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Fundamentación de la biología molecular Biología Molecular en acción: Oportunidades de diagnóstico molecular para el cáncer Osvaldo Martinez Hernández A01235881 INA Mtra. Bertha Olivia de la Re Dávila Campus Monterrey 08/09/2020 IDENTIFICACIÓN DEL PATÓGENO RELACIONADO CON EL CaCu El cáncer cervicouterino (CaCu), es la principal causa de muertes de mujeres en países subdesarrollados y la segunda causa de muerte en la mujer a nivel mundial. Su aparición está directamente relacionada con lesiones cervicales preinvasores (cancerígenos). Por esto es muy importante la detección temprana además de realizar el tratamiento adecuado a las etapas de avance en las que se encuentra, para lograr la disminución de muertes por este tipo de tumor. Una de las causas de aparición del CaCu está relacionada con un patógeno llamado virus del papiloma humano (VPH). Los papilomavirus comprenden un grupo de virus pequeños, no envueltos con genoma de ADN de doble cadena, los cuales tienen afinidad por el tejido epitelial (Santos, 2015). Las células donde se llevan a cabo la síntesis de nuevas partículas virales son las células epiteliales escamosas. El ciclo replicativo del VPH se divide comúnmente en dos etapas, denominadas temprana y tardía, ligadas a el estado de diferenciación de la célula presente en el tejido. Diagrama del genoma del virus de papiloma humano tipo 16. Se trata de un genoma de doble cadena circularizado de 7904 pares de bases. Se señalan los promotores PE y PL, para la expresión de los genes tempranos y tardíos, respectivamente, así como de los elementos PAE y PAL, que son señales de poliadenilación para los genes tempranos y tardíos, respectivamente. En la parte superior se observa una amplificación de la región larga de control (LCR) con diferentes elementos de respuesta a factores de transcripción virales y celulares. Figura tomada y modificada de Doorbar et al. http://revistamedica.imss.gob.mx/editorial/index.php/revista_medica/rt/printerFriendly/184/522 El virus necesita infectar los queratinocitos basales, además de que tiene que haber células con actividad mitótica. La introducción de los viriones en la célula es iniciada por la interacción de la proteína L1 con heparán-sulfato y sindecano 3 en la superficie celular (Márquez, 2015). La mayoría de los VPH invade a la célula por medio de la endocitosis, también durante la endosoma ocurre el desnudamiento del virión y la salida del genoma viral, que después migra al núcleo junto con la proteína L2. Una vez que lo hace el genoma se transcribe; las proteínas E1 y E2 son las primeras en expresarse y se mantienen entre 20 y 100 copias por célula, que también contribuyen en conjunto a las proteínas E5, E6 y E7 al incremento de células que se pueden infectar, esto se traduce a una mayor producción viral. También el gen E4 amplifica la replicación del genoma viral, lo que causa que se incrementen el número de copias del genoma. http://revistamedica.imss.gob.mx/editorial/index.php/revista_medica/rt/printerFriendly/184/522 Dentro de las funciones del VPH tardío, se encuentran la síntesis del ADN viral y la encapsulación del genoma; se sabe que estas ocurren solo en queratinocitos diferenciados. Cuando el genoma viral se integra al genoma celular se pierde la síntesis de la proteína E2 provocando que las proteínas E6 y E7 se incrementen y transformen la célula, haciéndola susceptible a la aparición del cáncer. Algunas de las técnicas para identificar el patógeno relacionado con el CaCu son: Captura de híbridos La prueba de captura de híbridos se basa en la hibridación de ácidos nucleicos para su detección y amplificación mediante quimioluminiscencia utilizando sondas de VPH. Fue aprobada por la administración de medicamentos y alimentos (FDA) para detectar el virus del papiloma humano (VPH) en una etapa temprana. El proceso de lleva acabo introduciendo un cepillo especial en la vía endocervical, posteriormente se pone en un tubo para ser llevado a un laboratorio donde se expone el material genético mediante una solución desnaturalizante, después