bgr,26010-49383-1-CE

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Vol. 4, No. 1, 36 - 45, 2011
REVISTA AIDIS 
de Ingeniería y Ciencias ambientales: 
Investigación, desarrollo y práctica. 
 
APLICACIÓN DE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR 
PARA LA IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS 
NITRIFICANTES Y DESNITRIFICANTES ADHERIDOS  
A ZEOLITAS NATURALES 
 
Camila Mery Araya 1*
Lorna Guerrero Saldes 1 
Jorge Alonso Gutiérrez 2 
Mónica Figueroa Leiro 2 
Juan Lema Rodicio 2 
Silvio Montalvo Martínez 3 
Gladys Vidal Saez 4
 
APPLICATION OF MOLECULAR BIOLOGY TECHNIQUES FOR THE 
IDENTIFICATION OF MICROORGANISMS NITRIFIYING AND 
DENITRIFYING ATTACHED  ON NATURAL ZEOLITE 
 
Abstract 
This study identified microbial populations in nitrifying and denitrifying batch reactors using chilean natural zeolite 
with different diameters for microbial support. The microbial populations were analyzed using molecular biology 
techniques: DGGE and FISH, founding that Gamaproteobacteria are the best adapted to the present nitrification 
and denitrification conditions. Nitrifying reactors showed similarity in their microbiological composition 
independent of the support size used, presenting all 80% of Gammaproteobacteria. However, the denitrifying 
reactors showed a big diversity, finding Bacteria and Archaea in different proportions depending of the diameter 
utilized. It is recommended DGGE and subsequent FISH analysis with specific probes to determine 
Gamaproteobacteria and Archaea species involved. 
 
Key words: Denitrification; DGGE; FISH; Nitrification; Zeolite. 
 
 
1 Departamento de Ingeniería Química y Ambiental, Universidad Técnica Federico Santa María, Chile. 
2 Departamento de Ingeniería Química, Universidad Santiago de Compostela, España. 
3 Departamento de Ingeniería Química, Universidad Santiago de Chile. 
4 Centro de Ciencias Ambientales, Universidad de Concepción, Chile. 
 
*Corresponding autor: Av. España 1680, Valparaíso – 2390123 – Chile. Tel.: 56-32-2654303– Fax.:56-32-2654478. Email: 
mery.camila@gmail.com 
 
 
 
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Resumen 
En este estudio se identificaron las poblaciones microbianas presentes en reactores batch nitrificantes y 
desnitrificantes que utilizan zeolita natural chilena de diferentes diámetros como soporte microbiano. Las 
poblaciones microbianas se analizaron mediante las técnicas de biología molecular DGGE y FISH, encontrando que 
las bacterias pertenecientes a la clase Gamaproteobacterias son las mejores adaptadas a las condiciones de 
nitrificación y desnitrificación presentes. Los reactores nitrificantes presentaron similaridad en su composición 
microbiológica independientemente del diámetro de soporte utilizado, presentando todos un 80% de 
Gammaproteobacterias. Los desnitrificantes, en cambio, presentaron gran diversidad, encontrando tanto Bacterias 
como Arqueas en diferentes proporciones dependiendo del diámetro utilizado. Se recomienda realizar análisis de 
DGGE y posterior FISH con sondas específicas para determinar para determinar las especies de 
Gamaproteobacterias y Arqueas involucradas. 
 
Palabras claves: Desnitrificación; DGGE; FISH; Nitrificación; Zeolita. 
 
 
 
Introducción 
La actividad humana está modificando la velocidad de algunos de los procesos involucrados en 
el ciclo natural del nitrógeno, produciendo acumulaciones de compuestos nitrogenados en las 
aguas y, en consecuencia, la contaminación de estas (Camargo y Alonso, 2006). Uno de los 
métodos ampliamente utilizados en la eliminación de nitrógeno presente tanto en aguas 
residuales urbanas como en gran parte de las aguas industriales, es la combinación de los 
procesos biológicos de nitrificación y desnitrificación. En la nitrificación el amonio se oxida 
secuencialmente a nitrito y nitrato mediante la intervención de dos grupos distintos de 
bacterias autótrofas: las bacterias oxidantes de amonio (BAO) que realizan la oxidación de 
amonio a nitrito, y las bacterias oxidantes de nitrito (BNO) que llevan a cabo la oxidación del 
nitrito a nitrato. La desnitrificación, reducción de nitrato a nitrógeno molecular en condiciones 
anóxicas, es llevada a cabo por diferentes géneros de bacterias, tanto heterótrofas como 
autótrofas. 
 
