Gonzalez-Rodriguez-Estela(1)

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Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
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Universitat d'Alacant 
Universidad de Alicante 
Tesis Doctoral 
Alteraciones del acoplamiento excitación-
contracción y la función del factor de 
crecimiento similar a la insulina-I en el 
deterioro del músculo esquelético con el 
envejecimiento 
Directores: Osvaldo Delbono 
Andrés Morales 
UNIVERSITAT D'ALACANT 
C E D í P 
o 1 OCT. 200/; 
m....\ Niim 
Estela González Rodríguez 
Alicante, septiembre, 2004 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Universitat d'Alacant 
Í ¿ ^ Universidad de Alicante 
Departament de Fisiología, Genética i Microbiología 
Departamento de Fisiología, Genética y Microbiologí 
Dr. Osvaldo Delbono, Catedrático del Departamento de Fisiología y 
Farmacología de Wake Forest * University Scliool of Medicine 
(Winston-Salem, Carolina del Norte) y Dr. Andrés Morales, Profesor 
Titular del Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología de 
la Universidad de Alicante, 
CERTIFICAN: Que el trabajo de investigación conducente a la 
obtención del grado de Doctor titulado: "Alteraciones 
del acoplamiento excitación-contracción y la función 
del factor de crecimiento similar a la insulina-I en el 
deterioro del músculo esquelético con el 
envejecimiento", de la que es autora Dña. Estela 
González Rodríguez, ha sido realizado bajo su 
dirección en los Departamentos de Fisiología y 
Farmacología de Wake Forest University School of 
Medicine y de Fisiología, Genética y Microbiología 
de la Universidad de Alicante. 
Y para que así conste, y surta los efectos oportunos, firman el 
presente certificado en Alicante, a dieciséis de septiembre de dos 
mil cuatro. 
jiW^ 
áldo Delbono Andrés Morales 
Tel, + 34 965 90 9494- Fax + 34 965 90 9569 
Campus de Sant Vicent del Raspeig 
Ap. 99. E-03080 Alacant 
e-mail; dgm@ua.es 
web: http.//www,ua.es/fgm 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
mailto:dgm@ua.es
http://http.//www,ua.es/fgm
AGRADECIMIENTOS 
Al Dr. Osvaldo Delbono, por toda la paciencia y la dedicación demostrada a lo 
largo de estos años. Agradezco sobre todo, su cálida acogida, la oportunidad 
de haber trabajado en su laboratorio y la comprensión que ha manifestado 
siempre hacia mi falta de conocimientos e inexperiencia. Al Dr. Andrés 
Morales por su apoyo incondicional y por todo el tiempo dedicado a este 
trabajo. La pasión y dedicación de ambos por la ciencia me ha animado y me 
ha provisto de ejemplos en los cuales modelar mi propia carrera científica. 
Mis compañeros de trabajo, en el laboratorio del Dr. Delbono, se merecen un 
reconocimiento muy especial; María-Laura Messí, Zhenlin Zheng, ZhongMin 
Wang, HongQu Shan y Anthony Payne. Todos han sido y son unos 
compañeros y amigos excelentes. Agradezco a Laura por llevar a cabo los 
experimentos de SDS PAGE e inmunohistoquímica para la determinación del 
tipo de fibras y a Zhenlin por las determinaciones de IGF-1 en músculo. 
