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Archivos Españoles de Urología
ISSN: 0004-0614
urologia@arch-espanoles-de-urologia.es
Editorial Iniestares S.A.
España
Oriola, Josep
QUÉ TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEBEN CONFORMAR EL ARMAMENTARIO PARA
LA INVESTIGACIÓN BÁSICA EN URO-ONCOLOGÍA
Archivos Españoles de Urología, vol. 66, núm. 5, junio, 2013, pp. 409-415
Editorial Iniestares S.A.
Madrid, España
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PERSPECTIVAS ACTUALES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR APLICADA A LA URO-ONCOLOGÍA
QUÉ TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEBEN CONFORMAR EL 
ARMAMENTARIO PARA LA INVESTIGACIÓN BÁSICA EN URO-ONCOLOGÍA
Josep Oriola 
Servicio de Bioquímica y Genética Molecular. CDB. Hospital Clínico. Departamento de Ciencias Fisiológicas I. 
Facultad de Medicina. UB. Barcelona. España.
Resumen.- La Biología Molecular ha sido una de las 
disciplinas científicas en las que se ha avanzado más 
en los últimos años. El primer impulso en el estudio de 
alteraciones genéticas, provino del descubrimiento de 
la estructura del DNA, seguido de la dilucidación del 
código genético, del descubrimiento de los enzimas 
de restricción y luego, de la invención de la PCR, sin 
olvidar por supuesto del exponencial desarrollo de la 
informática. Todo ello nos ha permitido conocer mucho 
más acerca de nuestro genoma y su regulación de lo 
que podíamos imaginar. El impulso en proteómica ha 
sido sobretodo la puesta a punto de métodos suaves de 
ionización acoplados a la espectrometría de masas. Sin 
embargo esto parece ser solo el comienzo ya que hoy 
en día continúan habiendo avances metodológicos que 
sin duda aumentarán aun más los conocimientos y las 
aplicaciones en esta disciplina. 
@ CORRESPONDENCIA
Josep Oriola
Casanova, 143
08036 Barcelona (España)
joriola@clinic.ub.es
Palabras clave: Biología molecular. Heredabi-
lidad. Exoma. Transcriptoma. Proteoma. Microma-
trices. microRNAs. Secuenciación masiva. Espec-
trometría de masas. Inmunoprecipitación. Cambios 
epigenéticos.
Summary.- Molecular biology has been one of 
the scientific disciplines in which there has been more 
advances in the last years. The first impulse in the study 
of genetic alterations came from the discovery of DNA 
structure, followed by elucidation of the genetic code, 
the discovery of restriction enzymes and subsequently 
the invention of PCR, not forgetting the exponential 
development of computer science. All of them have 
allowed us to know much more about our genome 
and its regulation than we could imagine. The impulse 
in proteomics has been especially in tune up of soft 
methods of ionization coupled with mass spectrometry. 
Nevertheless, this seems to be only the beginning since 
today there are continuous methodological advances 
that will increase more, without doubt, the knowledge 
and applications in this discipline.
Arch. Esp. Urol. 2013; 66 (5): 409-415
Keywords: Molecular biology. Heritability. 
Exome. Transcriptome. Proteome. Micromatrices. 
MicroRNAs. Massive sequentiation. Mass spectro-
metry. Immunoprecipitation. Epigenetic changes.
J. Oriola 
 “Alicia llega a un lugar en el bosque en don-
de el camino se parte en dos y ella no sabe por cual 
de los dos caminos seguir. Alicia mira al gato en el 
árbol y le pregunta: Señor gato, ¿qué camino debo 
tomar? A lo que el gato respondió: Eso depende del 
lugar que quieras ir”.
Lewis Carroll. Alicia en el país de las maravillas.
INTRODUCCIÓN
 Habitualmente el objetivo en una investiga-
ción biomédica es la detección de alteraciones mo-
leculares que nos expliquen el porqué se desarrolla 
una enfermedad, su evolución, o porque pacientes 
con “la misma” enfermedad evolucionan o responden 
de manera diferente a un mismo tratamiento. Estas 
alteraciones, en general, pueden dividirse en estruc-
turales (en el DNA) o cuantitativas (en la expresión de 
genes o en la funcionalidad de las proteínas) y para 
poder proceder a su estudio es básico conocer el ar-
mamentario de metodologías que podemos utilizar. 