El interés por la identificación de las diferentes poblaciones bacterianas presentes en sistemas 
biológicos de tratamiento de aguas residuales ha ido en aumento durante las dos últimas 
décadas, ya que permite una mejor comprensión de los procesos involucrados en la depuración 
de aguas residuales. En este estudio se evaluaran las principales poblaciones microbianas 
presentes en reactores batch nitrificantes y desnitrificantes que utilizan zeolita natural chilena 
de diferentes tamaños como medio de soporte. Esta evaluación se realizará mediante un 
análisis cuantitativo a través de hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) y cualitativo 
utilizando electroforesis en gel con gradiente desnaturalizante (DGGE). El medio de soporte 
utilizado es un mineral microporoso capaz de adsorber iones de amonio con una superficie 
rugosa e irregular y gran área superficial, convirtiéndolo en un excelente soporte para el 
desarrollo de biopelículas microbianas (Fernández et al. 2007). La constante transferencia de 
 
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iones de amonio entre la zeolita y el medio proporciona amonio disponible para los 
microorganismos que forman la biopelícula, específicamente para los microorganismos 
nitrificantes (Park et al., 2002). 
 
 
Metodología 
La operación de los reactores batch se realizó en la Universidad Técnica Federico Santa María, 
Valparaíso, Chile, a través de dos sistemas. Cada sistema se operó con un caldo de cultivo 
nitrificante y desnitrificante, respectivamente, utilizando diámetros de zeolita de 0.5, 1 y 2 mm 
en cada caso. Las características de los reactores dependían del tipo de digestión, y estos a su 
vez del diámetro de soporte utilizado. 
 
Los reactores nitrificantes fueron operados a 20°C, a un pH de 8 y un tiempo de operación de 25 
días. Estos reactores utilizaron un medio de cultivo con las siguientes características en g/L: 
NH4Cl 0,764; Urea 0,45; Extracto de levadura 0,28; FeSO4∙7H2O 0,0992; NaHCO3 3,12; KH2PO4 
0,181 y 1 mL/L de solución salina. Los reactores desnitrificantes, en cambio, fueron operados a 
37°C con un pH de 7 y un tiempo de operación de 28 días. En ellos, se utilizó el siguiente medio 
de cultivo en g/L: CH3COOK 1,5; MgSO4∙7H2O 0,08; NaCl 0,3; Extracto de levadura 0,2; KNO3 
1,56; K2HPO4 5,0; KH2PO4 1,5 y 1 mL/L de solución salina. La composición de la solución salina 
utilizada en ambos casos es la siguiente: EDTA 0.15 g/L; HCl 1 mL/L: FeSO4 2g/L; HBr 0.05 g/L; 
ZnCl2 0.05 g/L; MgCl2 0.05 g/L. 
 
De estos reactores se extrajeron muestras de biomasa junto con zeolita al comienzo y final de la 
experiencia, las que fueron fijadas y refrigeradas en Chile, siguiendo el protocolo descrito por 
Amann et al. (1995). Estas muestras fueron sometidas a ultrasonido durante 30 segundos y al 40 
% de amplitud del equipo (Branson Sonifier 150) para desadherir la biomasa y luego fijarla en 
parafolmadehido al 4% en PBS. Posteriormente, se analizaron mediante las técnicas DGGE y 
FISH. 
 
Fijación celular. La fijación celular se realizó según el procedimiento descrito por Amann et al. 
(1995) con 4% [peso/volumen] de paraformaldehido en solución salina amortiguada por 
fosfatos (PBS). 
 
FISH. Se siguió el procedimiento descrito por Amann et al. (1995), en el que se distinguen cuatro 
pasos: fijación de la biomasa, inmovilización sobre el portaobjetos, hibridación y análisis 
microscópico. La hibridación se llevó a cabo a una temperatura constante de 46°C durante un 
periodo de 120 minutos, ajustando el porcentaje de formamida a los valores indicados en la 
Tabla 1. 
 
