SECUENCIADOR_TERMICO_PARA_LABORATORIOS_DE_BIOLOGIA

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SECUENCIADOR TERMICO PARA LABORATORIOS DE
BIOLOGIA MOLECULAR
Jorge Gentile, Higmar Herrera, José F. Pico, Julio Valdés, Nelson del Portal, Alfredo Rego
CENTRO DE INMUNOENSAYO
Ave 25 y calle 134. Apartado 6653. Playa. C. Habana. Cuba. E-Mail: infot1@cie.sld.cu
RESUMEN
Este trabajo es la síntesis de todo el proceso de desarrollo
de un Secuenciador Térmico para laboratorios de Biología
Molecular. Dicho equipo tiene la función de amplificar las
cadenas de ADN o ARN extraídas de muestras de
pacientes, usando el principio de reacción en cadena de la
polimerasa, lo que se logra tras la ejecución de una serie de
pasos, en los cuales la muestra que se va a procesar alcanza
diferentes valores de temperatura de forma controlada y
con una duración determinada.
El equipo cuenta con una unidad de atemperamiento, en la
cual son colocadas las muestras a procesar. Dicha unidad,
para lograr y mantener los niveles de temperatura deseados,
tiene incluido un dispositivo termoeléctrico Peltier, que
permite lograr rampas de calentamiento y enfriamiento de
3ºC/s y 1ºC/s respectivamente. En el trabajo se destacan: el
sistema de control desarrollado, que es producto de la
integración de un programa elaborado y ensamblado en la
memoria interna del equipo, así como los circuitos
electrónicos que se diseñaron para el manejo de los
elementos de acción final. Tienen similar importancia las
ecuaciones de control que han sido aplicadas en dicho
sistema y que fueron el resultado de un proceso de cálculo,
que incluyó el uso de herramientas de computación
modernas.
La posibilidad de fabricación de este equipo en Cuba forma
parte de un proyecto conjunto de Biología Molecular
donde participan varios centro del Polo Científico y que
tendrá su punto culminante con la introducción del mismo
en el Sistema Nacional de Salud.
Palabras clave: PCR, secuenciador térmico, control de
temperatura, mediciones, temperatura.
1. INTRODUCCIÓN
De los múltiples métodos de diagnóstico que existen, el de
reacción en cadena de la polimerasa (RCP) se ha convertido
en uno de los más efectivos, a pesar de ser un método
costoso.
La RCP permite realizar en el laboratorio la amplificación
selectiva de una región particular del ADN mediante la
imitación del fenómeno de la repetición del ADN en los
seres vivos [1].
La realización del diagnóstico por RCP tiene tres fases. La
primera se llama extracción, que es el proceso de sepa-
ración del ADN o el ARN de la muestra proveniente del
paciente. La segunda se denomina amplificación, y es
donde se logra el aumento del número de cadenas de ácido
nucleico a partir de un fragmento de cadena original. Y la
tercera fase es la detección, donde se realiza el proceso
necesario para lograr la lectura del resultado por el método
establecido en el laboratorio, ya sea electroforesis,
fotometría, fluorimetría o cualquier otro existente.
Dentro del grupo de equipos que se utilizan en este tipo de
laboratorio está el secuenciador térmico, que es el
encargado de realizar la amplificación a través del proceso
de RCP.
La RCP requiere de 3 pasos térmicos: (1) la desnaturali-
zación de la cadena doble de ADN, que se logra a
temperaturas entre 92 y 96ºC, (2) templado o hibridación de
los cebadores a un sitio complementario de la plantilla, lo
que se hace a una temperatura entre 45 y 72ºC, y (3) la
extensión del cebador que ocurre a 72ºC. El esquema de
desnaturalización, hibridación y extensión, con cada paso
definido por un período de tiempo fijo es lo que se llama
ciclo. La repetición de esos ciclos es la que permite la
amplificación del ADN [1].
Se puede definir entonces, que el secuenciador térmico es
un equipo cuya función principal es la de realizar
automática y cíclicamente los cambios de temperatura que
se requieren para lograr la amplificación de una cadena de
ADN o ARN por medio de una enzima termoestable [2].
