YormarisCastilloRomero 2017

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Evaluación de los cambios en la 
expresión de mediadores 
inflamatorios inducidos por 
vesículas de membrana externa de 
Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
 
 
 
 
 
Yormaris Castillo Romero 
 
 
 
 
 
 
Universidad Nacional de Colombia 
Facultad de Ciencias 
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN) 
Bogotá. D.C, Colombia; noviembre de 2017 
 
 
Evaluación de los cambios en la 
expresión de mediadores 
inflamatorios inducidos por 
vesículas de membrana externa de 
Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
 
 
Yormaris Castillo Romero 
 
 
 
Trabajo de investigación para optar al título de: 
Magister en ciencias-Microbiología. 
 
 
 
Directora: 
Diana Marcela Castillo Perdomo 
BcL, MSc, cPhD. 
Facultad de Odontología, Universidad El Bosque 
Co-director: 
Jaime Eduardo Castellanos Parra 
OD, MSc, PhD 
Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Colombia 
 
 
 
Línea de Investigación: 
Biología Molecular de agentes infecciosos 
Grupo de Investigación: 
Instituto UIBO (Unidad de Investigación Básica Oral) Universidad El Bosque 
 
Universidad Nacional de Colombia 
Facultad de Ciencias 
Instituto de Biotecnología de la Universidad Nacional (IBUN) 
Bogotá. D.C, Colombia; noviembre de 2017 
 
Dedicatoria 
 
 
 
 
 
 
 
Dedico este trabajo a Dios, por darme la 
oportunidad de levantarme cada día, la 
perseverancia para cumplir con mis sueños y 
la luz para iluminar mí camino de vida. 
 
 
A mi familia, especialmente mi madre Yolis M 
Romero, mi hermano Diego, mi papá Ernesto 
y a mi novio Javier porque ustedes son mi gran 
apoyo y la razón para dar lo mejor de mí como 
persona, como profesional, estudiante y 
amiga. 
 
A mi amiga Alexandra Cáceres. 
 
 
 
 
 
 
 
 
“Aquel que tiene un porqué para vivir, se puede enfrentar a todos los cómos” 
Friedrich Nietzsche 
 
 
Agradecimientos 
A mis directores Diana Marcela Castillo Perdomo, Jaime Eduardo Castellanos, Gloria Inés 
Lafaurie. Por todo su apoyo, enseñanza, guía y dedicación en este proceso, por darme la 
oportunidad de aprender un poquito de todo su conocimiento y experiencia, por permitirme 
crecer como persona y profesional. 
A la Universidad El Bosque, especialmente al instituto UIBO porque es mi casa, es mi 
presente y ha sido mi escuela, a todos mis compañeros de UIBO, porque se han convertido 
en mi familia y de quienes aprendo cada día. Especialmente agradezco a Nathaly 
Delgadillo, Yineth Neuta y Andrés Cardona, por su colaboración, apoyo y ayuda en este 
proceso. 
Al Instituto de Virología, por abrirme las puertas de su laboratorio y a sus integrantes por 
siempre tener la mejor disposición para ayudarme en todo este proceso, especialmente 
agradezco a la doctora Myriam Velandia, Arturo Balbas y Giovanny Delgado. 
Agradezco al posgrado de Microbiología, por su apoyo en el desarrollo de este trabajo. A 
mis profesores, especialmente a la profesora Martha Raquel Fontanilla y Daniel Uribe 
Vélez, por toda su enseñanza y dedicación. A socorro Prieto, por su carisma, su dedicación 
y amor a lo que hace. Por ser nuestra guía en el posgrado, por su valioso e impecable 
trabajo. 
 
Agradezco a la Fundación para la promoción de la investigación y la tecnología, entidad 
que apoyó económicamente para el desarrollo de este trabajo. Contrato No 3955 
 
Al Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación (Colciencias). 
Contrato No 6422017 Código. 13874455642 
 
 
Resumen y Abstract IX 
 
Resumen 
Porphyromonas gingivalis es un patógeno periodontal, que secreta vesículas de 
membrana externa (OMV) como vehículo de factores de virulencia e incluso se ha 
reportado que estas pueden ser más virulentas que la propia bacteria y podrían modular 
la respuesta inmune. Objetivo: Determinar las variaciones en la expresión de mediadores 
inflamatorios en macrófagos humanos estimulados con vesículas de membrana externa 
de P. gingivalis. Métodos: Monocitos U937 fueron diferenciados a macrófagos y 
estimulados a diferentes tiempos con OMV, lisado bacteriano y bacteria viva. En 
experimentos independientes cada estímulo fue pre-tratado con los inhibidores KYT-1, 
KYT-36 y Polimixina-B para bloquear la acción de las gingipaínas R y K y además del LPS 
respectivamente. Se determinaron los niveles solubles de citocinas y quimiocinas y 
también del ARNm. Se usó ANOVA factorial para el análisis estadístico. Resultados: Las 
vesículas estimularon la producción de citocinas proinflamatorias y quimiocinas. Sin 
embargo, cuando se bloquean las gingipaínas R y K presentes en OMV, los niveles de IL-
1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α e IL-8 aumentaron significativamente comparado con 
células sin estímulo y las estimuladas sin el bloqueo (p<0,05). De manera contraria, se 
encontró una disminución en los niveles de TNF-α después de bloquear las proteasas o 
LPS. Conclusión: Las vesículas de membrana externa de P. gingivalis más que las 
bacterias vivas inducen cambios en la secreción de mediadores inflamatorios en 
macrófagos humanos por eventos de proteólisis dependientes de gingipaínas lo cual 
podría estar involucrado en el establecimiento de un estado crónico característico de la 
enfermedad periodontal. 
 
Palabras clave: Vesículas de membrana externa, P. gingivalis, citocinas, macrófago, 
gingipaínas. 
 
 
 
 
X Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
 
Abstract 
Porphyromonas gingivalis is a periodontal pathogen, which secretes outer membrane 
vesicles (OMV) as a vehicle for virulence factors and it has even been reported that these 
can be more virulent than the bacterium itself and could modulate the immune response. 
Objective: To determine the variations in the expression of inflammatory mediators in 
human macrophages stimulated with outer membrane vesicles of P. gingivalis. Methods: 
U937 monocytes were differentiated into macrophages and stimulated at different times 
with OMV, bacterial lysate and live bacteria. In independent experiments each stimulus 
was pre-treated with inhibitors KYT-1, KYT-36 and Polymyxin-B to block the action of the 
R and K gingipains and in addition to the LPS respectively. The soluble levels of cytokines 
and chemokines and also of the mRNA were determined. Factorial ANOVA was used for 
the statistical analysis. Results: The vesicles stimulated the production of proinflammatory 
cytokines and chemokines. However, when the R and K gingipains present in OMV are 
blocked, the levels of IL-1β, IL-6, MCP-1, RANTES, MIP-1α and IL-8 increased significantly 
compared with cells without stimulus and those stimulated without the blockade (p <0.05). 
Conversely, a decrease in TNF-α levels was found after blocking proteases or LPS. 
Conclusion: The outer membrane vesicles of P. gingivalis, more than live bacteria, induce 
changes in the secretion of inflammatory mediators in human macrophages due to 
gingipains-dependent proteolysis events, which could be involved in the establishment of 
a chronic state characteristic of periodontal disease. 
Key words: External membrane vesicles, P. gingivalis, cytokines, macrophage, 
gingipains. 
Contenido XI 
 
Contenido 
Pág. 
 
Resumen ……………………………………………………………………………………… IX 
Lista de figuras………………………………………………………………………………. XIII 
Lista de tablas………………………………………………………………………………... XVI 
Lista de Símbolos y abreviaturas………………………………………………………… XVII 
1 Marco teórico ............................................................................................................ 5 
1.1 Periodontitis ....................................................................................................... 5 
1.2 Etiología de la periodontitis ................................................................................ 6 
1.3 Porphyromonas gingivalis ..................................................................................7 
1.3.1 Factores de virulencia de P. gingivalis ............................................................. 8 
1.3.1.1 Fimbrias ............................................................................................... 8 
1.3.1.2 Hemaglutininas .................................................................................... 8 
1.3.1.3 Lipopolisacárido (LPS) ......................................................................... 9 
1.3.1.4 Gingipaínas .......................................................................................... 9 
1.3.1.4.1 Funciones de las gingipaínas .............................................................. 11 
1.3.2 Vesículas de membrana externa (OMV) ........................................................ 12 
1.3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis ........................................... 12 
1.3.3.1 Composición de las OMV de P. gingivalis .......................................... 14 
1.3.3.2 Función de las OMV de P. gingivalis .................................................. 16 
1.3.3.3 Cambios de respuesta inmune por OMV de P. gingivalis ................... 17 
2 Metodología ............................................................................................................ 19 
2.1 Cultivo bacteriano de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 y obtención 
de pre-inóculos ........................................................................................................... 19 
2.1.1 Inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 ................................................ 20 
2.1.2 Viabilidad bacteriana de inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 .......... 20 
2.1.3 Límite de detección de actividad de la proteasa (Rgp) en los pre-inóculos e 
inóculos de P. gingivalis ........................................................................................... 20 
2.2 Obtención y purificación de OMV P. gingivalis ................................................. 21 
2.2.1 Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) para OMV de P. gingivalis ... 22 
2.2.2 Límite de detección de actividad proteasa de las OMV de P. gingivalis ......... 22 
2.3 Cultivo celular de monocitos U937 ATCC® CRL1593.2™ ................................ 22 
2.3.1 Diferenciación de monocito U937 a macrófago .............................................. 23 
2.4 Evaluación de la viabilidad de macrófagos-U937 estimulados con P. gingivalis 23 
2.5 Modelo de infección de macrófagos - U937 con OMV de P. gingivalis ............. 24 
2.5.1 Evaluación de los niveles solubles de citocinas por citometría de flujo .......... 24 
XII Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por 
vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos 
humanos 
 
