densas, una posible explicación a este fenómeno es que como se pudo ver en el 
ensayo de MTT, el control negativo mostró un comportamiento de disminución en la división 
celular de los parásitos a las 72 horas, lo que explicaría la formación masiva de rosetas y por 
consiguiente generar un aglomerado que solo asocie las rosetas. 
Si bien los valores de densidad obtenidos para el tratamiento de L. dulcis sobre los promastigotes 
no varían respecto a los parásitos libres, su forma de distribuirse respecto al gradiente habla de que 
el cambio en volumen no es uniforme, lo que puede ser provocado por dificultades en la regulación 
osmótica o por un cambio en la química interna del parasito, ya que como se mencionó 
anteriormente la densidad y el contenido químico de una célula tienen una relación intrínseca 
(Duarte et al., 2014), además se relacionaría con los altos porcentajes de viabilidad encontrados en 
el ensayo de MTT, ya que como se mencionó anteriormente la mitocondria pudo aumentar su 
actividad para suplir la necesidad de regulación osmótica (Zeuthen,1994). 
Conclusiones 
L. dulcis Trevir posee metabolitos de interés asociados con actividad leishmanicida, expresándose 
con mayor variabilidad e intensidad en esteroles y terpenos, y moderada para los flavonoides, 
Además de reportar la inusual presencia de alcaloides. A pesar de que este posee los metabolitos 
secundarios relacionados con actividad microbicida, no se presentó actividad citotóxica por parte 
del extracto de L. dulcis sobre los promastigotes de L. panamensis. 
Aun cuando los porcentajes de viabilidad no disminuyeron en el ensayo de MTT, si se evidenció 
un cambio significativo en las propiedades biofísicas del parásito, una vez expuesta a 200 µg/ml 
de L. dulcis durante 72 horas, tanto de la densidad, el tamaño y cantidad de rosetas. Además, no 
se puede afirmar que L. dulcis es la responsable en el cambio de las propiedades biofísicas, puesto 
que no hay diferencias estadísticas entre la acción del solvente (DMSO) y el extracto, por lo que 
se sugiere evaluar otros solventes para el extracto. 
Recomendaciones 
 
Es importante como perspectiva para futuros estudios la posibilidad de evaluar el aceite esencial 
de L. dulcis sobre L. panamensis, tanto en su estadio amastigote como promastigote, ya que como 
se mencionó anteriormente el carácter hidrófobo de sus componentes permite atravesar la 
membrana celular haciendo más sencilla su acción sobre la diana y por consiguiente siendo más 
efectivo como posible tratamiento. Además, evaluar el efecto sobre las células hospederas sería 
propicio para próximos estudios, para así conocer su acción como tratamiento, ya que se busca que 
la acción citotóxica del extracto sea exclusiva sobre L. panamensis y no genere efectos adversos 
sobre los macrófagos.