Munoz J_Thesis 2009

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© Las fotos de Artemia de la portada y contraportada han sido tomadas y modificadas 
de la página web del Prof. Robert A. Browne y la Univ. de Urmia, respectivamente. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Implicaciones de la dispersión actual e histórica para 
la biología evolutiva y conservación de Artemia y 
otros invertebrados acuáticos con estadio de diapausa 
 
 
 
 
 
 
 
 
TESIS DOCTORAL 
Joaquín Muñoz García 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Estación Biológica de Doñana – 2009 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Implicaciones de la dispersión actual e histórica para 
la biología evolutiva y conservación de Artemia y 
otros invertebrados acuáticos con estadio de diapausa 
 Memoria presentada por el Licenciado Joaquín Muñoz García para optar al título de 
 Doctor en Biología por la Universidad de Sevilla 
 
Fdo.: Joaquín Muñoz García 
 
 Directores 
 
 Dr. Andy J. Green Dr. Ciro Rico 
 Estación Biológica de Doñana – CSIC Estación Biológica de Doñana – CSIC 
 
 Dr. Jordi Figuerola Borras 
 Estación Biológica de Doñana – CSIC 
 
 
 Tutora 
 
 Dra. Laura Serrano Martín 
 Departamento de Biología Vegetal y Ecología 
 Universidad de Sevilla 
 
Sevilla, ..10.. de ..JULIO.. de 2009 
 
Estación Biológica de Doñana – 2009 
 
 
 i 
 
 
 
 
 
Implicaciones de la dispersión actual e histórica para 
la biología evolutiva y conservación de Artemia y 
otros invertebrados acuáticos con estadio de diapausa 
 
 
ÍNDICE GENERAL 
 
Agradecimientos 1 
 
 
Introducción general 4 
 
 
Capítulo 1: Metodología 20 
 
- Montero-Pau J, Gómez A and Muñoz J. 2008. Application of an inexpensive and 
high-throughput genomic DNA extraction method for the molecular ecology of 
zooplanktonic diapausing eggs’. Limnology and Oceanography: Methods, 6: 218-
222 
 
- Muñoz J, Green AJ, Figuerola F, Amat F and Rico C. 2009. Characterization of 
polymorphic microsatellite markers in the brine shrimp Artemia (Branchiopoda, 
Anostraca). Molecular Ecology Resources, 9(2): 574-550 
 
 
Capítulo 2: Filogeografía 32 
 
- Muñoz J, Gómez A, Green AJ, Figuerola J, Amat F and Rico C. 2008. 
Phylogeography and local endemism of the native Mediterranean brine shrimp 
Artemia salina (Branchiopoda: Anostraca). Molecular Ecology, 17: 3160-3177 
 
 
Capítulo 3: Origen e historia de la partenogénesis 55 
 
- Muñoz J, Gómez A, Green AJ, Figuerola J, Amat F and Rico C. 2009. Evolutionary 
origin and range expansion of parthenogenetic brine shrimp Artemia 
(Branchiopoda: Anostraca). Heredity, EN REVISIÓN 
 
 
 
 
 ii 
Capítulo 4: Invasiones biológicas 69 
 
- Muñoz J, Gómez A, Green AJ, Figuerola J, Amat F and Rico C. 2009. Colonization 
and dispersal patterns of the invasive American brine shrimp (Artemia franciscana) 
in the Mediterranean. EN PREPARACION 
 
 
Capítulo 5: Biodiversidad y conservación 89 
 
- Muñoz J and Pacios F. 2009. Global biodiversity and geographical distribution of 
diapausing aquatic invertebrates: The case of the cosmopolitan brine shrimp 
Artemia (Branchiopoda, Anostraca). Crustaceana, ACEPTADO 
 
- Muñoz J. 2009. Diversity and distribution of diapausing aquatic invertebrates in 
worldwide inland lakes: An ecosystem conservation viewpoint. Journal for Nature 
Conservation, EN PRENSA (doi: 10.1016/j.jnc.2009.02.006) 
 
 
Conclusiones 119 
 
 
Bibliografía 122 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis hermanos 
 
(La hermandad no sólo se concilia por vínculos de sangre. 
Momentos de risas y llantos, visitas a talleres y desguaces, 
y sobre todo, almas y corazones de buena voluntad 
aúnan a las personas más fuertemente 
que los propios genes heredados) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
_______________________________________________________ Agradecimientos 
Agradecimientos 
 
Este apartado podría hacerse interminable…ya que las personas y circunstancias que me 
han rodeado mucho antes, antes y durante el desarrollo de este trabajo han sido muchas. 
De manera que para hacerlo lo más escueto posible, he abogado por la cronología de los 
hechos. 
 
Mis padres (Joaquín y Ana de la Cruz), y resto de mi familia, han sido un pilar 
fundamental en mi educación y formación desde que tengo uso de razón, y sobre todo 
desde el momento que decidí estudiar Biología (‘esa carrera universitaria que era para 
personas soñadoras, y con vocación y altruismo por la Naturaleza’). Una vez que obtuve 
el título de Licenciado no han parado de orientarme y preocuparse por mi bienestar 
profesional. Ellas son las únicas personas que siguen sin saber a qué me dedico 
exactamente y qué finalidad tiene este ‘trabajo’. Pero su Fe y Confianza ciega en mi no 
les han llevado a dudar en ningún momento que lo que hacía estaba bien y era bien para 
mi. ¡Eso es AMOR!. 
 
Por suerte, a lo largo de mi vida he estado rodeado por muchas mujeres – aquellas 
personas que me conocen bien saben que son ¡mi delirio! - mis abuelas, Dona y Juana, 
mis tías Encarna, Paula, Prado, Loli, Julia, Elvira, Carmen, Clara, Nani, Salud, Avelina, 
y mi hermana (y sus dos hijas, Cristina y Marta). Durante los años de Tesis se incorporó 
a esta lista una ‘madre adoptiva’, Inés, quien sin conocer al resto de mi familia pareciera 
un componente más de ella. De todas ellas aprendí a organizarme, a poner todos mis 
sentidos en lo que quiero, a ser optimista en momentos difíciles, a afrontar los 
problemas y errores, a aceptar mis limitaciones, y lo más importante, a tener 
sensibilidad y respeto por las personas que tengo a mi alrededor. Evidentemente, hay 
muchas más mujeres que fueron parte muy importante en mi vida en estos años de 
doctorando, y que por varios motivos no nombro aquí, pero eso es otra historia… 
 
En el ámbito de la formación y profesionalización, a lo largo de mi carrera como 
biólogo me he encontrado a muchas personas que, sin saber por qué, han confiado en mi 
plenamente. Desde mis primeros contactos con las técnicas moleculares y sus 
aplicaciones gracias a Tahía Benítez, pasando posteriormente por Juan Arroyo, José 
Antonio Godoy y Pedro Jordano, he sentido su confianza y aprendido a conectar el 
trabajo desarrollado por los ecólogos (los llamados en mis tiempos ‘biólogos de 
2
Agradecimientos _______________________________________________________ 
campo’) con las tareas desarrolladas por los biólogos moleculares (lo llamados 
‘biólogos de bata’). Una conciliación de conocimientos interesantísima y apasionada 
que puede llegar a enganchar como una ‘droga’. Gracias a ell@s, y otr@s much@s 
profesionales de la Estación Biológica de Doñana, he podido desarrollar mi trabajo 
como mejor he sabido y siempre con entusiasmo. El proyecto de Tesis se lo debo 
principalmente a Andy Green, Ciro Rico y Jordi Figuerola, quienes confiaron que 
podría sacar cosas más o menos interesantes de mis ‘adorables Artemias’. Su apoyo en 
la financiación, formación, orientación y discusión, y la libertad que me han dado 
para desarrollar ideas y manuscritos han sido cruciales para terminar este proyecto. Sin 
embargo, sin el apoyo y la colaboración de otr@s grandes profesionales como Francisco 
Amat, Peter Buston, África Gómez, Xavi Picó, y colegas coetáne@s como Miguel 
Alcaide, Juan Miguel Arroyo, Juan Antonio Galarza, Juan Luís García y Caty Monzón, 
entre otr@s, lo que hoy puedes leer en estas hojas encuadernadas no tendría el formato 
que presenta, ¡te lo garantizo!. 
 
¡Ni que decir tiene que todo este tiempo de Tesis, y anterior, no ha sido exclusivamente 
dedicado al trabajo!. No creo que pueda nombrar a las docenas de personas vinculadas 
directa o indirectamente a la EBD con las que he compartido un chiste, un puro 
(¿verdad Manolo?), una copa, un baile, un cante, un ‘momento Boris’, o un brindis. 
Pero si estás leyendo este apartado de agradecimientos, sabes que me refiero a ti. 
¡Muchas graciaspor esos buenos momentos!. 
3
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Introducción general 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
____________________________________________________ Introducción general 
 
Introducción general 
 
Biología de invertebrados acuáticos con diapausa 
 
Existe un amplio abanico de organismos invertebrados acuáticos (anostrácodos, 
briozoos, cladóceros, copépodos, notostrácodos, rotíferos) que, además de habitar en 
ecosistemas acuáticos marinos, marismas y riberas, son muy abundantes en ecosistemas 
no marinos aislados hidrológicamente entre si como lagos, lagunas, salinas y cuerpos de 
aguas temporales. Estas zonas se caracterizan por tener una alta variación e 
inestabilidad en sus parámetros abióticos: composición iónica, grado de salinidad, 
extensión, profundidad, etc. Para afrontar el carácter temporal e impredecibilidad 
ambiental de dichos hátibats, estos organismos producen durante su ciclo de vida 
huevos en un estadio estacionario del desarrollo (embriones enquistados), 
permitiéndoles sobrellevar las condiciones desfavorables (bióticas y/o abióticas) para su 
desarrollo, permaneciendo vivos pero sin eclosionar. Esta fase se conoce como 
diapausa, y los huevos producidos se denominan huevos de resistencia (‘resting eggs’), 
huevos diapausa (‘diapausing eggs’), o quistes (‘cysts’). Estas estructuras de resistencia 
son capaces de soportar condiciones ambientales extremas y formar bancos de quistes 
en un estadio de dormancia, similar a los bancos de semillas vegetales, en los 
sedimentos de lagos, lagunas y salinas que habitan (Proctor et al. 1967; Carlisle 1968; 
Hairston 1996). La función principal de los huevos de resistencia es asegurar la 
persistencia de la población, pero igualmente importante es el papel que cumplen como 
propágulos de dispersión. El viento, su adhesión al cuerpo de algunos vertebrados y la 
ingesta por aves acuáticas son los principales vectores de dispersión de los huevos de 
resistencia entre los distintos cuerpos de agua (Figuerola et al. 2005). Estas 
características tan peculiares definen a estos organismos como ‘invertebrados acuáticos 
con estadio de diapausa y dispersión pasiva’, y los convierten en interesantes modelos 
biológicos para estudios destinados a la ecología, especiación, y evolución de las 
especies y sus poblaciones en diversos grupos del zooplancton no marino (De Meester 
et al. 2002; Gómez et al. 2002; Adamowicz & Purvis 2005; Gómez 2005; Ishida & 
Taylor 2007). 
 