Mis familiares y amigos han llenado mi carrera de post-grado de memorias 
maravillosas. 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
índice 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
ÍNDICE 
Lista de abreviaturas v/ 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1. Estructura y función del músculo esquelético 2 
1.2. Acoplamiento excitación-contracción en músculo esquelético 5 
1.3. Subtipos de fibras musculares y tipos de contracción 8 
1.4. Importancia de la pérdida de función muscular con la edad 8 
1.5. Mecanismos responsables de la pérdida de la función muscular 
con el envejecimiento 10 
1.6. El desacoplamiento de EC como mecanismo responsable de 
la debilidad muscular 15 
1.7. La técnica de fibra única e intacta como excelente aproximación 
experimental para determinar la fuerza específica del músculo 
esquelético 16 
1.8. Eventos elementales de la liberación de Ca^*(EELC) -
Chispas de Ca^^ del RS 17 
1.9. El músculo esquelético y el factor de crecimiento similar a la 
insulina de tipo I (IGF-1) 19 
2. OBJETIVOS 21 
3. MATERIAL Y MÉTODOS 
3.1. Disección y montaje de fibras únicas intactas 25 
3.2. Registros de contracción de fibra única 26 
3.3. Registros de contracción de los experimentos de fatiga 27 
3.4. Experimentos de contracción de músculo entero 27 
3.5. Registros de Câ "̂ intracelular en fibras únicas intactas de FDB 28 
3.6. Calibración del indicador Fluo 3-AM y cálculo de la 
concentración intracelular de Ca^* 29 
3.7. Análisis del tipo de fibra en músculo esquelético 31 
3.8. Medida de la concentración de IGF-1 en músculo FDB 32 
3.9. Preparación de las fibras musculares para el registro de 
chispas de Ca^" 32 
3.10. Imágenes de fluorescencia de las chispas Ca^* 33 
3.11. Análisis de las imágenes de chispas de Ca "̂" 34 
3.12. Composición de cadena pesada de miosina (CPM) 36 
3.13. Preparación de las membranas e Immunoblots del RyR 36 
3.14. Análisis estadístico 38 
4. RESULTADOS 
4.1. Efecto del envejecimiento sobre la fuerza específica de células 
únicas intactas de los músculos extensor común de los dedos 
(EDL) y soleo de ratón disminuye 
III 
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4.1.1. La fuerza específica máxima en células de músculos 
rápidos y lentos 41 
4.1.2. Cinética de contracción de fibras de EDL y 
soleo de ratones jóvenes, de mediana edad y viejos 45 
4.2. índice de fatiga en fibras musculares del EDL y Soleo de ratones 
jóvenes y viejos 
4.2.1. índice de fatiga en fibras musculares de EDL y soleo 
de ratones jóvenes y viejos 48 
4.2.2. Curso temporal del índice de fatiga de fibras de 
EDL y soleo de ratones jóvenes y viejos 52 
4.3. El factor de crecimiento similar a la insulina-I previene la 
disminución de Ca^^ intracelular y fuerza específica en fibras 
únicas intactas de músculo de ratones transgénicos 
4.3.1. La expresión de IGF-1 en músculos FDB de ratones 
transgénicos 56 
4.3.2. La fuerza específica de músculo FDB entero de 
ratones normales y lGF-1-transgénicos 57 
4.3.3. Área de la sección transversal y fuerza específica 
máxima registrada en células únicas intactas del 
músculo FDB 58 
4.3.4. Valores máximos de [Ca "̂̂ ]! en fibras únicas 
intactas del músculo FDB 64 
4.3.5. Efecto de la cafeína en la disminución de la fuerza 
específica y en el pico de [Ca^""]! con el envejecimiento 65 
4.3.6. Tipo de fibras que componen el músculo FDB a 
distintas edades en ratones control y transgénicos 
(IGF-1) 67 
4.4. Eventos elementales de liberación de Ca^^: "chispas" y "ascuas" 
en fibras de músculo esquelético de ratones viejos 
4.4.1. Eventos de liberación de Câ "̂ en imágenes XY y de 
escan de línea 71 
4.4.2. Efecto de los moduladores de RyRs en la frecuencia 
de las chispas de Ca^^ 73 
4.4.3. Propiedades de los EELC identificados en imágenes 
X-Y o de escan de línea en fibras de ratones 
jóvenesy viejos 75 
4.4.4. Eventos tipo "ascua" en imágenes de escan de línea 
en fibras de EDL de ratones jóvenes y viejos 80 
4.4.5. Subtipos de fibras musculares y frecuencia de las 
chispas de Câ * 82 
4.4.6. Función mitocondrial y frecuencia de las chispas 
de Ca "̂" en fibras musculares de ratones jóvenes y 
viejos 83 
4.4.7. RyRI expression in EDL muscle from ageing mice 84 
IV 
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g DISCUSIÓN 
5.1. Efecto del envejecimiento sobre la fuerza específica de células 
únicas intactas de los músculos extensor común de los dedos 
(EDL) y soleo de ratón disminuye 
5.1.1 La fuerza específica de fibras intactas de los músculos 
esquelético EDL y soleo de ratón disminuye con la edad 88 
5.1.2. Mecanismos responsables de la disminución de fuerza 
específica en músculo esquelético con el envejecimiento 89 
5.1.3. Cinética de contracción en fibras de EDL y soleo de 
ratones jóvenes, de mediana edad y viejos 91 
5.2. índice de fatiga en fibras musculares del EDL y soleo de ratones 
