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Universidad de La Salle Universidad de La Salle 
Ciencia Unisalle Ciencia Unisalle 
Biología Escuela de Ciencias Básicas y Aplicadas 
2022 
Estudio del efecto de fármacos comerciales sobre el sistema Estudio del efecto de fármacos comerciales sobre el sistema 
quorum sensing de Pseudomonas aeruginosa quorum sensing de Pseudomonas aeruginosa 
Silvia Natalia Medina Rodríguez 
Universidad de La Salle, Bogotá, smedina21@unisalle.edu.co 
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Medina Rodríguez, S. N. (2022). Estudio del efecto de fármacos comerciales sobre el sistema quorum 
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1 
ESTUDIO DEL EFECTO DE FÁRMACOS COMERCIALES SOBRE EL SISTEMA 
QUORUM SENSING DE Pseudomonas aeruginosa 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
SILVIA NATALIA MEDINA RODRÍGUEZ 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
UNIVERSIDAD DE LA SALLE 
ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS 
PROGRAMA DE BIOLOGÍA 
2022 
 
2 
 
ESCUELA DE CIENCIAS BÁSICAS Y APLICADAS 
PROGRAMA DE BIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
ESTUDIO DEL EFECTO DE FÁRMACOS COMERCIALES SOBRE EL SISTEMA 
QUORUM SENSING DE Pseudomonas aeruginosa 
 
 
 
 
 
TRABAJO DE TESIS PARA OPTAR POR EL TITULO DE BIÓLOGA 
 
 
 
 
 
TUTOR 
DSc María Vanessa Gómez Ramírez 
CO TUTOR 
DCs Patricia Hernández Rodríguez 
 
 
 
 
 
BOGOTA, D.C. 
2022 
3 
 
NOTA DE ACEPTACIÓN 
 
 
 
 
________________________________________________ 
________________________________________________ 
________________________________________________ 
________________________________________________ 
 
 
 
 
__________________________________ 
Tutor: Vanessa Gómez Ramírez 
 
 
 
__________________________________ 
 Cotutor: Patricia Hernández Rodríguez 
 
 
 
__________________________________ 
Presidente del jurado 
 
 
 
 
Bogotá D.C., junio 2022 
 
4 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Inicialmente, quiero agradecer a la Universidad de La Salle y la Escuela de Ciencias Básicas 
por la formación académica y por permitirme el uso de sus laboratorios, equipos y materiales. 
 
A la vicerrectoría de investigación y transferencia de la universidad de 
La Salle y a Red COLSI por apoyo financiero. 
 
Al profesor Fabián López y a Laura López de la Universidad Nacional 
de Colombia por los estudios de cribado virtual por acoplamiento 
molecular. 
 
Al semillero de investigación Bio Pro y a la profesora Vanessa Gómez por su apoyo, 
paciencia, dedicación y conocimientos brindados en el desarrollo del proyecto. 
 
A la profesora Patricia Hernández Rodríguez por sus correcciones y su apoyo en la obtención 
de los reactivos y financiación económica. 
 
A la profesora Ludy Pabón por las asesorías y por estar pendiente a cualquier solicitud o 
dificultad que se presentaba. 
 
A mis compañeras de laboratorio Luisa, María Fernanda y Laura por las asesorías y el apoyo 
en este proceso investigativo. 
 
A mi padre, hermanos y amigas. 
 
5 
DEDICATORIA 
 
 
 
 
 
 
Por supuesto, a mi madre Criselda, que con su amor y apoyo incondicional me ha demostrado 
que la vida es hermosa, por el simple hecho de ser amada y poder amar a una persona tan 
inigualable como ella. 
 
 
 
6 
ÍNDICE 
 
RESUMEN ............................................................................................................................. 9 
INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 11 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN .................................................................................. 17 
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 17 
4.1. OBJETIVOS ESPECIFICOS ........................................................................................ 17 
MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................ 18 
5.1. Evaluación de la susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa frente a los fármacos 
comerciales ........................................................................................................................... 18 
5.2. Evaluación de la formación de biopelícula P. aeruginosa frente a los fármacos 
comerciales ........................................................................................................................... 18 
5.3. Evaluación de expresión génica de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales . 20 
5.3.1. Extracción de ARN de las bacterias expuestas a los fármacos comerciales .......... 20 
5.3.2. Transcripción reversa de los ARNs anteriormente extraídos ................................. 21 
5.3.3. Verificación de la expresión de los genes lasR y pqsR .......................................... 21 
5.3.4. Cuantificación de la expresión de los genes lasR y pqsR por qPCR ...................... 22 
5.4. Análisis estadístico ........................................................................................................ 23 
RESULTADOS .................................................................................................................... 25 
6.1. Susceptibilidad de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales…………………26 
6.2. Formación de biopelícula de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales………26 
6.3. Evaluación de la expresión génica de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales
 .............................................................................................................................................. 28 
DISCUSIÓN......................................................................................................................... 34 
CONCLUSIONES ............................................................................................................... 38 
REFERENCIAS ................................................................................................................... 39 
ANEXOS .............................................................................................................................. 45 
 
 
 
7 
ÍNDICE DE TABLAS 
 
 
Tabla 1. Fármacos comerciales evaluados, posición en el docking, porcentaje de pureza, uso 
y estructura molecular. ......................................................................................................... 16 
Tabla 2. Parámetros definidos en el equipo termociclador para la amplificación de la PCR 
convencional......................................................................................................................... 21 
Tabla 3. Secuencias y tamaño de amplificación de los primers empleados. ....................... 22 
Tabla 4. Reactivos, volúmenes empleados en la reacción y concentración final para el 
ensayo de PCR en tiempo real (qPCR) ................................................................................ 23 
Tabla 5. Parámetros definidosen el equipo CFX96 real-time PCR para la amplificación de 
la PCR en tiempo real (qPCR) ............................................................................................. 23 
Tabla 6. Efecto de los fármacos comerciales sobre la formación de biopelícula de 
Pseudomonas aeruginosa. .................................................................................................... 27 
Tabla 7. Cuantificación de los ARN extraídos y relación 260/280 .................................... 28 
Tabla 8. Porcentaje de inhibición de los genes lasR y pqsR frente a tres fármacos comerciales 
a una concentración establecida. .......................................................................................... 32 
 
 
8 
ÍNDICE DE FIGURAS 
 
Figura 1. Diagrama esquemático de los sistemas interconectados de detección de quórum 
Las, Rhl y Pqs en P. aeruginosa. ......................................................................................... 12 
Figura 2. Siembra en placa de 96 pozos para ensayo de formación de biopelícula. ........... 19 
Figura 3. Efecto de los fármacos comerciales sobre el crecimiento de Pseudomonas 
aeruginosa a una concentración de 100 µg/mL. .................................................................. 25 
Figura 4. Efecto de dos fármacos comerciales sobre el crecimiento de Pseudomonas 
aeruginosa a diferentes concentraciones. a) Fármaco Risperdal b) Fármaco Fendiline. ..... 26 
Figura 5. RNAs extraídos. Gel de electroforesis, agarosa al 1%. ....................................... 29 
Figura 6. Verificación de primers. ...................................................................................... 29 
Figura 7. Verificación de la expresión génica del gen control rpoD o gen Housekeeping 
frente a los fármacos comerciales. ....................................................................................... 30 
Figura 8. Verificación de la expresión génica del gen lasR frente a los fármacos comerciales.
 .............................................................................................................................................. 31 
Figura 9. Verificación de la expresión génica del gen pqsR frente a los fármacos 
comerciales. .......................................................................................................................... 31 
Figura 10. Curva de eficiencia del gen pqsR. Se evidencia el valor de Cq vs el logaritmo de 
equivalentes del genoma completo. ..................................................................................... 32 
 
 
 