En líneas generales, en los invertebrados acuáticos con dispersión pasiva podemos 
encontrar tres modos distintos de reproducción: Sexual obligada (machos/hembras), 
partenogénesis obligada (hembras) y partenogénesis cíclica (machos/hembras; Fig. 1). 
5
Introducción general ____________________________________________________ 
 
Las especies con reproducción partenogenética cíclica tienen una fase partenogenética 
durante los periodos en que las condiciones ambientales son idóneas para su desarrollo. 
Cuando aparecen las condiciones desfavorables, activan la reproducción sexual, 
pudiendo solapar ambos tipos de reproducción si las condiciones ambientales son 
impredecibles. Esta estrategia evolutiva permite monopolizar los recursos del hábitat a 
un determinado grupo de ‘clones’ genéticos favorecidos durante la fase de colonización 
inicial, aumentando el número de éstos producidos mediante partenogénesis, y al mismo 
tiempo permite aumentar la diversidad genética de la descendencia por la reproducción 
sexual generando un pool genético lo más variable posible que afronte las nuevas 
condiciones ambientales. 
 
Fig. 1. Representación esquemá-
tica de la reproducción parteno-
genética cíclica en Daphnia sp. 
(Crustáceo – Cladocero) indican-
do la fase sexual y partenogené-
tica (asexual) del ciclo reproduc-
tor, así como la fase béntica en 
adultos y pelágica durante el es-
tadio de dormancia (huevos de 
resistencia). Esquema modifica-
do de De Meester et al. (2006). 
 
 
 
 
 
 
 
Por otro lado, tanto la teoría como ciertas evidencias empíricas predicen distinta 
capacidad de adaptación a las condiciones ambientales locales dependiendo del tipo de 
reproducción que desarrolle cada especie (De Meester et al. 2002). Así, las especies con 
reproducción partenogenética cíclica tendrían una mayor capacidad de adaptación local 
respecto a las especies obligadamente sexuales o partenogenéticas. Los principales 
factores que confieren esta diferencia adaptativa a las especies con reproducción 
partenogenética cíclica son la posibilidad de combinar recombinación meiótica, que se 
produce en la fase sexual, y la selección y dispersión de clones genéticos, que se 
producen en la fase partenogenética. De modo similar, se prevé una mayor capacidad de 
adaptación local en especies con reproducción sexual obligada frente a aquellas con 
reproducción partenogenética obligada, principalmente por la capacidad de generar 
mayor diversidad genética mediante la recombinación meiótica. 
 
Estos aspectos evolutivos de los organismos invertebrados acuáticos con diapausa 
6
____________________________________________________ Introducción general 
 
tienen una implicación directa sobre la estructuración genética de sus poblaciones 
presentando una aparente paradoja entre el alto potencial de dispersión (facilitada por 
viento y aves) y el reducido flujo génico entre poblaciones encontrado en estudios 
recientes. Por un lado, Boileau et al. (1992) atribuyeron las causas para explicar esta 
paradoja tanto a la alta tasa de crecimiento que estos organismos tienen una vez 
establecidos en un nuevo hábitat no ocupado previamente, monopolizando los recursos 
del sistema rápidamente, como al corto tiempo de generación que tienen, evitando en 
gran medida cambios en las frecuencias alélicas que puedan provenir del flujo génico 
inter-poblacional. Este ‘efecto fundador’ (es decir, rápida proliferación de genotipos 
fundadores de un hábitat recién colonizado) se convertirá en un ‘efecto fundador 
persistente’ detectable a lo largo del tiempo debido a la gran cantidad de propágalos en 
estadio de dormancia (huevos de resistencia o quistes) que existen en los sedimentos de 
cada población. Por otro lado, autores como De Meester et al. (1996) y Okamura & 
Freeland (2002) mostraron resultados sobre la rápida adaptación a las condiciones 
ambientales locales a nivel intra-poblacional reduciendo fuertemente el proceso de flujo 
génico efectivo sobre las poblaciones estudiadas. Este proceso aumentaría la 
persistencia del ‘efecto fundador’ descrito previamente por Boileau et al. (1992). Una 
combinación de ambos procesos (efecto fundador persistente y adaptación local) 
proporcionó la base para desarrollar la llamada ‘Hipótesis de Monopolización' (Fig. 2; 
De Meester et al. 2002) que podría explicar la discrepancia existente entre la alta 
capacidad de dispersión y reducidos niveles de flujo génico encontrada en organismos 
acuáticos tanto animales como algunas macrófitas. 
 
Fig. 2. Esquema tomado de De 
Meester et al. (2002) mostrando 
un ejemplo teórico del ‘efecto 
fundador’ (Boileau et al. 1992) en 
invertebrados acuáticos dispersa-
dos de manera pasiva con una 
alta tasa de crecimiento. La lle-
gada de un genotipo a un hábitat 
disponible se ve favorecida por la 
alta tasa de crecimiento y corto 
tiempo de generación (en el caso 
de rotíferos 1 ind./día). El creci-
miento será exponencial, y en el 
supuesto de no existir inter-
acciones competitivas, idéntico 
‘fitness’ y un inmigrante por se-
mana, se calcula una tasa inmi-
grante/residente de 1/128 en la 
primera semana, 1/8256 tras dos semanas, y 1/106 después de transcurrir tres semanas tras la primera 
colonización del hábitat. Con el paso de las generaciones, este efecto mantendrá en una altísima 
proporción el genotipo originario y se verá acentuado en favor de los residentes si asumimos que se 
produce adaptación de éstosa las condiciones locales. 
7
Introducción general ____________________________________________________ 
 
Dispersión y estructura genética de las poblaciones de invertebrados acuáticos con 
diapausa 
 
La dispersión de invertebrados acuáticos que habitan ecosistemas marinos y ríos se 
puede producir a través de las corrientes de agua entre los distintos cuerpos de agua. Sin 
embargo, el movimiento de individuos entre los sistemas acuáticos de interior (‘inland 
wetland’), aislados entre si, se produce principalmente mediante las aves acuáticas que 
ingieren los huevos de resistencia, o los transportan adheridos al cuerpo. El transporte y 
dispersión por aves en plantas (semillas) e invertebrados acuáticos (huevos de 
resistencia) ya fue propuesto por Darwin (1859) para explicar la amplia distribución 
geográfica de estos organismos. Sin embargo, los estudios empíricos en este sentido son 
meramente anecdóticos y escasos (Figuerola & Green 2002; Green & Figuerola 2005; 
Green et al. 2008). 
 
Aunque la alta capacidad de dispersión y colonización de estos organismos sugiera una 
homogenización y alto flujo génico entre sus poblaciones, estudios recientes que 
utilizan marcadores moleculares han mostrado una alta diferenciación genética entre 
poblaciones incluso entre aquellas separadas por poca distancia (Gómez et al. 2007; 
Zierold et al. 2007). El papel relativo que las aves acuáticas pueden tener en la 
estructuración genética de las poblaciones de invertebrados acuáticos también ha sido 
abordado en estudios recientes (Figuerola et al. 2005). En términos generales, los 
trabajos más recientes (incluida esta Tesis) muestran un alto endemismo regional y local 
de linajes genéticos dentro de especies. En este sentido, cabe destacar que las especies 
de invertebrados acuáticos con diapausa que presentan dichos patrones de 
diferenciación geográfica entre sus linajes genéticos tienen reproducción sexual 
obligada o partenogénesis cíclica, mientras que las especies con reproducción 
partenogenética obligada presentan un patrón diferente, pudiendo encontrar genotipos 
multilocus y haplotipos mitocondriales distribuidos en un amplio rango geográfico 
(Weider et al. 1999; De Meester 1996). 
 
Un factor, relativamente reciente, a tener en cuenta en la dispersión de estos organismos 
con dispersión pasiva es el transporte de huevos de resistencia debido a actividades 
antropogénicas, es decir, el hombre como vector de dispersión. En un mundo 
globalizado, el papel del hombre sobre el movimiento de individuos de una población a 
otra separadas por miles de kilómetros atravesando barreras biogeográficas es un 
8
____________________________________________________ Introducción general 
 
proceso claramente descrito en invertebrados acuáticos (Panov et al. 2004) pudiendo 
tener efectos tanto en la estructura de las poblaciones como en la expansión de rango de 
dichas poblaciones por su introducción en áreas no nativas. En algunos casos estas 
introducciones accidentales consiguen colonizar y establecerse con éxito en el nuevo 
rango geográfico convirtiéndose en especies invasoras (Wilson et al. 2009), provocando 
en ocasiones el desplazamiento y la extinción local de especies autóctonas, cambios en 
la dinámica de los ecosistemas afectados, y causando graves pérdidas económicas, 
impactos todos ellos muy difíciles de solventar. 
 
Conservación de ecosistemas acuáticos no marinos: La importancia de 
invertebrados acuáticos 
 
Al contrario de lo que se pensaba hace décadas, en la actualidad se ha demostrado que 
los ecosistemas acuáticos son uno de los sistemas más vulnerables a las invasiones 
biológicas (Sakai et al. 2001; Grosholz 2002). Debido a la concienciación socio-política 
sobre el cambio global y la conservación de la biodiversidad, entre otros motivos, el 
estudio de las invasiones biológicas es ha incrementado en últimos años. 
 
