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Arch. Invest. Méd. (Méx.), 1990; 21: (Supl. 1): 133 
MARÍA EUGENIA HIDALGO 
ROSAURA HERNÁNDFZ 
WILLIAM E. KEENE 
JAMES H. MCKERROW 
ESlHER OROZCO 
MariaEugeniaHidalgo,RosauraHemándezyEstherOrozco. 
Depto. de Genética y Biología Molecular. Centro de lnv. y Es-
tudios Avanzados, IPN. WilliamE. Kee111!. DepartmentofBio-
medical and Environmental Health Sciences. School of Public 
Health. University of Califomai, Berkeley, Ca. 94720. James H. 
McKerrow. Department of Pathology U. of California, San Feo. 
Ca.94143. 
Solicitud de sobretiros (request for reprints): Esther Orozco. 
Depto. de Genética y Biología Molecular. Centro de Inv. Y 
Estudios Avanzados, IPN. Apdo. Postal 14 740. C.P. 07000-
México, D.F. 
Resumen 
En este trabajo estudiamos la relación entre la actividad secre-
tora de los trofozoítos de E. histolytica y la virulencia del 
parásito. Para esto, se aislaron y caracterizaron dos mutantes 
deficientes en virulencia, las clonas T-42 y T-63. Los trofozoítos 
de estas clonas fueron deficientes en adhesión y en fagocitosis 
de eritrocitos, mostraron baja capacidad para dañar células epi-
teliales en cultivo y para producir abscesos hepáticos en háms-
teres inoculados intraportalmente. En este estudio se incl•':·~;;n 
también las clonas C-23 y L-6, deficientes en virulencia. Para 
estudiar la capacidad secretora de las clon:::; se determinó la 
producción de la proteasa neutra principal y el porcentaje 
secretado de ésta. Las clonas C923, T -42 y T63 produjeron 
cantidades de proteasa neutra principal similares o superiores a 
las que produjo la clona silvestre. Sin embargo, secretaron 9%, 
12% y 18% de la proteasa total producida, respectivamente; 
mientras que la clona silvestre secretó el 38%. La clona L-6, fue 
deficiente tanto en la producción como en la secreción de esta 
enzima. Estos resultados apoyan fuertemente la hipótesis de que 
los trofozoítos secretan enzimas proteolíticas y sustancias con 
actividad citotóxica, las cuales participan en la agresividad del 
parásito; además confirman que la proteasa neutra principal 
desempeña un papel importante en la expresión de la virulencia 
de E. histolytica. 
Relación directa entre secreción de 
enzimas proteolíticas y virulencia en 
Entamoeba histolytica 
Direct relationship between secretion 
of proteolytic enzymes and virulenee 
of Entamoeba histolytica 
134 ARCHIVOS DE INVESTIGACION MEDICA (MEXICO), VOLUMEN 21 No. 1, 1990 
Introducción 
Entamoeba histolytica muestra \Dla poderosa actividad lítica 
durante la amibiasis invasiva. Estudios encaminados hacia el 
conocimiento de las bases celulares de la actividad citopática del 
parásito, han sugerido la participación de los factores amibianos 
con actividad proteolítica en la formación de lesiones tisulares 
asociadas a la amibiasis invasiva. 1~ Por otra parte, se ha postu-
lado también que la interacción de los parásitos vivos con la 
célula blanco podría resultar en el disparo de \Dl mecanismo que 
active la liberación de sustancias líticas contenidas dentro de la 
amiba. 5 Así, la secreción podría ser, por sí misma, 1U1 proceso 
ñmdamental que facilite al parásito la destrucción de células y 
tejidos del hospedero. 