2.6 Evaluación de la expresión de citocinas proinflamatorias por macrófagos-U937 
estimulados con OMV de P. gingivalis W83 y 33277 ................................................... 25 
2.7 Evaluación del efecto de la inhibición de gingipaínas y LPS de OMV en los 
niveles y expresión de citocinas en proinflamatorias ................................................... 26 
2.8 Plan de análisis ................................................................................................. 27 
3 Resultados ............................................................................................................. 29 
3.1 Recuentos bacterianos del pre-inóculo e inóculos P. gingivalis ATCC 33277 y 
W83 29 
3.2 Actividad de la Arg-gingipaína Rgp en los Pre-inóculos e inóculos de P. 
gingivalis ..................................................................................................................... 31 
3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y ATCC 33277 .............. 32 
3.3.1 Microscopia Electrónica de Transmisión de vesículas de membrana externa 
de P. gingivalis ......................................................................................................... 33 
3.3.2 Actividad Arg-gingipaína de vesículas de P. gingivalis .................................. 33 
3.4 Diferenciación celular de Monocitos U937 a Macrófagos-U937 ........................ 34 
3.5 Viabilidad celular de macrófagos U937 estimulados ......................................... 35 
3.6 Niveles solubles de citocinas proinflamatorias producidas por macrófagos-U937 
estimulados ................................................................................................................. 35 
3.7 Evaluación de la inhibición de Rgp y Kgp en OMV de P. gingivalis ................... 40 
3.8 Niveles de ARNm de citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por 
macrófagos-U937 estimulados .................................................................................... 50 
3.9 Efecto de la inhibición de Rgp, Kgp y LPS sobre la expresión de ARNm de 
citocinas proinflamatorias y quimiocinas producidas por macrófagos-U937 estimulados
 52 
4 Discusión ................................................................................................................ 57 
5 Conclusiones y recomendaciones ....................................................................... 63 
5.1 Conclusiones .................................................................................................... 63 
5.2 Recomendaciones ............................................................................................ 63 
5.3 Perspectivas ..................................................................................................... 64 
 
 
 
 
 
 
Contenido XIII 
 
Lista de figuras 
Pág. 
 
Figura 1. Productos de Transcripción y traducción de genes rgpA, rgpB y kgP de las 
gingipaínas. Tomado de: Imamura. J Periodontol; 2003 (36). ......................................... 10 
 
Figura 2. Modelo de biogénesis de vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Tres 
modelos son presentados: (A) una fuerza física inducida por acumulación de proteínas de 
la envoltura sobre-expresada. (B) interrupción del vínculo existente entre la membrana 
externa y la capa de peptidoglicano (C) aumento de la curvatura local de la membrana 
externa bacteriana potenciado por señales extracelulares como PQS: Xie H. Future 
Microbiol, 2015 (47). ....................................................................................................... 14 
 
Figura 3.SDS-PAGE de Pool OMV de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 (30 µg/pozo). 
Carril MP: (Protein Ladder 260 kDa); carril 1: Sonicado Pg 33277; carril 2: Sonicado Pg 
33277 1/100; carril 3: OMV Pg 33277; carril 4: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg 
33277; carril 5: Sonicado PgW83; carril 6: Sonicado PgW83 1/100; carril 7: OMV W83; 
carril 8: Sobrenadante de ultracentrifugación de Pg W83; carril 9: Caldo BHI 
ultracentrifugado. ............................................................................................................ 32 
 
Figura 4.Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) de vesículas purificadas de P. 
gingivalis (A) y Bacteria con vesículas de membrana externa (B).................................. 33 
 
Figura 5. Micrografía de un cultivo de monocito U937 (A) y Monocito U937 diferenciado a 
macrófago con 200ng/mL de PMA (B). ........................................................................... 34 
 
Figura 6. Niveles de citocinas pro-inflamatorias en macrófagos estimulados con Lisado, 
Bacteria y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 
horas (barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con 
líneas transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de 
IL-1β; B) Niveles de TNF-α; C) Niveles de IL-6 ............................................................... 38 
 
Figura 7.Niveles de quimiocinas en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria y OMV 
de P. gingivalis W83 y 33277 por 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas (barra blancapunteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas transversas) 
comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A) Niveles de IL-8; B) Niveles de 
RANTES; C) Niveles de MCP-1; D) Niveles de MIP-1 α. ................................................ 39 
XI
V 
Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por 
vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos 
humanos 
 
 
Figura 8.Niveles de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, 
Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-1β sin bloqueo y con inhibidor para Arg-
gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas 
(KYT-36). C: niveles de IL-1 β sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS 
(PMXB). .......................................................................................................................... 42 
 
Figura 9. Niveles de TNF-α en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con 
Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor 
para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de TNF-α sin bloqueo y con inhibidor para Lys-
gingipaínas (KYT-36). C: niveles de TNF-α sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor 
para LPS (PMXB). .......................................................................................................... 43 
 
Figura 10.Niveles de IL-6 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, 
Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-
gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-6 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas 
(KYT-36). C: niveles de IL-6 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
 ....................................................................................................................................... 44 
 
Figura 11.Niveles de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con Lisado, 
Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Arg-
gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-gingipaínas 
(KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB).
 ....................................................................................................................................... 47 
 
Figura 12.Niveles de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con 
Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para 
Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de IL-8 sin bloqueo y con inhibidor para Lys-
gingipaínas (KYT-36). C: niveles de IL-8 sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor para 
LPS (PMXB). .................................................................................................................. 48 
 
Figura 13. Niveles de RANTES en macrófagos estimulados durante 30 min y 6 horas con 
Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor 
para Arg-gingipaínas (KYT-1). B: niveles de RANTES sin bloqueo y con inhibidor para Lys-
gingipaínas (KYT-36). C: niveles de RANTES sin bloqueo y con pre-tratados con Inhibidor 
para LPS (PMXB). .......................................................................................................... 49 
 
Figura 14. Expresión relativa de ARNm en macrófagos estimulados con Lisado, Bacteria 
y OMV de P. gingivalis W83 y 33277 durante 30 minutos (barra negra punteada), 2 horas 
(barra blanca punteada), 6 horas (barra gris punteada) y 24 horas (barra gris con líneas 
transversas) comparadas con células sin estímulo (barra gris solida). A). IL-1β; B). MCP-
1; C) IL8. ......................................................................................................................... 51 
Contenido XV 
 
 
Figura 15.Expresión relativa de ARNm de IL-1β en macrófagos estimulados durante 30 
min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-1β 
sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-1β sin 
bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-1β sin 
bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ................................................ 54 
 
Figura 16. Expresión relativa de ARNm de IL-8 en macrófagos estimulados durante 30 min 
y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de IL-8 sin 
bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de IL-8 sin 
bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de IL-8 sin 
bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ................................................ 55 
 
Figura 17. Expresión relativa de ARNm de MCP-1 en macrófagos estimulados durante 30 
min y 6 horas con Lisado, Bacteria y OMV de P. gingivalis. A) niveles de ARNm de MCP-
1 sin bloqueo y con Inhibidor para Arg-gingipaínas (KYT-1). B) niveles de ARNm de MCP-
1 sin bloqueo y con Inhibidor para Lys-gingipaínas (KYT-36). C) niveles de ARNm de MCP-
1 sin bloqueo y pre-tratados con Inhibidor para LPS (PMXB). ........................................ 56 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Contenido XVI 
 
Lista de tablas 
Pág. 
 
Tabla 1. Proteínas identificadas en las OMV de P. gingivalis de las cepas ATCC 33277 y 
W83. (Las proteínas resaltadas en negrilla fueron las más abundantes). Modificado de: 
Mantri et al., Microbiology Open 2015 (48). ..................................................................... 15 
 
Tabla 2. Secuencias de primer y concentración utilizadas para detección de citocinas .. 26 
 
Tabla 3.Promedios de recuentos de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis W83 
expresados en Log 10. .................................................................................................... 29 
 
Tabla 4. Promedios de recuentos del inóculo de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. gingivalis 
W83 expresados en Log 10. ........................................................................................... 30 
 
Tabla 5. Actividad Arg-gingipaína de pre-inóculo e inóculo de P. gingivalis .................... 31 
 
Tabla 6.Límite de detección de actividad Arg-gingipaína de OMV de P. gingivalis ......... 34 
 
Tabla 7. Viabilidad de macrófagos U937 estimulados con lisado, bacteria o vesículas de 
P. gingivalis ..................................................................................................................... 35 
 
 
 