 
9 
RESUMEN 
 
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria patógena oportunista, causante de múltiples 
infecciones de tipo nosocomial como infecciones pulmonares y en el tracto urinario. Es 
resistente a múltiples antibióticos convencionales y ha sido catalogada por la OMS como 
patógeno de prioridad critica. Esto, gracias a su capacidad para comunicarse de célula a célula 
a través de moléculas señalizadoras. El mecanismo de comunicación es conocido como quorum 
sensing (QS) y es el responsable de la producción de diferentes factores de virulencia y la 
formación de biopelículas. El QS está regulado por tres sistemas, LasI/LasR, RhlI/RhlR y 
PQS/PqsR. Estos sistemas se encuentran interconectados entre sí a través de moléculas 
químicas de señalización. Las biopelículas son comunidades bacterianas que están protegidas 
por sustancias poliméricas extracelulares. Estas, confieren a la bacteria resistencia a los 
antibióticos convencionales y al sistema inmunitario del huésped. La resistencia a los 
antibióticos es una problemática a nivel global que ocasiona miles de muertes anualmente, 
debido el mal uso de los antimicrobianos convencionales y a mutaciones bacterianas. El 
objetivo de esta investigación fue evaluar la posible actividad inhibitoria de 8 fármacos 
comerciales, previamente seleccionados por cribado virtual por acoplamiento molecular frente 
a los factores transcripcionales LasR y PqsR del sistema QS de Pseudomonas aeruginosa. Los 
fármacos a evaluar fueron seleccionados de un proyecto de investigación del grupo 
BIOMIGEN de la Universidad de La Salle y Fabián López de la Universidad Nacional de 
Colombia. Se empleó la cepa (ATCC BAA-47), inicialmente se hicieron ensayos de 
susceptibilidad a una concentración de partida de 100µg/mL con el fin de determinar la 
concentración que no inhibía el crecimiento de la bacteria. Se procedió a determinar el efecto 
de los fármacos sobre la formación de biopelícula a través de la técnica de tinción con cristal 
violeta. Finalmente, se realizaron estudios de expresión génica de los genes lasR y pqsR. Para 
esto, se sintetizó cDNA a partir de ARN extraído de bacterias que crecieron en presencia de 
los fármacos comerciales. Se determinó la expresión génica mediante una PCR convencional 
usando primers específicos y se cuantificó mediante qPCR. Por último, se realizó una prueba 
ANOVA para determinar diferencias significativas con un p ≤ 0,05. Se encontró que la 
concentración que no inhibe el crecimiento de la bacteria es 12,5 y 0,78µg/mL para Risperdal 
y Fendiline respectivamente. Los demás fármacos no mostraron diferencia significativa en el 
crecimiento a 100 µg/mL. Se evidenció que los fármacos Domperidona, Rebamipide, 
Fendiline, Cloperidona y Benzotript inhiben significativamente la formación de biopelícula, 
siendo esta de 60,55 ± 11,91, 61,03 ± 12,45, 58,27 ± 8,080, 40,63 ± 7,510 y 36,01 ± 7,022 % 
10 
respectivamente. Se encontró que los fármacos Fendiline, Benzotript y Cloperidona tienen una 
inhibición de pqsR de 69,87 ± 13,83, 89,28 ± 10,89 y 90,82 ± 16,85% respectivamente. Con 
respecto a lasR, Benzotript y Cloperidona presentan una inhibición de 40,33 ± 14,46 y 45,60 ± 
13,04 % respectivamente. Fendiline no inhibe la expresión de lasR. En conclusión, Fendiline, 
Benzotript y Cloperidona presentan un efecto inhibitorio significativo en la formación de 
biopelícula y en la expresión de pqsR mientras que Benzotript y Cloperidona en lasR, lo cual 
sugiere que estos medicamentos podrían ser usados en conjunto con antibióticos para tratar 
infecciones por P. aeruginosa. 
 
PALABRAS CLAVE 
 
Fármacos comerciales, Percepción del quorum, Pseudomonas aeruginosa, Biopelícula, 
Resistencia bacteriana 
 
11 
INTRODUCCIÓN 
 
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria anaerobia, facultativa, gramnegativa con forma de 
bacilo y de distribución cosmopolita (Banerjee et al., 2017). Es oportunista causante de 
diferentes infecciones de tipo nosocomial (Almohaywi et al., 2018). Gran parte de las 
infecciones ocasionadas por esta bacteria están asociadas con defensas comprometidas del 
huésped, atacando principalmente a pacientes inmunodeprimidos con afectaciones por fibrosis 
quística, quemaduras graves, diabetes, cáncer y SIDA (Curran, Bolig & Torabi-Parizi 2018), 
causando infecciones del tracto urinario y pulmonares agudas. P. aeruginosa se adhiere al 
epitelio de las vías respiratorias del huésped a través de su flagelo y componentes de la 
membrana plasmática externa (Curran, Bolig & Torabi-Parizi 2018). 
 
P. aeruginosa exhibe una resistencia intrínseca a los antibióticos debido a la baja permeabilidad 
de su membrana externa y la presencia de al menos 12 bombas de flujo que pueden expulsar 
varios antibióticos, incluidas las cefalosporinas, los carbapenémicos, las fluoroquinolonas y los 
aminoglucósidos (Soukarieh, Williams, Stocks, & Cámara, 2018; Rezaie et al., 2018). Por 
tanto, diferentes cepas de P. aeruginosa han mostrado multirresistencia y la organización 
mundial de la salud la ha clasificado como una bacteria de prioridad crítica (Asokan, 
Ramadhan, Ahmed, & Sanad, 2019). 
 
P. aeruginosa cuenta con un sistema de señalización conocido como quorum sensing (QS), 
este sistema actúa como un mecanismo de comunicación célula a célula, regulando así la 
expresión de los genes en función de la densidad poblacionala través de moléculas 
autoinductoras que funcionan como señal química con el fin de generar una expresión genética 
colectiva (Soukarieh, Williams, Stocks, & Cámara, 2018). Cada autoinductor se difunde 
libremente en las células y a altas densidades de células bacterianas, estas moléculas alcanzan 
un umbral de concentración y se unen a su respectivo receptor. El QS está regulado por tres 
sistemas, LasI/LasR, RhlI/RhlR y PQS/PqsR (Figura 1), LasR, RhlR y PqsR son factores 
transcripcionales que regulan su propia expresión y la expresión de otros genes. Estos sistemas 
se encuentran interconectados entre sí a través de moléculas químicas de señalización 
(LewisOscar, Nithya, Alharbi, Alharbi, & Thajuddin, 2018). 
 
12 
 
Figura 1. Diagrama esquemático de los sistemas interconectados de detección de quórum Las, 
Rhl y Pqs en P. aeruginosa. LasR, RhlR y PqsR son factores transcripcionales que regulan su 
propia expresión y la expresión de otros genes. Figura tomada de: Soukarieh, Fadi, Williams, 
Stocks & Cámara, 2018. 
 
La molécula señal del sistema Las es N-Acil Homoserina Lactona (AHL). Este sistema induce 
la expresión de genes de virulencia como las elastasas LasA y LasB, la proteasa alcalina y la 
exotoxina A, necesarios para el desarrollo de biopelículas y los sistemas Rhl y Pqs. 
Adicionalmente, los sistemas mediados por AHL pueden regular varias enzimas extracelulares 
involucradas en la adquisición de C, N y P (McBride & Strickland, 2019; Pattnaik et. al., 2018). 
En cuanto al sistema Pqs, encontramos a 2-Heptil-3-Hidroxi-4-Quinolona como molécula de 
señalización. El sistema Pqs es el responsable de la producción de citotoxinas como cianuro de 
hidrógeno (HCN), piocianinas y motilidad bacteriana (Saleh, Sadeq, Abdel Latif, Abbas, & 
Askoura, 2019). Además, se ha demostrado que también es responsable de la formación y 
desarrollo de biopelículas (Vieira, Magalhães, Simões, & Sousa, 2022). Cuando los inductores 
químicos alcanzan un umbral, el sistema QS activa los genes que regulan la producción de los 
factores de virulencia previamente mencionados (Dai et al., 2019). 
 
Se reporta que el sistema quorum sensing de P. aeruginosa es altamente adaptable para 
responder a las condiciones biológicas externas a través de la producción de diferentes factores 
de virulencia como la piocianina, swarming y la formación de biopelículas, entre otros 
(Othman, Rukayadi, and Radu 2019). Existen numerosas formas de inhibir la comunicación 
célula-célula como la degradación de moléculas de señalización y la inhibición del sistema 
precursor o de regulación genética (Asif & Imran, 2020). 
13 
 
Las biopelículas son sistemas donde las bacterias viven en comunidad y sirven como una 
barrera, ya que, las bacterias están incrustadas en una matriz de polímeros auto sintetizada que 
consta de polisacáridos, proteínas y ADN. Esta matriz facilita la comunicación entre ellas y 
con el medio ambiente (Xiong, Zhao, Wen, & Li, 2020). La biopelícula brinda muchas ventajas 
a la bacteria, que incluyen, entre otras, protección física del sistema inmunitario del huésped y 
antimicrobianos/antibióticos, retención de agua y tolerancia a la desecación y almacenamiento 
de nutrientes, alta actividad enzimática extracelular, adhesión al sitio de infección y agregación 
celular que conduce a la coordinación de la expresión del factor de virulencia a través de QS 
(Bhardwaj, Bhatia, Singh, & Franco, 2021). Se reporta que esta biopelícula es uno de los 
principales factores virulentos que emplea P. aeruginosa para crear resistencia antibiótica. De 
hecho, se reporta que las bacterias formadoras de biopelículas son de 100 a 1000 veces más 
resistentes a los agentes antimicrobianos (Sadiq et al., 2020). 
 