Lo que me propongo explicar en este capítulo son 
pues las metodologías actuales mediante las cuales 
podemos realizar este tipo de estudios. Sin embargo, 
primero debe tenerse, por supuesto, una hipótesis o 
idea de lo que se pretende encontrar, de lo contrario, 
no sabremos qué metodología escoger.
ESTUDIO DEL DNA
 Si lo que pretendemos es detectar alteracio-
nes en el DNA, lo primero que debemos saber es si 
queremos buscar alteraciones que están presentes en 
todas las células del cuerpo (germinales/heredables) 
o sólo en determinados tejidos (somáticas). Para es-
tudiar las germinales, en principio podemos utilizar 
cualquier tejido pero por su facilidad en su obten-
ción generalmente se estudia la sangre (leucocitos). 
Si queremos estudiar cambios somáticos, entonces 
deberemos escoger el tejido en el que pensamos que 
pueden estar estos cambios (tejidos afectados). En 
el caso del cáncer debemos tener presente que cual-
quier pieza de tumor presenta diferentes subclones 
celulares en los que hay diferentes mutaciones por lo 
que no estarán “todos” los cambios que encontremos 
en “todas” las células del tejido analizado, además 
de la posible presencia residual de tejido normal. 
 ¿Qué tipo de alteraciones queremos bus-
car? Por ejemplo, si buscamos grandes deleciones, 
duplicaciones o translocaciones, quizás con el uso 
de las técnicas de citogenética clásica puede ser su-
ficiente ya que permite detectar cambios mayores de 
6-10Mb (millones de pares de bases). Si queremos 
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detectar cambios de menor extensión (entre 100Kb 
y 6Mb) podemos utilizar la metodología del array 
de Hibridación Genómica Comparada (Compara-
tive Genomic Hybridization array o CGH array en 
inglés), también llamado Cariotipo Molecular (Spei-
cher & Carter, 2005). Mediante esta técnica también 
se detectan las variaciones en el número de copias 
(copy-number variations o CNVs en inglés). Estas son 
regiones del genoma de mil a mas de un millón de 
pares de bases que se hallan repetidas varias veces 
y algunas de ellas se han descrito asociadas a en-
fermedades. Para detectar las CNVs también puede 
utilizarse el array de SNPs que describiremos mas 
adelante. Las metodologías anteriores son utilizadas 
cuando no sabemos exactamente las alteraciones 
que podemos encontrar. Si por el contrario, son alte-
raciones descritas y queremos detectar su presencia 
o ausencia, podemos utilizar la Hibridación “in situ” 
Fluorescente (fluorescent in situ hybridization o FISH 
en inglés), la PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) 
o la Amplificación Múltiple dependiente de sonda 
(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o 
MLPA en inglés). Estas últimas son pues metodologías 
específicas.
 Si los cambios a buscar son a nivel de nu-
cleótido, se pueden estudiar mediante secuenciación. 
La metodología clásica es la de Sanger (dideoxinu-
cleótidos) que permite, mediante amplificación pre-
via por PCR, secuenciar fragmentos de 700-800 pa-
res de bases. Cabe remarcar en este punto que a 
veces se dispone de cantidades limitadas de muestra 
(DNA). Mediante la amplificación de todo el geno-
ma (Whole Genome Amplification o WGA en inglés) 
podemos amplificar el genoma y obtener unas 400 
veces más DNA del que teníamos previamente. Hay 
varios métodos, pero el mas utilizado es el basado en 
la DNA polimerasa φ29. 
 Aunque hoy en día aún se continúa utilizandoampliamente la secuenciación por Sanger, se están 
utilizando ya las técnicas de secuenciación masiva 
de nueva generacion (Next-Generation Sequencing o 
NGS en inglés) que están revolucionando la manera 
de llevar a cabo la detección de cambios de nucleóti-
dos en el DNA. Estas metodologías permiten secuen-
ciar el genoma completo de un organismo o también 
solamente a los exones (exoma) que es donde se lo-
calizan la mayor parte de las mutaciones. Estas técni-
cas presentan muchas ventajas ya que por ejemplo, 
permiten el estudio de enfermedades mendelianas sin 
la necesidad de estudios de ligamiento. Otra de las 
aplicaciones que tiene la NGS es en el estudio de 
tumores. Con ellas se pueden encontrar prácticamen-
te todas las mutaciones que hay en un determinado 
tumor, siempre que estén presentes en un porcentaje 
importante de las células tumorales. Esto nos permite 
QUÉ TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEBEN CONFORMAR EL ARMAMENTARIO...