Contenido XVII 
 
Lista de Símbolos y abreviaturas 
Abreviaturas 
 
Abreviatura Término 
AAP Academia Americana de Periodoncia 
ATCC American Type Culture Collection 
BANA Benzoilarginina-2-naptilamida 
CAAM NCBZ- GLY-GLY-ARG- clorohidrato de 7-amido-4-metil coumarina 
CV Coeficiente de Variación 
DE Desviación estándar 
ECV Enfermedad cardiovascular 
ENSAB Encuesta Nacional de salud Bucal 
HA Hemaglutininas 
HGE Células epiteliales gingivales Humana 
HUVEC Células endoteliales de vena umbilical humana 
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelular 1 
IL-1β Interleucina 1 beta 
IL-6 Interleucina 6 
IL-8 Interleucina 8 
iNOS Óxido nítrico sintasa inducible 
LDL Lipoproteínas de baja densidad 
LPS Lipopolisacárido 
MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos 
MCP-1 Proteína quimioatrayente de monocitos 1 
MIP-1α (CCL3) Proteína Inflamatoria de macrófago 
MOI Multiplicidad de Infección 
NFκB Factor nuclear-kappaB 
NLR Receptores similares a NOD 
ON Óxido nítrico 
DO Densidad óptica 
OM Membrana externa 
OMV Vesículas de membrana externa "Outer Membrane Vesicles" 
PAMP Patrones Moleculares Asociados a Patógenos 
PI3K Fosfatidilinositol 3-quinasa 
qPCR Reacción en Cadena de la Polimerasa en tiempo real 
RANTES (CCL5) Quimiocina (C-C motif) ligand 5 también conocida como RANTESRIPK1 Receptor que interactúa con la proteína quinasa-1 
X
VII
I 
Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios inducidos por 
vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en macrófagos 
humanos 
 
 
 
 
 
 
 
Símbolos con letras latinas 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RLR Receptores similares a RIG-I 
TAK1 Factor de crecimiento transformante beta activado por cinasa 1 
TEM Microscopia Electrónica de Transmisión 
TLR Receptores Toll-like 
TNFα Factor de Necrosis Tumoral alfa 
UF Unidades de Fluorescencia 
UFC Unidad Formadora de Colonias 
VCAM-1 Molécula de adhesión celular vascular 1 
Símbolo Término 
µL Microlitro 
mL Mililitro 
µg Microgramos 
 Longitud de onda 
pg Picogramos 
 
Introducción 
La periodontitis es una enfermedad infecciosa, multifactorial, inflamatoria y crónica que 
compromete la integridad de los tejidos de soporte del diente, que incluyen la encía, el 
ligamento periodontal y el hueso alveolar, representa un reto inflamatorio sistémico, debido 
a las grandes superficies epiteliales inflamadas en las bolsas periodontales. Esta 
inflamación y vasodilatación ocasionan daño al tejido lo que permite que bacterias y sus 
productos puedan llegar a otras partes del cuerpo (1-3). La actividad de la enfermedad 
periodontal está determinada por una compleja interacción entre el sistema inmune y 
patógenos periodontales, las alteraciones en la microbiota subgingival se han asociado 
con el desarrollo y progresión de la periodontitis (4). 
Esta enfermedad tiene gran impacto en la pérdida dental de la población adulta en 
Colombia y en general en todas las poblaciones a nivel mundial (5). Además, se considera 
una enfermedad de gran importancia no solo porque causa perdida de los dientes sino 
también porque se ha relacionado con enfermedades sistémicas como: resultados 
adversos en el embarazo (3, 6, 7) artritis reumatoide (7), enfermedad cardiovascular como 
aterosclerosis y síndrome coronario agudo (8). 
El componente microbiano juega un rol muy importante en esta enfermedad y un grupo de 
bacterias anaerobias orales conocidas como periodontopatógenas pertenecientes al 
complejo rojo conformado por Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia y 
Treponema denticola que han sido asociada a la progresión de periodontitis, en función de 
sus factores de virulencia y su interacción con el sistema inmune del hospedero (2,3,9). 
P. gingivalis se considera como una de las bacterias con mayor importancia en el 
desarrollo de la periodontitis debido a que grandes cargas de esta bacteria se relacionan 
con mayor severidad de la enfermedad periodontal (10). Esta bacteria tiene diferentes 
factores de virulencia que determinan su patogenicidad, dentro de los que se encuentran: 
fimbrias, hemaglutininas, lipopolisacárido (LPS), gingipaínas, proteínas de membrana, 
antígenos capsulares, ceramidas y vesículas de membrana externa (11). Las vesículas de 
2 Introducción 
 
membrana externa, son importantes factores de virulencia secretadas al medio externo 
que sirven como sistema generalizado de secreción y transporte para otros factores de 
virulencia como LPS, fimbrias y enzimas entre las que se encuentran las gingipaínas. Estas 
vesículas han sido investigadas por su importante papel en la respuesta inmune del 
hospedador y la destrucción del tejido periodontal durante la infección por P. gingivalis. Se 
ha reportado que inducen la producción de citocinas proinflamatorias, asociadas con 
osteoclastogénesis y por tanto resorción de hueso alveolar y destrucción del tejido 
periodontal (12). 
Las OMV pueden ser internalizadas en las células hospedadoras, donde ocurre su lisis y 
la liberación de antígenos, que pueden ser procesados por las células presentadoras de 
antígeno, lo que conduce a la inducción de la inmunidad adaptativa incluyendo la 
producción de anticuerpos específicos contra este patógeno (12, 13, 14). 
Aunque P. gingivalis y sus factores de virulencia están involucrados en la patogénesis de 
la periodontitis, la naturaleza y magnitud de la respuesta del periodonto, se modula no sólo 
por las bacterias presentes, sino también por la respuesta inmune del hospedador y las 
interacciones hospedador–patógeno (15). Su persistencia crónica en el periodonto 
depende de su habilidad para evadir la inmunidad del hospedador sin inhibir por completo 
la respuesta inmune inflamatoria (16). Los macrófagos están implicados activamente en 
todas las fases de la inflamación y su papel como efector y células reguladoras ahora se 
reconoce ampliamente (17). Son un tipo de células fagocíticas que junto con otras células 
modulan con eficacia la respuesta inmune innata y adaptativa ayudando a promover la 
resolución inflamatoria y cicatrización de los tejidos (17). 
En la periodontitis estas células secretan citocinas quimiotácticas como RANTES, MCP-1, 
MIP-1α, MIP-3α, MIP-1β, IL-8, cuya función es la activación y migración de leucocitos; y 
citocinas proinflamatorias como la IL-1β, TNF-α, IL-6, que activan procesos de 
osteoclastogénesis y la degradación del tejido periodontal. Factores de virulencia como las 
OMV secretadas por P. gingivalis en las bolsas periodontales, a nivel local pueden 
exacerbar la enfermedad, lo cual podría estar influenciado por la capacidad de estas 
vesículas de modular en las células la expresión de estas citocinas (18). 
A nivel sistémico, la facilidad que tienen las vesículas para difundirse en tejidos profundos 
y torrente sanguíneo favorecen su interacción con diferentes tipos de células como 
plaquetas y células endoteliales que promueven la agregación plaquetaria y la 
Introducción 3 
 
coagulación, así como la interacción con moléculas de adhesión vascular favoreciendo la 
disfunción endotelial típica de la ateroesclerosis, adicionalmente se ha confirmado que 
bajas concentraciones de OMV inducen la conversión de macrófagos en células 
espumosas favoreciendo el desarrollo del ateroma (2, 18, 19). 
En este sentido las OMV de P. gingivalis cobran mayor importancia al ser uno de los 
principales factores de virulencia que desencadenan respuesta inmune local y sistémica 
favoreciendo adicionalmente la condición crónica de la periodontitis (20). Sin embargo, la 
inducción de los cambios en la respuesta inmune relacionados con la interacción de las 
OMV de P. gingivalis con la célula hospedadora han sido poco estudiados. Aún menos 
evidente es el mecanismo por el cual estas vesículas pueden inducir una respuesta celular 
de macrófagos humanos caracterizada por la producción de citocinas proinflamatorias 
asociadas con el desencadenamiento de enfermedades locales y sistémicas, lo que podría 
generar mayor patogenicidad de estas vesículas en comparación con la bacteria completa. 
Por otra parte, no es claro cuál es la contribución de los factores de virulencia que se 
encuentran en mayor proporción en las vesículas como las gingipaínas y el lipopolisacárido 
en la inducción de la respuesta inmune importante en el desarrollo, evolución y 
mantenimiento de la condición inflamatoria crónica a nivel periodontal. Por esta razón 
hemos planteado en este trabajo la siguiente pregunta de investigación ¿Cuáles son las 
variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos 
estimulados con vesículas de membrana externa de dos cepas de Porphyromonas 
gingivalis? En consecuencia, se planteó el siguiente objetivo general: Determinar las 
variaciones en la expresión de mediadores inflamatorios en macrófagos humanos 
estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis. 
En este estudio se demostró que las vesículas inducen cambios en la expresión de ARNm 
y los niveles de citocinas y quimiocinas en sobrenadantes de cultivo de macrófagos-U937 
por eventos de proteólisis dependiente de gingipaínas y esta inducción es diferencial entre 
dos cepas de P. gingivalis. 
 
 
 
 
1 Marco teórico1.1 Periodontitis 
La Academia Americana de Periodoncia (AAP) en su consenso de 1999, definen la 
periodontitis como una enfermedad infecciosa, multifactorial y crónica, que resulta en la 
inflamación de los tejidos de soporte de los dientes y pérdida progresiva del nivel de 
inserción clínico, caracterizada por la formación de bolsas periodontales y/o recesión 
gingival (21). Esta enfermedad fue clasificada en 1999 como periodontitis crónica, 
periodontitis agresiva y periodontitis asociada a condiciones sistémicas en función de 
parámetros clínicos periodontales. Actualmente existe una nueva clasificación que 
mantiene la clasificación de 1999 pero incluye la bolsa periodontal como parámetro clínico 
adicional (22, 23). 
 