Concretamente los ecosistemas acuáticos de interior (‘inland wetlands) distribuidos por 
todo el mundo, y los humedales en general, han sido tenidos en cuenta en aspectos de 
conservación y esfuerzos de manejo a nivel internacional por la presencia tanto de 
especies de vertebrados amenazados como de grandes masas vegetales (Convention 
wetland 1971; De Roeck et al. 2007; Muñoz 2007). Así, el uso de ‘especies paraguas’ 
(es decir, especies con cuya conservación y protección del hábitat acogen 
indirectamente a otras especies que se ven beneficiadas en su propia protección) ha sido 
una de las principales herramientas en las políticas de conservación. Como describe 
Belk (1998): ‘En términos prácticos, un hábitat es a veces conservado por la 
importancia de algunas especies o grupo de especies que son foco de interés para el 
hombre’. Sin embargo, los humedales como ecosistemas siguen siendo fuertemente 
alterados en su dinámica hidrológica y salinidad, y están sujetos a una gran presión de 
especies invasoras (Dudgeon et al. 2006; Velasco et al. 2006; Balian et al. 2008). Por 
ejemplo, en crustáceos que ocupan humedales, la tasa de dispersión mediada por el 
hombre se ha calculado en hasta 50.000 veces por encima de la tasa de dispersión 
natural (Hebert & Cristescu 2002), cabiendo destacar que la detección de especies de 
invertebrados acuáticos invasores puede permanecer oculta durante décadas debido la 
9
Introducción general ____________________________________________________ 
 
alta frecuencia de especies crípticas y gemelas en estos organismos, siendo necesario en 
muchos casos la utilización de métodos moleculares para identificarlas (Mergeay et al. 
2005, 2007). Afortunadamente, desde hace unos años existe una tendencia a considerar 
la conservación de los espacios naturales y ecosistemas en su conjunto sin tender a 
acotar la importancia de las especies que en ellos habitan (Picó & Groenendael 2007; 
Clucas et al. 2008). Desde finales de los años 90 se comenzó a debatir la importancia de 
los invertebrados acuáticos para que fuesen incorporados en las estrategias de 
conservación (New 1995), lo que implica un cierto avance en cuanto a la preservación 
de humedales en su conjunto, como un sistema completo, abogando no solo por la 
conservación de su flora y fauna sino también por el mantenimiento de su dinámica 
interna como ecosistema. 
 
Un modelo de estudio: Artemia 
 
La primera descripción de Artemia ocurrió en una población actualmente extinta de 
Lymington (Inglaterra) a mediados del S. XVIII, siendo identificada por Linneo (1758) 
como Cancer salinus. Muchos años después, Leach (1819) renombró a este organismo 
como Artemia salina. Desde entonces, A. salina ha sido utilizada como único ‘binomen’ 
para definir de forma generalizada a todas las especies pertenecientes al género Artemia. 
A pesar de los avances producidos en la clasificación taxonómica de este género desde 
la segunda mitad del S. XX, principalmente por el uso de herramientas moleculares y 
análisis filogenéticos (Clark & Bowen 1976; Abreu-Grobois & Beardmore 1982; 
Abatzopoulos et al. 2002; Baxevanis et al. 2006), aun se pueden encontrar referencias 
bibliográficas que continúan asignando de modo genérico el nombre A. salina (Acey et 
al. 2002; Gul et al. 2003; Taylor et al. 2005) para describir poblaciones ampliamente 
estudiadas de los Estados Unidos identificadas inequívocamente como A. franciscana. 
 
Desde su descripción, Artemia ha sido utilizada como organismo modelo para estudiar 
diversos aspectos biológicos tales como toxicología ambiental (Barahona & Sanchez-
Fortun 1999; Colombo et al. 2001), caracterización cromosómica (Papeschi et al. 2008), 
tasas de evolución genética y relaciones filogenéticos (Pérez et al. 1994; Hebert et al. 
2002), adaptación y resistencia a la salinidad (Sáez et al. 2000), especiación, 
hibridación y evolución de la reproducción sexual y asexual (Baxevanis et al. 2006; 
Kappas et al. 2009). Así, Artemia ha sido denominada de manera simbólica poralgunos 
autores como la “Drosophila acuática” (Gajardo & Beardmore 2001) por sus cualidades 
10
____________________________________________________ Introducción general 
 
de manejo y experimentación en laboratorio, y debido a su carácter cosmopolita, 
taxonomía relativamente simple y utilidad como organismo modelo ha sido objeto de 
varios libros monográficos (Persoone et al. 1980; Sorgeloos et al. 1987; Abatzopoulos 
et al. 2002). 
 
Aunque los aspectos genéticos, filogenéticos y evolutivos del género han sido 
estudiados desde los años 80 (Abreu-Grobois 1983, 1987; Bowen et al. 1980; Bowen et 
al. 1985; Browne 1988; Browne & MacDonald 1982), aún a día de hoy siguen 
existiendo debates sobre la descripción taxonómica de las distintas especies y surgiendo 
nuevos linajes genéticos. Por ejemplo, la especie A. tibetiana fue descrita como un 
nuevo taxon hace a penas 10 años (Abatzopoulos, Zhang, and Sorgeloos 1998). 
Actualmente estudios asistidos con las nuevas técnicas moleculares, incluida la presente 
tesis, plantean una re-evaluación taxonómica del género proponiendo nuevos linajes 
genéticos para su revisión (Tizol-Correa et al. 2009). 
 
El género Artemia (Crustáceo – Braquiópodo – Anostrácodo), comúnmente llamado 
camarón de salmuera, ‘brine shrimp’ en inglés, tiene reconocido seis especies con 
reproducción sexual obligada (A. salina, A. franciscana, A. urmiana, A. tibetiana, A. 
sinica, A. persimilis) y varios linajes partenogenéticos obligados con distinta ploidía 
(2n, 3n, 4n y 5n) (Gajardo et al. 2002; Baxevanis et al. 2006). Las especies sexuales 
tienen una clara delimitación geográfica, mientras que las partenogenéticas se 
encuentran distribuidas de forma extensa por todo el continente Euroasiático, África, 
Madagascar, Australia y Nueva Zelanda, es decir, una distribución global excepto en el 
continente Americano (Fig.3). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
11
Introducción general ____________________________________________________ 
 
 
Fig. 3. Mapa de distribución global de las distintas especies de Artemia. Las localizaciones de A. 
franciscana (amarillo) en el continente Euroasiático, África, Madagascar, Australia, y Nueva Zelanda son 
consideradas poblaciones invadidas por esta especie. Los datos geográficos están tomados de uno de los 
trabajos en vías de publicación de esta Tesis. 
 
Son organismos ovovivíparos cuando las condiciones son favorables para su desarrollo, 
y forman huevos de resistencia (quistes) en condiciones ambientales adversas 
(ovíparos). Artemia está catalogada como un organismo halofílico extremo pudiendo 
soportar concentraciones salinas hasta 10 veces la salinidad del mar (45 g/L – 370 g/L; 
Browne & Hoopes 1990). Además, la composición iónica de las sales puede ser muy 
diferente (Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Cl-, SO42-, CO32- ; Zúñiga et al. 1999; Van Stappen 
2002). Los hábitats hipersalinos ocupados por Artemia, salinas, lagunas y lagos, se 
encuentran separados, física e hidrológicamente, formando parches (ecosistemas tipo 
‘islas ecológicas’) distribuidos tanto en áreas costeras como de interior en toda la Tierra, 
excepto en la Antártica (Triantaphyllidis et al. 1998). 
 
De entre las especies comprendidas en el género Artemia, la más estudiada ha sido A. 
franciscana. Esta es una especie sexual originaria del continente Americano cuyos 
quistes han sido comercializados en todo el mundo desde los años 50 como alimento 
para peces alevines cultivados en piscifactorías (Lavens & Sorgeloos 2000). Su gran 
interés económico ha sido el principal incentivo para optimizar en esta especie las 
formas de obtener mayores rendimientos estudiando aspectos sobre su fertilidad, 
maduración y tiempos de generación (Wear et al. 1986; Triantaphyllidis et al. 1994) o 
contenido en ácidos grasos (Malpica-Sánchez et al. 2004; Ruiz et al. 2007). Sin 
embargo, su carácter invasor en áreas no nativas, debido principalmente a la inoculación 
12
____________________________________________________ Introducción general 
 
accidental por efluentes procedentes de la acuicultura, ha sido demostrado en regiones 
como la Cuenca Mediterránea (Amat et al. 2005, 2007; Mura et al. 2006), Australia 
(McMaster et al. 2007), Irán (Abatzopoulos et al. 2006), China (Van Stappen et al. 
2007) y Japón (Mito & Uesugi 2004). Directa o indirectamente este hecho ha sido un 
impulso para abordar estudios sobre la genética de poblaciones, análisis filogenéticos y 
filogeográficos (Baxevanis et al. 2006; Tizol-Correa 2006; Kappas et al. 2009), e 
implicaciones de la invasión en otras especies de Artemia (Mura et al. 2006; Amat et al. 
2005, 2007), proporcionando datos novedosos sobre la diferenciación genética entre 
poblaciones de anostrácodos, endemismos genéticos, especiación e hibridación. 
 
Por último, destacar el papel de las especies de Artemia como hospedadores intermedios 
para parásitos (cestodos) cuyo hospedador final son las aves acuáticas. Los análisis 
comparativos sobre la abundancia y prevalencia de estos parásitos entre la especie 
invasora (A. franciscana) y especies autóctonas (A. salina y A. parthenogenetica), han 
supuesto un avance sobre los posibles aspectos que le confieren ventajas competitivas a 
la especies invasora (Georgiev et al. 2007) y su efecto potencial sobre la dinámica de 
los humedales hipersalinos. Las especies autóctonas infectadas se vuelven de coloración 
anaranjada y adquieren un comportamiento fotofílico aproximándolas a la superficie del 
agua, haciéndolas fácilmente accesibles a los predadores y últimos hospedadores de 
parásitos, las aves. En este sentido, la ausencia o menor prevalencia de parásitos 
conferiría una ventaja a la especie invasora, ya que la menor infección por cestodos les 
permitiría evitar ser presa de las aves acuáticas. 
 
Estructuración y cuestiones que aborda esta Tesis 
 
Esta Tesis Doctoral se enmarca en aspectos ecológicos y evolutivos como la 
Filogeografía, Evolución de poblaciones asexuales, Invasiones biológicas y Diversidad 
y conservación enfocados en distintas especies de Artemia con reproducción sexual y 
asexual (A. salina, A. parthenogenetica, A. franciscana) relacionándolas con otras 
especies de Artemia y diferentes invertebrados acuáticos con estadio de diapausa. Esta 
memoria incluye algunos de los avances recientes en estudios sobre las implicaciones 
evolutivas de la dispersión y estructuración poblacional en anostrácodos así como 
algunos patrones de colonización e invasión de la especie invasora. 
 