observar si hay recurrencia (las mismas mutaciones) 
en tumores del mismo tipo en distintos pacientes y 
asociarlas a diagnóstico, evolución o respuesta al 
tratamiento. Si hay asociaciones con algunas muta-
ciones, su aplicación clínica es inmediata ya que nos 
puede permitir diseñar un panel para la detección de 
estas mutaciones de una forma rápida. El problema 
en estos momentos no es la metodología del NGS 
en sí misma sino el análisis de la enorme cantidad 
de variantes genéticas que se detectan, así como su 
significado biológico, pero solucionar esto es sólo 
cuestión de tiempo. En relación a la utilización de 
las NGS y enfocado al diagnóstico, hoy en día hay 
casas comerciales que están desarrollado técnicas de 
multiplex-PCR mediante las cuales, con pocas PCRs 
se pueden obtener mas de un centenar de amplifi-
caciones (amplicones) diferentes y todas estas son 
analizadas conjuntamente. Esta estrategia es muy útil 
cuando deben analizarse genes grandes como por 
ejemplo NF1, BRCA, o APC, o cuando para el es-
tudio de un determinado síndrome deben estudiarse 
diferentes genes, que por Sanger se van estudiando 
de uno en uno, por NGS se pueden estudiar todos a 
la vez y de una forma rápida.
 Otras veces lo que se quiere es estudiar 
posibles asociaciones entre polimorfismos de un 
solo nucleótido (Single Nucleotide Polymorphisms o 
SNPs en inglés) y una enfermedad. Este abordaje 
es habitual para el estudio de las llamadas enfer-
medades multifactoriales, es decir, enfermedades en 
las que el componente hereditario es muy significa-
tivo (generalmente queda patente en estudios entre 
gemelos monozigóticos) pero donde existe también 
un componente ambiental y los estudios de liga-
miento no nos son útiles. El componente genético 
de estas enfermedades se puede estudiar median-
te los arrays de SNPs. Se trata de plataformas co-
merciales que permiten la detección simultánea de 
cerca de un millón de SNPs que presentan frecuen-
cias poblacionales superiores al 5%. La aplicación 
mas directa de estas plataformas son los estudios 
de asociación del genoma completo (Genome-wide 
association Studies o GWAs en inglés). Se trata de 
estudiar por ejemplo dos grupos o poblaciones de 
individuos (ej: controles vs enfermos) y así podemos 
ver qué SNPs están representados en proporciones 
significativamente diferentes y, como se conoce la 
localización de cada uno de estos SNPs, permite 
hacer conjeturas acerca de qué gen está implicado 
en la enfermedad que estamos estudiando. En los 
estudios realizados, la mayoría de las variaciones 
que se han encontrado asociadas a enfermedades 
no se encuentran en zonas codificantes. Esto nos 
puede indicar que o bien estan en lugares regula-
dores de la expresión de genes o que no tengan 
un efecto directo, sino que sean asociaciones (for-
men parte de un haplotipo) con otros cambios que 
sí sean realmente los causantes de la patología.
 Sin embargo, muchos de los resultados obte-
nidos con los GWAs no han dado explicación a la 
alta “heredabilidad” que se observa en los estudios 
en gemelos. Se cree que la “heredabilidad” que falta 
podría estar en las variaciones genéticas que hay en 
el genoma pero que presentan una frecuencia inferior 
al 5% y estas no se hallan en las plataformas actua-
les de arrays de SNPs (Casals & Bertranpetit, 2012). 
Posiblemente nos darán la respuesta los arrays de 
SNPs que cubran estas variaciones o ya directamente 
las NGS. Los arrays de SNPs nos permiten detectar 
también los CNVs así como el estudio de tumores 
para detectar pérdidas alélicas (pérdida de heterozi-
gosidad) o amplificaciones (aumento en el número de 
copias) génicas aunque solo sean de unos miles de 
pares de bases. 
