LA_BIOLOGIA_MOLECULAR_Y_EL_ADN_MOLECULAR

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RESUMEN
El presente Artículo es una descripción de los aspectos más importantes
que se conocen del ADN desde que Watson y Crick presentaron su modelo
estructural y de la simultánea evolucion de la biología molecular, aspectos
que han permitido conocer el comportamiento de esta molécula tan esen-
cial para la vida y cómo ella ha servido para resolver problemas en diferentes
campos como el de la crimi-nalistica y en estudios de diversidad genética
especialmente a partir del decubrimiento de las enzimas de restricción y los
denominados marcadores moleculares, la PCR (Reacción en Cadena de la
Polimerasa) y otras técnicas basadas en ella, las cuales emplean el concepto
de ADN polimorfico.
ABSTRACT
This article is a description of the most important aspects that are known of
the DNA since Watson and Crick presented its structural model and of the
simultaneously evolution of the molecular biology, aspects that have allowed
to know the behavior of this molecule so essential for the life and how she
has been good to solve problems in different fields like that of the judicial
camp and in studies of genetic diversity especially since the discovery of
the restriction enzymes and the denominated molecular markers, the PCR
(Polimerase Chain Reaction) and other techniques based on her, which use
the concept of polimorphic DNA.
____________
Recibido para evaluación: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicación: 27 de febrero de 2004.
1 MSc., Especialista en Biotecnología, Profesor Asociado Departamento de Agroindustria,
Grupo de Investigación ASUBAGROIN FCA Unicauca
Correspondencia: Reinaldo Velasco Mosquera. , e_mail: rvelasco@unicauca.edu.co
LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y EL ADN
MOLECULAR BIOLOGY AND THE DNA
REINALDO VELASCO MOSQUERA1
PALABRAS CLAVE:
ADN, enzimas de restricción, mar-
cadores moleculares, PCR, diver-
sidad genética.
KEY WORDS:
DNA, restriction enzymes, mole-
cular markers, PCR, genetic
diversity.
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INTRODUCCION
La Biología molecular es la ciencia que se ocupa del
estudio de las bases moleculares de la vida; es decir,
relaciona las estructuras de las biomoléculas con las
funciones específicas que desempeñan en la célula y
en el organismo. Por tanto su objetivo fundamental es la
comprensión de todos aquellos procesos celulares que
contribuyen a que la información genética se transmita
eficientemente de unos seres a otros y se exprese en los
nuevos individuos. Para ello requiere de la secuenciación
de los ácidos nucleicos, del diagnóstico molecular, de la
producción de fragmentos de ácidos nucleicos a gran
escala, entre otras disciplinas (1).
EL ADN
La presentación del modelo estructural del ácido
desoxirribonucleico (ADN) por Francis Harry Comton
Crick y James Dewey Watson en 1953, fue el verdade-
ro inicio de la biología molecular. La importancia de
este hecho se debe, por un lado a que es la molécula
que transmite la información hereditaria de generación
en generación, y por otro a que la propia estructura
muestra cómo lo logra.
La química de la molécula de ADN tiende a ser más
bien simple, considerando la enorme cantidad de in-
formación almacenada y su misión trascendental en la
célula. Es una molécula de doble cadena de nu-
cleótidos, arreglados en forma antiparalela y comple-
mentaria, unidas entre sí por puentes de hidrógeno
entre los nucleótidos: adenina (A), guanina (G), citosina
(C) y timina (T). La A de una cadena se aparea siempre
con la T de la cadena complementaria mediante dos enla-
ces de hidrógeno, y la G con la C mediante tres enlaces de
hidrógeno. Los puentes de hidrógeno ocurren entre un
átomo de hidrógeno enlazado con un átomo
electronegativo (O, C, N) y un segundo átomo
electronegativo. Los puentes de hidrógeno tienen una
energía de estabilización de 10-30 kJ/mol (2).
Durante la replicación o duplicación, las dos hebras
simples se separan y cada una de ellas forma una nue-
va hebra complementaria, incorporando bases, la A se
unirá a la T de la hebra molde, la G lo hará con la C y así
sucesivamente. De esta manera se obtiene otra molé-
cula de ADN, idéntica a la original y por tanto, el mate-
rial genético se ha duplicado. Este material incluye toda
la información necesaria para el control de las funcio-
nes vitales de las células y del organismo.
Durante la división celular, las dos células hijas reci-
ben igual dotación genética; de este mismo modo se
reparte el material hereditario a la descendencia, cuando
se reproduce un organismo.
Cada nucleótido está formado por una molécula de
azúcar desoxirribosa (no posee O en el sitio 2�, única-
mente un H), una base orgánica nitrogenada
(pirimidinas, como en el caso de la citosina y la timina,
o purinas, como en el caso de la adenina y la guanina)
y un grupo fosfato.