 
 
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Tabla 1. Secuencias, organismos objetivo y porcentaje de formamida (%FA) utilizados. 
Sonda  Fluor.  Secuencia (5’→3’)  % FA  Organismo objetivo 
EUB338I Fluos GCT GCC TCC CGT AGG AGT 20 Dominio Bacteria 
ALF1BFluos CGT TCG YTC TGA GCC AG 20 
Alphaproteobacteria, algunas 
Deltaproteobacteria, Spirochaetes 
NIT3* Cy3 CCT GTG CTC CAT GCT CCG 40 Nitrobacter spp. 
NITComp CCT GTG CTC CAT GCT CCG 
BET42a* Cy3 GCC TTC CCA CTT CGT TT 35 Betaproteobacteria 
BETComp ‐  GCC TTC CCA CAT CGT TT 
NSO190 Cy3 CGA TCC CCT GCT TTT CTC C 55 
Betaproteobacteria oxidantes de 
amonio 
GAM42a* Cy3 GCC TTC CCA CAT CGT TT 35 Gammaproteobacteria 
GAMComp - GCC TTC CCA CTT CGT TT 
GAOQ431 Cy3 TCC CCG CCT AAA GGG CTT 35 
Candidatus Competibacter 
phosphatis 
ARC915 Cy3 GTG CTC CCC CGC CAA TTCCT 40 Archaea 
MX825 Cy3 TCG CAC CGT GGC CGA CAC CTA GC 50 Algunas Methanosaetaceae 
MS821 Fluos 
CGC CAT GCC TGA CAC CTA GCG 
AGC 
40 Methanosarcina 
MB1174 Cy3 TAC CGT CGT CCA CTC CTT CCT C 45 
Methanobacteriales (menos 
Methanothermus) 
*Sondas usadas con una concentración equimolar de competidor sin fluorocromo. 
 
 
En cada pocillo de los portaobjetos se realizó la hibridación empleando sondas con los 
fluorocromos fluoresceína-5-isotiocianato (Fluos), cianina (Cy3) y 4,6-diamidino-2-fenilindol 
diclorohidrato (DAPI). Este último es un colorante universal que se une al ADN permitiendo 
visualizar todas las células de la muestra. Las señales de fluorescencia se registraron a través de 
una cámara digital (Coolsnap, Roper Scientfific Photometrics) acoplada al microscopio de 
epifluorescencia (Axioskop 2 plus, Zeiss) equipado con los filtros correspondientes para 
visualizar cada fluorocromo empleado dado que cada uno de ellos presenta un espectro de 
excitación y emisión característico y único. 
 
DGGE. Se realizó análisis DGGE según lo descrito por Alonso-Gutiérrez et al. (2009). Las 
muestras analizadas fueron las del reactor anaerobio con diámetro de zeolita de 1 mm. El ADN 
se extrajo a través del kit MoBio Power Soil™ siguiendo el protocolo del fabricante. La reacción 
en cadena de la polimerasa (PCR) se realizó utilizando el termociclador Veriti. Se empleó la 
combinación de primers universales F341-GC y R907 (Yu and Morrison, 2004). Los productos de 
la PCR se cargaron en un gel de poliacrilamida al 6% (peso/volumen) formado con un gradiente 
desnaturalizante de formamida/urea que variaba desde el 40 al 75%, para ello se utilizó el 
 
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equipo INGENY phorU, operado a 60°C y 100 V durante 16 h. Las bandas más intensas se 
secuenciaron y clasificaron mediante comparación con la base de datos existentes en Gen Bank, 
utilizando el software computacional Blast (BLASTN, Altschul et al., 1990). 
 
 
Resultados y Discusión 
FISH. Los reactores nitrificantes presentaron diversidad microbiana similar independiente del 
tamaño de zeolita utilizado como soporte microbiano. En todos los reactores con medio de 
cultivo nitrificante dominaron las Gammaproteobacterias con un 80%, también se identificaron 
Betaproteobacterias con porcentajes alrededor de 12%. 
 
Dentro de las Betaproteobacterias se determinó la presencia de Betaproteobacterias amonio-
oxidantes, sin embargo no fueron identificadas. Se determinó, también, la presencia de 
Nitrobacter las cuales oxidan el nitrito a nitrato, sin embargo, tampoco fueron identificadas. Los 
amplios porcentajes de Gammaproteobacterias encontradas y la no identificación de 
Betaproteobacterias amonio-oxidantes parecerían indicar que tanto las BAO, como las BNO 
pertenecen a la clase Gammaproteobacterias. 
 