 Si lo que se quiere es estudiar un determina-
do cambio conocido de uno o pocos nucleótidos en 
muchas muestras es mejor utilizar metodologías con 
sondas específicas. Hay varias pero la más común 
es mediante sondas TaqMan. Este método es rápido 
pero tal como se ha mencionado, sólo permiten el 
análisis de unos pocos cambios a la vez.
 Otro tipo de variaciones en el DNA son las 
producidas postsíntesis como por ejemplo la metila-
ción, acetilación o la fosforilación. Estos cambios epi-
genéticos pueden ser causa del silenciamiento o de 
la expresión de genes, ya sea en casos hereditarios o 
somáticos. De estas variaciones la más estudiada es 
la metilación y las metodologías para su estudio pue-
den ser: por digestión con enzimas de restricción que 
cortan o no en función de si la citosina está metilada 
o mediante el método del bisulfito, que transforma la 
citosina no metilada (5-metil-citosina) en uracilo y que 
una vez amplificada por PCR pasa a ser una timina. 
En este último caso debemos utilizar dos tipos de pri-
mers, unos específicos para la secuencia normal y 
otros para la secuencia modificada. Esta técnica se 
denomina PCR específica de metilación (methylation-
specific PCR o MSP en inglés).
 Hoy día ya se puede estudiar el patrón de 
metilación del genoma entero (citosinas metiladas). 
Esto puede realizarse de varias formas: Se puede di-
gerir el DNA con enzimas de restricción sensibles a 
la metilación de las citosinas, capturar los fragmentos 
con proteínas que se unen al DNA metilado y a conti-
nuación secuenciar mediante NGS. Otro método uti-
liza la inmunoprecipitación (Methyl-DNA immunopre-
cipitation o MeDIP en inglés) que consiste en cortar 
el DNA mediante sonicación, desnaturalizarlo y pre-
cipitarlo con anticuerpos específicos que reconozcan 
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J. Oriola 
a las 5-metil-citosinas. A continuación ya tenemos ais-
lada la fracción de DNAs metilados y podemos estu-
diarlos por NGS. También pueden utilizarse métodos 
basados en el bisulfito, es decir, tratar el DNA con 
bisulfito y luego secuenciar con NGS. Debe tenerse 
en cuenta sin embargo que el bisulfito no distingue 
entre 5-metil-citosina y 5-hidroximetil-citosina (Jones, 
2012).
ESTUDIO DEL RNA
 En primer lugar es importante remarcar el es-
pecial cuidado que se debe tener en la obtención de 
la muestra, pues, a diferencia del DNA, el RNA se de-
grada con mucha facilidad. Por ello, debe protegerse 
de su degradación mediante congelación inmediata 
y/o mantenerlo en un medio con estabilizador del 
RNA. El estudio del RNA también se ha diversificado 
en los últimos años, pues aparte de nuevas tecnolo-
gías, se han descubierto otros tipos de RNAs que no 
se traducen (ej: microRNAs) (Gutschner & Diederichs, 
2012). Sea pues el tipo que sea de RNA, lo que se 
pretende es cuantificar su expresión en diferentes te-
jidos (espacio) y/o en diferentes momentos (tiempo) 
del desarrollo, o en otros casos por ejemplo compa-
rar los niveles de expresión en tejido sano vs alterado 
y así conocer qué vías bioquímicas están activadas o 
inhibidas en una determinada enfermedad.
 La metodología mas utilizada actualmente 
son los arrays de expresión que permiten obtener per-
files de expresión del RNA. En estos arrays hay cien-
tos de millares de sondas para detectar la presencia 
específica de RNAs. Los hay con sondas para RNAs 
codificantes(varias sondas por gen que se hibridan 
en diferentes exones) y con sondas para microRNAs 
u otros RNAs no codificantes. Los RNAs que se ob-
servan diferencialmente expresados en los arrays de-
ben ser validados mediante otra metodología como 
por ejemplo la PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR) 
previa retrotranscripción del RNA a cDNA (Real-time 
reverse-transcription PCR o RT-qPCR en inglés). Si solo 
se quieren estudiar unos pocos RNAs, hay paneles 
comerciales prediseñados o también según el con-
sumidor. En este caso no es necesaria su validación 
por otro método.