Los nucleótidos se enlazan entre sí por enlaces
covalentes fosfodiester entre el grupo fosfato ubicado
en el sitio 5� con el grupo OH ubicado en el sitio 3� del
nucleótido anterior. El enlace covalente es una unión
en la cual dos electrones son compartidos por dos
átomos. En este tipo de enlace, cada electrón del par
compartido es atraído por los núcleos involucrados
en el enlace, lo cual hace que sea un enlace muy fuer-
te, que dependiendo del tipo de átomos involucrados
puede tener una energía desde los 263 kJ/mol para un
enlace C-P hasta 460 kJ/mol para un enlace O-H (2).
Esto hace que la molécula de ADN sea particularmente
estable en condiciones tanto intra como extracelulares.
Los enlaces covalentes que unen a cada subunidad de
nucleótido son químicamente estables y no son sus-
ceptibles de experimentar ruptura hidrolítica en el me-
dio acuoso de la célula. Esto establece una forma se-
gura y duradera de almacenamiento de la información
genética, que no debe alterarse ni dañarse de genera-
ción en generación. Es por esta razón que se ha extraí-
do ADN de especimenes de museo y muestras arqueo-
lógicas de varios millones de años (3).
La cadena orientada en el sentido 5� � 3� recibe el nom-
bre de codificante porque es la que tiene la informa-
ción y la cadena antiparalela que va en el sentido 3� �
5� el de cadena molde, porque es en esta cadena en la
que se hibridiza el ARN. Una vez terminada una cade-
na, en el extremo 5� queda un grupo fosfato y en el
extremo 3� un grupo OH.
Esta disposición lleva las bases orgánicas al interior
de la doble hélice. Las bases adyacentes de la misma
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hebra se apilan unas sobre otras (como peldaños de
una escalera en espiral), esto permite la formación de
interacciones hidrofóbicas, en las que la presencia de
agua obliga a los grupos no polares a distribuirse or-
denadamente para evitarla, las cuales tienen una ener-
gía de estabilización de 5-30 kJ/mol, e interacciones
de van der Waals, formadas entre moléculas con
dipolos transitorios inducidos por fluctuación de elec-
trones, ocurriendo entre cualquier par de átomos que
esten muy cercanos, estas ultimas tienen una energía
de stabilización de 1-5 kJ/mol (2).
El lenguaje empleado para almacenar la información en
el ADN consiste en el alfabeto de las cuatro letras: A, T,
G y C. El formato para almacenarla es una secuencia
lineal de los nucleótidos en ADN que varía en tamaño y
secuencia con cada especie. Por ejemplo, el genoma
humano completo tiene 1 metro de longitud y contiene
un número estimado de 3 mil millones de pares de
nucleótidos. Una molécula de ADN de E. Coli mide cer-
ca de 2 cm de largo y contiene alrededor de 4 millones
de pares de nucleótidos.
LA BIOLOGIA MOLECULAR
Podría parecer que purificar moléculas de ADN es tarea
fácil, sin embargo en la práctica es bien difícil conse-
guir una molécula bien definida de ADN natural de cual-
quier organismo, excepto los virus más simples. Esto
se debe a la gran complejidad que presenta esta molé-
cula, la cual como ya se dijo es una cadena compuesta
de desoxinucleótidos normalmente apareada con otra
cadena con secuencias complementarias formando hé-
lices dobles,las cuales a su vez están enrolladas y ro-
deadas de proteínas diversas (4).
Cuando los biólogos moleculares intentan aislar una
cadena de ADN desnuda, esta es tan larga y delgada
que se rompe aleatoriamente en múltiples pedazos has-
ta con el tratamiento más suave. Por esta razón la extrac-
ción de ADN que se haga de múltiples células idénticas,
así mismo producirá múltiples copias de cualquiera de
los genes de dicho ADN, pero cada copia se hallará en
un fragmento de distinta longitud.
Durante muchos años este problema fue un obstácu-
lo para el estudio de los genes. En los años sesenta
se descubrieron las restrictasas (endonucleasas de
restricción), enzimas que cortan las cadenas de ADN
en sitios específicos, permitiendo cortar el ADN en
fragmentos menores, más consistentes e identifica-
bles, por lo cual es más fácil aislar los fragmentos
que por tan el gen que interesa a los biólogos
moleculares (4).
Aunque la Ciencia poseía las herramientas necesarias
para el estudio del ADN, su aplicación en la resolución
de casos judiciales solo se produjo hasta 1985, cuando
el Ministerio del Interior Británico solicitó la ayuda de
Alec J. Jeffreys, profesor de Genética de la Universidad
de Leicester. Los primeros casos de Criminalística fue-
ron resueltos gracias a la técnica de los RFLPs
(Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de res-
tricción). Jeffreys descubrió la existencia de unas re-
giones minisatélites hipervariables dispersas por el
genoma humano que al ser tratadas con enzimas de
restricción generaban fragmentos de longitud variable.