La periodontitis crónica es una patología de gran prevalencia en la población mundial (2). 
En Colombia, datos del ENSAB III en 1999, indican que la enfermedad periodontal afecta 
en forma generalizada al 12% de la población antes de los 35 años y ésta aumenta 
significativamente a los 60 años en un 42%. Según su severidad, el 14% de la población 
cercana a los 35 años presenta una destrucción periodontal de moderada a severa y a los 
60 años, esta aumenta al 40% (22). La prevalencia de enfermedad periodontal en 
Colombia aumentó a un 61.8% de acuerdo al último estudio nacional de salud bucal 
(ENSAB IV); de esta cifra el 43.46% de los casos corresponden a periodontitis moderada 
y el 10.62% a periodontitis severa. De esta forma, la presencia de periodontitis a los 18 
años muestra una prevalencia de 21.90%, con un 10.6% de periodontitis leve y 10.97% de 
moderada y para la edad de 35 a 44 años, el 48.29% de las personas presentan 
periodontitis moderada y el 7.84% evidencia periodontitis avanzada. A partir de los 45 años 
la periodontitis aumenta por encima del 82.88% y a las edades de 65 a 79 años el 25.99% 
presentaba periodontitis severa (24). Estos datos tienen un gran impacto en la salud de los 
colombianos, no solo a nivel oral por perdida de piezas dentales, sino por todas las 
6 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
condiciones sistémicas con las que se encuentra asociada al aumentar el riesgo de los 
pacientes para sufrir aterosclerosis, resultados adversos del embarazo, artritis reumatoide, 
neumonía por aspiración y cáncer de cabeza y cuello (2). 
1.2 Etiología de la periodontitis 
Una tríada de bacterias anaerobias orales que comprende P. gingivalis, T. denticola y T. 
forsythia tradicionalmente han sido consideradas como agentes causantes de periodontitis, 
en función de sus propiedades de virulencia y fuerte asociación con los sitios afectados 
(2,9). 
El hábitat predominante de bacterias asociadas con periodontitis es el surco gingival, 
donde encuentran microambientes distintos asociados al biofilm dental, el fluido crevicular 
gingival y el epitelio de revestimiento del surco. El entorno subgingival es rico en 
mediadores inmunes e inflamatorios, y ofrece desafíos y oportunidades para las bacterias. 
La salud periodontal requiere un estado inmuno-inflamatorio controlado que permite 
mantener la homeostasis hospedador-microorganismo en el periodonto. Sin embargo, 
durante la periodontitis, se desregula la respuesta inmune del hospedador y por lo tanto es 
ineficaz para restringir la patogenicidad bacteriana. Este desequilibrio genera una 
respuesta inflamatoria que favorece la cronicidad de la infección (2). 
La disbiosis de la microbiota periodontal se caracteriza por un desequilibrio en la 
abundancia relativa o la influencia de las especies microbianas que tienen funciones 
distintas en el biofilm y que actúan en sinergia para dar lugar a un proceso infeccioso que 
puede causar enfermedad en la cavidad oral o tejidos extra-orales de individuos 
susceptibles (2). 
La etiología infecciosa de esta entidad fue reconocida desde la década de los 60 (25); 
posteriormente confirmada por innumerables estudios epidemiológicos alrededor del 
mundo, en los cuales se reconoció que una serie de microorganismos Gram negativos 
anaerobios y microaerofílicos aumentan significativamente en la placa subgingival de 
pacientes con periodontitis indicando que esta entidad representa una infección con un 
patrón polimicrobiano, que aunque variable en los individuos, muestra cierta especificidad 
caracterizada por el aislamiento de un grupo de microorganismos que han sido 
considerados periodontopágenos, entre los cuales se han identificado P. gingivalis , T. 
Capítulo 1 7 
 
forsythia, T. denticola, Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Eikenella corrodens, 
Campylobacter rectus, Parvimonas micra, Prevotella intermedia, Prevotella nigrescens y 
Dialister pneumosintes, entre otras. Siendo P. gingivalis el microorganismo aislado con 
mayor frecuencia en periodontitis tanto crónica como agresiva alrededor del mundo, con 
un patrón similar para la población colombiana (25 - 28). 
1.3 Porphyromonas gingivalis 
P. gingivalis es un cocobacilo Gram negativo, anaerobio estricto, inmóvil, no esporulado 
tiene un diámetro entre 0,5 ~ 3,5 µm. Es un colonizador tardío de la placa dental, utiliza las 
bacterias residentes en la cavidad oral para la colonización inicial y hace parte del complejo 
rojo al que pertenecen los microorganismos periodontopatógenos (9). Esta bacteria tiene 
una naturaleza hemolítica y exhibe un pigmento negro característico en medios de cultivos 
que contienen los derivados metabólicos del hierro, extraído de la hemoglobina u otras 
proteínas que contienen el grupo hemo. Es una especie caracterizada por ser asacarolítica 
y su fuente de carbono y energía es proporcionada por la fermentación de aminoácidos 
(11). Tiene diferentes factores de virulencia que determinan su alta patogenicidad, dentro 
de los que se encuentran: fimbrias, hemaglutininas, LPS, vesículas de membrana, 
gingipaínas, proteínas de membrana, antígenos capsulares y ceramidas (11). 
 
P. gingivalis es uno de los principales patógenos implicados en la progresión de la 
enfermedad periodontal, basado en la observación de que el aumento en el recuento de 
esta bacteria se asocia con un aumento en severidad de la enfermedad periodontal. 
Resultados de estudios experimentales de infección oral con P. gingivalis en primates, 
apoyan firmemente esta hipótesis, y demuestran que la inoculación subgingival de la 
bacteria en monos libres de enfermedad periodontal resulta en el desarrollo de 
periodontitis. En este modelo es significativo, que los niveles de la bacteria en el surco 
subgingival están estrechamente correlacionados con una marcada pérdida del hueso 
alveolar (29). 
8 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
1.3.1 Factores de virulencia de P. gingivalis 
1.3.1.1 Fimbrias 
P. gingivalis posee fimbrias, las cuales están involucradas en la mayoría de las 
propiedades de adherencia y de interacción con moléculas salivares, células epiteliales 
orales y otras bacterias, así como en la inducción de la secreción de citoquinas de las 
células infectadas (30). Esta bacteria tiene dos tipos de proteínas fimbriales, FimA 
denominadas fimbrias mayores y Mfa1 fimbrias menores, expresadas en la superficie de 
la bacteria y compuesta por polímeros de proteínas FimA y Mfa1, respectivamente (31). 
 
Las fimbrias están constituidas en su mayoría por la proteína fimbrilina que actúa como 
puente entre P. gingivalis y la superficie a colonizar e infectar (fibroblastos, células 
epiteliales y células endoteliales). Estas juegan un papel muy importante en la adhesión a 
células y facilita la formación del biofilm en el surco gingival. Las fimbrias mayores son de 
gran importancia en la invasión, pero no son suficientes para que este proceso selleve a 
cabo (30). Las fimbrias menores están implicadas en la activación del sistema inmune, que 
se encuentra estrechamente relacionado con la resorción ósea y la pérdida del ligamento 
periodontal, adicionalmente se encuentran involucradas con la formación de biofilm oral 
(31). 
El gen fimA existe como una única copia en el cromosoma de esta bacteria y codifica para 
una fimbrilina polimórfica FimA. Análisis por PCR, han permitido identificar seis genotipos 
denominados I, Ib, II, III, IV y V (25). Estudios epidemiológicos han demostrado que las 
cepas que poseen FimA tipo II y tipo IV son frecuentes en los pacientes con periodontitis, 
mientras que la cepa de tipo I es detectada en individuos sanos. (32). Las fimbrias Mfa1 
están compuestas principalmente de polímeros de la proteína Mfa1, codificados por el gen 
mfa1. La proteína Mfa2 (codificada por mfa2) se localiza en la membrana externa y 
desempeña un papel en el anclaje y la regulación de longitud de Mfa1 (32). 
1.3.1.2 Hemaglutininas 
P. gingivalis puede utilizar hemaglutininas (HA) para adherirse a los eritrocitos y/o a otras 
células y adquirir nutrientes. Múltiples HA han sido identificadas en P. gingivalis, HagB se 
ha demostrado estar involucrada en la adherencia de P. gingivalis a las células endoteliales 
de arteria coronaria humana. HagA y HagD son 73,8% idénticas y comparten homología 
Capítulo 1 9 
 
con el dominio hemaglutinina de las gingipaínas. Otra hemaglutinina, HagE, comparte una 
región de 523 aminoácidos con un 93% de homología con HagA (33). 
1.3.1.3 Lipopolisacárido (LPS) 
El LPS hace parte de la envoltura externa de todas las bacterias Gram negativas. Está 
constituido por una región polisacárida y una región lipídica unidas covalentemente. La 
región polisacárida está constituida por dos porciones, una cadena lateral (antígeno O) y 
una región central (core). El antígeno O usualmente define la especificidad inmunoquímica 
de la bacteria. El polisacárido central típicamente consiste de un número de hexosas y dos 
azucares únicos, heptosa y 2-keto-3-deoxioctonato (KDO) (11). El lípido A es el 
responsable de diversas actividades biológicas y está compuesto de un disacárido D-
glucosamina unido por enlaces beta 1-6 y ácidos grasos. El LPS funciona como una 
endotoxina potente y juega un papel muy importante en la activación de la respuesta 
inflamatoria, favoreciendo la producción de citocinas por parte de neutrófilos y macrófagos, 
que se asocian con activación de osteoclastogénesis y por tanto inicio y progresión de la 
periodontitis (11). 
P. gingivalis libera OMV que penetran en los tejidos periodontales y median una respuesta 
inmuno-inflamatoria en los tejidos periodontales. La naturaleza exacta y la consecuencia 
de la respuesta del hospedador al LPS de esta bacteria han sido objeto de debate, debido 
a los resultados contradictorios existentes. Recientemente, se reveló que P. gingivalis es 
capaz de generar LPS con estructuras heterogéneas de lípido A través de una modulación 
dependiente de hemina. Este microorganismo contiene LPS con lípido A tetra-acilado 
(LPS1435/1.449) o penta-acilados (LPS1690) que genera efectos opuestos sobre la respuesta 
inmune innata, por lo tanto, juega un papel clave en los cambios de la respuesta inmuno-
inflamatoria del hospedador (34, 35). 
1.3.1.4 Gingipaínas 
Las gingipaínas constituyen un grupo de endopeptidasas cisteína C25, responsables de 
más del 85% de la actividad proteolítica y el 100% de la actividad llamada “actividad tipo 
tripsina”. Estas enzimas son producto de tres genes (Figura 1): rgpA, rgpB y kgp, 
reconocidas como gingipaína R y gingipaína K de acuerdo con su especificidad de 
hidrólisis en residuos peptídicos donde encuentran Arginina o Lisina, Arg-Xaa o Lys-Xaa 
respectivamente (36). 
10 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Productos de Transcripción y traducción de genes rgpA, rgpB y kgP de las gingipaínas. 
Tomado de: Imamura. J Periodontol; 2003 (36). 
 