 También las NGS permiten conocer el trans-
criptoma de un tipo celular en un momento dado de 
la vida de un individuo, cualitativa y cuantitativamen-
te, ya sean RNAs codificantes como no codificantes. 
Esto se consigue mediante la transcripción reversa 
y luego se procesa como si fuese DNA (RNA-seq o 
Whole Transcriptome Shotgun Sequencing, WTSS en 
inglés). Además, las NGS nos permiten un análisis 
cuantitativo por lo que obtenemos también la valo-
ración de la expresión, no solo de un determinado 
tránscrito sino de cada uno de los exones. Los pri-
meros resultados que se han obtenido nos muestran 
que hay muchas mas regiones que se transcriben de 
las que se pensaba. Qué porcentaje de estos datos 
son artefactuales o reales, y si son reales, si tienen un 
significado biológico, es algo que sólo empezamos a 
vislumbrar. 
ESTUDIO DE LAS PROTEINAS
 Al igual que las metodologías aplicadas a 
los ácidos nucleicos, también las aplicadas al estudio 
de las proteínas han evolucionado mucho (Mallick 
& Kuster, 2010). Si queremos saber qué proteínas 
hay en una muestra, primero debemos separar las 
diferentes proteínas. Esto se puede hacer mediante 
electroforesis bidimensional en gel de poliacrilami-
da (2D-PAGE). El 2D-PAGE separa las proteínas en 
función de su tamaño y de su punto isoeléctrico y 
luego se pueden teñir con azul de Coomassie, plata, 
colorante fluorescente o un anticuerpo específico. La 
imagen que se obtiene da una idea del proteoma 
del tejido que se estudia así como de la abundancia 
(semicuantitativa) de las proteínas que se observan. 
Una modificación del 2D-PAGE es el 2D-DIGE (2D 
dimensional difference gel electrophoresis en inglés). 
En este caso, se pueden teñir hasta tres muestras 
diferentes cada una con un fluorocromo diferente y 
después se hacen correr en el gel. A continuación, se-
gún la luz a la que expongamos el gel detectaremos 
una muestra u otra. Esto minimiza de gran manera 
las variaciones inter-ensayo. Además, la cuantifica-
ción de cada proteína es mejor en el DIGE que en el 
PAGE. Ambas técnicas permiten un rango de estudio 
desde 20KDa a 250KDa. Una vez que tenemos las 
proteínas separadas en el gel, lo que queremos es 
caracterizarlas. Para ello cogeremos cada una de las 
manchas y las digeriremos con una proteasa. Esto 
nos dará para cada proteína un conjunto de péptidos 
que podrán ser analizados mediante espectrometría 
de masas. La espectrometría de masas nos separa 
moléculas cargadas (ionizadas) en función de su 
masa y su carga (m/z). Hay varias clases de ana-
lizadores pero de cualquier forma, lo que se acaba 
midiendo es la m/z de cada péptido, que dependerá 
de la proteasa que hayamos utilizado. Esto es lo que 
se llama huella peptídica (peptide mass fingerprinting 
o PMF). A continuación se cotejan los cocientes obte-
nidos con las de bases de datos de proteínas conoci-
das para saber de qué proteína se trata. Otra forma 
de estudio del proteoma es digerir con una proteasa 
una muestra de proteínas y proceder a su separación 
mediante HPLC, seguido también de la identificación 
de los péptidos mediante espectrometría de masas. 
Con esta variante se trabaja con péptidos desde el 
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QUÉ TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEBEN CONFORMAR EL ARMAMENTARIO...
inicio y no con proteínas y su ventaja es que el ren-
dimiento es muy superior respecto a la variante de 
separar proteínas en un gel.
 Entre las muchas ventajas de la espectrome-
tría de masas está su alta sensibilidad (femptomoles) 
y la capacidad de detectar cambios post-traduccio-
nales en las proteínas (ej: fosforilación, acetilación, 
metilación) así como determinar cual es el aminoá-
cido modificado. Si además de la caracterización 
de las proteínas se quieren cuantificar, es necesario 
su marcaje con isótopos estables (Mallick & Kuster, 
2010) o también pueden utilizarse, al igual que se 
hace con los arrays en DNA o RNA, las microma-
trices proteicas (quantitative protein expression pro-
filing en inglés). Estas consisten en arrays donde se 
inmovilizan anticuerpos, fragmentos de anticuerpos 
o aptámeros que van a captar proteínas específicas. 