se analizan los tipos de VPH oncogénicos dentro de las sondas de ARN; cuando exista una presencia de alguno de estos, se forma una hibrido ADN viral-ARN expuesto a causa de una emisión luminosa. Por último, cuando se da una emisión de luz significa que la prueba es positiva. Aunque es una prueba efectiva, no es posible saber qué tipo de VPH posees y el resultado solo es cualitativo; si alguna paciente sale negativa en esta prueba la probabilidad de contraer esta enfermedad en los próximos cinco años es cero. Metodología de las pruebas de detección de VPH. https://www.elsevier.es/en-revista-medicina-universitaria-304-articulo-biologia-del- virus-del-papiloma-X1665579610901659 APTIMA HPV Assay La prueba de APTIMA HPV Assay se basa en la amplificación de los genes oncogénicos E6 y E7 provenientes del VPH mediante una sonda de ácidos nucleicos. Esta fue creada con el fin de desarrollarse en 2 diferentes sistemas, uno automatizado y el otro semiautomatizado (TIGRIS DTS y DTS respectivamente). https://www.elsevier.es/en-revista-medicina-universitaria-304-articulo-biologia-del-virus-del-papiloma-X1665579610901659 https://www.elsevier.es/en-revista-medicina-universitaria-304-articulo-biologia-del-virus-del-papiloma-X1665579610901659 El primer paso para realizar la prueba es capturar la diana, después se amplifica mediante la transcripción y finalmente es detectada por un ensayo de protección de hibridación; el ensayo tiene un control por dentro que vaya supervisando todo para evitar posibles errores. Las enzimas usadas en la amplificación del ARN son la Polimerasa T7 y la Transcriptasa inversa MMLV, esta última se utiliza para copiar el ADN desde el ARNm de diana, obteniendo así la secuencia que después utiliza la polimerasa T7 para generar copias del ADN inicial. El ensayo de ARNm del VPH Aptima identifica la presencia y actividad de infecciones por VPH de alto riesgo, lo que le permite identificar y concentrarse en aquellas mujeres que más necesitan su atención. https://www.questdiagnostics.com/home/physicians/testing- services/condition/womens-health/cervical-cancer/co-testing-solutions/ Esta prueba es muy viable para su aplicación en las mujeres mexicanas porque detecta el VPH entre las fases CIN 1 y CIN 3, la ventaja que tiene dicha prueba es que dentro de la etapificación del CaCu es detectable en cualquier etapa. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La técnica de reacción en cadena de la polimerasa, mejor conocida como PCR se basa en detectar el oncogénico especifico del VPH. Dicha técnica de laboratorio es una de las más utilizadas en la biología molecular para la detección temprana del VPH, un beneficio de tomar esta prueba es que detecta la presencia de VPH incluso antes de que se presenten síntomas. Las tres fases de la técnica son la desnaturalización, el alineamiento y la polimerización. Estas se encargan de sintetizar un fragmento de ADN varias veces mediante la Polimerasa Taq, se simula la síntesis de ADN con ayuda de primers que amplifican una parte del gen L1, después de esto se detecta la presencia de VPH. https://www.questdiagnostics.com/home/physicians/testing-services/condition/womens-health/cervical-cancer/co-testing-solutions/ https://www.questdiagnostics.com/home/physicians/testing-services/condition/womens-health/cervical-cancer/co-testing-solutions/ Deteccion y genotipificación del VPH por PCR en muestras cervicales. http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342015000300015 Para realizar esta prueba se necesitan espacios, equipos y personal calificado para crear un análisis efectivo de las pruebas, esta técnica es muy efectiva porque puede detectarinfecciones múltiples relacionadas con el VPH de una forma sensible. Es importante que las mujeres mexicanas se hagan cualquier tipo de prueba mencionada anteriormente para prevenir el desarrollo del CaCu y que después pueda ser muy tarde para erradicarlo. Proceso del diagnóstico del VPH mediante PCR. https://es.slideshare.net/erwinchiquete/erwin-vph-genmica-protemica-y-dx http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1726-46342015000300015 