 
13
Introducción general ____________________________________________________ 
 
Así, esta Tesis se estructura en los siguientes capítulos, que corresponden a trabajos 
científicos ya publicados o en vías de publicación: 
 
Capítulo 1: Metodología. Los trabajos en Ecología Molecular sobre organismos para 
los que las técnicas y métodos están poco desarrollados requiere una tarea inicial de 
desarrollo y optimización para aplicarlos a posteriori. En este capítulo se describen y 
caracterizan dos herramientas necesarias, o al menos útiles, para abordar este tipo de 
trabajos. Por un lado, se optimiza y describe un método de extracción de ADN, y sus 
ventajas frente a los métodos ampliamente utilizados hasta ahora, a partir de huevos de 
resistencia para su uso en técnicas que utilicen la PCR aplicable de una variedad de 
invertebrados acuáticos (cladóceros, rotíferos, anostrácodos, notostrácodos y 
copépodos). Y por otro lado, a nivel más específicos (Artemia – anostrácodo) se 
describen y caracterizan los primeros marcadores microsatélites polimórficos 
desarrollados en este género, y se muestra su utilidad para asignación poblacional y su 
relevancia para estudios en genética de poblaciones y procesos de invasión en la especie 
A. franciscana. Estos trabajos están publicados en Limnology and Oceanography: 
Methods (2008) 6, 218-222 y Molecular Ecology Resources (2009) 9(2), 574-550, 
respectivamente.Capítulo 2: Filogeografía. Este capítulo analiza la diversidad genética de Artemia 
salina a lo largo de toda su distribución geográfica (Cuenca Mediterránea y Sudáfrica) 
encontrando una alta estructuración poblacional y linajes endémicos a lo largo de toda 
la región Mediterránea con algunos linajes evidenciando dispersión a larga distancia. 
Así mismo, se define un linaje altamente divergente en Sudáfrica proponiendo su re-
evaluación taxonómica. A pesar de que las poblaciones de Artemia (sistemas acuáticos 
salinos) han estado íntimamente relacionas a la producción de sal por parte del hombre 
durante milenios, los resultados obtenidos en este capítulo apuntan a que su diversidad 
genética y estructuración no ha sufrido un impacto detectable por el manejo tradicional 
de dichas salinas. Este trabajo está publicado en Molecular Ecology (2008) 17, 3160-
3177. 
 
Capítulo 3: Origen e historia de la partenogénesis. En este capítulo se analiza la 
diversidad genética de una especie/estirpe partenogenética de Artemia (Artemia 
parthenogenetica diploide). Como es esperado en organismos con reproducción 
partenogenética obligada, la estirpe diploide partenogenética de Artemia muestra una 
14
____________________________________________________ Introducción general 
 
diversidad muy reducida y haplotipos que son compartidos por la mayoría de las 
poblaciones a lo largo de todo su amplio rango de distribución geográfica. Los pocos 
haplotipos encontrados y la enorme similitud entre ellos sugieren una rápida expansión 
geográfica de esta estirpe desde su origen. Adicionalmente, los resultados obtenidos 
apuntan a la localización geográfica del origen de la partenogénesis en este género en 
Asia Central, a diferencia de lo que había sido sugerido hasta ahora suponiendo su 
origen en el Mediterráneo. Actualmente este trabajo está en revisión en la revista 
Heredity. 
 
Capítulo 4: Invasiones biológicas. Como un corolario al establecimiento exitoso de las 
poblaciones introducidas por el hombre, en invertebrados acuáticos con diapausa a este 
hecho le sigue un proceso de dispersión por mecanismos naturales (corrientes de agua, 
viento, aves), teniendo mayores consecuencias a la hora de controlar y abordar los 
problemas de invasiones biológicas y dificultando el manejo de zonas de interés para los 
programas conservación biológica. Detectar los patrones generales de colonización, 
invasión y dispersión de las especies exóticas es actualmente uno de los principales 
objetivos perseguidos en biología de la conservación. Desafortunadamente son escasos 
los estudios que provean la información necesaria sobre la que extrapolar patrones 
generalizados. Este capítulo analiza los patrones de colonización y dispersión en la 
región Mediterránea de la especie invasora Artemia franciscana, nativa de América. 
Desde los años 80 esta especie fue identificada como especie invasora en el 
Mediterráneo en los humedales salinos de Portugal, ampliando su rango de distribución 
no nativa desde entonces hacia España, Francia, Marruecos e Italia. Los datos genéticos 
obtenidos en este trabajo indican varios patrones de colonización y dispersión en este 
anostrácodo: colonización de hábitats por introducción múltiple y/o masiva 
(característico de inoculaciones producidas por el hombre como vector de dispersión); 
colonización por introducciones puntuales; y un patrón de dispersión y transporte 
llevado a cabo por aves desde poblaciones invadidas a nuevas zonas aun no invadidas. 
Los resultados de este trabajo están en formato manuscrito pendiente de envío. 
 
Capítulo 5: Biodiversidad y conservación. Esta última parte de la memoria de Tesis 
está basada en aspectos conceptuales y biogegráficos utilizando datos bibliográficos 
previamente publicados por otros autores y datos propios. En este capítulo, por un lado 
se evalúa y actualiza escala global la diversidad y distribución geográfica de los 
15
Introducción general ____________________________________________________ 
 
distintos linajes y taxones del género Artemia así como las implicaciones de dicha 
información para la conservación y manejo de los humedales salinos. Por otro lado, se 
discuten algunos de los procesos principales que configuran los patrones de distribución 
genética en los humedales de interior y determinan la biodiversidad y distribución 
geográfica en invertebrados acuáticos haciendo especial énfasis en la necesidad de 
estudios a gran escala geográfica para comprender la dinámica de sus poblaciones e 
implicaciones en conservación. Los trabajos tratados en este capítulo están en vías de 
publicación en Crustaceana (Aceptado) y Journal for Nature Conservation (en prensa, 
doi: 10.1016/j.jnc.2009.02.006), respectivamente. 
 
 
 
Literatura citada en la Introducción general 
- Abatzopoulos TJ, Agh N, Van Stappen G, 
Razavi-Rouhani SM & Sorgeloos P (2006) 
Artemia sites in Iran. Journal of the Marine 
Biological Association of the United 
Kingdom, 86, 299-307. 
- Abatzopoulos TJ, Beardmore JA, Clegg JS & 
Sorgeloos P (2002) Artemia: Basic and 
Applied Biology. Kluwer Academic 
Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 
- Abatzopoulos TJ, Zhang B & Sorgeloos P 
(1998) Artemia tibetiana: preliminary 
characterization of a new Artemia species 
found in Tibet (People’s Republic of China). 
International Study on Artemia. LIX. 
International Journal of Salt Lake Research, 
7, 41–44. 
- Abreu-Grobois FA & Beardmore JA (1982) 
Genetic differentiation and speciation in 
Artemia. In: C. Barigozzi, (ed.) 
"Mechanisms of Speciation". Alan Liss, 
Inc., New York, pp. 345-376. 
- Abreu-Grobois FA (1983) Population genetics 
of Artemia. Ph. D. Thesis, Univ. Coll. 
Swansea, Great Britain. 438 pp. 
- Abreu-Grobois FA (1987) A review of the 
genetics of Artemia. In P. Sorgeloos, D. A. 
Bengtson, W. Decleir & E. Jaspers (eds), 
Artemia Research and its Applications. 
Universa Press, Wetteren, Belgium 1: 61-99. 
- Acey RA, Bailey S, Healy P, Jo C, Unger TF 
& Hudson RA (2002) A 
butyrylcholinesterase in the early 
development of the brine shrimp (Artemia 
salina) larvae: a target for phthalate ester 
embryotoxicity? Biochemical and 
Biophysical Research Communications, 299, 
659–662. 
- Adamowicz SJ & Purvis A (2005) How 
many branchiopod crustacean species are 
there? Quantifying the components of 
underestimation. Global Ecology and 
Biogeography, 14, 455–468. 
- Amat F, Hontoria F, Ruiz O, Green AJ, 
Sánchez MI, Figuerola J & Hortas F 
(2005) The American brine shrimp as an 
exotic invasive species in the western 
Mediterranean. Biological Invasions, 7, 
37-47. 
- Amat F, Hontoria F, Navarro JC, Vieira N 
& Mura G (2007) Biodiversity loss in the 
genus Artemia in the Western 
Mediterranean Region. Limnetica, 26, 
177-194. 
- Balian EV, Segers H, Lévèque C & Martens 
K (2008) The freshwater animal diversity 
assessment: An overview of the results. 
Hydrobiologia, 595, 627–637. 
- Barahona MV & Sanchez-Fortun S (1999) 
Toxicity of carbamates to the brine 
shrimp Artemia salina and the effect of 
atropine, BW284c51, iso-OMPA and 2-
PAM on carbaryl toxicity. Environmental 
Pollution, 104, 469–476. 
- Baxevanis AD, Kappas I & Abatzopoulos 
TJ (2006) Molecular phylogenetics and 
asexuality in the brine shrimp Artemia. 
Molecular Phylogenetics and Evolution, 
40, 724-738. 
- Belk D (1998) Global status and trends in 
ephemeral pool invertebrate conservation: 
implications for Californian fairy shrimp. 
In: Ecology, Conservation, and 
Management of Vernal Pool Ecosystems - 
Proceedings from a 1996 Conference (ed. 
16
____________________________________________________ Introducción general 
 