Las proteínas a detectar deben ser proteínas conoci-
das. Con ellas se puede obtener el perfil de expresión 
proteico de una determinada muestra o compararlo 
con otras muestras (ej: normal vs tumor). Los límites 
de detección están entre nano y picomolar (Sydor 
& Nock, 2003). Esta estrategia nos permite también 
detectar nuevos biomarcadores.
ESTUDIO INTERACCIÓN DNA-PROTEINAS
 Se sabe que la expresión de los genes de-
pende de factores de transcripción específicos pero 
también de las interacciones DNA-Histonas y otras 
proteínas relacionadas y de cómo estas están modifi-
cadas. Para poder estudiar esta relación entre genes 
y proteínas se utiliza la metodología de la inmunopre-
cipitación de la cromatina (Chromatin ImmunoPreci-
pitation o ChIP en inglés) que tiene la ventaja de po-
der utilizarse “in vivo”. Consiste primero en fijar las 
proteínas entre ellas y al DNA mediante por ejemplo 
formaldehido y a continuación lisar las células. Lue-
go se fragmenta el DNA por sonicación (500-1500 
pares de bases) y se precipitan estos complejos uti-
lizando anticuerpos específicos para las proteínas 
modificadas que queramos estudiar. Posteriormente 
se libera al DNA, se amplifica por PCR y se secuen-
cia. También pueden hibridarse los DNAs obtenidos 
con arrays de DNA ya conocidos (ChIP-on-chip). Ac-
tualmente sin embargo ya se está utilizando el ChIP 
asociado a la NGS para poder tener el mapa de 
todos los lugares del genoma donde se unen estas 
proteínas (ChIP-sequencing) (Ku et al., 2011).
PERSPECTIVAS DE FUTURO
 Estas metodologías anteriores están siendo 
utilizadas mayoritariamente para la investigación, 
pero gracias a ellas empezamos a conocer qué 
cambios en el DNA, qué RNAs o qué proteínas van 
asociadas a determinadas patologías o subgrupos 
de patologías, por lo que una vez tengamos unos 
biomarcadores definidos, ya sean de DNA, RNA o 
proteínas, estos se podrán analizar en paneles redu-
cidos y específicos (Godley, 2012) y podrán aplicar-
se al diagnóstico, pronóstico y tratamiento de una 
gran variedad de enfermedades.
GLOSARIO
Cariotipaje: Proceso por el cual se observan los cro-
mosomas en metafase y se ordenan según su tamaño, 
longitud de los brazos y patrón de las bandas. 
Material: Sangre, tejido fresco, cultivo celular. 
Proceso: Se debe cultivar para poder obtener metafa-
ses. Tinción habitual con Giemsa (bandas G).
Utilidad: Permite detectar aneuploidias, poliploidias, 
translocaciones equilibradas y no equilibradas.
Ventajas: permite la detección de translocaciones 
equilibradas.
Desventajas: No se detectan alteraciones menores de 
10Mb. No detecta disomia uniparental.
Array de CGH o cariotipo molecular: Análisis de ga-
nancias /pérdidas de regiones en el genoma.
Material: Sangre, tejido, cultivo celular, material pa-
rafinado, DNA.
Proceso: Hibridación conjunta de cantidades equimo-
lares de dos DNAs marcados (uno estandar y el otro 
a testar) con distintos fluorocromos, sobre pocillos en 
los cuales hay sondas de DNA.
Utilidad: ganancias (amplificaciones génicas) y pér-
didas (deleciones) en los cromosomas. Resolución de 
100Kb.
Ventajas: No son necesarias metafases. No cultivo. 
Detecta CNVs. No hace falta estandarización al tra-
tarse de plataformas comerciales aunque si se desea, 
se pueden diseñar a medida.
Desventajas: No detectatranslocaciones equilibra-
das. No detecta disomia uniparental. Pueden detec-
tarse cambios de los que se desconoce su patoge-
nicidad debido a la alta variabilidad que hay en el 
genoma. No detecta copias completas del genoma 
(triplodias, tetraploidias).