Estos tres genes se encuentran presentes en todas las cepas de P. gingivalis y son 
considerados constitutivos, dan origen a 3 proteínas, la primera RgpA presenta un dominio 
catalítico y un dominio hemaglutinina adhesina, RgpB que únicamente tiene un dominio 
catalítico y por ultimo Kgp que al igual que RgpA presenta dominio catalítico y dominio 
hemaglutinina adhesina. Los dominios hemaglutinina adhesina de RgpA y Kgp presentan 
una homología entre sí, que varía entre el 97 a 98% en la mayoría de las regiones y solo 
46% de homología con la región HA1 (36, 37). 
 
Los dominios catalíticos de RgpA y RgpB son homólogos (89%), lo que podría indicar que 
estas dos proteínas cumplen funciones muy similares y que la ausencia de alguna de las 
dos en cepas mutantes no generaría ningún cambio en el metabolismo de la misma ni en 
su capacidad patogénica, sin embargo, diferentes estudios confirman que cepas mutantes 
para el gen rgpA presentan restricción en su crecimiento y menor virulencia (36-38). La 
capacidad proteolítica de las gingipaínas sobre diferentes sustratos como: benzoilarginina-
2-naptilamida (BANA), NCBZ- GLY-GLY-ARG- clorohidrato de 7-amido-4-metil coumarina 
(CAAM) ha hecho que se les conozca como enzimas similares a tripsina y se ha empleado 
esta característica para la confirmación de P. gingivalis en el laboratorio (38, 39). 
 
Capítulo 1 11 
 
1.3.1.4.1 Funciones de las gingipaínas 
 
Las gingipaínas tienen como una de sus principales funciones la degradación de proteínas, 
ya que el metabolismo de esta bacteria es dependiente de la hidrólisis de proteínas. 
Además, están implicadas en el secuestro de hemoglobina, hemaglutinación, 
neutralización y variaciones del sistema inmune por degradación proteolítica de citocinas 
anti-inflamatorias y activación de citocinas proinflamatorias como IL-1, IL-6 IL-8 y TNF-α 
activadoras de osteoclastogénesis, lo cual favorece a la destrucción del tejido periodontal. 
También participan en la formación de biofilm oral, estas parecen ser fundamentales en la 
comunicación entre las bacterias y la adhesión gracias a su dominio hemaglutinina-
adhesina y se ha demostrado que la expresión de estas proteasas aumenta cuando P. 
gingivalis está en coagregación con otras bacterias como T. forsythia, T. denticola, F. 
nucleatum y P. intermedia (39). Estas están involucradas en la adhesión de P. gingivalis a 
las células endoteliales antes de la invasión. Existen estudios que plantean la posibilidad 
de usar estas gingipaínas como blanco terapéutico para la bloquear la acción proteasa y 
por consiguiente impedir la invasión de este microorganismo tanto en el tejido periodontal 
como en placas ateromatosas (40, 41). 
 
Así mismo, la formación de células espumosas por adición de colesterol LDL 
(Lipoproteínas de baja densidad) puede ser estimulada por P. gingivalis, ya que este 
microorganismo tiene la capacidad de alterar la movilidad de esta molécula, facilitando de 
esta manera su agregación en los macrófagos. Cuando se evalúan cepas mutantes para 
proteasas Kgp y Rgp está agregación se ve inhibida, lo cual lleva a pensar que estas 
proteasas son modificadoras de la movilidad del LDL, debido a que las gingipaínas tienen 
la capacidad de degradar la apo B-100, uno de los mayores componentes de las partículas 
de LDL. La proteólisis de esta proteína altera la carga de las partículas afectando la 
movilidad del LDL, favoreciendo su agregación en los macrófagos y posteriormente la 
formación de placas ateromatosas (42). Además, las gingipaínas se han caracterizado por 
estimular la respuesta inmune innata, degradar componentes del complemento, péptidos 
antibacterianos, citocinas y quimiocinas evitando así la resolución de la infección y 
favoreciendo la cronicidad (43). 
 
12Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
1.3.2 Vesículas de membrana externa (OMV) 
Las OMV, son nano estructuras membranosas asimétricas, que han sido descritas en 
Archaeas, bacterias Gram positivas y bacterias Gram negativas (44). Las bacterias Gram 
negativas producen naturalmente OMV. Estas se componen de una sola membrana que 
deriva de la membrana externa y contienen tanto proteínas de membrana externa como 
LPS, y otros lípidos, mientras que el lumen de la vesícula contiene principalmente proteínas 
del periplasma que en su mayoría son importantes factores de virulencia involucrados en 
la adherencia bacteriana, defensa contra los factores del hospedador o enzimas entre otros 
(45). 
1.3.3 Vesículas de membrana externa de P. gingivalis 
Las vesículas de este microorganismo son consistentes con vesículas de otras bacterias 
Gram negativas, tienen un diámetro entre 50 y 250 nm (figura 2) y se producen a manera 
de ampollas en la superficie de la membrana externa de la bacteria (46, 47). Estudios han 
demostrado que las vesículas sirven como un vehículo para el transporte de toxinas, 
enzimas proteolíticas, y adhesinas; esto se confirmó experimentalmente concluyendo que 
pueden degradar diferentes sustratos como el colágeno, Azocoll, y N-alfa-benzoil-
DLarginine p-nitroanilida, y promueven la adhesión bacteriana entre dos especies 
bacterianas no coagregantes como Capnocytophaga ochracea y Eubacterium saburreum 
(47). 
Actualmente son consideradas un sistema de secreción generalizado, altamente regulado 
que puede proporcionar una matriz de efectores moleculares, incluidos los implicados en 
las interacciones célula-célula, adquisición de nutrientes, desregulación y modulación 
inmune del hospedador y formación del biofilm oral. Además, por su tamaño nanométrico 
las OMV tienen la capacidad de diseminarse lejos de la célula permitiendo que las 
bacterias sésiles asociadas a la biopelícula extiendan su espacio de influencia. Por lo tanto, 
los OMV son importantísimos contribuyentes a la supervivencia y virulencia bacteriana y, 
por lo tanto, de la patogenicidad (16). 
La biogénesis de las vesículas de P. gingivalis puede ser explicada desde distintos 
modelos (Figura 3). Un primer modelo apoya la idea de que la membrana externa 
bacteriana es empujada hacia afuera a través de una fuerza física inducida por la 
Capítulo 1 13 
 