Por otra parte, la resistencia antibiótica y el aumento de microorganismos multirresistentes 
(MMR) representan una problemática global que ha ido aumentado durante los últimos años, 
esto debido al uso excesivo e inadecuado de los antibióticos convencionales, antibióticos de 
amplio espectro con dosificación errática y a mutaciones bacterianas (Curran, Bolig, & Torabi-
Parizi, 2018; Asokan, Ramadhan, Ahmed, & Sanad, 2019). Las infecciones ocasionadas por P. 
aeruginosa son de difícil erradicación debido a la resistencia que presenta esta bacteria a 
diferentes antibióticos como: ceftazidima, piperacilina, tazobactam, ciprofloxacina, entre otros 
(Díaz, Barrero et al., 2018). En Colombia para P. aeruginosa se reporta que la resistencia a 
carbapenémicos se presenta en un rango de 25,8 a 28,4%. En países como Perú un 69%, seguido 
de países como Ecuador y Paraguay que presentaron porcentajes de 45% y 40% 
respectivamente (Díaz, Barrero, et al., 2018). 
 
En promedio, 2 millones de personas se infectan con bacterias resistentes a los antibióticos y 
23.000 personas mueren cada año en los Estados Unidos. Por otra parte, en la Unión Europea, 
la resistencia antibiótica causa 25.000 muertes y 2,5 millones de días extra de hospitalización 
al año. Un informe del Banco Mundial advirtió que la resistencia a los antimicrobianos podría 
causar tanto daño a la economía mundial como la crisis financiera de 2008 (Asokan, 
Ramadhan, Ahmed, & Sanad, 2019). 
 
14 
En 2019 fueron reportadas 700.000 muertes anuales por resistencia antibiótica en todo el 
mundo. Con una alta probabilidad de aumentar a 10 millones para 2050 si no se toman medidas 
para reducir la resistencia a los medicamentos o para desarrollar nuevos antibióticos (Dai et al., 
2019). La organización mundial de la salud (OMS) reportó en 2017 un listado de bacterias de 
prioridad critica con alto impacto en la salud humana, P. aeruginosa ocupaba el segundo lugar 
(Dai et al., 2019). 
 
Adicionalmente, el QS puede regular la formación de biopelículas, lo cual propicia la necesidad 
de buscar inhibidores de quórum sensing (IQS) (Ma, Shi, He & Chen, 2021). Los IQS pueden 
disminuir los factores de virulencia, atenuar su patogenia sin afectar el crecimiento y evitar la 
resistencia bacteriana frente a los antibióticos (Almohaywi et. al. 2018). Recientemente se ha 
considerado a los IQS para combatir la aparición de fenotipos resistentes a los antibióticos 
(Ouyang et al., 2020). En la búsqueda de IQS se han reportado una alta diversidad de moléculas 
tales como extractos de Curcuma xanthorrhiza (Othman, Rukayadi, & Radu, 2019), 
Andrographis paniculata (Banerjee et al., 2017), Spirulina platensis (LewisOscar, Nithya, 
Alharbi, Alharbi, & Thajuddin, 2018), nano partículas de óxido de zinc (Saleh, Sadeq, Abdel 
Latif, Abbas, & Askoura, 2019) e incluso fármacos comerciales como el Ibuprofeno (Dai et 
al., 2019). 
 
Por otra parte, la búsqueda de nuevos fármacos requiere un amplio periodo de tiempo y costos 
elevados (Liu, Zuo & Wu, 2020); es por ello, que el reposicionamiento de fármacos se presenta 
como una alternativa que busca que medicamentos aprobados para viejos tratamientos se 
utilicen en nuevas terapias (Liu, Zuo & Wu, 2020). Adicionalmente, la técnica de cribado 
virtual por acoplamiento molecular permite examinar grandes bibliotecas de compuestos para 
descubrir nuevas moléculas en función de su estructura que tienen más probabilidades de unirse 
a una proteína específica de interés y formar un complejo estable (Sadiq et al., 2020). 
 
Por tal razón, con este trabajo se planteó la evaluación de ocho fármacos comerciales como 
inhibidores de QS seleccionados previamente mediante una técnica bioinformática conocida 
como cribado virtual por acoplamiento molecular frente a las proteínas o factores 
transcripcionales, LasR y PqsR. Estos fármacos presentan una amplia ventaja al reportar 
estudios de toxicidad, generando así, una disminución en tiempo y costos (Liu, Zuo & Wu, 
2020). 
 
15 
Los fármacos evaluados en esta investigación se determinaron en el marco de un proyecto al 
interior del grupo de investigación BIOMIGEN de la Universidad de la Salle en cooperacióncon Fabián López-Vallejo de la Universidad Nacional de Colombia (Resultados no 
publicados). Del listado reportado se escogieron los fármacos a evaluar, teniendo en cuenta 
parámetros como: diferencias en la estructura química, ubicación en el listado de acoplamiento 
molecular, porcentaje de pureza >90% y disponibilidad comercial ≥ 10mg. 
 
Estos fármacos presentan pluralidad en su uso clínico. Por ejemplo, Risperdal y Penfluridol 
son empleados como antipsicótico, ya que, ambos se usan en el tratamiento de la esquizofrenia 
(Bobo & Shelton, 2010; Soares, B. G., & de Lima, M. S., 2006). A su vez, Domperidone y 
Rebamipide son usados principalmente como terapia de problemas gastrointestinales 
(Reddymasu, Soykan & McCallum, 2007; Arakawa et. al., 1998). Por otra parte, Kentanserin, 
Fendiline, Benzotript y Cloperidona son empleados como antihipertensivo (Brogden & Sorkin, 
1990), vasodilatador coronario (Bayer & Mannhold, 1987), potenciador de morfina (Hahne et. 
al., 1981) e inhibidor de citocromo P450 (Goldwaser et. al., 2022), respectivamente. 
 
Su estructura molecular presenta algunas similitudes, por ejemplo todos poseen anillos 
aromáticos de benceno y nitrógeno en grupos tipo amina, amida o heterociclos. Además, siete 
de estos poseen halógenos (Cl o F) en su estructura. Estos fármacos comerciales, su posición 
en el docking, uso clínico, porcentaje de pureza y estructura molecular se presentan en la tabla 
1. 
16 
Tabla 1. Fármacos comerciales evaluados, posición en el docking, porcentaje de pureza, 
uso y estructura molecular. 
 
 
 
17 
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN 
 
¿Cuáles de los fármacos comerciales identificados previamente por docking molecular tienen 
un efecto inhibitorio en la formación de biopelícula y el sistema quorum sensing de 
Pseudomonas aeruginosa? 
 
 
OBJETIVO GENERAL 
 
Evaluar el efecto de ocho fármacos comerciales sobre el sistema quorum sensing de 
Pseudomonas aeruginosa. 
 
 
 4.1. OBJETIVOS ESPECIFICOS 
 
• Establecer el efecto de los fármacos comerciales sobre el crecimiento de Pseudomonas 
aeruginosa. 
• Evaluar la actividad de los fármacos comerciales sobre la formación de la biopelícula 
de Pseudomonas aeruginosa. 
• Determinar la expresión de los genes lasR y pqsR frente a los fármacos comerciales que 
mostraron disminución en la formación de biopelícula. 
 
 
 
18 
MATERIALES Y MÉTODOS 
 
5.1. Evaluación de la susceptibilidad de Pseudomonas aeruginosa frente a los fármacos 
comerciales 
A continuación, se determinó el efecto de los fármacos comerciales sobre el crecimiento de P. 
aeruginosa a una concentración inicial de 100 µg/ mL. Para esto, se sembraron de 2 a 3 colonias 
de la cepa (ATCC BAA-47) de P. aeruginosa en 5 mL de medio LB y se dejó en incubación a 
37°C durante 24 horas, con movimiento de 180 rpm. Pasado este tiempo se leyó OD600 nm 
del inoculo (0,8 -1,0) y se realizó una dilución 1/100 subcultivando 50µL del inóculo anterior 
en 4950 µL de medio LB (para una concentración final de 1 X105 UFC/mL) (Gámez & Rúgeles, 
2020). Luego, en una placa de 96 pozos se adicionó en cada uno de los pozos: 196 µL de medio 
LB, 2 µL de fármaco y 2 µL de bacteria diluida. Se hizo un control con medio LB + DMSO. 
El control positivo tenía medio LB, DMSO y bacteria únicamente. Esto se colocó a incubar 
durante 24 h a 37°C en condiciones estáticas (Cockerill, Wikler & Hardy, 2013). 
 