FISH: Metodología que permite, mediante sondas 
específicas, la visualización de genes o loci ya co-
nocidos, sobre metafases o núcleos interfásicos. El 
SKY/M-FISH es un caso particular del FISH en el que 
se utilizan sondas para todos los cromosomas a la 
vez.
Material: Sangre, tejido, cultivo celular.
Proceso: hibridación de sondas marcadas sobre cro-
mosomas en metafase o interfase.
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J. Oriola 
Utilidad: Detección de aneuplodias, poliploidias, 
amplificaciones y otros reordenamientos cromosómi-
cos. En algunos casos puede ser complementario a 
la qPCR. Confirmación de resultados obtenidos por 
MLPA o arrays de CGH. Resolución de 80-100kb.
Ventajas: Análisis rápido en un gran número de 
muestras.
Desventajas: Solo se pueden utilizar pocas sondas a 
la vez. Debe saberse lo que se quiere buscar.
qPCR (PCR cuantitativa): PCR que se realiza a partir 
de DNA o RNA y que permite cuantificar el número 
de copias de una determinada región del genoma 
(DNA) o que permite valorar la cantidad de RNA que 
procede de un determinado gen. 
Material: Sangre, tejido, cultivo celular, material pa-
rafinado, DNA, RNA.
Proceso: Se realiza mediante la utilización de sondas 
marcadas específicas o de fluorocromos que se in-
tercalan en el producto que se amplifica. No deben 
confundirse las siglas de qPCR con las de RT-qPCR 
(retrotranscripción del RNA a DNA).
Utilidad: En DNA permite la valoración del número 
de copias de una determinada región cromosómica. 
Aneuploidias, poliploidias, pérdida de heterozigosi-
dad, CNVs y SNPs. Puede utilizarse para el diag-
nóstico prenatal de las aneuploidias mas comunes. 
En este caso, se amplifican microsatélites. En RNA 
permite cuantificar la expresión de un determinado 
gen. Existen paneles de expresión comerciales para 
determinar la expresión de varios genes a la vez.
Ventajas: Análisis rápido en un gran número de 
muestras.
Desventajas: En DNA, no detecta reordenamientos. 
Detecta el número de copias en regiones determina-
das pero la detección de, por ejemplo, tres copias en 
una región cromosómica no nos indica necesariamen-
te que hay tres copias completas del cromosoma en 
que la sonda hibrida. Debe saberse lo que se quiere 
buscar. En RNA, debe tenerse en cuenta que un gen 
puede presentar diferentes RNAs (splicing) por lo que 
la utilización de una sonda, no necesariamente nos 
permite detectar todas las formas de splicing del gen 
que se estudia.
MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplifi-
cation): Metodología que permite, mediante sondas 
contiguas específicas, la amplificación simultanea de 
varias regiones del genoma (multiplex), previa hibri-
dación de estas sondas con el DNA a testar.
Material: DNA.
Proceso: hibridación con el DNA a testar, ligamiento 
y posterior amplificación por PCR.
Utilidad: Generalmente se utiliza para la detección 
de deleciones/duplicaciones de exones de uno o 
más genes o de regiones específicas en el genoma 
(por ejemplo las subteloméricas). También permite 
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la detección de mutaciones puntuales ya conocidas. 
Hay variantes de MLPA que permiten la detección de 
metilación (MS-MLPA).
Ventajas: Rapidez. Ha substituido en la mayoría de 
los casos al Southern.
Desventajas: La altura de los picos obtenidos puede 
estar influenciada por la calidad del DNA, la presen-
cia de polimorfismos o baja eficiencia de la amplifi-
cación, por lo que si se observa una posible deleción 
solamente en una sonda, debe evaluarse con otro 
método (ej: PCR a tiempo real). El método permite 
solo la amplificación de aproximadamente 40 regio-
nes a la vez.
Secuenciación de DNA/RNA, método de Sanger: Mé-
todo enzimático basado en el uso de dideoxinucleóti-
dos que permite conocer la secuencia de nucleótidos 
de una determinada región del genoma o la secuen-
cia de un RNA.
Material: Sangre, tejido, cultivo celular, material pa-
rafinado, DNA, RNA.
Proceso: Extracción de DNA/ RNA y transcripción re-
versa. Reacción de secuenciación mediante dideoxi-
nucleótidos marcados con fluorocromos.