El equipo que se presenta es un secuenciador térmico que
cumple con los requerimientos más importantes que debe
tener un instrumento de este tipo. Ellos son: gran exactitud,
uniformidad y reproducibilidad en la temperatura, gran
uniformidad entre la temperatura de todas las posiciones
donde se colocan las muestras, Mínimo sobre impulso
cuando se alcanza la temperatura deseada, alta
reproducibilidad entre los tiempos de los ciclos, alta
conductividad térmica en todo el sistema, posibilidad de
controlar la temperatura por un sensor colocado en la
muestra o por uno montado en el bloque de
atemperamiento, poca masa térmica en el sistema, poca
condensación interna en los tubos o los pozos de las
muestras y posibilidad de uso de diferentes tubos de
reacción (por ejemplo: tubos Eppendorf de 1.2ml o 0.7ml,
MicroAmpTM, capilares, etc.).
2. METODOLOGÍA
2.1. Descripción de la Unidad de Atemperamiento.
Fig. 1: Esquema de la Unidad de Atemperamiento
Para tener una idea de la forma que tiene la unidad de
atemperamiento, en la Fig.1 aparece un dibujo parcial de la
Cubierta ExteriorCubierta Exterior Bloque de MuestrasBloque de Muestras
Tarjeta deTarjeta de
CircuitoCircuito
ImpresoImpreso
Aislante TérmicoAislante Térmico
Disipador de calorDisipador de calor
Cubierta ExteriorCubierta Exterior Bloque de MuestrasBloque de Muestras
Tarjeta deTarjeta de
CircuitoCircuito
ImpresoImpreso
Aislante TérmicoAislante Térmico
Disipador de calorDisipador de calor
Xioma Rojas
Memorias II Congreso Latinoamericano de Ingeniería Biomédica, Habana 2001, Mayo 23 al 25, 2001, La Habana, Cuba
Xioma Rojas
950-7132-57-5 (c) 2001, Sociedad Cubana de Bioingeniería, artículo 00406
misma con la descripción de las diferentes partes que la
componen.
Cuando el sistema está montado completamente, el blo-
que de las muestras se encuentra aislado del ambiente, y
a esto contribuyen, tanto la cubierta exterior como la ta-
pa caliente. Esta última es una cubierta superior que po-
see la unidad de atemperamiento, la cual tiene la posi-
bilidad de alcanzar una temperatura tal que evita la con-
densación de las muestras dentro de los tubos de reac-
ción.
En la zona donde se encuentra ubicada la tarjeta de circuito
impreso ocupan espacio también la resistencia y el ele-
mento termoeléctrico Peltier (TEC) [4], ambos encargados
del atemperamiento del bloque de las muestras.
En la Fig. 2 se puede observar un esquema donde se mues-
tra la ubicación de los elementos de acción final en el inte-
rior de la unidad de atemperamiento.
Fig. 2: Ubicación de los EAF. (1) Bloque de muestras, (2) Re-
sistencia de papel grafitado, (3) Elemento Peltier (TEC), (4) Di-
sipador.
El disipador, en este caso tiene la función de bombear hacia
el ambiente el calor cuando al bloque de atemperamiento se
le está bajando la temperatura.
2.2. Descripción del sistema de control.
En la Fig.3 se muestra el esquema en bloques del sistema
de control diseñado para atemperar el bloque de las mues-
tras.
El TEC es el componente que más actúa en el proceso de
control de la temperatura en el bloque, y la resistencia (R)
ejecuta su función sólo durante las rampas de calentamiento
para lograr altas velocidades de cambio de la temperatura.
A diferencia de la resistencia, el TEC tiene la posibilidad de
realizar el calentamiento del bloque cuando se le hace pasar
corriente en un sentido, y de enfriarlo al hacerle pasar co-
rriente en sentido inverso.
Al introducir un valor en la referencia (TRef), los controlado-
res modifican el voltaje (VCR y VCP) en la entrada de los
respectivos circuitos de gobierno de los elementos de ac-
ción final (EAF), y la salida de esos circuitos es aplicada en
forma de corriente (IR e IP) con un valor constante a la re-
sistencia y el TEC.
De acuerdo a como sea el flujo de calor en el sistema que se
está controlando, el bloque de las muestras se calentará o
enfriará, y la variable temperatura se puede medir lo mismo
en el bloque que en un tubo similar a los que se usan con
las muestras reales. Los sensores usados en este equipo son
termistores previamente calibrados, cada uno de los cuales
forma parte de un circuito que da a su salida un voltaje que
está en función de latemperatura medida.