Pasado este tiempo se leyeron los resultados a OD600 nm usando un lector de microplacas 
(Thermo Scientific). Este proceso se realizó con los ocho fármacos comerciales, cada uno de 
ellos por triplicado y se determinó la desviación estándar. Se realizó una prueba estadística 
ANOVA en el programa R con el fin de saber si existía una diferencia significativa entre el 
crecimiento de la bacteria en presencia del fármaco y sin fármaco (Control positivo). 
 
Con los fármacos que presentaron una diferencia significativa respecto al control, se repitió el 
mismo procedimiento, disminuyendo las concentraciones del fármaco ½ (evaluando rangos de 
100 µg/ mL a 0,78 µg/ mL) hasta encontrar la concentración que no inhibía el crecimiento de 
la bacteria. 
 
5.2. Evaluación de la formación de biopelícula P. aeruginosa frente a los fármacos 
comerciales 
Para la determinación del efecto de los fármacos comerciales sobre la formación de biopelícula 
de P. aeruginosa se tomaron 2 colonias de la bacteria en 4 mL de medio LB y se dejó en 
incubación a 37°C durante 24 h, con movimiento de 180 rpm. 
 
En una placa de 96 pozos se adicionó 196μL de medio LB, 2μL del fármaco solubilizado en 
DMSO y 2μL del cultivo bacteriano overnight para un volumen final de 200 μL por pozo con 
19 
una concentración final de 1 X107 UFC/mL (Gámez & Rúgeles, 2020; Cockerill, Wikler & 
Hardy, 2013). Para el control negativo, se adicionó 198 µL de medio LB, 2 μL de DMSO y 
2μL del cultivo bacteriano. Finalmente, se incluyó un control positivo con el antibiótico 
gentamicina a una concentración de 1,5 µL/mL (Bahari et. al., 2017). La siembra en la placa 
se muestra en la figura 2. 
 
 
Figura 2. Siembra en placa de 96 pozos para ensayo de formación de biopelícula. 
 
La placa se incubó a 37 °C durante 24 horas en condiciones estáticas. Después de la incubación, 
los pocillos se enjuagaron cuidadosamente 2 veces con buffer fosfato salino (PBS) para 
eliminar las células planctónicas. Las células adheridas en las paredes fueron teñidas con 150 
μL de solución de cristal violeta al 0.1% (HiMedia, India) durante 15 min. El exceso de 
colorante se eliminó enjuagando cuatro veces con PBS y se resuspendió con 150 μl de etanol 
al 95% (Bali, Türkmen, Erdönmez, & Saglam, 2019). La intensidad fue medida a OD570 nm 
usando un lector de microplacas (Thermo Scientific). Los ensayos fueron realizados por 
quintuplicado, se determinó desviación estándar. Los resultados fueron expresados como % de 
formación de biopelícula y se hallaron empleando la ecuación 1. Se evaluaron 4 
concentraciones por fármaco. La concentración de evaluación inicial fue la establecida en el 
ensayo de susceptibilidad y se redujo ¼ tres veces. 
 
[Ecu. 1] 
*RQ1 DNase 10X Reaction Buffer: 400mM Tris-HCl (pH 8.0), 100mM MgSO4 y 10mM CaCl2 
**TBE (Tris-borate-EDTA) 0.5X: 5.4 g Tris base, 2.75 g Boric-acid, 2 mL 0.5 M EDTA pH 8.0, 1L H2O 
*** Stop Solution: 20mM EGTA (pH 8.0). 20 
5.3. Evaluación de expresión génica de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales 
Para los ensayos de expresión génica se seleccionaron los fármacos con mejores resultados en 
la formación de biopelícula, es decir aquellos que generaron un porcentaje de formación de 
biopelícula ≤ al 50%. 
 
5.3.1. Extracción de ARN de las bacterias expuestas a los fármacos comerciales: Inicialmente 
se sembró 1 colonia de P. aeruginosa en 5 mL de medio LB, esto se incubó a 37° y 180 rpm 
durante 18 a 24 horas (OD 600nm 0,8 a 1,0). Luego, se hizo una dilución 1/100 subcultivando 
2940 µL de medio LB, 30 µL de fármaco a la concentración seleccionada y 30 µL del inóculo 
overnight. Para el control positivo se colocó 2940µL de medio LB, 30 µL de DMSO y 30µLde 
inoculo, para un volumen final de 3 mL. Esto se colocó a incubar a 37°C y 180 rpm hasta 
alcanzar una absorbancia entre 0,6 a 0,8 OD600 nm. Cada fármaco y control se realizó por 
triplicado. 
 
Al alcanzar la absorbancia deseada (0,6 a 0,8 OD600 nm) se inició con la extracción de ARN 
con el kit RNeasy mini kit (Qiagen ®) de acuerdo al protocolo de extracción. El siguiente paso 
fue limpiar cada una de las muestras de ARN, para esto, se agregó: RQ1 RNase-Free DNase 
Reaction Buffer a concentración final 1X*, 1 unidad de RQ1 RNase-Free Dnase y se incubó 
durante 50 minutos. Pasado este tiempo, se realizó una PCR convencional con las 
especificaciones de la tabla 2, usando 6,25 µL de gotaq green mastermix 12,5X, 4,75 µL de 
agua DEPC, 0,5 µL primer reverse 12,5µM, 0,5 µL de primer forward 12,5µM (tabla 3) y 0,5 
µL de la muestra de ARN tratado como plantilla. Se realizó un control negativo sin plantilla y 
un control positivo usando ADN extraído de P. aeruginosa como plantilla. 
 
Se realizó una electroforesis; para esto se hizo un gel de agarosa a una concentración de 1,25%, 
3 µL de midori y buffer TBE (Tris-borate-EDTA) 0,5X**. Para el marcador de peso se utilizó 
2 µL buffer de carga 6X, 2 µL agua DEPC, 2 µL ladder 1000 bp. Para cada uno de los productos 
de la PCR se utilizó 2 µL buffer de carga 6x y 4 µL de producto. Esta electroforesis se dejó 
correr durante una hora a 100 voltios. El gel fue observado en un transiluminador. A cada una 
de las muestras tratadas y limpias de ADN se les agregó buffer de parada RQ1 DNase stop*** 
a concentración final 1X y se incubó por 10 minutos a 65 °C para denaturar la enzima DNasa.
 
 21 
Se determinó la concentración del RNA final y la relación 260/280 en una placa de 
cuantificación nanodrop (Thermo Scientific). Finalmente, se realizó una electroforesis de 
agarosa a 1% con los ARNs extraídos. 
 
Tabla 2. Parámetros definidos en el equipo termociclador para la amplificación de la 
PCR convencional. 
 
Nombre del 
ciclo 
Temperatura Tiempo 
Número de 
ciclos 
Desaturación 
Inicial 
95 °C 5 minutos 1 
Denaturación 95 °C 45 segundos 
Anillamiento 58 °C 45 segundos 30 
Extensión 72 °C 1 minutos 
Extensión Final 72 °C 7 minutos 1 
Enfriamiento 10 °C el necesario 1 
 
5.3.2. Transcripción reversa de los ARNs anteriormente extraídos: la síntesis de cDNA se 
realizó con 1μg de ARN, 0,5 μg de primers hexámeros aleatorios por μg de ARN y se completó 
a 16 μL con agua DEPC. Esto se calentó a 70 °C durante 10 minutos. Luego se enfrió el tubo 
en hielo y se agregaron los siguientes reactivos: buffer de reacción M-MLV [10X] a 
concentración final 1X, 1 μL de dNTP [10 mM] a concentración final 0,5 mM y 200 unidades 
de enzima M-MLVRT (Sigma ®). Esto se mezcló y se incubó durante 10 minutos a 22°C. 
Luego se incubo 50 minutos a 37 °C y finalmente, 10 minutos a 90 °C con el fin de denaturar 
la enzima transcriptasa reversa. 
 