https://es.slideshare.net/erwinchiquete/erwin-vph-genmica-protemica-y-dx IDENTIFICACIÓN DEL PATÓGENO EN INFECCIÓN ACTIVA Una infección activa es el proceso mediante el cual el VPH lleva a cabo la replicación del ADN, la transcripción del ARN y la traducción de las proteínas, formando viriones que infectan las capas epiteliales de la superficie. Fouéré menciona que una de las características mas importantes del VPH es que cuando penetra las células basales epiteliales el genoma permanece como episoma en su núcleo, haciendo que el ADN viral empiece a duplicarse, transcribirse y traducirse comenzando así la infección. Dentro del ciclo replicativo del virus los primeros genes en expresarse son el E1 y E2 mientras que los oncogenes E5, E6 y E7 son los últimos, estos oncogenes son las principales causales de riesgo para el desarrollo del CaCu porque impiden que las células realicen sus funciones. Algunas de las técnicas para identificar el patógeno en infección activa son: Detección serológica La técnica de detección serológica se basa en analizar las moléculas y detectar la presencia de algún patógeno conociendo así su actividad. Existe una versión en la cual se puede realizar la técnica de manera automatizada, reduciendo el tiempo de espera y de datos erróneos. Existen diferentes fases de la infección del virus en el cual el diagnóstico serológico puede detectar la actividad. Para lograr la detección del patógeno, primero se tiene que identificar el isotipo IgM. Para ser reconocido, se requiere de ensayos indirectos de captura que utilice un antisuero anti-IgM conjugado para mostrar si existe una reacción. Si lo hay, el isotipo IgM se combina con el antisuero anti-IgM y se puede medir su presencia con la intensidad de la reacción. Este mismo proceso se lleva a cabo para el isótopo anticuerpo IgG. El esquema creado muestra el funcionamiento de las pruebas de serología, al inicio se debe extraer una prueba al paciente y combinarlo con un antisuero anti-IgG. Si el resultado es una reacción con una intensidad alta significa que cuenta con el anticuerpo IgG, este se comienza a hacer presente en la etapa de infección. Si se cuenta con este anticuerpo, se procede a hacer la siguiente prueba donde se utiliza un antisuero para probar si se es positivo al isotipo IgM. Si no se cuenta con el anticuerpo, se puede concluir que se está en una etapa temprana de la infección y por lo tanto no se ha desarrollado el anticuerpo IgM. Al obtener un resultado positivo, se determina que la infección está en una etapa tardía o que ya no está presente la infección. Los resultados de esta técnica de detección dan a conocer si se cuentan con anticuerpos anti-E6 y/o anti- E7. Sin embargo, se debe ser muy cuidadosos al momento de analizar los resultados ya que si no se conocen las otras infecciones a las que el paciente ha estado expuestas, los resultados de los IgM pueden dar falsos positivos. Esta técnica de detección internacionalmente reconocida es muy buena para las mujeres mexicanas ya que es muy accesible económicamente en el país. A partir de esta se puede obtener información valiosa para saber si necesitan de más pruebas para la comprobación de la infección, por otro lado, no es posible dar un análisis de resultados profundo sobre los anticuerpos. APTIMA HPV Assay Esta prueba antes mencionada sirve tanto para la detección temprana del CaCu como para identificar la infección del patógeno si se encuentra activamente, esta prueba consiste en estudiar el ARNm infectado por las oncoproteínas E6 y E7 identificadas en los 14 serotipos de alto riesgo. Dicha prueba se divide en 3 partes, Rincón menciona que primero se identifica la manera en que este se desarrolla, después con la ayuda de la enzima ARN polimerasa y la transcripción inversa que genera ADN por medio del ARNm se amplifica durante el proceso de transcripción, posteriormente se lleva a cabo una PCR en tiempo real, y finalmente con el uso de colorantes específicos y señales se crean y analizan los resultados de detección de VPH. (2017) Revista de la Sociedad Americana de Citopatología. (2016). Transferencia celular de frotis teñidos con DQ [Ilustración]. Recuperado de https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S221329451630045X-gr1.jpg Proceso para realizar adecuadamente la técnica de detección del CaCu APTIMA HPV Assay: 1. El primer paso es realizar una inmunohistoquímica que es una técnica que generalmente es empleada para determinar la presencia y el nivel específico de proteínas celulares, la inmunohistoquímica mide la expresión proteica por medio del uso de anticuerpos etiquetados que se adhieren a las proteínas de interés. 