C.W. Witham ETB, D. Belk, W.R. Ferren 
Jr., and R. Ornduff), pp. 147-150. California 
Native Plant Society, Sacramento, CA. 
- Boileau MG, Hebert PDN &Schwartz SS 
(1992) Non-equilibrium gene frequency 
divergence: Persistent founder effects in 
natural populations. Journal of Evolutionary 
Biology, 5,25-39. 
- Bowen ST, Davis ML, Fenster SR & Lindwall 
GA (1980) Sibling species of Artemia. In G. 
Persoone, P. Sorgeloos, 0. Roels & E. 
Jaspers (eds), The Brine Shrimp Artemia. 
Universa Press, Wetteren, Belgium 1: 155-
167. 
- Bowen ST, Fogarino EA, Hitchner KN, Dana 
GL, Chow VHS, Buoncristiani MR & Carl 
JR (1985) Ecological isolation in Artemia: 
Population differences in tolerance of anion 
concentrations. Journal of Crustacean 
Biology, 5, 106-129. 
- Browne RA (1988) Genetic and ecological 
divergence of sexual and asexual brine 
shrimp (Artemia) populations in the 
Mediterranean Basin. National Geographic 
Research, 4, 310. 
- Browne RA, Hoopes CW (1990) Genotype 
diversity and selection in asexual brine 
shrimp (Artemia). Evolution, 44, 1035-1051. 
- Browne RA & MacDonald GH (1982) 
Biogeography of the brine shrimp, Artemia: 
Distribution of pathenogenetic and sexual 
populations. Journal of Biogeography, 9, 
331-338. 
- Carlisle DB (1968) Triops (Entomostraca) 
eggs killed only by boiling. Science, 161, 
279-280. 
- Clark LS & Bowen ST (1976) The genetics of 
Artemia salina. The Journal of Heredity, 67, 
385-388. 
- Clucas B, McHugh K & Caro T (2008) 
Flagship species on covers of US 
conservation and nature magazines. 
Biodiversity and Conservation, 17, 1517–
1528. 
- Colombo ML, Bugatti C, Mossa A, Pescalli N, 
Piazzoni L, Pezzoni G, Menta E, Spinelli S, 
Johnson F, Gupta RC & Dasaradhi L (2001) 
Cytotoxicity evaluation of natural coptisine 
and synthesis of coptisine from berberine. 
Farmaco, 56, 403–409. 
- Convention on wetlands (1971) Ramsar 
Convention on Wetlands of International 
Importance. Ramsar, Iran. Available in 
website: http://www.ramsar.org. 
- Darwin C (1859) The origin of species by 
means of natural selection John Murray, 
London. 
- De Meester L (1996) Local genetic 
differentiation and adaptation in freshwater 
zooplankton populations: patterns and 
processes. Ecoscience, 3, 385-399. 
- De Meester L, Gómez A, Okamura B & 
Schwenk K (2002) The Monopolization 
Hypothesis and the dispersal-gene flow 
paradox in aquatic organisms. Acta 
Oecologica, 23, 121-135. 
- De Meester L, Vanoverbeke J, De Gelas K, 
Ortells R & Spaak P (2006) Genetic 
structure of cyclic parthenogenetic 
zooplankton populations - a conceptual 
framework. Archiv fur Hydrobiologie, 
167, 217-244. 
- De Roeck ER,Vanschoenwinkel BJ, Day 
JA, Xu Y,R aitt L & Brendonck L (2007) 
Conservation status of large branchiopods 
in the western cape, South Africa. 
Wetlands, 27(1), 162–173. 
- Dudgeon D, Arthington AH, Gessner MO, 
Kawabata Z-I, Knowler DJ, Leveque C, 
Naiman RJ, Prieur-Richard A-H, Soto D, 
Stiassny MLJ & Sullivan CA (2006) 
Freshwater biodiversity: importance, 
threats, status and conservation 
challenges. Biological Reviews, 81, 163–
182. 
- Figuerola J, Green AJ & Michot TC (2005) 
Invertebrate eggs can fly: Evidence of 
waterfowl-mediated gene flow in aquatic 
invertebrates. The American Naturalist, 
165, 274-280. 
- Figuerola J & Green AJ (2002) Dispersal of 
aquatic organisms by waterbirds: a review 
of past research and priorities for future 
studies. Freshwater Biology, 47, 483-494. 
- Gajardo G, Abatzopoulos TJ, Kappas I & 
Beardmore JA (2002) Evolution and 
speciation. In: Biology of Aquatic 
Organisms. Artemia: Basic and Applied 
Biology (ed by ThJ Abatzopoulos, JA 
Beardmore, JS Clegg and P Sorgeloos). 
Kluwer Academic Publishers. Dordrecht, 
The Netherlands. Pp. 225-250. 
- Gajardo G & Beardmore JA (2001) 
Coadaptation: Lessons from the brine 
shrimp Artemia, “the aquatic Drosophila” 
(Cruscatea; Anostraca). Revista Chilena 
de Historia Natural, 74(1). Disponible en: 
http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci
_arttext&pid=S0716-
078X2001000000012&lng=es&nrm=iso
&tlng=en 
- Georgiev BB, Sánchez MI, Vasileva GP, 
Nikolov PN & Green AJ (2007) Cestode 
parasitism in invasive and native brine 
shrimps (Artemia spp.) as a possible 
factor promoting the rapid invasion of A. 
franciscana in the Mediterranean region. 
Parasitology Research, 101, 1647–1655. 
- Gómez A, Serra M, Carvalho GR & Lunt 
DH (2002) Speciation in ancient cryptic 
17
Introducción general ____________________________________________________ 
 
species complexes: evidence from the 
molecular phylogeny of Brachionus 
plicatilis (rotifera). Evolution, 56, 1431–
1444. 
- Gómez A (2005) Molecular ecology of 
rotifers: from population differentiation to 
speciation. Hydrobiologia, 546, 83-99. 
- Gómez A, Montero-Pau J, Lunt DH, Serra M 
& Campillo S (2007) Persistent genetic 
signatures of colonization in Brachionus 
manjavacas rotifers in the Iberian Peninsula. 
Molecular Ecology, 16, 3228–3240. 
- Green AJ & Figuerola J (2005) Recent 
advances in the study of long-distance 
dispersal of aquatic invertebrates via birds. 
Diversity and Distributions, 11, 149-156. 
- Green AJ, Jenkins KM, Bell D, Morris PJ & 
Kingsford RT (2008) The potential role of 
waterbirds in dispersing invertebrates and 
plants in arid Australia. Freshwater Biology, 
53, 380–392. 
- Grosholz E (2002) Ecological and 
evolutionary consequences of coastal 
invasions. Trends in Ecology and Evolution, 
17, 22-27. 
- Gul HI, Gul M & Erciyas E (2003) Toxicity of 
some bis mannich bases and corresponding 
piperidinols in the brine shrimp (Artemia 
salina) bioassay. Journal of Applied 
Toxicology, 23, 53–57. 
- Hairston, NG (1996) Zooplankton egg banks 
as biotic reservoirs in changing 
environments. Limnology and 
Oceanography, 41, 1087-1092. 
- Hebert PDN & Cristescu MEA (2002) Genetic 
perspecties on invasions: the role of the 
cladocera. Canadian Journal of Fisheries 
and Aquatic Sciences, 59, 1229-1234. 
- Hebert PDN, Remigio EA, Colbourne JK, 
Taylor DJ & Wilson CC (2002) Accelerated 
molecular evolution in halophilic 
crustaceans. Evolution, 56, 909-926. 
- Ishida S & Taylor DJ (2007) Mature habitats 
associated with genetic divergence despite 
strong dispersal ability in an arthropod. 
BMC Evolutionary Biology, 7, 52. 
- Kappas I, Baxevanis AD, Maniatsi S & 
Abatzopoulos TJ (2009) Porous genomes 
and species integrity in the branchiopod 
Artemia. Molecular Phylogenetics and 
Evolution,doi:10.1016/j.ympev.2009.03.012. 
- Lavens P & Sorgeloos P (2000) The history, 
present status and prospects of the 
availability of Artemia cysts for aquaculture. 
Aquaculture, 181, 397–403. 
- Malpica Sánchez A, Castro Barrera T, 
Sandoval Trujillo H, Jorge Castro Mejía J, 
De Lara Andrade R & Germán Castro Mejía 
G (2004) Composición del contenido de 
ácidos grasos en tres poblaciones mexicanas 
de Artemia franciscana de aguas 
epicontinentales. Revista de Biología 
Tropical, 52, 297-300. 
- McMaster K, Savage A, Finston T, Johnson 
MS & Knott B (2007) The recent spread 
of Artemia parthenogenetica in Western 
Australia. Hydrobiologia, 576, 39-48. 
- Mergeay J, Verschuren D & De Meester L 
(2005) Cryptic invasion and dispersal of 
an American Daphnia in East Africa. 
Limnology and Oceanography, 50, 1278–
1283. 
- Mergeay J, Vanoverbeke J, Verschuren D & 
De Meester L (2007) Extinction, 
recolonization, and dispersal through time 
in a planktonic crustacean. Ecology, 88, 
3032–3043. 
- Mito T & Uesugi T (2004) Invasive alien 
species in Japan: The Status Quo and the 
new regulation for prevention of their 
adverse effects. Global Environmental 
Research, 8(2), 171-191. 
- Muñoz J (2007) Biodiversity conservation 
including uncharismatic species. 
Biodiversity and Conservation, 16, 2233-
2235. 
- Mura G, Kappas I, Baxevanis AD, 
Moscatello S, D’Amico Q, Lopez GM, 
Hontoria F, Amat F & Abatzopoulos TJ 
(2006) Morphological and molecular data 
reveal the presence of the invasive 
Artemia franciscana in Margherita di 
Savoia salterns (Italy). International 
Reviwe of Hydrobiologia, 91, 539–554. 
- New TR (1995) Introduction to invertebrate 
conservation biology. Pp 1-194 (Oxford 
University Press, Oxford). 
- Okamura B & Freeland JR (2002) Gene 
flow and the evolutionary ecology of 
passively dispersing aquatic invertebrates.In: Dispersal Ecology (J.M. Bullock, R.E. 
Kenward, R.S. Hails, eds.). Blackwell 
Science, Oxford. 
- Papeschi AG, Lipko P, Amat F & Cohen 
RG (2008) Heterochromatin variation in 
Artemia populations. Caryologia, 61, 53-
59. 
- Pérez ML, Valverde JR, Batuecas B, Amat 
F & Marco R (1994) Speciation in the 
Artemia genus: Mitochondrial DNA 
analysis of bisexual and parthenogenetic 
brine shrimps. Journal of Molecular 
Evolution, 38, 156-168. 
- Persoone G, Sorgeloos P, Roels O & 
Jaspers E (1980), The Brine Shrimp 
Artemia, vol. 1. Morphology, Genetics, 
Radiobiology, Toxicology. Universa 
Press, Wetteren, Belgium. 
- Picó FX & van Groenendael J (2007) 
Large-scale plant conservation in 
18
____________________________________________________ Introducción general 
 