5.3.3. Verificación de la expresión de los genes lasR y pqsR: sobre cada uno de los cDNAs se 
realizó la verificación de la expresión de los genes lasR y pqsR por PCR convencional usando 
primers específicos para estos. Esto se visualizó mediante una electroforesis de agarosa, con 
los parámetros descritos en el numeral 5.3.1. La secuencia y tamaño de amplificación de cada 
uno de los primers se muestra en la tabla 3.
 
22 
 
Tabla 3. Secuencias y tamaño de amplificación de los primers empleados. 
Primers Secuencia 
Tamaño de 
amplificación 
RpoD 
(Savli et al. 2003) 
Secuencia Forward: 
GGGCGAAGAAGGAAATGGT 
178 bp 
Secuencia Reverse: 
CAGGTGGCGTAGGTGGAGA 
 
LasR 
(Parai et al. 2018) 
Secuencia Forward: 
ACGCTCAAGTGGAAAATTGG 
241 bp 
Secuencia Reverse: 
GTAGATGGACGGTTCCCAGA 
 
PqsR 
(Parai et al. 2018) 
Secuencia Forward: 
AACCTGGAAATCGACCTGTG 
238 bp 
Secuencia Reverse: 
TGAAATCGTCGAGCAGTACG 
 
 
 
5.3.4. Cuantificación de la expresión de los genes lasR y pqsR por qPCR: Se evaluaron los tres 
fármacos seleccionados por triplicado en una qPCR usando el cDNA previamente obtenido 
como plantilla, el Kit Luna® Universal qPCR y el equipo CFX96 real-time PCR (Bio-Rad). Se 
realizó la normalización con el gen housekeeping rpoD (Saleh, Sadeq, Abdel Latif, Abbas, & 
Askoura, 2019). Los volúmenes de los reactivos se presentan en la tabla 4 y los parámetros 
definidos en el equipo en la tabla 5. 
 
Se determinó la expresión de los genes empleando la ecuación 2, en donde ΔΔCt = ((Ct gen de 
interés – Ct gen control) tratamiento) – ((Ct gen de interés – Ct gen control) control) (Kenneth & Thomas, 2001). 
Los resultados fueron expresados como porcentaje de inhibición génica. 
 
[Ecu. 2] 
 
 
23 
 
Tabla 4. Reactivos, volúmenes empleados en la reacción y concentración final para el 
ensayo de PCR en tiempo real (qPCR) 
 
Reactivo Reacción 10 µL Concentración final 
Luna Universal qPCR Mix 5 µL 1X 
Forward primer (10 µM) 0,25 µL 0,25 µM 
Reverse primer (10 µM) 0,25 µL 0,25 µM 
Plantilla cDNA 2 µL < 100ng 
Agua libre de nucleasas 2,5 µL 
 
Tabla 5. Parámetros definidos en el equipo CFX96 real-time PCR para la amplificación 
de la PCR en tiempo real (qPCR) 
 
Nombre del 
ciclo 
Temperatura Tiempo 
Número de 
ciclos 
Denaturación 
inicial 
95 °C 1 minuto 1 
Denaturación 95 °C 15 segundos 35 
Extensión 62 °C 30 segundos 
Curva melting 65 – 95 °C Variado 1 
 
La curva de eficiencia para los genes rpoD y lasR se realizó previamente en el grupo de 
investigación (López L., 2022). Mientras que para el gen pqsR se realizó un ensayo de qPCR 
usando como plantilla 6 diluciones seriadas (1/10) de ADN de P. aeruginosa. Se graficaron lo 
valores de Cq vs el número de equivalentes del genoma completo (egc). Se obtuvo la ecuación 
de la recta y el valor de R2. Se determinó el porcentaje de eficiencia aplicando la ecuación 3. 
[Ecu. 3] 
 
5.4. Análisis estadístico 
 
Los ensayos de susceptibilidad fueron realizados por triplicado y se determinó la deviación 
estándar. Se usó una prueba de normalidad Shapiro-Wilk para contrastar si los datos seguían 
una distribución normal. Posteriormente, se usó un análisis de varianza simple (ANOVA) 
 
24 
 
(Tukey) para determinar la concentración a la cual el ensayo en presencia del fármaco es 
estadísticamente igual al control y por tanto no afectara el crecimiento de la bacteria. 
 
Para la determinación del efecto de los fármacos comerciales sobre la biopelícula se realizaron 
ensayos por quintuplicado, se determinó desviación estándar y coeficiente de variación. Se 
realizó prueba Shapiro-Wilk y la prueba estadística ANOVA (Tukey) con una significancia 
relativa de p ≤ 0.05. Los resultados se expresaron como porcentaje de formación de biopelícula. 
 
Los ensayos de expresión génica fueron realizados por triplicado y se determinó la desviación 
estándar. Se realizó una prueba Shapiro-Wilk y un análisis de varianza simple ANOVA para 
determinar el efecto de los fármacos comerciales sobre los genes de interés del sistema QS de 
P. aeruginosa con una significancia relativa de p ≤ 0.05. 
 
 
25 
 
RESULTADOS 
 
6.1. Susceptibilidad de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales 
 
Los fármacos Domperidona, Rebamipide, Benzotript y Cloperidona a una concentración de 
100 µg/mL, no generan inhibición significativa sobre el crecimiento de P. aeruginosa (Figura 
3). Por tanto, esta concentración se empleó en la evaluación de formación de biopelícula. 
 
Por otra parte, la bacteria con los fármacos Ketanserin y Penfluridol, presenta un crecimiento 
ligeramente mayor que el control siendo de 115 ± 4% y 128 ± 6% respectivamente. P. 
aeruginosa mostró frente a los fármacos Risperdal y Fendiline un crecimiento de 70 ± 9% y 52 
± 6 % respectivamente a una concentración de 100 µg/mL. Siendo estos resultados 
estadísticamente diferentes con respecto al control (Figura 3). 
 
 
 
Figura 3. Efecto de los fármacos comerciales sobre el crecimiento de Pseudomonas 
aeruginosa a una concentración de 100 µg/mL. El control (barra azul) es el crecimiento de la 
bacteria sin ninguna clase de compuesto (100%). Las barras con * representan los fármacos 
con diferencia significativa respecto al control p ≤ 0,05. Estos ensayos fueron realizados por 
triplicado. Se presenta promedio y desviación estándar. 
 
 
26 
 
Por tanto, para los fármacos Fendiline y Risperdal fue necesario disminuir la concentración del 
fármaco hasta encontrar una concentración que no inhibía el crecimientode la bacteria. Se 
encontró que el fármaco Risperdal a una concentración de 12,5µg/mL no inhibe el crecimiento 
de la bacteria; siendo este crecimiento de 90 ± 6%. Por su parte, para el fármaco Fendiline la 
concentración 0,78µg/mL no inhibe el crecimiento bacteriano y en este caso se presentó un 
crecimiento en la bacteria de 90 ±1%. Estos resultados se muestran en la Figura 4. 
 
 
 
Figura 4. Efecto de dos fármacos comerciales sobre el crecimiento de Pseudomonas 
aeruginosa a diferentes concentraciones. a) Fármaco Risperdal b) Fármaco Fendiline. El 
control es el crecimiento de la bacteria sin ninguna clase de compuesto (100%). * diferencia 
significativa respecto al control p ≤ 0,05. Estos ensayos fueron realizados por triplicado. Se 
presenta promedio y desviación estándar. 
 
6.2. Formación de biopelícula de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales 
 
Se encontró que el fármaco Domperidona causa efecto inhibitorio significativo en la formación 
de biopelícula únicamente a la concentración de 25µg/mL. Por otro lado, los fármacos 
Rebamipide y Cloperidona generan inhibición únicamente en la concentración más baja 
evaluada, 1,56µg/mL. Fendiline inhibe significativamente a una concentración de 0,78µg/mL 
y el fármaco Benzotript presenta inhibición en la formación de biopelícula a 6,25µg/mL y a 
1,56µg/mL con respecto al control. Los fármacos Ketanserin, Penfluridol y Risperdal no 
inducen inhibición significativa en la formación de biopelícula en ninguna de las cuatro 
concentraciones evaluadas. Estos resultados se muestran en la tabla 6. 
 
 
27 
 
Tabla 6. Efecto de los fármacos comerciales sobre la formación de biopelícula de 
Pseudomonas aeruginosa. Se presenta las concentraciones evaluadas, su porcentaje de 
formación de biopelícula con su respectiva desviación estándar. 
 
 
 
Los % de formación con * presentan diferencias significativas con respecto al control con un 
p ≤ 0,05. Los fármacos seleccionados para ser evaluados en ensayos de expresión génica, se 
encuentran en un cuadro rojo. 
 