Estudios posteriores realizados por el mismo Jeffreys
demostraron que las diferencias en el tamaño de estos
fragmentos se debían a que estas regiones consistían
en un determinado número de repeticiones en tándem
de una secuencia central, la cual variaba de unos indivi-
duos a otros (1).
El primer locus de ADN polimórfico fue descubierto por
Wyman y White en 1980 usando una sonda de ADN
arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de
más de 15 longitudes diferentes en una pequeña mues-
tra de individuos. Posteriormente se encontraron otros
loci hipervariables como en la secuencia del gen de la
insulina humana, en el oncogen �ras�, en el pseudo
gen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina.
Estos loci hipervariables constaban de repeticiones en
tándem de una secuencia de oligonucleótidos (11 a 60
pb), de manera que las diferentes longitudes de los frag-
mentos originados dependían del número de dichas
repeticiones y se les denominó VNTR (�Variable Number
of Tandem Repeat�).
Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se ob-
servó que éstos podían ser aplicados a la medicina
forense y sustituir a los marcadores clásicos, que con-
sistían en el estudio de antígenos eritrocitarios (sistema
ABO, Rh, MN), proteínas séricas, enzimas eritrocitarias
y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores
podía incluirse o excluirse una persona como posible
sospechoso por poseer una combinación genética igual
o diferente a la del vestigio biológico hallado en el lugar
de los hechos.
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En un principio la manera de estudiar los marcadores
VNTRs se hizo por medio de la técnica llamada hibrida-
ción con sondas o Southern blot. Esta técnica consta
básicamente de las siguientes etapas (1):
1. Digestión del ADN con enzimas de restricción tras
conseguir extraer un ADN de alta molecularidad.
2. Separación de los fragmentos obtenidos por me-
dio de una electroforesis en gel de agarosa.
3. Desnaturalización de los fragmentos separados y
cortados.
4. Transferencia de las cadenas simples a una mem-
brana de nitrocelulosa o nylon y fijación de las
mismas por medio de calor (80ºC).
5. Prehibridación con sondas de ADN inespecífico
para bloquear los lugares de unión inespecíficos
que pudiera haber en la membrana.
6. Marcaje de la sonda con nucleótidos radioactivos
(32P normalmente).
7. Hibridación de la sonda marcada y desnaturaliza-
da con los fragmentos de ADN fijados a la mem-
brana, y lavado de la membrana para eliminar el
exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado
mal.
8. Revelado en placa radiográfica e interpretación de
los resultados.
Las sondas utilizadas pueden ser de dos tipos:
� Sondas Mono-locus (SLP): son específicas para
una región de un determinado cromosoma. Se
unen a secuencias largas de nucleótidos y pre-
sentan mayor variabilidad que las sondas multi-
locus. Como resultado se observan una o dos
bandas por individuo, según sea homocigoto o
heterocigoto. El patrón de bandas obtenido con
estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN
o �DNA profiling�
� Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuen-
cias minisatélites presentes en varios loci de dife-
rentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15
nucleótidos que se repiten múltiples veces y tras el
revelado se observan de 10 a 20 bandas por
persona. Este patrón de múltiples bandas se co-
noce como huella genética multilocus o �DNA
fingerprint�.
Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de
ventajas e inconvenientes con respecto a una serie de
parámetros como son:
Información aportada: las sondas multi-locus tienen una
mayor capacidad discriminativa al aparecer múltiples
bandas. No obstante, las mono-locus son más especí-
ficas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es
de mayor tamaño.
Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas
multi-locus se requiere aproximadamente un
microgramo de ADN sin degradar mientras que en el
caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y
este ADN no necesariamente debe estar en perfecto es-
tado, siempre y cuando el fragmento complementario a
la sonda esté intacto.
Especificidad entre especies: las sondas multi-locus
permiten su uso sobre el ADN humano y de cientos de
animales superiores, mientras que las mono-locus son
exclusivas de una especie, se ha utilizado con frecuen-
cia en humano.
 A pesar de que el análisis SLP ha sido y es bastante
útil en estudios de paternidad no puede decirse lo mis-
mo de su aplicación a la Criminalística ya que presenta
una serie de inconvenientes como son:
� La cantidad de ADN que se necesita está entre 20 y
100 ng, cantidad difícil de conseguir en casos de
criminalística en los que los indicios biológicos
encontrados son mínimos.
� En cuanto a la calidad del ADN, en la práctica
forense es muy difícil encontrar en estado no de-
gradado toda la cantidad de ADN que se necesita
para un análisis con sondas mono-locus.