European semi- natural grasslands: A 
population genetic perspective. Diversity 
and Distributions, 13, 920–926. 
- Proctor VW, Malone CR & DeVlaming VL 
(1967) Dispersal of aquatic organisms: 
Viability of disseminules recovered from the 
intestinal tract of captive Killdeer. Ecology, 
48, 672-676. 
- Ruiz O, Medina GR, Cohen RG, Amat F & 
Navarro JC (2007) Diversity of the fatty acid 
composition of Artemia spp. cysts from 
Argentinean populations. Marine Ecology 
Progress Series, 335, 155–165. 
- Sáez AG, Escalante R & Sastre L (2000) High 
DNA Sequence Variability at the a1 Na/K-
ATPase Locus of Artemia franciscana 
(Brine Shrimp): Polymorphism in a Gene for 
Salt-Resistance in Salt-Resistant Organism. 
Molecular Biology and Evolution, 17, 235–
250. 
- Sakai AK, Allendorf FW, Holt JS, Lodge DM, 
Molofsky J, With KA, Baughman S, Cabin 
RJ, Cohen JE, Ellstrand NC, McCauley DE, 
O'Neil P, Parker IM, Thompson JN & 
Weller SG (2001) The population biology of 
invasive species. Annual Review of Ecology 
Evolution and Systematics, 32, 305-332. 
- Sorgeloos P, Bengtson DA, Decleir W & 
Jaspers E (1987) Artemia Research and its 
Applications, vol. 1. Morphology, Genetics, 
Strain Characterization, Toxicology. 
Universa Press, Wetteren, Belgium. 
- Taylor RL, Caldwell GS & Bentley MG 
(2005) Toxicity of algal-derived aldehydes 
to two invertebrate species: Do heavy metal 
pollutants have a synergistic effect? Aquatic 
Toxicology, 74, 20–31. 
- Tizol-Correa RA (2006) Contribución a la 
caracterización molecular, citogenética, 
morfométrica y bioquímica del camarón de 
salmuera Artemia de Cuba y Sur de México. 
Ph.D. thesis. PDF file available at: 
http://iodeweb1.vliz.be/odin/bitstream/1834/
1546/1/Tesis%20Doctoral%20R%20tizol.pd
f. 
- Tizol-Correa R, Maeda-Martínez AM, 
Weekers PHH, Torrentera L & Murugan G 
(2009) Biodiversity of the brine shrimp 
Artemia from tropical salterns in southern 
México and Cuba. Current Science, 96, 81-
87. 
- Triantaphyllidis GV, Abatzopoulos TJ & 
Sorgeloos P (1998) Review of the 
biogeography of the genus Artemia 
(Crustacea, Anostroca). Journal of 
Biogeography, 25, 213-226. 
- Triantaphyllidis GV, Pilla EJS, Thomas KM, 
Abatzopoulos TJ, Beardmore JA & 
Sorgeloos P (1994) International study on 
Artemia. LII. Incubation of Artemia cyst 
samples at high temperature reveals 
mixed nature with Artemia franciscana 
cysts. Journal of Experimental Marine 
Biology and Ecology, 183, 273-282. 
- Van Stappen G (2002) Zoogeography. In: 
Biology of Aquatic Organisms. Artemia: 
Basic and Applied Biology (ed. by Th.J. 
Abatzopoulos, J.A. Beardmore, J.S. Clegg 
and P. Sorgeloos). Kluwer Academic 
Publishers, Dordrecht, The Netherlands. 
Pp 171–224. 
- Van Stappen G, Yu H, Wang X, Hoffman 
S, Cooreman K, Bossier P & Sorgeloos P 
(2007) Occurrence of allochthonous 
Artemia species in the Bohai Bay area, 
PR China, as confirmed by RFLP analysis 
and laboratory culture tests. Fundamental 
and Applied Limnology, 170, 21-28. 
- Velasco J, Millán A, Hernández J, Gutiérrez 
C, Abellán P, Sánchez D & Ruiz M 
(2006) Response of biotic communities to 
salinity changes in a Mediterranean 
hypersaline stream. Saline Systems, 2, 12. 
- Wear RG, Haslett SJ & Alexander NL 
(1986) Effect of temperature and salinity 
on the biology of Artemia franciscana 
Kellogg from lake Grassmere, New 
Zealand. 2. Maturation, fecundity, and 
generation times. Journal of Experimental 
Marine Biology and Ecology, 98, 167-
183. 
- Weider LJ, Hobaek A, Colbourne JK, 
Crease TJ, Dufresne F & Hebert PDN 
(1999) Holarctic phylogeography of an 
asexual species complex I. Mitochondrial 
DNA variation in arctic Daphnia. 
Evolution, 53, 777-792. 
- Wilson JRU, Dormontt EE, Prentis PJ, 
Lowe AJ & Richardson DM (2009) 
Something in the way you move: 
dispersal pathways affect invasion 
success. Trends in Ecology and Evolution, 
24, 136-144. 
- Zierold T, Hanfling B & Gómez A (2007) 
Recent evolution of alternative 
reproductive modes in the ‘living fossil’ 
Triops cancriformis. BMC Evolutionary 
Biology, 7, 161. 
- Zuñiga O, Wilson R, Amat F & Hontoria F 
(1999) Distribution and characterization 
of Chilean populations of the brine 
shrimp Artemia (Crustacea, 
Branchiopoda, Anostraca). International 
Journal of Salt Lake Research, 8, 23–40. 
 
 
 
19
 
 
 
 
 
 
 
Capítulo 1 
 
Metodología 
 
 
 
 
Javier Montero-Pau1,2, África Gómez1 and Joaquín Muñoz1,3 
Application of an inexpensive and high-throughput genomic DNA extraction method 
for the molecular ecology of zooplanktonic diapausing eggs. 2008. Limnology and 
Oceanography: Methods, 6, 218-222 
 
Joaquín Muñoz1, Andy J. Green1, Jordi Figuerola1, Francisco Amat4 and 
Ciro Rico1 
Characterization of polymorphic microsatellite markers in the brine shrimp Artemia 
(Branchiopoda, Anostraca). 2009. Molecular Ecology Resources, 9, 547-550 
 
 
 
 
 
 
1 Department of Biological Sciences, 
University of Hull, 
Hull, UK 
 
2 Institut Cavanilles de Biodiversitat i Biologia Evolutiva, 
Universitat de València, 
Valencia, Spain 
 
3 Department of Wetland Ecology, 
Estación Biológica de Doñana, CSIC, 
Sevilla, Spain 
 
4 Instituto de Acuicultura de Torre de la Sal, CSIC, 
Riberas de Cabanes, Castellón, Spain 
 
 
 
 
____________________________________________________________ Capítulo 1 
 
Application of an inexpensive and high-throughput genomic 
DNA extraction method for the molecular ecology of 
zooplanktonic diapausing eggs 
 
 
 
Resumen 
En este trabajo describimos la aplicación de un método simple, de bajo coste y efectivo 
para la extracción de ADN a partir de propágulos de invertebrados acuáticos 
continentales para su uso en amplificación por PCR (hot sodium hydroxide and Tris, 
HotSHOT). Ilustramos el uso de esta técnica en huevos diapausa de cladóceros, 
rotíferos, anostrácodos, notostrácodos y copépodos. Comparamos el rendimiento de la 
técnica HotSHOT con el método más utilizado para extraer ADN de huevos de 
zooplancton e individuos adultos, la resina quelante (ó Chelex). La técnica HotSHOT 
resuelve algunos problemas que se apreciaban con Chelex, y permite una fácil 
optimización para la extracción de alto rendimiento de ADN en placas de 96 pocillos y 
posterior caracterización genética. Prevemos un amplio uso de esta técnica en el futuro 
en campos desde el ADN-Barcoding de estadios en diapausa hasta la caracterización 
genética de los bancos de huevos diapausa de invertebrados acuáticos continentales en 
general. 
 
 
Abstract 
We describe the application of a simple, low-cost, and effective method of DNA 
extraction (hot sodium hydroxide and Tris, HotSHOT) to the diapausing propagules of 
continental aquatic invertebrates for its use in PCR amplification. We illustrate the use 
of the technique in cladocerans, rotifers, anostracans, notostracans, and copepod 
diapausing eggs. We compare the performance of the HotSHOT technique to the 
currently most widely used method for DNA extraction of zooplankton eggs and 
individuals, the chelating resin (or Chelex) technique. The HotSHOT technique 
overcomes several of the problems posed by Chelex and permits easy optimization for 
its use with 96-well plates for high-throughput DNA extraction and subsequentgenetic 
characterization. We foresee a wide use of this technique in the future from DNA 
barcoding of diapausing stages to the genetic characterization of the diapausing egg 
banks of continental aquatic invertebrates. 
 
 
 
Acknowledgments 
We thank D. Lunt for suggesting the use of HotSHOT, for technical help, and for 
providing old Daphnia samples. We are grateful to T. Zierold for providing Triops 
samples and F. Amat for providing Artemia systs. Rob Hammond is kindly thanked for 
his constructive comments on an earlier version of this manuscript. We also thank the 
valuable comments and suggestions by two anonymous reviewers. This study was 
partly funded by a NERC Advanced Fellowship to AG. JM was supported in his stay in 
Hull by the Spanish Ministerio de Educación y Ciencia Project (project CGL2006-
05085/BOS) to A.J. Green, C. Rico, F. Hontoria and J. Figuerola. The Spanish 
Ministerio de Educación y Ciencia supported JMP during his stay in the University of 
Hull. 
21
Metodología ___________________________________________________________ 
 
In recent years, an explosive development of high-throughput, relatively cheap, 
molecular techniques for the scoring of microsatellites, AFLPs, SNPs, and sequencing 
has taken place. These technological advances have spurred population-level analysis 
from phylogeography and population structure to barcoding and large-scale multigene 
sequencing projects, all key areas of ecological and evolutionary research. The 
development of methods to prepare DNA extractions in a quick, simple, cost-effective 
and high-throughput way has shown a parallel progress for model organisms including 
human forensic material (Walsh et al. 1991; Rudbeck & Dissing 1998), mouse (Truett 
et al. 2000), and Arabidopsis and crop plants (Xin et al. 2003), but their wider 
application for molecular ecology is timely. 
 