Se seleccionaron los fármacos comerciales con porcentajes de formación de biopelícula ≤ al 
50%. Los fármacos seleccionados para evaluar su efecto en la expresión de los genes lasR y 
pqsR fueron Benzotript y Cloperidona a una concentración de 1,56 µg/mL y Fendiline a 0,78 
µg/mL, ya que presentaron mayor efecto inhibitorio en la formación de biopelícula a bajas 
concentraciones. 
 
 
28 
 
6.3. Evaluación de la expresión génica de P. aeruginosa frente a los fármacos comerciales 
 
La extracción de ARN se realizó en la fase de crecimiento exponencial de P. aeruginosa 
(Anexo 1), las absorbancias de los cultivos se presentan en el anexo 2. En la PCR convencional 
usando cada uno de los ARNs tratados como plantilla, se evidenció que no hay productos de 
amplificación, lo que muestra que la digestión con DNasa fue efectiva. Estos resultados se 
muestran en anexo 3. Todos los ARNs presentaron una relación 260/280 entre 1,8 y 2. Lo que 
indica que las muestras tienen una pureza óptima. La concentración de ARN de las muestras y 
la relación 260/280 se muestran en la tabla 7. 
 
Tabla 7. Cuantificación de los ARN extraídos y relación 260/280 
 
Fármaco Concentración 
ARN 
Relación 
260/280 
Fármaco Concentración 
ARN 
Relación 
260/280 
Control 1 254,4 µg/mL 2,062 Benzotript 1 243,9 µg/mL 2,058 
Control 2 242,9 µg/mL 2,059 Benzotript 2 223,4 µg/mL 2,061 
Control 3 211,4 µg/mL 2,025 Benzotript 3 168,2 µg/mL 2,088 
Fendiline 1 113,0 µg/mL 1,925 Cloperidona 1 368,2 µg/mL 2,070 
Fendiline 2 134,1 µg/mL 1,940 Cloperidona 2 234,0 µg/mL 1,958 
Fendiline 3 163,8 µg/mL 1,880 Cloperidona 3 312,8 µg/mL 2,062 
 
La electroforesis de algunos de los ARNs extraídos se muestra en la figura 5. 
 
 
29 
 
Figura 5. RNAs extraídos. Gel de electroforesis, agarosa al 1%. Las fechas rojas señalan los 
RNAs ribosomales. 1. Marcador de peso, 2. RNA control 1, 3. RNA Fendiline 1, 4. RNA 
Benzotript 1, 5. RNA Cloperidona 1. 
 
El peso del rRNA 16S de P. aeruginosa es de 1500 pb y el del rRNA 23S es de 3000 pb (Vallet 
et. al. 2004), en la Figura 5, se observan transcritos con pesos moleculares superiores a 1000 
pares de bases, lo cual es un indicativo de un ARN íntegro y de buena calidad. 
 
Los primers empleados fueron obtenidos de literatura (Tabla 2). Se realizó la verificación de 
la amplificación sobre DNA de las tres parejas de primers usados. Se evidencia que para lasR, 
pqsR y rpoD se obtiene un producto del tamaño esperado, 178 pb, 241 pb y 238 pb 
respectivamente (Tabla 2, Figura 6). Adicionalmente, al no amplificar los controles negativos 
se demuestra que los primers, agua DEPC y gotaq Green master mix están libres de 
contaminantes como ácidos nucleicos. Se evidencia que estos primers no amplifican dímeros. 
 
 
Figura 6. Verificación de primers. 1. Marcador de peso, 2. Control negativo del gen rpoD, 3. 
Control positivo de ADN del gen rpoD 4. Control negativo del gen lasR 5. Control positivo de 
ADN del gen lasR 6. Control negativo del gen pqsR 7. Control positivo de ADN del gen pqsR. 
 
El gen housekeeping empleado fue rpoD, estos genes son conocidos así, ya que, su síntesis se 
produce en todos los tipos de células nucleadas; rpoD codifica el principal factor sigma de P. 
aeruginosa, inducido en fase exponencial (Masaya, Kan, Hideo & Akinori, 1994). La síntesis 
de esas moléculas se considera a menudo muy poco fluctuante en comparación con la de otras 
 
30 
 
y, por su uso común, se consideran en muchos laboratorios como constantes y seguras (Thellin 
et. al. 1999). 
 
En los estudios de verificación de la expresión génica se evidenció que el gen control rpoD 
amplifica el triplicado del control (cDNA sin tratamiento) y los triplicados de los tres fármacos. 
Además, no se evidencia reducción en la amplificación de ninguna de las muestras, evidenciado 
la estabilidad en la expresión con cada uno de los tratamientos y el uso adecuado como gen 
housekeeping para normalizar la expresión de los genes diana. Se evidencia la amplificación 
del producto en el tamaño esperado, 178 pb. Estos productos amplificados se muestran en la 
figura 7. 
 
 
Figura 7. Verificación de la expresión génica del gen control rpoD o gen Housekeeping frente 
a los fármacos comerciales. Electroforesis en gel de agarosa al 1.25 % de los productos de PCR 
sobre cDNA. Carril 1: Marcador de peso; carril 2, 3 y 4: Control 1, 2 y 3; carril 5, 6 y 7: 
Fendiline 1, 2 y 3 a 0,78 µg/mL; carril 8, 9 y 10: Benzotript 1, 2 y 3 a 1,56 µg/mL; carril 11,12 
y 13: Cloperidona 1, 2 y 3 a 1,56 µg/mL. 
 
Con respecto a la expresión del gen lasR frente a los fármacos comerciales no se evidencia 
reducción aparente en la amplificación frente al fármaco Fendiline y Cloperidona. Sin 
embargo, frente al fármaco Benzotript se evidencia una leve inhibición en la amplificación de 
las bandas. Se evidencia la amplificación del producto en el tamaño esperado, 241 pb. La 
amplificación de estos cDNAs se evidencia en la figura 8. 
 
 
 
31 
 
 
Figura 8. Verificación de la expresión génica del gen lasR frente a los fármacos comerciales. 
Electroforesis en gel de agarosa al 1.25 % de los productos de PCR sobre cDNA. Carril 1: 
Marcador de peso; carril 2, 3 y 4: Control 1, 2 y 3; carril 5, 6 y 7: Fendiline 1, 2 y 3 a 0,78 
µg/mL; carril 8, 9 y 10: Benzotript 1, 2 y 3 a 1,56 µg/mL; carril 11,12 y 13: Cloperidona 1, 2 
y 3 a 1,56 µg/mL. 
 
En la figura 9 se evidencia la amplificación del triplicado del control de de los tres fármacos. 
Es visible una reducción en la banda que muestra la expresión del gen pqsR en el control frente 
al triplicado de los fármacos Fendiline y Benzotript. Sin embargo, es importante la 
cuantificación de estos resultados mediante una PCR en tiempo real (qPCR). Se evidencia la 
amplificación del producto en el tamaño esperado, 238 pb. 
 
Se empleó un control negativo de losgenes rpoD, lasR y pqsR usando agua DEPC como 
plantilla y un control positivo de los tres genes usando agua ADN de P. aeruginosa como 
plantilla (Figura 6). 
 
 
 
Figura 9. Verificación de la expresión génica del gen pqsR frente a los fármacos comerciales. 
Electroforesis en gel de agarosa al 1. 25 % de los productos de PCR sobre cDNA. Carril 1: 
Marcador de peso; carril 2, 3 y 4: Control 1, 2 y 3; carril 5, 6 y 7: Fendiline 1, 2 y 3 a 0,78 
µg/mL; carril 8, 9 y 10: Benzotript 1, 2 y 3 a 1,56 µg/mL; carril 11,12 y 13: Cloperidona 1, 2 
y 3 a 1,56 µg/mL. 
 
Para la cuantificación por qPCR, se realizó la curva de eficiencia del gen pqsR, esta muestra 
una eficiencia de 112% y un R2 de 0,9953 que indica un comportamiento lineal para las 
cantidades de plantilla evaluadas. El gen rpoD y lasR había mostrado en un estudio previo 
(López, L., 2022) eficiencia de 108% y 111% respectivamente, así como R2 de 0,998 y 0,9995 
 
32 
 
con las cantidades de plantilla evaluadas. La curva de eficiencia para pqsR se evidencia en la 
figura 10, para rpoD en el anexo 4 y para lasR en el anexo 5. 
 
 
 
Figura 10. Curva de eficiencia del gen pqsR. Se evidencia el valor de Cq vs el logaritmo de 
equivalentes del genoma completo. Se presenta la ecuación de la curva, el valor de R2 y el 
porcentaje de eficiencia. 
 