El programa de control del equipo es el encargado de reco-
lectar los datos medidos, convertirlos a valores de tempe-
ratura (T1 ó T4) y compararlos con el valor de referencia. La
señal de error resultante es utilizada entonces en la genera-
ción de una nueva señal de entrada a los circuitos de go-
bierno de los EAF.
Durante el trabajo del sistema, el disipador tiene que eva-
cuar el calor generado a partir del efecto Joule en los EAF.
Para ayudar en ese proceso existe un ventilador que se
encuentra ubicado en uno de los extremos laterales del
radiador y su objetivo es variar el flujo de aire en función
de la temperatura que se alcanza en el disipador, la cual se
mide a través del termistor 2. De la misma forma el ventila-
dor se utiliza para extraer el calor generado por los compo-
nentes que disipan potencia en el interior del equipo. El
programa de control del ventilador, partiendo de los valores
de temperatura T2 y T3 genera la señal de voltaje correspon-
dientes para tratar de mantener la temperatura del disipador
y del interior del equipo lo más cercano a la temperatura
ambiente.
En el esquema no aparece representado el sistema de con-
trol de la tapa caliente, sólo se puede observar la influencia
como perturbación que ejerce la temperatura de dicha tapa
en el bloque de las muestras. De cualquier manera éste
 1
2
3
4
Termistor 3
Control
del TEC
Circuito de
gobierno de
la R
Circuito de
gobierno del
TEC
TEC
Ventilador
R
Bloque
de mues-
tras
Muestra
Disipador
de Calor
Termistor 2
Termistor 1
Termistor 4
Control
de la R
TRef
TRefF
T2
TEF
TEP
TER
VCF
VCP
VCR
IF
IP
IR
TF
TP
TR
TD
T4
T1
TB TM
TT2
TI
TL
-+
-+
+
--
Circuito de
gobierno del
Ventilador
++
++
Fig. 3: Esquema en bloques del sistema de control.
sistema es similar al que se muestra para controlar el bloque
de las muestras a través del TEC, aunque funciona con una
resistencia. El calentamiento en este caso es por efecto
Joule y el enfriamiento se realiza por convección, al dejar
de alimentar el elemento resistivo.
2.3. Descripción general del equipo.
El Secuenciador Térmico es un equipo que basa su fun-
cionamiento en una computadora PC/XT compatible, que
se encarga del manejo de todos los dispositivos
acoplados a ella. De esta manera es posible el manejo de
una pantalla de cristal líquido y un teclado de membrana
de 16 teclas conectado de forma matricial. Ambos ele-
mentos constituyen el medio de comunicación del usua-
rio con el equipo. Al bus ISA de dicha computadora se
conecta una tarjeta denominada Adquisición de Datos y
Control que es la que permite recibir y procesar las se-
ñales procedentes de los sensores de temperatura y al
mismo tiempo es la encargada de enviar las señales de
control correspondientes a cada uno de los EAF. Entre
esta tarjeta y los EAF existe una interfaz que es la que
permite el manejo de las altas corrientes que consumen el
TEC y las resistencias de calentamiento. Dicha interfaz
tiene la característica de convertir señales de voltaje
pequeñas en valores de corriente del orden de los 10A, y
esto es debido al uso de convertidores PWM en el cir-
cuito, los cuales, unidos al uso de transistores MOSFET
de alta potencia y alta respuesta de frecuencia, permiten
aplicar el principio de las fuentes conmutadas para lograr
esos requerimientos de corriente de salida. La fuente con
que trabaja este circuito es de 40V de CD y permite un
consumo de potencia de 480W.
3. RESULTADOS
De acuerdo con los requerimientos que se trazaron en la
fase inicial de desarrollo, el equipo construido posee las
siguientes características:
• Tiene la posibilidad de intercambiar unidades de
atemperamiento.
• Rango de temperatura del bloque: entre 0º y 105ºC
• Exactitud de la temperatura: ±0.3ºC a 90ºC.
• Precisión en el control de la temperatura: ±0.1ºC.
• Homogeneidad térmica del bloque: ±0.5ºC.
• Velocidad o rampa de cambio de temperatura:
Rampa de calentamiento: 3ºC/s.
Rampa de enfriamiento: 1ºC/s.
• Capacidad de muestras:
Unidad con capacidad para 16 muestras de 0.5ml.
Unidad con capacidad para 25 muestras de 0.2ml.