En este trabajo se estudió la relación que guarda el proceso de 
secreción con la virulencia de los trofozoítos amibianos. Para 
ello, se utilizaron mutantes deficientes en virulencia como 
controles genéticos altamente específicos. Como marcador de 
secreción se eligió la proteasa neutra pincipal, debido a que es la 
única enzima proteolítica amibiana producto de secreción que 
ha sido purificada y caracterizada hasta el momento. Esta 
enzima, que también ha sido identificada en la fracción soluble 
de lisados de trofozoítos, es \Dl8 proteasa tiol-dependiente de 56 
kDa, con actividad óptima a pH neutro, que además esta invo-
lucrada en la virulencia de los trofozoítos, E. histolytica. 4•16 
Materiales y métodos 
Cultivos de trofozoítos. Los trofozoítos se cultivaron axénica-
mente a 37 °C en el medio TYI-S-33 descrito por Diamond y 
col.6 
Mutagénesis y selección de mutantes deficientes en fagocitosis. 
Trof07.0ítos de la clona A, en fase logarítmica de crecimiento, se 
incubaron con 20 ug/ml de 2-metoxi-6-cloro-9-(3-(etil-2-
cloroetil)aminopropilamino) dihidrocloruro de acridina (ICR-
170) (Polysciences, Inc.) a 37°C durante 24 h en la oscuridad. 
Después, las células se incubaron de 24 a 48 h en medio fresco 
para permitir la recuperación de las células y la segregación de 
las mutaciones. La selección de trofozoítos deficientes en fago-
citosis se realizó como se describió previamente. 7 
Adhesión, fagocitosis y efecto citopático. La adhesión, la fago-
citosis y el efecto citopático se midieron de acuerdo a los 
métodos antes descritos. 1 
Virulencia in vivo. 2.5 X 105 amibas se inocularon intraportal-
mente. en hámsten:s jóvenes anestesiados con 1 mi de Anestesal 
(Norden, México) diluído 1:10 por cada 100 g de peso. Ocho 
días después se registró el porcenteja de animales que presenta-
ron abscesos hepáticos. de acuerdo a la metodología descrita.' 
Preparación de secreciones y lisados de trofozoítos. Los trofo-
zoítos se ajustaron a 107 células/mi de PBS y se incubaron 3 h a 
37° C. Después, se incubaron 1 Ominen hielo y se centrifugaron 
5 mina 400 x g. El sobrenadante se pasó a través de un filtro con 
tamaño de poro de 0.45¡.un. A este material se le denominó 
secreciones amibianas.4 
La pastilla se resuspendió en PBS y se determinó la viabilidad de 
los trof07.0ítos por su capacidad para excluir el colorante azul de 
triplano. También se estimó la integridad de los trofozoítos 
midiendo la actividad de alcohol deshidrogenasa, tanto en las 
secreciones como en los lisados amibianos, utilizando etanol 
como sustrato.10 Las amibas se lisaron por tres ciclos de conge-
lación-descongelación, y el lisado se centrifugó a 12 000 rpm a 
4ºCpor10minen1U1amicrocentrífugaEppendorf.Elsobrena-
dante se pas6 a través de \Dl fütro con tamaño de poro de 0.45 ¡.un 
y este matarial se designó lisado amibiano. La cantidad de 
proteína se determinó por el metodo de Lowry y col.11 
Geles de poliacrilamida-gelatina. Las muestras de secreciones y 
de los lisados se analizaron bajo condiciones no reductoras por 
electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS al 10% (P AGE), 12 
copolimerizados con gelatina al 0.1 % (P AGE-gelatina).13 
Actividad p-oteolítica. La actividad de la preteasa neutra princi-
pal se determinó espectroflurométricamente, utilizando como 
susttato Boc-arginin-arginin-4-amino-7-metilcumarina (Z,-ARg-
ARg-AMC) (Enzyme System Products, Livermo, CA).4 
Pwificación de la proteasa neutral principal. La proteasaneutra 
.principal se purificó a partir del lisado de la clona T-42, en un 