Por otro lado, In situ, se pudo observar que los tamaños de zeolita de 0.5 y 1 mm poseían una 
forma y agrupación similar de Gammaproteobacterias. Situación contraria a la observada en la 
zeolita de tamaño 2 mm (Figura 1). De lo anteriormente expuesto se podría inferir que se 
trataría de especies diferentes; sin embargo, hacen falta estudios más exhaustivos para afirmar 
o rechazar la hipótesis expuesta. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 1. Imagen de FISH. Gammaproteoacterias (Cy3: rojo) sobrepuesto en toda la biomasa (DAPI:azul). Izquierda: 
Muestra de reactor aerobio con soporte de 0,5 mm. Derecha: Muestra de reactor aerobio con soporte de 2 mm. 
Barra indica 10 um. 
 
 
 
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Nogueira et al. (2002) en su estudio sobre poblaciones nitrificantes que utilizan polietileno 
expandido como medio de soporte, señalan que las Betaproteobacterias fueron las bacterias 
dominantes, mientras que las Gammaproteobacterias fueron prácticamente indetectables. 
Utilizando polietileno granulado en sistemas de nitrificación, según lo estudiado por Kim et al. 
(2006), un 80% de las bacterias corresponden a Alfaproteobacterias y Betaproteobacterias. 
Utilizando un medio de cultivo similar al utilizado por ambos autores y zeolita natural chilena 
como medio de soporte, el presente estudio indica que el 80% de las bacterias corresponde a 
Gammaproteobacterias, por ende el tipo de soporte influiría en la biodiversidad que lo coloniza, 
siendo independiente del diámetro de soporte utilizado. 
 
Al igual que en los reactores nitrificantes, todos los reactores desnitrificantes presentaron 
Gammaproteobacterias, sin embargo la cantidad identificada fue menor. En estos últimos 
reactores, el mayor porcentaje fue de 70% correspondiente al tamaño de 0.5 mm, mientras que 
para los diámetros de 1 mm y 2 mm fue de 20% y 30% respectivamente, es decir, mientras 
menor es el tamaño de zeolita mayor es la cantidad de Gammaproteobacterias. 
Se analizó la presencia de Betaproteobacterias sin embargo no fueron identificadas. Estudios 
recientes sobre en sedimentos marinos (Heath et al., 2008) muestran alta abundancia de 
Gammaproteobacterias en procesos de nitrificación y desnitrificación, atribuibles a un alto nivel 
de metabolismo de esta clase que permite responder a los rápidos cambios de oxigeno y 
sustratos que se producen en las arenas del mar. 
 
Dentro de la clase Gammaproteobacterias se identificó la presencia de Candidatus 
Competibacter phosphatis en todos los reactores anaerobios con similar porcentaje, la 
identificación de estos es importante en procesos de eliminación de fosforo ya que compiten 
con las bacterias que lo acumulan haciendo menos efectivo este proceso (Gregary et al., 2002). 
Se analizó la presencia de Arqueas en todos los reactores desnitrificantes, encontrándolas sólo 
en uno. 
 
El reactor que presento Arqueas fue el de tamaño de soporte 1 mm, identificándose un 70% de 
estas (Figura 2, derecha), lo que indicaría que este tamaño de soporte genera las condiciones 
óptimas para su desarrollo. 
 
La desnitrificación es un proceso anaerobio llevado a cabo por microorganismos 
filogenéticamente distintos de grupos de bacterias y arqueas (Zumft, 1997; Cheneby et al., 
2000) por lo que existe la posibilidad que las arqueas encontradas participen en la eliminación 
de nitrógeno. 
 
 
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Debido a la fluorescencia natural (Figura 2) de la zeolita el fondo fue demasiado alto como para 
permitir una cuantificación precisa de los grupos bacterianos hibridados con sondas marcadas 
con fluorescencia Fluos. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2. Imagen de FISH. Izquierda. Muestra de reactor aerobio con soporte de 0,5 mm. Eubacterias (Fluos:verde), 
se observa fuerte fluorescencia de la muestra tras aplicar la sonda fluos. Derecha. Muestra de reactor anaerobio 
con soporte 1 mm. Arquea (Cy3: rojo) sobrepuesto en toda la biomasa (DAPI:azul); Barra indica 10 um 
 
 
DGGE. Dado que tras realizar FISH se detectó una mayor diversidad en la muestra del reactor 
desnitrificante cuyo diámetro de soporte era de 1 mm, se decidió estudiar la evolución de la 
biodiversidad de dicho reactor mediante DGGE, comparando las principales poblaciones 
microbianas presentes en el inóculo y el la biopelícula formada tras la operación del reactor, 
denominadas DNB1 y DNB3, respectivamente. 
 