Los datos de los Cq de los cDNAs con los genes de interés frente a cada uno de los tratamientos 
se muestran en el anexo 6. En los resultados de qPCR se encontró que los fármacos comerciales 
Fendiline, Benzotript y Cloperidona inhiben la expresión génica de pqsR significativamente y 
Benzotript y Cloperidona inhiben significativamente lasR. Por otra parte, el fármaco Fendiline 
no presenta inhibición del gen lasR. Además, el fármaco Cloperidona genera la mayor 
inhibición sobre lasR y pqsR. Estos resultados se evidencian en la Tabla 8. 
 
Tabla 8. Porcentaje de inhibición de los genes lasR y pqsR frente a tres fármacos comerciales 
a una concentración establecida. 
 
 
33 
 
 
Los porcentajes de inhibición con * son estadísticamente diferentes respecto al control con un 
p ≤ 0.05. 
 
Adicionalmente, se encontró que Cloperidona y Benzotript son los fármacos que presentan 
mejores resultados de inhibición tanto en la formación de biopelícula como en la expresión 
génica. 
 
 
34 
 
DISCUSIÓN 
 
P. aeruginosa es una bacteria multirresistente que genera numerosas muertes anualmente 
debido a la ineficiencia de múltiples antibióticos. Esta resistencia a los antibióticos 
convencionales se atribuye principalmente a la formación de biopelículas (Vadekeetil, 
Chhibber, & Harjai, 2019). Además, P. aeruginosa genera afectaciones en la industria médica 
ya que, las biopelículas se forman en superficies como catéteres y equipos médicos (Erhabor, 
Erhabor & McGaw, 2019). 
El cribado virtual por acoplamiento molecular surge como una estrategia en la búsqueda de 
inhibidores de quorum sensing, ya que, mejora en gran medida la eficiencia y reduce costos de 
investigación (Fan, Fu, & Zhangz, 2019). Además, la reutilización de medicamentos tiene 
como objetivo generar nuevos usos clínicos para medicamentos ya establecidos con posibles 
efectos antimicrobianos o potenciarlos cuando se usan en combinación con un antibiótico 
(Vieira, Magalhães, Simões, & Sousa, 2022). 
Los fármacos comerciales evaluados en este estudio fueron seleccionados a traves de cribado 
virtual por acoplamiento molecular frente a los factores transcripcionales LasR y PqsR. Se 
evidencia que estos fármacos no presentan una línea única de uso médico. Por ejemplo, el 
fármaco Rebamipide se emplea en el tratamiento para la protección de la mucosa, curación de 
úlceras gastroduodenales y gastritis (Arakawa et. al., 1998). Al igual que el fármaco 
Domperidone empleado para aliviar vómitos y molestias gastrointestinales (Reddymasu, 
Soykan & McCallum, 2007). Fendiline, es empleado como vasodilatador coronario que inhibe 
la función del calcio en las células musculares en el acoplamiento de excitación – contracción 
(Bayer & Mannhold, 1987). Benzotript es empleado como un potenciador de morfina y es 
ampliamente utilizado en estudios de neurociencia (Hahne et. al., 1981). Finalmente, el 
fármaco Cloperidona ha sido reportado en investigaciones como inhibidor de citocromo P-450 
2C9 (Goldwaser et. al., 2022). 
Sin embargo, sus estructuras químicas presentan algunas similitudes como lo muestra la tabla 
1, por ejemplo, los ocho fármacos tienen mínimo tres anillos aromáticos unidos mediante un 
átomo de nitrógeno ya sea en un grupo amida o amina y siete de los ocho fármacos presentan 
grupos halógenos en su estructura (Cl y F). 
 
35 
 
Por otra parte, las furanonas halogenadas también han sido descritas como inhibidores de QS 
de P. aeruginosa. La similitud estructural permite que las furanonas inhiban competitivamente 
el efecto de las moléculas de señalización de AHL, además, destabilizan LasR. 
Adicionalmente, tienen persuasión sobre la biosíntesis de sideróforos (Asif & Imran, 2020). 
En la búsqueda de inhibidores de quorum sensing es importante evaluar concentraciones de 
fármacos que no tengan un efecto inhibitorio en el crecimiento de P. aeruginosa para asegurar 
que se está generando un tipo de desarme bacteriano, inhibiendo el QS en lugar de afectar el 
crecimiento, lo que reduce la carga evolutiva de las bacterias y el riesgo de desarrollo de 
resistencia a antibióticos convencionales (Almohaywi et al., 2018), por ello previo a los 
estudios sobre la formación de biopelícula y los ensayos de expresión génica, se realizó la 
evaluación de los fármacos sobre el crecimiento de la bacteria y se seleccionó la concentración 
que no generó inhibición. 
Los fármacos Domperidone, Rebamipide, Fendiline, Benzotript y Cloperidona presentaron 
efecto inhibitorio significativo en la formación de biopelícula de P. aeruginosa. Siendo esta de 
60.55 ± 11.91, 61.03 ± 12.45, 58.28 ± 8.079, 40.64 ± 7.022, 36.32 ± 7.510 % respectivamente. 
Se evidenció que el efecto de los fármacos comerciales sobre la formación de biopelícula no 
mostró ser dependiente de las concentraciones evaluadas. Sin embargo, los efectos inhibitorios 
más altos se dan en las concentraciones más bajas para el caso de los fármacos Rebamipide, 
Benzotript y Cloperidona. 
Por otra parte, se observa que cuatro de los cinco fármacos con efecto inhibitorio significativo 
en la formación de biopelícula, incluyendo los dos fármacos con mayor efecto, es decir, 
Cloperidona y Benzotript, poseen en su estructura un átomo de cloro (Cl) unido a un benceno. 
Mientras que Ketanserin, Risperdal y Penfluridol, que no presentaron inhibición significativa 
en la formación de biopelícula, presenta uno o varios átomos de flúor (F). 
Los fármacos Fendiline, Benzotript y Cloperidona tuvieron un efecto inhibitorio significativo 
en la expresión de pqsR, con porcentajes de inhibición de 69.87 ± 13.83, 89.28 ± 10.89, 90.82 
± 16.85 respectivamente. Benzotript y Cloperidona inhibieron la expresión de lasR 40.33 ± 
14.46 y 45.60 ± 13.04 respectivamente. Fendiline no inhibió lasR. 
Los fármacos evaluados en estudios de expresión génica, fueron seleccionados por su óptima 
inhibición en la formación de biopelícula. Estos, evidencian un mayor efecto inhibitorio en 
pqsR. Esto puede ser debido a que el sistema PQS/pqsR, es responsable de la producción de 
 
36 
 
ADN extracelular (eDNA), un componente importante de la matriz polimérica que cubre la 
estructura de la biopelícula (Siqueira et. al. 2021). PQS también regula la producción de 
elastasa, ramnolípidos, la lectina galactófila, LecA y piocianina (un pigmento azul-verde de 
fenazina) que influyen en el desarrollo de biopelículas (Pattnaik et. al., 2018). 
Adicionalmente, se ha demostrado que la motilidad tipo swarming a menudo esta co-regulada 
con la formación de biopelícula. Este tipo de motilidad facilita la propagación y colonizaciónde la bacteria en diferentes entornos y la adhesión a las superficies (Guo et. al., 2014), por 
tanto, los fármacos que mostraron inhibición en la biopelícula podrían llegar a mostrar 
inhibición de la motilidad. 
Benzotript y Cloperidona presentan un efecto inhibitorio significativo en la expresión génica 
de lasR de 40.33 ± 14.46 y 45.60 ± 13.04 respectivamente. El regulador transcripcional LasR, 
es capaz de unirse al ADN y regular su propia transcripción así como la de múltiples genes 
dentro de la biopelícula (Siqueira et. al., 2021). LasR, también influye en la formación de la 
matriz de la biopelícula y en la activación del polisacárido pel, que afecta la maduración de las 
biopelículas (Guo et. al., 2014). 
Los fármacos con mayor efecto inhibitorio en la formación de biopelícula fueron Benzotript y 
Cloperidona, lo cual se relaciona con los resultados de expresión génica donde se obtuvo el 
mayor efecto inhibitorio con estos dos fármacos sobre la expresión de pqsR y lasR, siendo 
sobre pqsR la mayor acción inhibitoria. 
Aunque el QS funciona como una red jerárquica, en donde pqsR es regulado por lasR, se ha 
encontrado que un mismo compuesto pude presentar efectos tanto inhibidores como 
potenciadores de diferentes sistemas de QS. Por ejemplo, Kim y colaboradores (2019) 
evaluaron galato de octilo (OG), en diferentes factores de virulencia de QS encontrando que 
OG inhibió la producción de ramnolípidos y piocianinas, pero estimuló la producción de 
elastasa. Luego, mediante un análisis de la producción de moléculas de señalización de QS 
encontraron que OG activó LasR pero inhibió PqsR. 
 