sistema de cromatografía líquida rápida (FPLC, Pharmacia) 
como se describió antes.4 El Iisado se aplicó a 1U1a columna de 
filtración en gel (Superose 12) y se eluyó con N aCl 150 mM en 
solución amortiguadora de fosfatos 50 mM pH 7.4. Las fraccio-
nes que presentaron la mayor actividad proteolítica ~obre el 
susttato Z-Arg-ARg-AMC, se reunieron y se aplicaron a una 
columna de intercambio aniónico (Mono Q). Las proteínas se 
eluyeron con \Dl gradi~te lineal de NaCl en Tris-HCl 20 rnM pH 
7.5 y las fracciones con mayor actividad proteolítica sobre Z-
ZAg-Arg-AMC se reunieron y se dializaron toda la noche contra 
bis-Tris 25 mM, pH 7 .1. El dializado se aplicó a una columna de 
cromatoenfoque (Mono P). Las proteínas se eluyeron con Poly-
buffer74 (Pharmacia) al 10%pH 5. La actividad proteolíticade 
las fracciones se determinó como antes, sobre el sustrato ZArg-
Arg-AMC. El curso de la purificación de la proteasa se siguió 
porPAGE-gelatinayporPAGEbajocondicionesreductorasen 
geles teñidos con nitrato de plata. 14 
Resultados y discusión 
Obtención y caracterización de las clonas T42 y T63. Rodríguez 
y Orozco1 obtuvieron mutantes deficientes en fagocitosis utili-
zando como mutágeno etilmetanosulfonato (EMS), el cual 
produce mutaciones p1U1tuales que generalmente dan comoresultado proteínas alteradas. El ICR-170 induce mutaciones 
por corrimiento en el marco de lectura, las cuali:s pueden incluso 
provocar la ausencia de proteínas. Este efecto es importante 
cuando se pretende utilizar las mutantes como herramienta 
biológica para identificar y estudiar proteínas funcionales. Las 
mutantes T 42 y T 63 fueron deficientes en virulencia in vivo e 
in vitro. Los trofozoítos de las clonas T-42 y T-63 adhirieron 
HIDALGO Y COL.: SECRECION DE ENZIMAS PRO'IBOLITICAS 135 
CUADRO l. CARACI'ERIZACION DE MUTANTES 
DEFICIENTES EN FAGOCITOSIS 
Fag• Adh~ Ci~ Vir" 
Clona IOmin IOmin (%) (%) 
A HX>±3.6 100±4.7 100±9.7 100±6.5 
T-42 45±8.5 42± 1.7 57 ±7.1 14±9.0 
T-63 38±3.0 36±8.3 43±4.8 o 
a. lll', de eritrocitoc fagocitados por amiba a 37" C; b. lll', de erilroeitoc adherid01 por 
amiba a 4'C; c. 'llí de desuucci6n que monocapu celularca de la linea MDCH por 
IIOfozoitoc vivoc a 37" C; d. 'llí de húnsleft:I que damolluon abacaos hep'1ie01 
ochodla, ydespu6idehabersidoinoculad01 con 25 XI O'trofozait01. ±S.D-del-
viaci6n estándar de tres e,q,crimentoc independientes 
42% y 36% y fagocitaron el 45% y 38%, respectivamente, de los 
eritrocitos adheridos y fagocitados por los trofomítos de la clona 
silvestre (clona A) (Cuadro 1). Los trofozoítos de las clonas T-
42 y T-63 destruyeron 57% y 43% respectivamente, de las 
monocapas de células MOCK; mientras que los trofomítos de la 
clona A destruyeron, bajo las mismas condiciones, el 100% 
(Cuadro 1). En concordancili con las pruebas de virulencia in 
vitro, los trofozoítos de la clona T63 no produjeron abscesos 
hepáticos y los de la clona T42 produjeron abscesos sólo en el 
14% de los hámsteres inoculados (Cuadro 1). Estos resultados 
aportan una evidencia más de que la fagocitosis está involucrada 
en el mecanismo de agresión de E. histolytica, ya que las 
mutantes T42 y T63 que fueron seleccionadas por su deficiencia 
en fagocitosis, perdieron simuháneamente su virulencia in vivo 
einvitro. 
A 
3 4 5 M 
Kd 
66 --....69 
56 
45 40 
36 
29 ..,,.. 29 
24 25 
Y VIRULENCIA EN ENTAMOEBA HISTOLYTICA 
En este estudio se incluyeron también las mutantes deficientes 
en virulencia, clonas C9231y L-6, 7 deficientes en virulencia. En 
todos los experimentos con los mutantes se incluyó como 
control de la clona A.,7 altamente virulenta. 