acumulación de proteínas de la envoltura sobre-expresadas (47). La segunda teoría 
describe una interrupción en el vínculo existente entre la membrana externa y la capa de 
peptidoglicano, lo que lleva a una liberación descontrolada de OMV. Esta suposición se 
basó en la observación de que las deficiencias en varias proteínas implicadas en la 
interconexión de la membrana externa y peptidoglicano tienen un impacto dramático en la 
vesiculación; un ejemplo es la lipoproteína OPRI de 6,95 kDa descrita en P. aeruginosa y 
también encontrada en P. gingivalis. OPRI es una proteína de membrana externa 
abundante y parece interactuar de forma covalente con la capa de peptidoglicano. La 
deleción del gen Opri mejora significativamente la vesiculación en P. aeruginosa, que 
presumiblemente resulta en la pérdida de la inmovilización de la membrana externa con el 
peptidoglicano (47). 
Finalmente, la tercera teoría describe que la vesiculación puede resultar en un aumento de 
la curvatura local de la membrana externa bacteriana. Este modelo se apoya en estudios 
recientes que describen una molécula de señalización 2-heptil-3-hidroxi- 4-quinolona 
(PQS) descrita por primera vez en P. aeruginosa. PQS parece ser necesaria y suficiente 
para la formación de OMV a través de la interacción directa con la membrana bacteriana y 
la expansión de la membrana externa, lo que aumenta la curvatura de la membrana y 
conduce a la formación de vesículas (47). 
Mantri et al.,2015 describieron que la vesiculación en P. gingivalis es dependiente de 
fimbrias, al comparar vesículas secretadas por cepas con un alelo fimbrial tipo I (ATCC 
33277), tipo III (ATCC 49417) y tipo IV (W83). Mediante microscopía electrónica de 
transmisión, encontraron más OMV en las superficies de la cepa ATCC 33277 y ATCC 
49417, que en la cepa W83, que se ha descrito como poco productora de fimbrias. 
Curiosamente, cuando se introdujo un gen que codifica para fimbrias tipo IV en la cepa 
ATCC 33277, la vesiculación fue similar entre la cepa parental y la cepa receptora, lo que 
sugiere que el subtipo fimbrial está implicado en la biogénesis de vesículas (2048). 
La evidencia actual indica que la biogénesis de OMV es un proceso estrictamente 
controlado y regulado, que implica un gasto energético de la célula, por lo que no son 
producidas al azar y son estrategias de evasión, adquisición de nutrientes y patogenicidad 
importantes en la bacteria, aunque es probable que las vías específicas varíen entre filo, 
géneros e incluso especies, aún hacen falta por dilucidar estas diferencias (16). 
14 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
Actualmente se cree que un aumento de la curvatura local de la membrana externa (~ 14 
veces) indica que la biogénesis de OMV requiere un gasto de energía para una curvatura 
significativa de la membrana. En P. gingivalis se ha propuesto que esto se puede lograr 
regulando positivamente la producción de ciertos lípidos de las caras internas o externas 
de la membrana, lo que provoca la curvatura localizada hacia afuera de la membrana 
externa. Esto da como resultado la selección de LPS aniónicos (A-LPS) y proteínas 
extracelulares de la familia CTD asociadas en la superficie. La desacilación de A-LPS 
puede permitir adicionalmente una mayor curvatura que conduzca a la formación de OMV 
(44). 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Modelo de biogénesis de vesículas de membrana externa de P. gingivalis. Tres modelos 
son presentados: (A) una fuerza física inducida por acumulación de proteínas de la envoltura sobre-
expresada. (B) interrupción del vínculo existente entre la membrana externa y la capa de 
peptidoglicano (C) aumento de la curvatura local de la membrana externa bacteriana potenciado 
por señales extracelulares como PQS: Xie H. Future Microbiol, 2015 (47). 
1.3.3.1 Composición de las OMV de P. gingivalis 
Estudios recientes utilizando herramientas proteómicas han demostrado que las vesículas 
de P. gingivalis pueden actuar como intermediarios que llevan una amplia variedad de 
factores de virulencia proporcionadas por sus células parentales. En las vesículas se 
encuentran los factores de virulencia presentes en la membrana externa de esta bacteria 
incluyendo LPS, FimA, Mfa1, HagA, Kgp, RgpA, y RgpB. Algunos de estos factores de 
virulencia fueron encontrados en mayor proporción en vesículas comparado con los niveles 
encontrados en células intactas y se ha reportado una mayor cantidad (3-5 veces) de 
gingipaínas en las vesículas comparadas con la cantidad observada en los extractos de la 
superficie de esta bacteria (20). En la tabla 1, se describen las proteínas presentes en las 
Capítulo 1 15 
 
vesículas de P. gingivalis ATCC 33277 y W83, donde se destacan las gingipaínas como 
las más abundantes (20). 
Tabla 1. Proteínas identificadas en las OMV de P. gingivalis de las cepas ATCC 33277 y W83. (Las 
proteínas resaltadas en negrilla fueron las más abundantes). Modificado de: Mantri et al., 
Microbiology Open 2015 (20). 
Rank P. gingivalis ATCC 33277 P. gingivalis W83 
1 Lys-gingipaína, kgp Arg-gingipaína, RgpA 
2 Arg-gingipaína, RgpA Receptor antígeno A, RagA 
3 Sistema de secreción Por ( PorV) Sistema de secreción Por (PorV) 
4 Arg-gingipaína, RgpA Arg-gingipaína, RgpB 
5 Receptor antígeno A, RagA Receptor antígenoB, RagB 
6 Peptidilarginina deiminasa Peptidilarginina deiminasa 
7 Proteína Hemaglutinina, HagA Proteína Hemaglutinina, HagA 
8 Proteína de subunidad fimbrial tipo-1 
Fim A 
Antígeno Inmunoreactivo de 61 
kDa 
9 Receptor antígeno B, RagB Proteína no caracterizada (PG_1823, 
PGN_1744) 
10 Antígeno Inmunoreactivo 61 kDa Carboxipeptidasa putativa de Zinc 
11 Proteína no caracterizada (PGN_1744) Proteína no caracterizada 
12 Fimbrilina, Mfa1 Proteína no caracterizada (PG_1626, 
PGN_0477) 
13 Lipoproteína putativa Lipoproteína putativa 
14 Carboxipeptidasa putativa de Zinc Proteína de unión a hemina 35 kDa 
15 Antígeno inmunoreactivo 23 kDa Proteasa extracelular putativa 
16 Proteína no caracterizada (PGN_0477) Antígeno inmunoreactivo 47 kDa 
17 Antígeno inmunoreactivo 47 kDa Proteína no caracterizada 
18 Proteína de unión a hemina 35 kDa Proteína no caracterizada 
19 Proteína putativa no caracterizada Proteína de unión a hemina FetB 
20 Proteasa extracelular putativa Proteína de membrana externa 41 
16 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
1.3.3.2 Función de las OMV de P. gingivalis 
 
Se ha sugerido que el aumento de la antigenicidad encontrado en las vesículas podría ser 
a causa de una mayor concentración de factores de virulencia en las vesículas que en la 
superficie de P. gingivalis. Las OMV liberadas al espacio extracelular, son capaces de 
penetrar una mucosa intacta y entrar a los tejidos subyacentes del hospedador liberando 
todos los componentes antigénicos que trae consigo favoreciendo la progresión de la 
infección (14). 
Los OMV de P. gingivalis que se enriquecen selectivamente en proteínas de la familia CTD 
como las gingipaínas, favorecen la coagregación bacteriana promoviendo el desarrollo de 
biopelículas. También se cree que las OMV de P. gingivalis contribuyen a la interacción y 
colonización del hospedador, a la evasión de los mecanismos de defensa inmunitaria y a 
la destrucción de los tejidos periodontales. Las OMV pueden ser cruciales para la captura 
de micronutrientes y macronutrientes, especialmente el hemo y probablemente otros 
compuestos asimilables para su propio beneficio y el de la comunidad de biofilm en general 
(44). Recientemente se demostró el mecanismo de endocitosis de las OMV de P. gingivalis 
en células epiteliales gingivales y se observó que este proceso es dependiente de fimbrias, 
además de actina y Rac1, y que una vez internalizadas, estas son enviadas al endosoma 
temprano, donde son capaces de degradar proteínas de la célula como el receptor 
intracelular de transferrina, importante para el trasporte y metabolismo del hierro, lo que 
induce alteraciones de la función celular como síntesis de DNA y la mayoría de actividades 
dependientes de ATP (13, 20). Después de la internalización, las OMV son distribuidas en 
compartimientos lisosomales, donde son degradadas por la maquinaria celular y varios 
antígenos pueden ser reconocidos y procesados por las células presentadoras de 
antígenos, lo que conduce a la inducción de la inmunidad adaptativa incluyendo la 
producción de anticuerpos (13). 
Furuta et al., 2009 evaluaron la actividad proteolítica de las OMV frente a sustratos para 
gingipaínas R y gingipaínas K confirmando que en estas vesículas hay gran actividad 
mediada por estas enzimas (48). Sin embargo, el papel de OMV de P. gingivalis en la 
inmunopatología y la inmunogenicidad durante el desarrollo de las enfermedades 
periodontales en humanos no se ha descrito y el mecanismo por el cual estas vesículas 
Capítulo 1 17 
 