• Tapa caliente donde se pueden alcanzar hasta 115ºC
de forma controlada.
• Interfaz con el usuario:
Teclado de 16 teclas y la pantalla de cristal líquido
4 líneas x 20 caracteres.
• Número de programas en memoria: 99 programas.
• Comunicación Serie: RS232C
• Entrada de alimentación.
Voltaje de entrada: 110 / 220 VAC, frecuencia: 50 /
60 Hz y potencia: 500W.
Estas especificaciones técnicas son el resultado de una
serie de experimentos que se desarrollaron durante la
fase de diseño y construcción del prototipo.
La Tabla I permite observar las especificaciones princi-
pales que poseen los secuenciadores térmicos de las
firmas más reconocidas que existen en el mercado inter-
nacional [3].
Tabla I
Características más significativas de algunos de los
equipos existentes en el mercado internacional.
Firma Biometra Hybaid MJResearch Techne
Equipo
Personal
Cycler
PCR
Sprint
PTC150 Progene
Mecanismo de
atemperamiento
Peltier Peltier
Peltier-
Joule
Peltier
Rango de tem-
peratura
4 a 100ºC 4 a 99ºC -9 a 105ºC 4 a 99ºC
Control de
temperatura
±0.1ºC ±0.1ºC ±0.1ºC ±0.1ºC
Exactitud ±0.5ºC ±0.5ºC ±0.3ºC ±0.2ºC
Uniformidad ±0.5ºC ±0.5ºC ±0.3ºC ±0.3ºC
Máxima rampa
de enfriamiento
>1.3ºC/s 2ºC/s 1.2ºC/s 2.2ºC/s
Número máxi-
mo de progra-
mas
100 60 80 50
Tapa Caliente Opcional Si Opcional Si
Las ecuaciones de control del sistema, logradas al final
de todo el proceso de desarrollo se describen a continua-
ción.
Para el control del bloque de las muestras se definió que
la ecuación del TEC es la siguiente:
( ) 5381.0z9567.0z367.1z346.1z
026.2z434.1z234.1z0.6
G
234
23
BM_LQG
z +⋅+⋅+⋅+
−⋅−⋅+⋅=
donde ( )
BM_LQG
zG es la función de transferencia del
controlador.
Dentro del mismo control del bloque, las ecuaciones de
la rampa de calentamiento son:
7146.0R5572.0R0229.0U esperada
2
esperadaTEC +⋅+⋅−=
TECRbloque U5724.0U ⋅=
donde UTEC y URbloque son las señales de control del ele-
mento Peltier y la resistencia del bloque respectivamen-
te, y Resperada es la rampa que se desea.
Y la ecuación para la rampa de enfriamiento es:
1019.4R308.13
R408.12R1372.4U
esperada
2
esperada
3
esperadaTEC
+⋅
+⋅+⋅=
Para el control de la tapa caliente la ecuación de
transferencia obtenida fue la siguiente:
( )
)17.0z24.0z37.0z95.0z66.0
z67.0z/()105.5z104.1
z107.2z17.0z41.0z75.0(G
234
561717
217345TC_LQG
z
+⋅+⋅+⋅+⋅
+⋅+⋅−⋅⋅
−⋅⋅+⋅+⋅+⋅=
−−
−
Para el control del ventilador se definieron 3 niveles de
comparación con la temperatura existente en el mismo
para enviar, respectivamente, 3 señales de voltaje cons-
tante con diferentes niveles de amplitud. En este caso,
para alimentar el motor se definieron 8V, 10V y 12.5V.
A modo de ejemplo, el gráfico de la Fig. 4 muestra el
comportamiento obtenido en el bloque y la tapa caliente
durante el funcionamiento. Los parámetros a cumplir
eran:
• Bloque de muestras: Paso 1Æ 100ºC
Paso 2 Æ 50ºC
• Tapa Caliente: Paso 1 Æ 10ºC por arriba de la
temperatura del bloque.
0
20
40
60
80
100
120
0 49,4 98,8 148,2 197,6 247 296,4
Tiempo (s)
T
em
pe
ra
tu
ra
 (
ºC
)
Tbloque
Ttapa
Fig. 4: Comportamiento del sistema bajo control.
4. DISCUSIÓN
Si se comparan las características del Secuenciador Tér-
mico descrito en este trabajo con las de otros equipos de
la competencia se puede ver que las mismas son simila-
res.