Especies protcoliticas en secreciones y en lisados amibianos. 
Antes de caracterizar la actividad secretora de las mutantes, se 
estudió el patrón de especies proteolíticas producidas por los 
trofozoítos. Los Iisados de los trofozoítos se analizaron por 
PAGE-gelatin.a. los geles se tiñeron con azul de Coomassie y las 
especies capaces de degradar la gelatina se detectaron por la 
aparición de bandas blancas sobre el fondo azul. En todos los 
casos se detectó una banda principal de 56 kDa y otras bandas 
con menor intensidad de 76, 69, 40, 36, 28 y 25 kDa (Fig 1, A). 
En general, los trofomítos de las clonas mutantes presentaron el 
mismo patnn de especies proteolíticas (gelatinasas) que la clona 
silvestre, pero se ob_servaron diferencias notables en la intensi-
dad de las bandas. Los trofomítos de la mutante T &· presentaron 
bandos de actividad protcolítica con intensidades similares o 
mayores a las de la clona silvestre, mientras que las mutantes 
C923, L-6 y T 42 presentaron bandas con menor intensidad que 
las de la clona A. Estos resultados confirmaron las observacio-
nes de Keene y col4, quienes reportaron que en E. histolytica, la 
actividad proteolítica principal presenta un peso molecular entre 
50 y 70 kDa. Algunas de las otras especies proteolíticas que de-
tectamos, conrresponden probablemente a las proteasas de 66, 
56 40 y 27 kDa encontradas por Pérez-Montfort y col15 en el 
lisado de la cepa HMI :IMSS. 
Las proteútas secretadas por los trofozoítos también se analiza-
rón por PAGE-gelatina. Las secreciones dc'los trofozoítos de 
todas las clones presentaron varias bandas de actividad proteo-
lítica: una banda principal de56 kDa y otras tres minoritarias de 
69, 36 y 28 kDa (Fig 1,B). Las secreciones de los trofozoítos 
mutantes presentaron el mismo patron de especies proteolíticas 
B 
3 
66 
4 5 
4 M 
76 
69 
56 
28 
Fipnl Eapocia pte(lleoliticu en eallaClol y e IIOCnlci011111 de E. H,atolytica. Socleci011111 y eatnclal unan-• analizuua «n ¡ela deo poliacrilamida-SDS ~ 
IO'I. copolimerizad01 con 1elatin1 al 0.1 'llí A: 0.5 µ1 de lisado. B: 1 ul de leC!eCionea. Curila M: man:adora de P.M.; Canila 1: clona A; Carrila 2: C· 
23; Canila 3: 1,6; Carrila 4: T-42; Canila S: T ~-
136 ARCHIVOS DE INVESTIGACION MEDICA (MEXICO), VOLUMEN 21 No. 1, 1990 
(gelatinas as) que la clona silvestre, pero hubo diferencias nota-
bles en la intensidad de las bandas. Los trofozoítos de los 
mutantes T -42 y T -63 presentaron bandas aparentemente igua-
les en intensidad a las de la clona silvestre, mientras que las 
muantes C-23 y L-6 presentaron bandas con menor intensidad. 
Estos resultados sugieren que los trofozoítos de las clonas C-23 
y L-6 no secretaron eficientemente las proteasas, o bien, las 
proteasas secretadas tienen la menor actividad sobre la gelatina. 
Con el fin de determinar si las mutantes deficientes en virulencia 
estaban alteradas a nivel de la secreción de enzimas proteolíti-
cas, estudiamos su capacidad para producir y secretar la proteasa 
neutra principal, la única proteasa amibiana producto de secre-
ción, que hasta el momento, ha sido purificada a homogeneidad 
y caracterizada. 
Actividad secretora de los trofozoítos deficientes en virulencia. 