2. Después se hace uso de otra técnica llamada “Frotis Diff-Quick” con la cual se logra teñir y diferenciar la muestra patológica, luego se revisan las muestras teñidas y se marcan con un círculo las áreas que contienen aproximadamente 200 células dañadas con un bolígrafo de histología. 3. Luego, haciendo uso de un bolígrafo de punta de diamante, se hacen círculos del cubreobjetos en la parte posterior del portaobjetos del microscopio, posteriormente se procede a empapar los portaobjetos con xileno. 4. Después se coloca una fina capa de una sustancia llamada “mount-quick” sobre del área celular de la muestra recogida y se incuban los portaobjetos a 60ºC por 2 horas o hasta que la sustancia “mount-quick” se endurece. 5. Se toman los portaobjetos y se sumergen en agua con una temperatura de 45ºC durante 2 horas o hasta que se puedan retirar sin esfuerzo. Con un bisturí se levanta con mucho cuidado el “mount-quick” del portaobjetos. https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S221329451630045X-gr1.jpg 6. Una vez que se tienen las muestras listas, se ponen en xileno y se someten a algo que se llama “lavado de xileno” que sirve para eliminar el medio de montaje. Una vez hecho esto, se procede a poner las células en un medio de etanol al 70% y se transfieren a un tubo de transporte GenProbe, el cual tiene un medio que lisa las células hace que se libere el ARNm, además de que funge como protección durante el almacenamiento. 7. Una vez cubierto el procedimiento anterior, se procede a hacer la prueba de VPH Aptima, la cual sirve para detectar agentes de alto riesgo de VPH a través del uso del instrumento “GenProbe Panther”. La prueba Aptima consta de tres pasos fundamentales: diana de ARNm de captura, ARNm diana de amplificación por TMA, y la detección de los productos de amplificación. 8. Finalmente, un control interno supervisa la etapa de captura, amplificación y detección de ARNm diana. Los resultados confirman la presencia de VPH de alto riesgo con las oncoproteínas E6 y E7, en caso de que los resultados resulten ser inválidos se tiene que sacar una segunda muestra y volver a realizar la prueba. Esta técnica de detección, aunque se recomienda solo realizarse en mujeres mayores de treinta años es una de las mejores en México porque es precisa al momento de detectar los VPH de alto riesgo, enfocándose en la oncoproteínas E6 y E7 adquiriendo un conocimiento más completo del desarrollo del CaCu. Otra ventaja es que es rápida de hacer y se puede llegar a realizar hasta 250 pruebasen 5 horas. IDENTIFICACIÓN DE LOS BIOMARCADORES INDUCTORES DE CaCu Los biomarcadores son moléculas dentro de la sangre, tejidos o fluidos corporales que son representaciones de una enfermedad, proceso o infección. Sirven para detectar riesgos y realizar estudios para solucionar el problema, pero antes deben ser aprobados. En la última fase del ciclo de infección del CaCu, los biomarcadores que se producen son las proteínas p.53 y Rb ya que son las que se encargan de eliminar los tumores en las personas y cuando existe una presencia de cáncer, este trata de inhibirlas. Para detectar lesiones precancerosas en las mujeres y buscar un tratamiento para el CaCu, se deben evaluar estas proteínas. Estos dos biomarcadores se producen en la Traducción del ADN. Algunas de las técnicas para identificar los biomarcadores inductores del CaCu son: ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas es una técnica de biología molecular que sirve para identificar proteínas dentro del cuerpo, específicamente