Por la complejidad de la unidad de atemperamiento, las
ecuaciones de control fueron obtenidas a partir de un
proceso que comenzó con la identificación de cada uno
de los sistemas a controlar de manera independiente. Una
vez obtenidas las ecuaciones de transferencia correspon-
dientes a la tapa y al bloque se procedió a obtener las
ecuaciones de control, usando las herramientas de com-
putación disponibles, entre las que están los programas
Delphi 4.0 y MATLAB 5.2. Unido a esto fue usada una
maqueta electrónica, donde se encontraban incluidos: la
computadora, la unidad de atemperamiento, latarjeta de
control y adquisición de datos que lleva el equipo y la
interfaz de manejo de los EAF.
5. CONCLUSIONES
Este es un proyecto cuyo objetivo principal desde el
principio fue el poder fabricar en Cuba un Secuenciador
Térmico para usarlo en la confirmación del diagnóstico
de la hepatitis C, lo que se hace hoy en día por métodos
que son invasivos para el cuerpo humano. La introduc-
ción del mismo en los laboratorios nacionales permitirá
llevar adelante un proyecto mucho más extenso, que
incluye la creación de un programa de diagnóstico de
enfermedades que se hará extensivo a todo el país.
El hecho terminado este trabajo con el cumplimiento de
los objetivos iniciales es un logro desde el punto de vista
tecnológico y de diseño, ya que los problemas encontra-
dos durante el desarrollo fueron resueltos en su mayoría
con tecnologías a las que Cuba tiene acceso y con el uso
de la inventiva de las personas que integraron el grupo
multidisciplinario que intervino en el mismo.
Es de destacar en este trabajo el diseño y construcción de
circuitos electrónicos complejos que han requerido de la
aplicación de técnicas modernas para el manejo de altas
frecuencias y altas corrientes.
También en este equipo ha sido diseñado un sistema de
control de lazo cerrado que constituye un paso superior
en el desarrollo de equipos de laboratorio en Cuba. El
control que ha sido necesario aplicar en este instrumento
es de gran complejidad, pues el sistema a controlar posee
más de una variable de entrada y de salida.
El Secuenciador Térmico se encuentra en estos momen-
tos en fase de Pre-producción y en los próximos meses
estará validado para su utilización dentro del Sistema
Nacional de Salud.
REFERENCIAS
[1] A. Rolfs, I. Schuller, U. Finckh and I. Weber-Rolfs, “PCR
Principles and Reaction Components”, PCR: Clinical Diagnos-
tics and Research, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 1-
21, 1992.
[2] A. Rolfs, I. Schuller, U. Finckh and I. Weber-Rolfs, “Physical
Features of Thermocyclers and Their Influence on the Effi-
ciency of PCR Amplification”, PCR: Clinical Diagnostics and
Research, Springer-Verlag Berlin Heidelberg, pp. 259-262,
1992.
[3] M. Brush, “Up on Blocks: A Profile of Thermal Cyclers With
Interchangeable Blocks”, The Scientist, vol. 12, #20, pp-21-23,
October 12, 1998.
[4] Melcor Thermoelectrics, “Frigichip® Thermoelectric Cooling
Devices” , Thermoelectric Engineering HandBook, Melcor
Corporation, 2000.
THERMAL CYCLER FOR MOLECULAR BIOLOGY
LABORATORIES
ABSTRAC
This work is the synthesis of a whole development process of a thermal cycler for Molecular Biology labs. This
device functions as an DNA or RNA chain amplifier. The DNA or RNA being extracted from blood samples of
patients. The device takes advantage of the polimerasa chain reaction, that occurs on the execution of a series of
steps in which the sample processed reaches certain different temperature values in a controlled form and during
programmed times. The device has a tempering unit in which the samples to process are to be placed. The unit, in
order to achieve and maintain the temperature levels required includes a thermoelectric device that can achieve
3ºC/s and 1ªC/s during heating and cooling respectively. An important issue of this work is the controller. This
controller is the result of an internal program assembled into the internal memory of the device. Equally important
are the electronic circuits designed and implemented to govern the final action elements. Similar importance must
be given to the control equations that have been applied to the system. They are, in turn, the result of a process
that included the use of several modern computations tools. The possibility that this kind of equipment can be
fabricated in Cuba is just a part of a join Molecular Biology project, in wish several institutes from the Scientific
Pole take part, and will reach its maximum point with its introduction to the National Health System.