La actividad de la proteasa neutra principal se midió en las 
secreciones y en el lisado de los trofozoítos utilizando Z-Arg-
Arg-AMC como sustrato. La actividad de la proteasa en los 
lisados de las mutantes C923, fue de 203%, la de T-42 fue de 
286% y la de T-63 196%, con respecto a la clona A que se tomó 
como 100%. Mientras que, la actividad proteolíticaen el lisado 
de la clona L-6, fue el 58% del de la clona A (Cuadro m. Al medir 
la actividad de la proteasaneutra principal en las secreciones se 
encontraron diferencias importantes en la cantidad de enzima 
secretada por las mutantes con respecto a la dona silvestre. Los 
trofozoítos de las mutantes C-23, L-6, T-42 y T63 secretaron 
33%, 11 % 61 % y 72% respectivamente, de la actividad proteo-
lítica que secretó la clona silvestre (Cuadro m. Por otra parte, al 
calcular la producción total, que es la suma de actividad de la 
proteasa en las secreciones con la actividad proteolítica del 
lisado, se encontró que todas las mutantes, excepto la clona L-
6, produjeron eficientemente la proteasa, aunque todas secreta-
ron menor cantidad de la proteasa que la clona A ( cuadro 11). 
Estos resultados fueron sorprendentes, ya que dado el bajo nivel 
de destrucción de las monocapas celulares por los trofozoítos de 
las clonas C923, T-42 y T63 y dada la relación directa que la 
CUADROII ACTIVIDAD DE LA PROIBASA 
NEUI'RAPRINCIPAL ENCLONASDE 
E. histolytica DEFICIEN1ES EN 
VIRULENCIA 
Actividad proteolítica• 
Clona Secreción Lisado Total %Secretado 
A 18± 1.2 29±3,2 47 ±2.1 38±3,3 
C-23 6±0,8 59±6,2 65±7,4 9±0,8 
L-6 2±0,6 17 ±2,1 19±2,9 10±2,4 
T-42 11 ± 1.5 83±9.1 94±9,7 12±2.3 
T-63 13±0,4 57±7,0 70±9,1 18±3,7 
• (umoles de sustnto hidrolizado,'min/1 O" trofozoílOI) 
La actividad de la proleaaa neutra principal IC detaminó en secreciones y en 
liaadol unibianm utilizando Z-Arg-Arg-AMC como llllllnto. El inc:mnentoen 
ta fluoraccncia debida a ta hidr6liail del sustrato ae registró a longitudes de onda 
de emisión y ablon:i6n de 480 nm y 360 nm, respectivamcnie. ± S.D. • 
desviación es~ar de 1res experimenlOI independientes. 
actividad proteolítica guarda con la virulencia amibiana,14 se 
esperaba encontrar un bajo nivel de actividad de proteasa neutra 
principal en las mutantes. Sin embargo, se encontró que los 
trofozoítos mutantes son deficientes en la secreción de esta 
proteasa independientemente de la cantidad que de ella produ-
cen. Las mutantes C923, L-6, T-42 y T-63secretan sólo 9%, 
10%, 12% y 18%., respectivamente, de la actividad total produ-
cida, mientras que la clona silvestre secretó el 38% de la 
actividad total ( cuadro 11). 
Las clonas T-42 y T-63 mostraron cambios en sus fenotipos. 
Originalmente estas clonas fueron deficientes en adhesión, 
fagocitosis y efecto citopático, pero no se hicieron ensayos de 
actividad proteolítica. En los estudios actuales, ambas mostra-
ron expresión variable de proteasa y expresión variable de efecto 
citopatico. Fue notable la observación que cuando T-42 o T-43 
expresaron niveles superiores de proteasa que la clona A, ellas 
produjeron significativamente más efecto citopático.14 
Como control de integridad de los trofozoítos durante el expe-
rimento de secreción, se utilizócomomarcadorcitoplásmico la 
enzima alcohol deshidrogenasaNADP-dependiente. La activi-
dad de esta enzima se midió al fmal del tiempo de incubación, 
tanto en las secreciones como en los lisados y fue de 25 a 145 
veces mayor en los lisados que en las secreciones (Cuadro III), 
indicando un alto índice de integridad de las amibas. Además, 
más del 90% de los trofozoítos excluyeron el azul de tripano 
después de la incubación en PBS. 