son capaces de inducir cambios en la función de células de la respuesta inmune innata no 
es claro. 
1.3.3.3 Cambios de respuesta inmune por OMV de P. gingivalis 
Si bien la inflamación es un componente importante de la defensa del hospedador, la 
inflamación persistente y desregulada proporciona un entorno nutricionalmente favorable 
para las bacterias en la bolsa periodontal responsables en gran medida de la destrucción 
ósea y tisular que caracteriza a la periodontitis (49). 
Diferentes estudios han investigado el papel potencial de los OMV en la respuesta inmune 
del hospedador y la destrucción del tejido durante la infección por P. gingivalis (12,14, 50). 
En primer lugar estudios en sueros de pacientes con periodontitis se reportó que tenían 
una reactividad fuerte contra OMV; por otra parte, cuando se adicionan OMV a una 
monocapa de una línea de células epiteliales escamosas orales, las OMV provocan 
desprendimiento de células, lo cual fue corroborado al pre-incubar las OMV con antisuero 
anti-gingipaína el cual bloqueo la acción de las vesículas, indicando adicionalmente que 
las gingipaínas derivadas de OMV tienen un efecto proteasa fuerte en la actividad de la 
vesícula y sugiriendo que pueden contribuir a la destrucción del tejido periodontal al servir 
como un vehículo para los antígenos y proteasas activas. (12). 
Además, las OMV de P. gingivalis han sido evaluadas en células epiteliales gingivales 
humana (HGE), para determinar su efecto sobre la expresión de ARNm de COX-2, IL-6, 
IL-8, MMP-1 y MMP-3 (51); en línea celular de carcinoma de células epiteliales escamosas 
(HSC-2), para evaluar el efecto citotóxico y de desprendimiento de células en cultivo 
cuando están expuestas a las vesículas (12); en células endoteliales de vena umbilical 
humana (HUVEC), utilizadas para evaluar su habilidad para promover la inflamación y su 
efecto sobre la biosíntesis de moléculas de adhesión (E-selectina, ICAM-1 y glicoproteínas 
como MHC-II) (52); en línea celular de macrófago de ratón (RAW264), para evaluar su 
capacidad de inducir la producción rápidamente ON por las células (53). 
Duncan et al., (2004) confirmaron en la línea celular mielomonocítica humana (U937) que 
las vesículas contribuyen a la pérdida del receptor CD14 para LPS y que las gingipaínas 
son las responsables de esta degradación. Este fenómeno, fue confirmado con vesículas 
de cepas mutantes P. gingivalis deficiente de gingipaínas (54). 
18 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
Las OMV de P. gingivalis también pueden persistir dentro de los lisosomas de las células 
hospedadoras y son potentes activadores de los receptores Toll-like (TLR) (55). Un estudio 
reciente reportó que la capacidad de P. gingivalis para alterar la respuesta inmune local 
se debía a la hipo-respuesta que inducen las OMV en los monocitos, favoreciendo que 
estos no respondan a la infección por P. gingivalis viva (56). 
Se sabe que los monocitos y los macrófagos son las principales células de la respuesta 
inmune del hospedador a la infección bacteriana a través de la fagocitosis, la presentación 
del antígeno y la producción de citoquinas. Las biopsias de tejido gingival de pacientes con 
periodontitis han mostrado un número elevado de macrófagos y concentraciones más altas 
de óxido nítrico sintasa y citocinas proinflamatorias, que sirven para promover la 
inflamación y reclutar células inmunitarias adicionales al sitio de la infección (49). Se sabe 
que las OMV bacterianas se unen a las células de mamíferos y se internalizan 
rápidamente, por lo que entregarían Patrones Moleculares Asociados a Patógenos 
(PAMPs) tanto a la superficie celular como a los receptores citosólicos, modulando en las 
células que se internaliza la funcionalidad y respuesta de las misma a la infección por P. 
gingivalis (49). 
Se ha establecido que P. gingivalis tiene un mecanismo para clasificar selectivamente 
proteínas en OMV, lo que resulta en el empaquetado preferencial algunos factores de 
virulencia en OMV y la exclusión de muchas proteínas de membrana externa de la carga 
de proteína. La existencia de un proceso paraempaquetar factores de virulencia 
específicos en OMV puede alterar significativamente la comprensión actual de las 
interacciones hospedador-patógeno (57). 
 
 
 
 
 
 
2 Metodología 
Para cumplir el objetivo general se plantearon los siguientes objetivos específicos: 
1. Obtener y purificar las vesículas de membrana externa de P. gingivalis W83 y P. 
gingivalis ATCC 33277. 
2. Evaluar los niveles y expresión de citocinas proinflamatorias en macrófagos 
cultivados y estimulados con vesículas de membrana externa de P. gingivalis. 
3. Evaluar el efecto de la inhibición de gingipaínas y lipopolisacárido de vesículas 
extracelulares de P. gingivalis en la expresión de citocinas en proinflamatorias en 
macrófagos. 
La metodología a continuación descrita permitió cumplir los objetivos propuestos. 
2.1 Cultivo bacteriano de P. gingivalis ATCC 33277 y P. 
gingivalis W83 y obtención de pre-inóculos 
 
Cepas de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 fueron descongeladas del cepario 
del Laboratorio de Microbiología Oral del Instituto UIBO, conservadas en caldo BHI (Brain 
Heart Infusion) con 10% de glicerol a -80°C y cultivadas en agar Brucella suplementado 
con (0.3% de Bacto agar, 0.2% de extracto de levadura, 5% de sangre de cordero, 0.2% 
de sangre hemolizada, 0.0005% de hemina y 0.00005% menadiona) y fueron incubadas a 
37°C durante 4 días en condiciones anaeróbicas (Anaerogen, Oxoid, Hampshire, UK). 
Pasado el tiempo de incubación se verificó pureza de los cultivos y posteriormente se 
ajustaron pre-inóculos bacterianos de P. gingivalis ATCC 33277 y P. gingivalis W83 en 
caldo BHI y se cuantificaron por espectrofotometría a una longitud de onda () de 620 nm 
y estandarizados a una densidad óptica (DO) de 0.970 – 0.972 para P. gingivalis W83 y 
DO: 1.000-1.008 para P. gingivalis ATCC: 33277 con el fin de obtener recuentos lo más 
similares posibles entre las dos bacterias (>1 x 108 bacterias/mL) y de esta manera 
asegurar las mismas condiciones para las dos cepas a evaluar. 100 µL de cada suspensión 
20 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
previamente ajustada (pre-inóculo), fueron utilizados para hacer diluciones seriadas en 
base 10 hasta la dilución -8. Se realizó el recuento del número de bacterias por mL de P. 
gingivalis ATCC 33277 y W83, adicionalmente se calculó la concentración de proteínas del 
pre-inóculo con ácido Bicinconínico (Pierce® BCA Solid, Thermo Scientific) usando una 
curva de calibración con concentraciones conocidas de albumina sérica bovina como 
patrón. 1mL del cultivo bacteriano restante fue conservado a -20°C para posteriores 
pruebas. Todos los experimentos fueron realizados por triplicado. 
2.1.1 Inóculos de P. gingivalis ATCC 33277 y W83 
En experimentos independientes se estandarizaron los inóculos bacterianos, para los 
cuales se partió del pre-inóculo ajustado previamente y 100 µL de cada suspensión 
bacteriana fueron sembrados en 4 mL de caldo BHI suplementado con 5% de hemina y 
5% menadiona e incubados en condiciones anaeróbicas, en agitación a 90 rpm durante 48 
horas. A las 48 horas de incubación se tomó una alícuota de 100 µL de cada inóculo 
bacteriano y se realizaron diluciones seriadas en base 10 para realizar el cálculo del 
número de bacterias a las 48 horas de incubación (Inóculo final) y se obtuvieron alícuotas 
para determinar límite de detección de actividad Arg-gingipaína. 
2.1.2 Viabilidad bacteriana de inóculos de P. gingivalis ATCC 
33277 y W83 
Para confirmar adicionalmente el dato de los recuentos bacterianos a las 48 horas de 
incubación y correlacionar con los recuentos obtenidos por plaqueo, se determinó la 
viabilidad bacteriana del inóculo final con el kit comercial LIVE/DEAD™ BacLight™ 
Bacterial Viability Kit (Thermo Fisher), como lo hemos reportado previamente en Castillo 
et al., 2015 (58). 
2.1.3 Límite de detección de actividad de la proteasa (Rgp) en los 
pre-inóculos e inóculos de P. gingivalis 
De los pre-inóculos y los inóculos bacterianos con recuentos en UFC/mL previamente 
estandarizados, se realizaron diluciones seriadas 1:2 hasta la dilución 1:4096. Se obtuvo 
el límite de detección de la actividad Arg-gingipaína de cultivos de P. gingivalis (Pre-inóculo 
e Inóculo de 48 horas) usando el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg 7-amido-4-
Capítulo 2 21 
 
metilcoumarin hydrochloride (CAAM; Sigma) como lo describe previamente Nakagawa et 
al., 2006 con modificaciones (59). El inóculo fue preparado a una concentración de 16nM 
en 50mM de Buffer Tris HCl pH 8.0 y DMSO (Dimetilsulfóxido), en una relación de 10µL 
de reactivo CAAM con 50 µL de muestra. Todos estos ensayos fueron realizados por 
triplicado, en placas de 96 pozos oscuras de fondo claro e incubadas a 37°C durante 30 
minutos, pasado el tiempo de incubación la reacción fue detenida con 40 µL de una 
solución de parada que contiene 100 mM de buffer acetato de sodio pH: 5.0 y 10 mM de 
ácido acético 4M. Las placas fueron leídas en un fotofluorómetro Infinite® 200 PRO Tecan, 
una  excitación: 380 nm y  de emisión: 460 nm. Se obtuvieron las unidades de 
fluorescencia, que fueron transformadas en unidades de actividad Rgp. 
𝑨𝒄𝒕𝒊𝒗𝒊𝒅𝒂𝒅 𝑹𝒈𝒑 =
𝑃𝑟𝑜𝑚𝑒𝑑𝑖𝑜 𝑑𝑒 𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒𝑠 𝑑𝑒 𝑓𝑙𝑢𝑜𝑟𝑒𝑠𝑐𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛
µ𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛𝑎 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 
 