Utilidad: Permite conocer la secuencia de nucleóti-
dos. Determinación de mutaciones puntuales, dele-
ciones o inserciones de pocos pares de bases.
Ventajas: Rapidez, ya que puede secuenciarse el pro-
ducto de PCR sin necesidad de clonaje.
Desventajas: No detecta grandes deleciones / du-
plicaciones. Las lecturas no son mas largas de 700-
800pb.
WGA (Whole Genome Amplification): Métodos enzi-
máticos basados en la amplificación del DNA de todo 
el genoma para obtener mas cantidad de DNA.
Material: DNA.
Proceso: Reacción enzimática.
Utilidad: Síntesis de DNA de “novo”. 
Ventajas: Muy útil cuando disponemos de cantidades 
limitadas de muestra.
Desventajas: El DNA utilizado debe ser de calidad. 
Disminuye mucho la eficiencia cuando se quieren am-
plificar regiones superiores a las 2.000pb.
NGS (Next-Generation Sequencing) o Secuenciación 
masiva o high-throughput sequencing: Secuenciación 
del genoma, del exoma o del transcriptoma de un 
determinado organismo. 
Material: DNA / RNA y transcripción reversa.
Proceso: Técnicas basadas en la amplificación y 
secuenciación de millones de fragmentos cortos de 
DNA en paralelo.
Utilidad: DNA.- Búsqueda de mutaciones en todo el 
genoma/exoma sin necesidad de hipótesis previas 
de búsqueda en determinados genes. RNA.- Análisis 
del transcriptoma de un tipo celular en un momento 
QUÉ TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR DEBEN CONFORMAR EL ARMAMENTARIO...
determinado.
Ventajas: No hace falta saber “a priori” en qué lugar 
pueden estar las mutaciones que buscamos.
Desventajas: Baja cobertura para secuencias repetiti-
vas. No se detectan expansiones de secuencias repe-
titivas. La gran cantidad de cambios que se detectan, 
pues muchos de ellos no se sabe si son causa de 
patología o no.
Arrays de SNPs. Detección de miles de SNPs a la vez, 
en todo el genoma. 
Material: Sangre, tejido, cultivo celular, material pa-
rafinado, DNA.
Proceso: El DNA se digiere con enzimas de restric-
ción, se añaden adaptadores a los extremos de estos 
fragmentos y se amplifican. A continuación se frag-
mentan y se hibridan en plataformas que contienen 
secuencias específicas para cada SNP.
Utilidad: Estudio de grandes cohortes de individuos 
para establecer asociaciones entre variaciones gené-
ticas y enfermedades multifactoriales (Genome-wide 
association Studies o GWAs). Estudios de pérdida de 
heterozigosidad. Detecta ganancias (amplificaciones 
génicas) y pérdidas (deleciones) en los cromosomas. 
Se detectan CNVs, Detecta disomia uniparental. Aná-
lisis de susceptibilidad a diferentes enfermedades. 
Ventajas: No hace falta estandarización al tratarse 
de plataformas comerciales.
Desventajas No están incluidos los SNPs de frecuen-
cias inferiores al 5%. 
TaqMan: Análisis de variaciones genéticas o expre-
sión de genes, mediante PCR a tiempo real con son-
das específicas.
Material: DNA, RNA.
Proceso: Amplificación por PCR mediante dos primers 
específicos, de una región que contiene la variación 
genética a testar. Se utilizan además dos sondas mar-
cadas específicas, una se une a la secuencia normal 
y la otra a la alterada. Durante la fase de extensión 
la DNA polimerasa degrada a la sonda que se ha 
unido y esto da lugar a la emisión de fluorescencia 
indicando cual de las dos sondas estaba unida. En 
el caso de heterozigosis, se observan los dos colores 
a la vez.
Utilidad: genotipado de variaciones genéticas. Tam-
bién puede utilizarse para el estudio de la expresión 
(RNA).
Ventajas: Permite realizar el genotipado en centena-
res de muestras en poco tiempo. Comerciales.
Desventajas: Sólo permite el genotipado de una o 
dos variaciones genéticas al mismo tiempo.
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BIBLIOGRAFÍA y LECTURAS
RECOMENDADAS (*lectura de interés y ** 
lectura fundamental)