Purificación de la proteasa neutra principal. Para comprobar que 
la actividad proteolítica detectada en las mutantes sobre el 
sustrato Z-Arg-ARg-AMC correspondía realmente a la proteasa 
neutra principal, se purificó la enzima a partir de la mutante 
hiperproductora deficiente en· secreción T42 de acuerdo a la 
metodología antes descrita.4 Los lisados se pasaron por una 
columna de filtración en gel, después por una columna de 
intercambio aniónico y finalmente por una columna de croma-
toenfoque. La fracción de la última columna con mayor activi-
dad sobre el sustrato Z-Arg-Arg-AMC, mostró una sola banda 
de actividad de 56 kDa en PAGE-gelatina (Fig 2, A) y sólo un 
péptido en PAGE bajo ·condiciones reductoras (Fig 2, B); 
CUADRO III ACTIVIDAD DE LA ALCOHOL 
DESHIDROOENASA EN E. histolytica 
Actividad específica• 
Clona Secreción Lisado 
A 0.046 ±0,05 6.7 ±0,08 
C,23 0.087 ±0,06 5.1 ±0,07 
L-6 0.125 ±0,07 2,9±0.46 
T-42 0.123 ±0,05 6,5±0,06 
T-63 0.1110±0,09 6,5±0,5 
• (umoles de NADPH formado/min/mg de procdna). 
La actividad de ta enzima alcohol deahidrogenua se determinó en secreciones 
y lisados unibianou 251 C, utilizando e1anol como sus1rato. La actividad espe-
cífica ae estimó a partir de la velocidad de aparición de NADPH, registrada como 
el inc:mncnto en la ablorblncia a 340 nm con resl!CC1D al tiempo.± S.D . ., 
desviación estándud de dol experimenlOI independientes. 
HIDALGO YCOL.: SECRECIONDBENZIMAS PROTEOLffiCAS 137 
Y VIRULBNCIA BN BNTAMOEBA IDSTOL YTICA 
A e 
M l 2 3 4 5 6 Kd 2 3 4 5 6 M 
92.5 
66 
56 
45 
-
fiaun2 Pwific:ac:imdela,-aa-1raprincipaLLapmieaa-1pnncipdaepwific6apatirdelliadodelaclanaT-42,paáncloloporunacolumnaclefiltraci6n 
m ¡el (Supemae-12), dapu6a por una oolumna ele intcn:ambio ani6nico (Mono Q) y por una columna de c:mmatoenfoque (Mono P) como ae indicó en 
Matcrialcl y M61odm. Lu fraccionaa ae ana1izuat por PAGB-¡clatina (A), y par PAGB en candicionaa mluc:ICrU tiilimdo 1m aclaa ccn plata (B). Curilca 
M; mm:adonll de P.M.; Curi1m 1: material de imcio; Curilca 2: pico de actividad Supeaua.12: Canilea 3: pico de actividad Mano Q: Carrilca 4: pico de 
actividad Mono P; Cam1aa 5 y 6: una fracci6n antaa y una daapu61 del pico de actividad Mano P, noapecti.:,amente. 
mostrando que la proteína responsable de la hidrólisis del 
sustrato r.,pecífico Z.Arg-Arg-AMC tiene el mismo peso mole-
cular que la proteasa neutra principal descrita por Keene y col. 4 
De acuerdo a los resultados presentados en este trabajo, las 
mutantes C923, L-6, T-42 y T-63 deficientes en virulencia 
fueron también deficientes en secreción, lo que sugiere fuerte-
mente que la secreción de sustancias líticas, en particular de la 
protcasa neutra principal, es un evento relevante en la expresión 
de la virulencia amibiana. Sin embargo, en base a los resultados 
de nuestro gurpo y ocros grupos esta claro que la virulencia de E. 
histolytica es un proceso multifactorial en el que participan de 
manera importante varias mol&:ulas como la adhesina de 112 
lcDa.17 
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