Los resultados de DGGE muestran un marcado cambio poblacional. Mientras que en el inóculo 
los organismos predominantes detectados pertenecen a las clases Flavobacteria y 
Bacteroidetes, al final de la operación del reactor,todas las secuencias identificadas parecen 
estar relacionadas con el phylum Firmicutes. 
 
 
Cabe destacar que la mayoría de estas bandas corresponden a bacterias no cultivadas 
encontradas en plantas de tratamiento anaerobio de aguas residuales. La banda 6, en cambio, 
corresponde a una bacteria responsable de la desnitrificación en campos de arroz (Ishii et al., 
2009). Esto indicaría que la presencia de Arqueas no dificulta el desarrollo de especies 
microbianas desarrolladas normalmente en sistemas de tratamiento de aguas residuales al igual 
que especies que lleven a cabo la desnitrificación. 
 
 
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Figura 3. Lado izquierdo. 
Gel de técnica DGGE donde se 
señalan las bandas de muestras 
DNB1 y DNB3 con sus 
respectivos cortes enumerados. 
Lado derecho. Bandas de interés 
cortadas y los organismos más 
cercanos filogenéticamente 
encontrados. 
 
 
Conclusiones y Recomendaciones 
Los reactores nitrificantes mostraron similaridad en su composición microbiológica, 
independiente del tamaño de zeolita utilizado. Cada uno presentó un 80% de 
Gammaproteobacterias. Considerando el alto porcentaje y la ausencia de Betaproteobacterias 
amonio-oxidantes y Nitrobacter, podría indicarse que las bacterias amonio-oxidantes y nitrito-
oxidantes presentes en los reactores estudiados pertenezcan a Gammaproteobacterias. 
Los reactores desnitrificantes, en cambio, presentaron gran diversidad microbiológica, 
encontrando tanto Bacterias como Arqueas en las muestras estudiadas. Cada reactor 
desnitrificante presento Gammaproteobacterias y sólo el reactor cuyo diámetro de soporte era 
1 mm presento Arqueas. Las bacterias desnitrificantes se caracterizan por ser microorganismos 
filogenéticamente distintos, por ello existe la posibilidad de que la Arqueas encontradas sean 
bacterias desnitrificantes. 
 
En los reactores nitrificantes como desnitrificantes, independientemente del tamaño de soporte 
utilizado, se identificaron Gamaproteobacterias, lo que indicaría que esta clase de bacterias es 
la mejor adaptada a las condiciones presentes en el medio, es decir, que el amonio disponible 
Muestra  Banda 
Mejor resultado (Nº de 
acceso) 
Organismo más 
cercano (% similitud)
DNB1 4 
Uncultured bacterium 
nbw139f01c1 (GQ047959) 
Flavobacteria (94%) 
DNB1 5 
Uncultured bacterium 
D242_27F_BAC_019 
(AB447697) 
Bacteroidetes (99%) 
DNB3 5 
Uncultured bacterium clone 
LaYa5b-55 (GU291589) 
Clostridium (99%) 
DNB3 6 
Uncultured bacterium clone: 
TSNIR002_A18 (AB487194) 
Clostridium (98%) 
DNB3 7 
Bacterium enrichment culture 
clone DPHE06 (GQ377119) 
Clostridium (99) 
DNB3 8 
Uncultured bacterium clone 
HAW-RM37-2-B-877d-A14 
(FN563219) 
Bacteroidetes (99%) 
DNB3 9 
Uncultured Clostridiales 
bacterium clone DS166 
(DQ234248) 
Frigovirgula (100%) 
DNB3 10 
Uncultured Firmicutes 
QEDN2BH06 (CU925649) 
Firmicutes (99%) 
DNB3 11 
Uncultured bacterium clone IA-
23 (AJ488074) 
Firmicutes (99%) 
 
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para los microorganismos que forman la biopelícula podría ser metabolizado por esta clase de 
bacterias. Sin embargo, se recomienda para posteriores estudios similares la realización de 
DGGE de bacterias en todos los reactores nitrificantes y desnitrificantes y de DGGE de arqueas 
en desnitrificantes, con el fin de determinar las especies presentes, para luego aplicar la técnica 
FISH con la sonda específica que hibride a esa bacteria y de esta forma determinar su 
metabolismo, y su cuantificación. 
 