en la sangre, tejidos y fluidos corporales que es donde se encuentran los biomarcadores. Es una de las mejores técnicas de detección de CaCu porque su principal función es detectar las proteínas p.53 y Rb en cada muestra, también es muy buena porque no es nada difícil realizarla y es fácil de producir; también ha contribuido en la detección del Virus del Papiloma humano. Inmoviliza dichas proteínas para que sea más fácil la separación de los dos materiales y después las analiza dentro de microplacas de poliestireno. Imagen de una placa donde se realiza una prueba de ELISA. http://www.elhospital.com/temas/Nuevo-software-podria-reducir- variabilidad-en-pruebas-de-biomarcadores-ELISA+130520 Los métodos más comunes para realizar esta prueba son: el ensayo directo que hace uso de un solo anticuerpo primario común para la tinción inmunohistoquímica de tejidos y células, el ensayo indirecto que usa un anticuerpo secundario que tiene especificidad con el primario; este método es el mas comercial, y por ultimo el ensayo de captura (sándwich) en este se necesita de un anticuerpo secundario especifico para detectar el anticuerpo primario, se debe ser muy cuidadosos al realizar esta prueba ya que es muy sensible. Formatos comunes de ELISA https://www.thermofisher.com/mx/es/home/lifescience/proteinbiology/protein-biology-learning- center/protein-biology-resource-library/pierce-proteinmethods/overview-elisa.html Este ensayo es muy bueno ya que su efectividad es alta y evita el desarrollo de NCI 3 de la patogénesis del VPH porque las oncoproteínas E6 y E7 tienen niveles altos mientras que los biomarcadores p.53 y Rb son bajos. Es muy útil para las mujeres mexicanas que ya han tenido antecedentes de CaCu y lleven un análisis del progreso de la enfermedad Western Blot Esta técnica separa las macromoléculas tomadas de una muestra por medio de electroforesis en gel, después se transfieren a otra muestra bloqueando la membrana y sondeando la proteína con anticuerpos. Al combinarse con un sustrato producen un cambio de color visible. Imagen del proceso de la técnica Western Blot. https://es.slideshare.net/MayteMancilla/western-blot-47342264 La técnica de Western Blot consta de 3 pasos clave para llevar a cabo un ensayo efectivo, primero se debe separar por tamaños, después se transfieren a un soporte sólido, y finalmente se marca la proteína diana usando anticuerpos primarios y secundarios. Esquema del proceso de Western Blot, Elaboración propia a partir de http://www.ecogen.com/upfiles/A56009.pdf A continuación, se mostrarán algunos resultados para evaluar los biomarcadores p.53 y Rb, la expresión consta de ocho líneas celulares y observamos que seis de ellas contienen secuencias de HPV y en ellas se observa que no hay rastro de las proteínas anteriormente mencionadas, por otro lado, cuando no se observa significa que es negativo y no se aprecia la presencia de estas proteínas. La disminución de las proteínas Rb y p.53 está directamente relacionada con el desarrollo de tumores en el individuo. Pruebas Western Blot para la evaluación y expresión de los biomarcadores P53 y Rb https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24831244/ Esta técnica es recomendable para mujeres que tienen un nivel de patogénesis de la enfermedad avanzado porque detecta lesiones cervicales y pueden saber cómo actúan las oncoproteínas y las proteínas dentro para llevarse a cabo el tratamiento adecuado. Desgraciadamente se necesita de una gran inversión del gobierno junto con el sector salud para tener el equipo necesario, así como personal especializado para que todas las mujeres mexicanas puedan realizarse esta prueba. Referencias Cáncer de cuello uterino - Detección y prevención. (2020, January 16). Retrieved August 21, 2020, from https://www.cancer.net/es/tipos-de-c%C3%A1ncer/c%C3%A1ncer-de-cuello- uterino/detecci%C3%B3n-y-prevenci%C3%B3n Cáncer de cuello uterino: MedlinePlus en español. (2019). Retrieved August 21, 2020, from https://medlineplus.gov/spanish/cervicalcancer.html CancerQuest. (s. f.). 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