Por otra parte, el uso de fármacos comerciales en la búsqueda de inhibidores de quorum sensing 
ha aumentado en los últimos años. Por ejemplo, Dai y colaboradores (2019) evaluaron el efecto 
del fármaco Ibuprofeno en la formación de biopelícula, en donde la mayor inhibición 
encontrada fue de un 55% a una concentración de 100µg/mL. Además, reportan que a una 
 
37 
 
concentración de 75µg/mL, el Ibuprofeno inhibe la expresión de LasI, LasR y RhlR entre 1.5 
y 3 veces. Mientras que en esta investigación se reportan inhibiciones más altas en la formación 
de biopelícula a concentraciones de 1,56µg/mL. 
Otro ejemplo del uso del reposicionamiento de fármacos, lo muestra Vieira y colaboradores 
(2022) cuando realizaron un estudio netamente in sillico, en donde aplicaron docking 
molecular, buscando en una base de datos con diferentes fármacos aprobados por la FDA contra 
pqsR. Encontrando cinco fármacos comerciales con alta probabilidad de inhibir eficientemente 
el QS. Evidenciando como el reposicionamiento de fármacos es una estrategia para optimizar 
la búsqueda de inhibidores de QS y biopelícula; y mostrando como a través de docking 
molecular se pueden predecir diferentes IQS con el fin de generar reducción de ensayos in 
vitro. 
Los fármacos Benzotript y Cloperidona presentan óptimos resultados como inhibidores en la 
formación de biopelícula y en la expresión de pqsR y lasR, a una concentración de 1,56 µg/mL, 
la cual no interfiere con el crecimiento de la bacteria. Lo que muestra que son candidatos para 
usarse en conjunto con antibióticos convencionales para el tratamiento de infecciones 
ocasionadas por P. aeruginosa. Además, las concentraciones bajas aseguran menor toxicidad 
y mayor aprovechamiento de los fármacos. Sin embargo, se sugiere una mayor cantidad de 
estudios, por ejemplo, del efecto de estos fármacos frente a otros factores de virulencia 
regulados principalmente por PqsR como piocianinas o ramnolípidos y evaluar directamente 
el nivel de la proteína, con el fin de corroborar su efecto inhibitorio. 
 
 
 
38 
 
CONCLUSIONES 
 
Los fármacos comerciales Domperidona, Rebamipide, Cloperidona, Benzotript y Fendiline 
seleccionados por acoplamiento molecular tienen un efecto inhibitorio significativo en la 
formación de biopelícula de P. aeruginosa. Siendo Benzotript, Cloperidona y Fendiline los 
fármacos con mejores reportes de inhibición, principalmente en las concentraciones más bajas 
evaluadas. 
 
En la búsqueda de IQS es importante evaluar concentraciones que no afecten el crecimiento de 
P. aeruginosa. Así, las concentraciones de los fármacos que generaban una mayor inhibición 
en la formación de biopelícula no generaban inhibición en el crecimiento de P. aeruginosa. 
 
El fármaco Fendiline genera una inhibición significativa de la expresión génica únicamente de 
pqsR, mientras que Benzotript y Cloperidona generan un efecto significativo en la inhibición 
de pqsR y lasR, es decir presentan efecto multidiana. Por tanto, estos dos últimos, pueden 
proponerse como posibles candidatos para ser usados en conjunto con antibióticos, con el fin 
de tratar infecciones causadas por P. aeruginosa 
 
 
 
39 
 
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ANEXOS 
 
Anexo 1. Curva de crecimiento de Pseudomonas aeruginosa (ATCC BAA047). Absorbancia 
600nm vs Tiempo (Horas). Datos de la curva tomados de (Gámez & Rúgeles, 2020) 
 
 
Anexo 2. Absorbancia inicial y absorbancia final que evidencia que P. aeruginosa se 
encontraba en una fase exponencial para la realización de la extracción de ARN. 
 
Fármaco Abs inicial 
0 horas 
Abs Final 
6 horas 
Fármaco Abs inicial 
0 horas 
 
Abs Final 
6 horas 
Control 1 0,030 0,733 Benzotript 1 0,033 0,823 
Control 2 0,026 0,733 Benzotript 2 0,031 0,860 
Control 3 0,030 0,823 Benzotript 3 0,028 0,811 
Fendiline 1 0,024 0,832 Cloperidona 1 0,024 0,885 
Fendiline 2 0,031 0,748 Cloperidona 2 0,027 0,865 
Fendiline 3 0,030 0,901 Cloperidona 3 0,031 0,727 
 
Anexo 3. PCR convencional sobre los RNAs tratados con DNasa. Gel de electroforesis a 
1.25%. Carril 1. Marcador de peso, carril 2, 3, 4. RNA Fendiline 1, 2 y 3, carril 5, 6 y 7 RNA 
Benzotript 1, 2 y 3, carril 8. Control negativo lasR, carril 9. Control positivo lasR (ADN). 
 
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Anexo 4. Curva de eficiencia del gen rpoD. Se evidencia el valor de Cq vs el número de 
equivalentes del genoma completo. Se presenta la ecuación de la curva, el valor de R2 y el 
porcentaje de eficiencia. Figura tomada y adaptada de (López, L., 2022). 
 
 
Anexo 5. Curva de eficiencia del gen lasR. Se evidencia el valor de Cq vs el número de 
equivalentes del genoma completo. Se presenta la ecuación de la curva, el valor de R2 y el 
porcentaje de eficiencia. Figura tomada y adaptada de (López, L., 2022). 
 
 
 
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Anexo 6. Valores de Cq y Tm de los amplificados de los genes rpoD, lasR y pqsR con el 
triplicado del control y el triplicado de los tres fármacos evaluados. Se incluye control negativo 
(agua DEPC como plantilla) y positivo (ADN como plantilla) de amplificación. 
Gen - Fármaco Cq Tm Gen- Fármaco Cq Tm 
 Ctrl Negativo rpoD 29,49 74,00 lasR Fendiline 3 20,69 89,00 
Ctrl Positivo rpoD 14,16 90,50 lasR Benzotript 1 18,99 89,00 
rpoD Control 1 21,37 90,50 lasR Benzotript 2 17,03 89,00 
rpoD Control 2 21,03 90,50 lasR Benzotript 3 18,97 89,00 
rpoD Control 3 21,25 90,50 lasR Cloperidona 1 18,68 89,00 
rpoD Fendiline 1 21,75 90,50 lasR Cloperidona 2 19,25 89,00 
rpoD Fendiline 2 20,41 91,00 lasR Cloperidona 3 19,58 89,00 
rpoD Fendiline 3 22,17 90,50 Ctrl Negativo pqsR 29,01 75,00 
rpoD Benzotript 1 19,57 90,50 Ctrl Positivo pqsR 13,45 88,50 
rpoD Benzotript 2 17,15 90,50 pqsR Control 1 20,39 89,00 
rpoD Benzotript 3 19,81 90,50 pqsR Control 2 21,32 89,00 
rpoD Cloperidona 1 19,05 91,00 pqsR Control 3 20,32 89,00 
rpoD Cloperidona 2 19,29 90,50 pqsR Fendiline 1 23,01 89,00 
rpoD Cloperidona 3 20,32 90,50 pqsR Fendiline 2 22,42 89,00 
Ctrl Negativo lasR 27,57 74,50 pqsR Fendiline 3 22,80 89,00 
Ctrl Positivo lasR 14,00 90,50 pqsR Benzotript 1 23,35 88,50 
lasR Control 1 19,57 89,50 pqsR Benzotript 2 21,30 89,00 
lasR Control 2 20,01 89,00 pqsR Benzotript 3 21,38 89,00 
lasR Control 3 20,20 89,00 pqsR Cloperidona 1 20,05 89,50 
lasR Fendiline 1 19,80 89,00 pqsR Cloperidona 2 22,3 88,50 
lasR Fendiline 2 20,85 89,00 pqsR Cloperidona 3 25,03 89,00 
 
 
	Estudio del efecto de fármacos comerciales sobre el sistema quorum sensing de Pseudomonas aeruginosa
	Citación recomendada
	tmp.1663342012.pdf.sFCFJ