� El tiempo requerido para este tipo de análisis es de
dos o tres días.
� El hecho de que se requieran cantidades elevadas
de ADN hace que normalmente, con el primer aná-
lisis se consuma la totalidad de la muestra, con lo
que se dificultan contra pericias y una posterior
revisión del caso.
LA PCR
Kary B. Mullis, quien trabajaba desde 1979 en Cetus
Corporation, de Emeryville, California, dice que: �sa-
bía que una técnica que permitiese fácilmente identifi-
car el nucleótido presente en una posición determina-
da de una molécula de ADN sería muy útil, sobre todo
en los casos de gran complejidad del ADN y con pe-
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queña cantidad disponible de esta molécula. No veía
por qué no se podía utilizar la enzima polimerasa de
ADN en una variante del método de secuenciación con
ddNTPs y diseñé un cándido experimento para some-
ter esa idea a comprobación. Pasaron meses mientras
preparaba mi primer experimento para comprobar si la
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) funciona-
ba. Cuando estuvo todo listo, acometí mi tipo favorito
de experimento: el que sólo necesita un tubo de ensa-
yo y en el que la respuesta es positiva o negativa. ¿Mul-
tiplicaría la PCR la secuencia de ADN seleccionada? La
respuesta fue sí� (4).
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se
volvió rápidamente una de las técnicas más am-
pliamente usadas en biología molecular por una
buena razón: es rápida, es un medio relativamente
barato y simple de producir cantidades relativamen-te grandes de copias de ADN a par tir de cantidades
muy pequeñas de moléculas de material de ADN,
incluso si la fuente de ADN es de relativamente
pobre calidad.
Las técnicas basadas en PCR emplean el concepto
de polimorfismo o de ADN polimorfico: «poli» =
«muchas»; «mórfico» = formas. Y se refiere a que
existen secuencias de ADN que son relativamente
variables entre diferentes individuos o especies.
Algunas regiones de ADN dentro de un genoma pue-
den ser sumamente conservados (no variar) entre
los individuos de una especie o entre especies de
una misma familia. Ese ADN conservado no será
útil para la utilización de métodos analíticos que
emplean el ADN para encontrar diferencias entre los
individuos.
Alternativamente, algunos de los intervalos de ADN
dentro del genoma tienden a variar moderada o ex-
tremadamente entre los individuos. Estos interva-
los variables de ADN serán más informativos al usar
el ADN para distinguir a los individuos uno de otro
o para distinguir las especies una de otra.
APLICACIONES
La identificación con ADN o �huella genética� se basa
en el estudio de una serie de fragmentos de ADN pre-
sentes en todos los individuos, pero que poseen la
caracter íst ica de ser al tamente var iables o
polimórficos entre los mismos.
El análisis de un determinado número de estas se-
cuencias o fragmentos de ADN permite inclusive iden-
tificar a un ser humano con una probabilidad muy
cercana al 100%. Además de ser muy poli-mórfico,
el ADN que se utiliza para este tipo de identificacio-
nes, es un ADN no codificante o no expresivo, por lo
que no revela características feno-típicas de los indi-
viduos; este hecho es de gran importancia a la hora
de considerar la creación de las bases de datos
genéticas (5).
Para analizar dichos polimorfismos del ADN se utili-
zan una serie de técnicas que están en continua evo-
lución, consiguiendo que cada vez la identificación
por medio del ADN sea más precisa y rápida.
Se parte entonces de unas regiones del ADN que pre-
sentan variabilidad entre los distintos individuos, es
decir, de regiones polimórficas del ADN. Así, anali-
zando un determinado número de regiones
polimórficas, la probabilidad de que dos individuos
sean genéticamente iguales es prácticamente nula
(excepto en el caso de gemelos univitelinos).
El estudio de indicios biológicos por PCR ha permiti-
do la resolución de un gran número de casos en
Criminalística que hasta entonces eran desestimados
por no poseer la suficiente cantidad de muestra para
su análisis por RFLP. Con el uso de la PCR muestras
tan mínimas como pueden ser un pelo con raíz, una
minúscula mancha de sangre o semen e incluso cas-
pa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo
un análisis de identificación genética (1).
En estudios de diversidad genética se emplean tanto
la PCR como una serie de técnicas basadas en ella.
Hoy en día estas técnicas son muy empleadas, no
obstante no hay una comprensión adecuada de los
principios que rigen estas técnicas, ni el papel que
desempeñan los reactivos químicos empleados en
su ejecución. En un próximo ar tículo se presentará
una revisión bibliográfica acompañada de un análi-
sis teórico de lo biológico, lo químico y las probabi-
lidades, para compendiar esta información que está
diseminada en diferentes textos y artículos científicos.
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