 Molecular genetic surveys of continental aquatic invertebrates (cladocerans, 
anostracans, rotifers, copepods, ostracods, etc.) have yielded valuable insights into the 
evolutionary forces shaping their genetic structure and microevolution (De Meester et 
al. 2002; Gómez 2005; Ishida & Taylor 2007), and are helping to characterize the 
cryptic biodiversity of these groups (Gómez et al. 2002; Adamowicz & Purvis 2005). 
Continental aquatic invertebrates cope with the temporal character and unpredictability 
of their habitats by producing diapausing stages. Diapausing eggs—which are encysted 
embryos in arrested state of development, also called cysts or resting eggs—are resistant 
to a wide range of environmental extremes (Proctor et al. 1967; Carlisle 1968), and are 
long-lived dormant stages in pond and lake sediments, forming diapausing egg banks 
(Hairston 1996). For many molecular genetic surveys in these organisms, sampling 
diapausing egg banks in populations is a useful or even the only way of obtaining 
population or species level genetic information. Given the ephemeral nature of many 
aquatic habitats, the year-round availability of diapausing stages—as opposed to often 
ephemeral planktonic stages—is a great advantage for their use. Furthermore, when the 
ponds and lakes are sampled during dry periods, they represent the best sample of the 
population gene pool (Moorad et al. 1997; Gómez et al. 2000; Ortells et al. 2000). In 
addition, and conveniently, sediment samples containing living diapausing stages can be 
maintained in the laboratory for long periods of time. Finally, old diapausing stages 
from lake and pond sediment cores are a repository of the historical genetic constitution 
of past populations, and their use for genetic analysis has revealed much valuable 
information from historical changes in the environment, the dynamics of Daphnia 
communities, adaptive changes in antipredator behavior, alien invasions to the 
dynamics of coexistence of cryptic species (Duffy et al. 2000; Reid et al. 2000; Cousyn 
et al. 2001; Limburg & Weider 2002; Mergeay et al. 2004; JM-P, unpublished 
manuscript). 
 
 Although the importance of sampling diapausing stages was realized a while ago 
(Carvalho & Wolf 1989; Hairston 1996), the genetic characterization of diapausing egg 
banks depended on hatchlings obtained in the laboratory to obtain sufficient biomass for 
genetic analysis, as DNA extractions from such small samples remained a challenge. 
Ideally, DNA extraction techniques from individual diapausing stages should obtain 
reliable results from a very small amount of tissue (for example, rotifer diapausing 
stages are less than 100 µm in length) using as few tube transfers as possible to avoid 
contamination of samples. A chelating resin method (using Chelex® 100 resin or 
InstaGene matrix, Bio-Rad) (Walsh et al. 1991), originally developed to extract DNA 
from forensic material, has been, and remains to this date, the most widely used method 
to prepare DNA from diapausing stages and individual zooplankton in rotifers (Gómez 
& Carvalho 2000; Fontaneto et al. 2007), Daphnia (Taylor et al. 1996; Reid et al. 
2000), copepods (Edmands 2001; Bohonak et al. 2006), anostracans (Moorad et al. 
22
____________________________________________________________ Capítulo 1 
 
1997) and ostracods (Yamaguchi 2000). However, various problems become apparent 
when working with this method. Resin beads inhibit polymerase chain reaction (PCR). 
Therefore, in order to use high-throughput 96-well plates for PCR amplification using 
multichannel pipettes, centrifugation and transfer of the sample supernatant into fresh 
tubes or plates is needed after extraction and before preparing PCR reactions. This 
increases preparation time and cost, and the chances of contamination. In addition, and 
more importantly, the technique does not produce a stable DNA extract, and samples 
often deteriorate with time and become unusable for PCR (Greenspoon et al. 1998; 
Hajibabaei et al. 2005) unless buffered (Söller et al. 2000). 
 
 Here we describe an optimized alkaline lysis protocol to produce inexpensive, 
rapid, and simple DNA extractions that avoid the above-mentioned problems. This 
protocol produces reliable DNA extractions that can be used to conduct PCR based 
genetic screening (e.g., mitochondrial DNA and microsatellite amplification) on large 
samples of diapausing stages of zooplanktonic organisms. The HotSHOT technique 
(Truett et al. 2000), a modified alkaline lysis method (Sambrook & Russell 2001), is a 
reliable, cheap, and simple DNA extraction technique that can be easily adapted to 
aquatic invertebrates organisms with diapausing propagules. An additional advantage is 
that, being a single-tube technique, the likelihood of cross-contamination is reduced. 
We demonstrate the use of this technique for diapausing stages in zooplankton and 
illustrate its efficiency with cysts or diapausing eggs of cladocerans, rotifers, copepods, 
anostracans and notostracans, both for fresh and preserved material. In addition, we 
compare directly the efficiency of the technique with the widely used Chelex resin 
method. 
 
Materials and procedures 
 
Biological material—Diapausing eggs were obtained from plankton samples from 
natural populations. Eggs were extracted from lake sediments using a sucrose-flotation 
technique (Onbé 1978; Gómez & Carvalho 2000), or taken directly from laboratory 
cultures (see Table 1 for details). We obtained samples of five different groups of 
aquatic invertebrates: rotifers (Brachionus plicatilis), cladocerans (Daphnia magna), 
anostracans (Artemia salina), notostracans (Triops cancriformis), and copepods 
(unidentified species). Mature Daphnia ephippia were separated from their mothers and 
diapausing eggs manually decapsulated. The diapausing eggs of these organisms have a 
range of sizes from under 100 µm to ca. 400 µm. Some of the diapausing eggs had been 
preserved in ethanol 100%, some were collected fresh from mature females, and others 
had been stored dry and in the dark or in sediment samples. A few samples had been 
keptin the laboratory for several years, either in dormant (live) state or fixed (Table 1). 
 
 
 
23
Metodología ___________________________________________________________ 
 
DNA extraction protocol— Prior to the DNA extraction, fresh and dry preserved 
diapausing eggs were washed with MilliQ water. Ethanol preserved samples were re-
hydrated for two hours in MilliQ water. 
 
 To perform the HotSHOT extraction (see Table 2 for details), individual 
diapausing eggs were transferred into a 0.2 mL tube containing 50 µL of alkaline lysis 
buffer under a stereomicroscope. Once in the buffer, the eggs were crushed against the 
side of the tube using a sterile pipette tip. Samples were incubated at 95°C for 30 min 
and stored on ice for 3-4 min. A further 50 µL of neutralizing buffer was added to each 
tube, and the samples were vortexed briefly and spun down. Samples were stored at 4°C 
to be used directly in PCR reactions, or at –20°C for a long storage period. 
 
 
For the Chelex extraction, the diapausing eggs were transferred individually to 0.2 mL 
tubes containing 50 µL of Instagene Matrix (containing 6% Chelex resin, Bio-Rad) and 
crushed against the side of the tube using a sterile pipette tip. The samples were 
incubated for 30 min at 60°C and 8 min at 100°C. Finally, the samples were centrifuged 
at 14,000 rpm during 5 min, and the supernatant directly used in PCR reaction or stored 
at –20°C until needed. 
 
Polymerase chain reaction (PCR)—To assess the success of the DNA extractions, a 
fragment of the mitochondrial gene cytochrome c oxidase subunit I (COI) (ca. 710 bp) 
was amplified using the LCO1490 and HCO2198 primers (Folmer et al. 1994) or 
specific primers for the same mitochondrial region modified for Artemia (J. Muñoz, 
unpublished manuscript). PCR reactions were performed in a total volume of 20 µL 
using 2 µL of DNA extract, 1 x PCR buffer, 0.5 µM of each primer, 1.5-2.0 mM 
MgCl2, 0.2 mM dNTPs, and 0.4-0.6 U Taq DNA polymerase (Bioline). The thermal 
profile consisted of a 3 min initial cycle at 94°C, followed by 35 cycles of 94°C for 45 
s, 45- 55°C for 1 min, and 72°C for 1 min, with a final extension of 72°C for 5 min. 
Five microliters of the PCR product were separated by electrophoresis in 0.5 x SB 
buffer (Brody & Kern 2004) in a 1.5% agarose gel. Gels were stained with ethidium 
bromide and visualized under UV in a transilluminator. 
 
Assessment 
 
To test the performance of the HotSHOT protocol in diapausing stages, we assessed the 
technique in different groups of zooplankton and compared the results with the Chelex 
24
____________________________________________________________ Capítulo 1 
 
technique. We also tested the success of DNA extraction on old ethanol preserved 
samples and in diapausing stages of different ages. In addition, we carried out 
HotSHOT DNA extractions using a range of different total volumes (20-140 µL) and 
quantified the DNA in the extracts. For this, we used diapausing eggs from rotifers and 
anostracans (the smallest and the largest diapausing eggs used in this study, 
respectively). Soluble DNA concentration in the HotSHOT extractions was quantified 
by measuring the absorbance at 260 nm using a GeneQuant II spectrophotometer 
(Pharmacia Biotech Co.). No comparison could be done with the Chelex extractions due 
to unreliable quantification of these extractions with spectrophotometers (JM, JM-P, 
personal observations). 
 
 DNA concentrations obtained with the HotSHOT method in Artemiacysts 
ranged between 25 and 5 ng/µL for the smallest (20 µL) and largest (140 µL) total 
extract volume, respectively, while lower concentrations were obtained for the smaller 
Brachionus diapausing eggs (maximum 5 ng/µL). Although in Brachionus the amount 
of DNA was not high, it was sufficient to perform PCR amplifications with the same 
success than for Artemia (Fig. 1). Both HotSHOT and Chelex methods resulted in 
reliable amplifications of diapausing stages for freshly prepared DNA extractions in 
fresh and old preserved material, including dry (live) and ethanol-preserved samples, 
with the HotSHOT method providing slightly stronger bands (see Fig. 1; Table 1). 
 
 The success rate for individual cysts DNA extractions with the HotSHOT 
method (measured indirectly as successful PCR amplifications) was on the order of 
97% for all taxonomic groups, and in tests in rotifers, it increased when only healthy 
looking eggs were used in the extraction (JM-P, personal observation). 
 
 In addition, we successfully tested the HotSHOT technique for various adult 
zooplanktonic samples (abdomen Artemia, adult Brachionus, whole/half copepod, 
whole/antenna Daphnia). 
 
 In contrast to Chelex preparations, HotSHOT produced long-lasting DNA 
extractions, as 3-y-old DNA rotifer preparations using this method and stored at –20°C 
gave clear amplification products for COI and even for a larger fragment of mtDNA 
genome (1300 bp). These old extracts were also used to reliably score seven 
microsatellite loci in a large number of samples with no allelic dropout effect (JM-P, 
unpublished results), indicating that the quality and quantity of the DNA obtained with 
this method is adequate for PCR-based methods. 
 