2.2 Obtención y purificación de OMV P. gingivalis 
 
La preparación y purificación de las vesículas fue realizada como lo describe previamente 
Furuta et al., 2009b con modificaciones (48). 100 µL de pre-inóculos previamente ajustados 
para cada una de las bacterias fueron sembrados en 4 mL de caldo BHI suplementado con 
hemina y menadiona e incubados en agitación a 90 rpm durante 48 horas. Transcurrido 
este tiempo a cada cultivo se le adicionaron 40 µL del coctel inhibidor de proteasas 100X 
(Protease Inhibitor Cocktail for use with mammalian cell and tissue extracts-Sigma) y se 
procedió a realizar dos ciclos de centrifugación a 1.600 gravedades durante 1 hora a 4°C 
cada ciclo. El sobrenadante obtenido libre de bacterias fue filtrado a través de filtros de 
membrana en esteres de celulosa con un tamaño de poro de 0,22 µm (Millipore), para 
remover bacterias residuales. 
El sobrenadante filtrado, fue utilizado para la obtención de vesículas por ultra 
centrifugación a 100.000 g durante 1 hora en una Ultracentrífuga (OptimaTM MAX-TL- 
Ultracentrífuga (Beckman Coulter)) a 4°C. El pellet final de la ultra centrifugación fue 
resuspendido en 50 µL de Tris-HCl 20 mM pH: 8.0 con 10% de glicerol y conservadas a -
20°C hasta su uso. 
La concentración de proteínas totales de las OMV fue cuantificada con ácido Bicinconínico 
(Pierce® BCA Solid, Thermo Scientific) usando una curva de calibración con 
concentraciones conocidas de albumina sérica bovina como patrón. El perfil proteico de 
22 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
las OMV fue evaluado mediante SDS–PAGE (Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel 
electrophoresis) al 14% usando un extracto sonicado de células completas de P. gingivalis 
W83 y 33277 como control positivo (59), PBS + 10% de glicerol como control negativo y 
se incluyó un segundo control negativo con caldo BHI. Los geles fueron separados en un 
equipo Mini Protean electrophoresis (Bio-Rad, Vienna, Austria) y las proteínas se tiñeron 
con coloración de plata. Los perfiles electroforéticos fueron comparados con los reportados 
previamente por Veith et al., 2014 y Mantri et al., 2015 (45,20). 
2.2.1 Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM) para OMV de 
P. gingivalis 
Para evaluar la integridad de las vesículas después de su obtención por ultracentrifugación, 
serealizó TEM, usando el Microscopio Electrónico Digital de Transmisión Marca: FEI; 
Modelo: TECNAI 20 Twin - 200Kv. Se obtuvieron imágenes de OMV purificadas de las dos 
bacterias usando un pool representativo de 4 lotes de vesículas obtenidos en diferentes 
momentos y conservados durante un mes a -20°C. 
2.2.2 Límite de detección de actividad proteasa de las OMV de P. 
gingivalis 
 
El límite de detección de actividad Rgp de las vesículas de P. gingivalis ATCC: 33277 y P. 
gingivalis W83 fue determinada de la misma manera como fue realizada con bacteria 
completa usando el sustrato fluorogénico Z-Gly-Gly-Arg 7-amido-4-metilcoumarin 
hydrochloride (CAAM; Sigma) como lo describe previamente Nakagawa et al., 2006 (59). 
2.3 Cultivo celular de monocitos U937 ATCC® 
CRL1593.2™ 
Una línea celular de monocito U937 ATCC® CRL1593.2™ donada por el Instituto de 
Virología de la Universidad El Bosque, fue cultivada como lo describe Sekot et al., 2011 
con modificaciones (60). Las células fueron mantenidas en medio RPMI-1640 (1X) con L-
Glutamina (GIBCO) suplementado con 10% de suero fetal bovino (GIBCO) y 1% de una 
mezcla de antibiótico-antimicótico (100 U/mL de penicilina, 100 µg/mL de Estreptomicina 
y 0, 25 µg/mL de Anfotericina B Thermo Fisher Scientific) a 37°C en una atmosfera con 5% 
Capítulo 2 23 
 
de CO2 y humedad relativa del 90%. Los cultivos fueron mantenidos por adición de medio 
fresco cada 3 días con el fin de mantener una densidad celular entre 1 X 105 y 2 X 106 
células /mL, siguiendo las recomendaciones de la ATCC, todos los experimentos se 
realizaron al tercer pase. 
2.3.1 Diferenciación de monocito U937 a macrófago 
Para inducir la diferenciación de monocitos U937 a macrófagos adherentes, se sembraron 
150.000 células por pozo en placas de 24 pozos a un volumen final de 500 µL y una 
concentración de 200ng/mL de PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate (Sigma)) como 
agente diferenciador, la concentración fue definida después de un proceso de 
estandarización (datos no mostrados). Las células fueron incubadas por 72 horas a 37°C 
en una atmosfera con 5% de CO2 y humedad relativa del 90%. Después de la incubación, 
se realizó un recambio de medio, adicionando a las células medio libre de PMA e 
incubando nuevamente durante 24 horas. 
Después de 24 horas de incubación de las células con medio libre de PMA, se retiró el 
medio y se agregó medio fresco, se verificó la adherencia de las células a la placa y el 
cambio de tamaño y morfología celular para confirmar la diferenciación celular. 
2.4 Evaluación de la viabilidad de macrófagos-U937 
estimulados con P. gingivalis 
Se determinó la viabilidad de las células infectadas con diferentes multiplicidades de 
infección (MOI) de P. gingivalis W83 y 33277 así como con diferentes concentraciones de 
lisado celular y OMV con el fin de definir la concentración de bacterias, lisado y vesículas 
a la que se obtendría un efecto importante sin daño de la célula. Para ello se realizó el 
protocolo de viabilidad celular con el método resazurina, como lo describe Riss et al., 2011, 
con modificaciones. Las células viables con metabolismo activo pueden reducir la 
resazurina en el producto de resorufina, que es de color rosado y fluorescente (61). Para 
este fin macrófagos-U937 fueron estimulados con P. gingivalis W83 y 33277 a una MOI: 
10, 50, 100 y 200 y lisado celular o vesículas a 20 μg/mL durante 30 minutos, 1 hora, 2 
horas, 3 horas, 6 horas, 12 horas y 24 horas. Posterior al tiempo de estímulo, este fue 
retirado y las células fueron lavadas con PBS apirogénico, se usaron como control 
macrófagos -U937 sin tratamiento. Resazurina a una concentración de 4,4 μM fue 
24 Evaluación de los cambios en la expresión de mediadores inflamatorios 
inducidos por vesículas de membrana externa de Porphyromonas gingivalis en 
macrófagos humanos 
 
adicionada en cada pozo. Se realizó observación del cambio de color de morado a rosado 
a partir de la hora de contacto de las células con el reactivo, las placas fueron leídas en un 
fotofluorómetro Infinite® 200 PRO Tecan, una  excitación: 535 nm y  de emisión: 630 
nm. Se obtuvieron las unidades de fluorescencia, con las que se calculó el porcentaje de 
viabilidad de las células estimuladas comparadas con las células sin estímulo. Todos los 
experimentos fueron realizados por triplicado. 
2.5 Modelo de infección de macrófagos - U937 con OMV 
de P. gingivalis 
La estimulación de macrófagos con OMV se realizó como lo describe Friedrich et al., 2015 
con modificaciones (62). Los macrófagos adherentes sembrados en placas de 24 pozos a 
una densidad de 150.000 células por pozo en un volumen de 500 μL RPMI-1640 fueron 
estimulados con OMV y lisados celulares de P. gingivalis W83 y 33277 a una concentración 
de 20 μg/mL y con bacteria completa a MOI: 100, durante 30 min, 2 horas, 6 horas y 24 
horas. Posterior a cada tiempo de estímulo, el estímulo fue retirado y las células lavadas 2 
veces con PBS 1X para adicionarles medio fresco. 24 horas después, fueron colectados 
los sobrenadantes para evaluación de niveles solubles de citocinas mediante citometría de 
flujo, las células fueron desprendidas y conservadas en Trizol® (Invitrogen) a -80oC para 
extracción de RNA y determinación de la expresión genes de citocinas y quimiocinas, se 
realizaron tres replicas biológicas para todos los experimentos y se incluyeron células sin 
estímulo como control. 
2.5.1 Evaluación de los niveles solubles de citocinas por 
citometría de flujo 
Sobrenadantes de cultivo después de cada uno de los tiempos de estímulo, fueron 
utilizados para determinar los niveles solubles de TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8, RANTES, MCP-
1 y MIP-1α por citometría de flujo usando el panel de citocinas proinflamatorias (Human 
inflammation panel Cat. No. 740118 LEGENDplex (Multi-Analyte Flow Assay Kit) 
BioLegend) de acuerdo a las recomendaciones del fabricante. Este es un inmunoensayo 
basado en perlas, que utiliza los mismos principios básicos de los inmunoensayos tipo 
sándwich, mediante el cual se captura un analito soluble entre dos anticuerpos. Cada 
conjunto de perlas está conjugado con un anticuerpo específico en la superficie y sirve 
Capítulo 2 25 
 
como base de captura para ese analito en particular. Los anticuerpos de detección 
biotinilados y cada anticuerpo de detección se unen a su analito específico unido a las 
perlas de captura, formando así sándwiches de captura de perlas, analitos y anticuerpos 
de detección. Posteriormente, se agrega estreptavidina-ficoeritrina (SA-PE), que se unirá 
a los anticuerpos de detección biotinilados, proporcionando una señal fluorescente con 
intensidades en proporción a la cantidad de analito unido (Información disponible en página 
web https://www.biolegend.com/legendplex). Para cada población de perlas, la intensidad 
de fluorescencia de la señal de PE fue cuantificada utilizando un citómetro de flujo (BD 
Accuri™ C6). La concentración particular de cada analito se determinó en base a una curva 
estándar conocida usando el software de análisis de datos LEGENDplex ™. 
2.6 Evaluación de la expresión de citocinas 
proinflamatorias por macrófagos-U937 estimulados 
con OMV de P. gingivalis W83 y 33277 
La monocapa celular fue utilizada para extracción de RNA usando Trizol® (Invitrogen), se 
realizó tratamiento con DNase (Promega); retro-transcripción y síntesis de cDNA usando 
M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) y posteriormente qPCR usando el kit Precision 
Melt Supermix for High Resolution Melt (HRM) Analysis (BIORAD). Se determinó la 
expresión relativa de ARNm en los diferentes tiempos de estímulo para TNF-α, IL-1β, IL-
6, IL-8, RANTES, MCP-1 y MIP-1α, usando β-actina como housekeeping. En la tabla 2, se 
muestran las secuencias de primer utilizadas para la determinación de expresión de las 
citocinas, los primers para MIP-1α y β-actina fueron diseñados en este estudio usando el 
software Beacon