La zeolita al ser de origen mineral presenta algunos problemas de autofluorescencia al aplicar la 
técnica FISH, por ello se recomienda el uso de un protocolo de FISH para suelos en estudios 
posteriores. 
 
 
Agradecimientos 
Este estudio fue posible gracias al financiamiento del proyecto FONDECYT 1090414, Chile y 
apoyado en la toma de muestras y fijación celular por Gabriela Valdes y Monserrat Vásquez de 
la Universidad Técnica Federico Santa María, Chile. 
 
Referencias Bibliográficas 
Alonso-Gutiérrez J., Figueras A., Albaiges J., Jimenez N, Vinas M, Solanas AM, Novoa B (2009). Bacterial 
communities from shoreline environments (costa de morte, northwestern Spain) affected by the pestige 
oil spill. Applied and Environmental Microbiology, 75(11), 3407-3418. 
Amann R., Ludwig, W. and Schleifer, K.H. (1995). Phylogenetic identification and in-situ detection of individual 
microbial cells without cultivation. Microbiological Reviews, 59(1), 143-169. 
Camargo J.A. and Alonso A. (2006). Ecological and toxicological effects of inorganic nitrogen pollution in aquatic 
ecosystems: A global assessment. Environment International, 32(6), 831-849. 
Cheneby D., Philippot L, Hartmann A, Henault C., Germon J.C. (2000). 16 rDNA analysis for characterization of 
denitrifying bacteria isolated from tree agricultural soils. FEMS Microbiology Ecology, 34(2), 121-128. 
Fernández N., Montalvo S., Fernández - Polanco F., Guerrero L., Cortés I., Borja R., Sánchez E., Travieso L. (2007). 
Real evidence about zeolite as microorganisms immobilizer in anerobic fluidized bed reactors. Process 
Biochemistry, 42, 721-728. 
Gregary R. Crocetti, Jillian F. Banfield, Jürg Keller, Philip L. Bond and Linda L. Blackall (2002). Glycogen-accumulating 
organisms in laboratory-scale and full sacale wastewater treatment processes. Microbiology, 148, 3353-
3364. 
Heath J. Mills, Evan Hunter, Mike Humphrys, Lee Kerkhof, Lora McGuinness,Markus Huettel, y Joel E. Kostk (2008). 
Characterization of Nitrifying, Denitrifying, and Overall Bacterial Communities in Permeable Marine 
Sediments of the Northeastern Gulf of Mexico. Applied and environmental microbiology, 74(14), 4440–
4453. 
Ishii S., Yamamoto M., Kikuchi M., Oshima K., Otsuka S. and Senoo K. (2009). Microbial population responsive to 
denitrification-inducing conditios in rice paddy soil, as revelated by comparative 16S rRNA gene analysis. 
Applied and Environmental Microbiology, 75 (22), 770-7078. 
Kim D., Lee D., Keller J. (2006). Effect to temperature and free ammonia on nitrification and nitrite accumulation on 
in landfill leachate and analysis of its nitrifying bacterial community by Fish. Bioresourse Technology, 97(3), 
459-468. 
 
45 
 
Vol. 4, No. 1, 36 - 45, 2011
Nielsen H., Daims H. and Lemmer H. (2009). FISH handbook for biological wastewater treatment, IWA Publisihing, 
London, UK. 
Nogueira R., Melo L., Purkhold U., Wuertz S., Wagner M. (2002). Nitrifying and heteroftrophic population dinamics 
in biofilm reactors: effects of hidraulic retention time and the presence of organic carbon. Water Research, 
36(2), 469-481. 
Yu Z.T. and Morrison, M. (2004). Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in 
fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis. Applied and 
Environmental Microbiology 70(8), 4800-4806. 
Zumft W.G. (1997). Cell biology and molecular basis of denitrification, Microbiology and Moecular Biology Reviews, 
61(4), 533-536.