Discussion 
 
We have shown that HotSHOT DNA extractions provide consistent and reliable PCR 
amplification in diapausing eggs in a range of invertebrate taxa. HotSHOT yielded as 
good or better results as the widely used Chelex technique in extracting DNA from 
single diapausing eggs, both for fresh and preserved material (Fig. 1). Although the rate 
of successful amplifications from both techniques is comparable, HotSHOT presents 
superior features, such as being a single tube method, which increases the efficiency and 
eases the implementation of high-throughput processing of diapausing egg samples, 
and, at the same time, minimizes the risk of cross-sample contamination and success of 
long-term preservation of DNA samples. The low failure rate in PCR amplifications 
found in our work is likely to be due to the deteriorated stage of the embryos rather than 
the age or mode of preservation of the diapausing eggs. 
25
Metodología ___________________________________________________________ 
 
 
 
 
HotSHOT extraction is a highly suitable technique for PCR-based methods such as 
microsatellite genotyping, restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis, 
single stranded conformation polymorphism (SSCP) analysis, and sequencing. Its 
application to other methods requiring high DNA concentrations or high molecular 
weight DNA could be restricted (Truett et al. 2000). 
 
 In summary, the HotSHOT method is a rapid, inexpensive, high-performance 
technique for PCR-quality DNA extractions from diapausing eggs, which avoids cross-
contamination and, as larger volumes are used, it allows for more PCR reactions per 
sample. In addition, HotSHOT DNA extractions are stable for at least several years. All 
these advantages make HotSHOT a valuable method to use in diapausing eggs and a 
superior technique to the widely used Chelex method. 
 
 We have provided a protocol to perform high-throughput DNA extraction 
widely applicable for high-throughput PCR-based genetic screening analyses of 
virtually all zooplanktonic organisms with diapausing stages in their life cycle. This 
technique will facilitate the application of large-scale screening molecular techniques in 
several areas of molecular ecology, from population genetics to barcoding studies. 
 
 
 
 
 
 
26
____________________________________________________________ Capítulo 1 
 
Characterization of polymorphic microsatellite markers in 
the brine shrimp Artemia (Branchiopoda, Anostraca) 
 
 
 
Resumen 
El camarón de salmuera Artemia es un género complejo que contiene especies sexuales 
y linajes partenogenéticos. Artemia franciscana es una especie nativa de América y sus 
quistes (huevos diapausa) son usados como fuente de alimento en acuicultura a lo largo 
de todo el mundo.Como consecuencia, este anostrácodo se ha convertido en una 
especie invasora en muchos ecosistemas acuáticos hipersalinos de otros continentes. 
Los linajes partenogenéticos de Artemia solo pueden ser encontrados en el Viejo 
Mundo. Hemos desarrollado diez y cinco marcadores microsatélites para caracterizar 
dos poblaciones de A. franciscana y dos poblaciones de el linaje partenogenético 
diploide de Artemia, respectivamente. Para A. franciscana obtuvimos un rango de alelos 
por locus entre 11 a 58, mientras que para el linaje partenogenético el número de alelos 
rondó entre los tres y los diez. Los niveles de heterocigosidad se encontraron entre 
0.115 y 0.976 para A. franciscana, y entre 0.000 y 0.971 para el linaje partenogenético. 
Estos microsatélites mostraron un alto poder de asignación poblacional que se prevé de 
utilidad para futuros estudios sobre genética de poblaciones y procesos de invasión en el 
género Artemia. 
 
 
Abstract 
The brine shrimp Artemia is a complex genus containing sexual species and 
parthenogenetic lineages. Artemia franciscana is native to America and its cysts 
(diapausing eggs) are used worldwide as a food source in aquaculture. As a 
consequence, this anostracan has become an invasive species in many hypersaline 
aquatic ecosystems of other continents. Parthenogenetic Artemia lineages occur only in 
the Old World. Ten and five microsatellite markers were developed to characterize two 
populations for A. franciscana and two populations for diploid parthenogenetic Artemia, 
respectively. For A. franciscana the number of alleles ranged from 11 to 58 per locus, 
while for parthenogens the number of alleles ranged from three to 10. The levels of 
heterozygosity in A. franciscana and in parthenogens ranged from 0.115 to 0.976 and 
from 0.000 to 0.971, respectively. These microsatellite loci showed a high population 
assignment power, which will be useful for future studies of population genetics and 
invasive processes in Artemia. 
 
 
 
 
 
 
Acknowledgements 
We are indebted to Juan Miguel Arroyo for assistance with genotyping. We thank 
Catalina Monzón for assistance and discussion of analyses. Africa Gómez, Cino 
Pertoldi and Jacob Gratten provided constructive criticism of an earlier version of this 
manuscript. This work was funded by the Spanish Ministerio de Educación y Ciencia 
(projects BOS2003-02486 and CGL 2006-05085 BOS). 
 
27
Metodología ___________________________________________________________ 
 
The brine shrimp Artemia is a zooplankter inhabiting hypersaline waterbodies around 
the world. Artemia franciscana is native in North, Central and South America (down to 
latitude 37°S), while parthenogenetic Artemia are exclusive to the Old World. 
Diapausing eggs (cysts) of the American brine shrimp, harvested from natural 
populations, are a major food source in aquaculture and exported across the world. The 
two main commercial sources of cysts are San Francisco Bay (SFB) in California and 
Great Salt Lake (GSL) in Utah. Artemia franciscana is now present as an exotic and 
invasive species in several Mediterranean countries, Iran, Russia, Vietnam, New 
Zealand, Australia and China. 
 
 To date, the population genetic, phylogeographical and evolutionary studies on 
Artemia have been based on allozyme, random amplified polymorphic DNAs, 
restriction fragment length polymorphisms and mitochondrial or nuclear DNA 
sequences (Abatzopoulos et al. 2002; Muñoz et al. 2008). No microsatellite DNA 
markers have previously been isolated in the genus Artemia. Here we describe the 
isolation of 10 polymorphic microsatellite loci for A. franciscana and five for the 
diploid parthenogenetic Artemia (hereafter Artemia parthenogenetica), using the 
magnetic bead-based enrichment method described previously by Jones et al. (2002) 
and the Glenn et al. (2000) method as is detailed in Galarza et al. (2006), respectively. 
 
 For the Jones et al. (2002) method, high molecular genomic DNA of eight adult 
specimens of A. franciscana was isolated using a cetyltrimethyl ammonium bromide 
protocol (Muñoz et al. 2008). Approximately 100 µg of DNA was partially digested 
with a cocktail of seven restriction enzymes (RsaI, HaeIII, BsrB1, PvuII, StuI, ScaI, 
EcoRV). Fragments in the size range of 300–750 bp were ligated to adapter primers (20 
bp), which contained a HindIII site at the 5′ end. Four enriched parallel libraries were 
prepared to be subjected to magnetic bead capture using Biotin-CA15, Biotin-GA15, 
Biotin-AAC12 and Biotin-ATG12 in a protocol provided by the manufacturer (CPG, 
Inc.). Captured molecules with repetitive sequences were amplified and restricted with 
HindIII to remove the adapters. The resulting fragments were ligated into the HindIII 
site of the pUC19 plasmid and introduced into Escherichia coli strain DH5α by 
electroporation (ElectroMax, Invitrogen). 
 
 A total of 45 different microsatellite-containing clones were identified in A. 
franciscana, while 27 were identified in A. parthenogenetica. Only 31 and 19 
polymerase chain reaction (PCR) primer pairs, respectively, could be designed using 
Primer 3 (Rozen & Skaletsky 2000) and oligo version 6.4 (Molecular Biology Insight, 
Inc.) software. Seventeen and eight of the primer pairs, respectively, yielded products of 
varying size, within the clonal expected size range, from 10 different brine shrimp 
samples and were selected for fluorescent labelling. 
 
 PCR amplifications were carried out in 20-µL total volume containing 2 µL of 
10 x PCR buffer (Bioline), 1.5–3.0 mm of MgCl2 (Bioline), 0.25–0.60 µm of each 
primer (see Table 1 for details), 250 µm of each dNTPs, 0.5 µL of 20 mg/mL bovine 
serum albumin (BSA) (Roche Diagnostics), and 0.5 U Taq DNA polymerase (Bioline). 
Reaction conditions were as follows: an initial denaturation step at 95 °C for 5 min, 16–
21 cycles consisting of 60 s at 95 °C, 60 s at 60 °C decreasing 1 °C per cycle, and 60 s 
at 72 °C. Then, 24 additional cycles were performed consisting of a step of 30 s at 95 
°C, 30 s at 40 °C, and 30 s at 72 °C, and a final supplementary extension step of 15 min 
at 72 °C. 
28
 
29
 ____________________________________________________________ Capítulo 1
Metodología ___________________________________________________________ 
 
Ten out of the 17 polymorphic markers were screened in a set of 88 individual cysts 
from two US populations [GSL (n = 42), and SFB (n = 46)] in A. franciscana. Five out 
of the eight loci for A. parthenogenetica were screened in a set of 50 individual cysts 
from two Spanish populations [Cabo de Gata, GAT (n = 15), and La Mata, MAT (n = 
35)]. DNA was isolated from individual cysts using the Montero-Pau et al. protocol 
(2008). Individuals were genotyped by assessing allele size on an ABI 3130xl Genetic 
Analyser (Applied Biosystems) using forward primers labelled with FAM (Sigma), and 
NED, PET and VIC (Applied Biosystems) together with LIZ 500 size standard (Applied 
Biosystems). Due to some screened loci showing peaks with one base of difference, we 
added a palindromic sequence (5′-GTGTCTT-3′) at the 5′ end of their unlabelled 
reverse primer (see Table 1) in order to minimize the generation of stutter peaks 
(Brownstein et al. 1996). Allele scoring was carried out in two independent laboratories 
using GeneMapper version 3.7 software (Applied Biosystems). Sequences of loci were 
deposited in GenBank (EU888832–EU888846). 
 
 Observed and expected heterozygosities, deviations from Hardy–Weinberg 
equilibrium (HWE) expectations and linkage disequilibrium were calculated using 
Arlequin version 2.000 (Schneider et al. 2000). Sequential Bonferroni corrections for 
multiple tests were applied using a global P value of 0.05 (Rice 1989). The program 
Micro-Checker version 2.2.3 (van Oosterhout et al. 2004) was used to test for null 
alleles, large allele dropout and scoring errors due to stutter peaks. 
 
 The number of alleles detected at each locus ranged from 11 to 58 for A. 
franciscana, and