jóvenes y viejos 
5.2.1. Fatiga muscular en ratón y otras especies 94 
5.2.2. Fatiga en fibras de los músculos EDL y soleo 95 
5.2.3. Mecanismos responsables de la alteración del 
funcionamiento neuromuscular con el envejecimiento 95 
5.3. El factor de crecimiento similar a la insulina-I previene la 
disminución de Ca^* intracelular y fuerza específica en fibras 
únicas intactas de músculo de ratones transgénicos 
5.3.1. IGF-1 previene la disminución de fuerza 
específica con el envejecimiento 98 
5.3.2. Mecanismos responsables de la disminución de fuerza 
específica de fibras musculares con el envejecimiento 100 
5.3.3. Mecanismos del efecto de IGF-1 en ratones 
IGF-1-transgénicos 102 
5.4. Eventos elementales de liberación de Ca^*: "chispas" y "ascuas" 
en fibras de músculo esquelético de ratones viejos 
5.4.1. EELC en músculo esquelético de ratón adultos 105 
5.4.2. Efectos del envejecimiento en las propiedades 
de los EELC 107 
6. CONCLUSIONES 113 
7 BIBLIOGRAFÍA 115 
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Abreviaturas 
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LISTA DE ABREVIATURAS 
AMM 
ATP 
AST 
Ca *̂ 
CPM 
CICR 
DE 
DEC 
DHPR 
DMM 
EC 
EEM 
EDL 
EELC 
FE 
FDB 
IGF-I 
MA 
RDI 
RS 
RyR 
SERCA 
TMB 
Anchura a la mitad del máximo 
Adenosina trifosfato 
Área de la sección transversal 
Ion calcio 
Cadena pesada de miosina 
Liberación de Ca "̂" inducida por Ca "̂" 
Desviación estándar 
Desacoplamiento de excitación-contracción 
Receptor de la dihidropiridina 
Duración a la mitad del máximo 
Excitación-contracción 
Error estándar de la media 
Extensor común de los dedos {Extensor digitorum longus) 
Eventos elementales de liberación de calcio 
Fuerza específica 
Flexor corto de los dedos {Flexor digitorum brevis) 
Factor de crecimiento similar a la insulina-I 
Mediana edad 
Región de interés 
Retículo sarcoplasmático 
Receptor de la rianodina 
ATPasa de Ca "̂" del retículo endoplasmático 
Tetrametilbenzidina 
vn 
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^ Túbulos-T 
TT 
^ Sensor de voltaje 
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1. Introducción 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
1. INTRODUCCIÓN 
1.1, Estructura y función del músculo esquelético 
Los músculos permiten a los animales convertir energía química, en forma de 
ATP, en energía mecánica. Atendiendo a criterios morfofuncionales los músculos de los 
vertebrados se pueden clasificar en dos tipos: i) músculo estriado, que presenta 
estriaciones características producidas por grupos organizados de filamentos de actina 
y miosina que forman los sarcomeres; dentro de este grupo se incluye el músculo 
cardiaco, que forma parte de la pared del corazón y se caracteriza, entre otras cosas, 
por carecer de innervación específica para cada fibra y generar potenciales de acción 
de muy larga duración; y el músculo esquelético, en el que cada fibra recibe inervación 
de una motoneurona y , como su nombre indica, está unido al esqueleto; y ii) músculo 
liso, localizado en las paredes de los órganos huecos, excepto el corazón, y 
caracterizado por carecer de las típicas estriaciones del músculo esquelético y generar 
contracciones más lentas. 
El músculo estriado esquelético está rodeado de una cubierta de tejido conectivo 
denominado epimisio. Además, bandas de fibras musculares y las propias células 
están delimitadas por tejido conectivo que constituye, respectivamente, el perimisio y el 
endomisio. A través de este tejido fibroso discurren los vasos sanguíneos, linfáticos y 
nervios musculares. Adicionalmente, el tejido conectivo en el músculo genera 
estructuras más fuertes como los tendones, aponeurosis, rafes y capa reticular de la 
dermis o periostio, que proveen soporte para la inserción y contracción del músculo. 
Las fibras musculares esqueléticas son células multinucleadas cilindricas de una 
gran longitud (pueden alcanzar varios centímetros) y un diámetro que puede variar 
entre 5 y 100 |am. Las fibras musculares están rodeadas de una membrana 
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Introducción 
denominada sarcolenna y contienen miofibrillas formadas por las proteínas contráctiles 
como la miosina, actina, tropomiosina, el complejo troponina y proteínas de soporte 
estructural como la actinina y tinina. La organización espacial específica de los 
filamentos contráctiles finos (constituidos por actina, tropomiosina y el complejo 
troponina) y gruesos (formados por miosina) es responsable de la estriación cruzada 
característica de los músculos estriados. Las diferencias en el índice de refracción de 
distintas regiones de la fibra muscular determinan la alternancia de bandas claras, 
isótropas o bandas " I " y bandas oscuras, anisótropas o bandas "A". La figura 1 ilustra la 
organización de las bandas I y A en la sección de una fibra única. Las líneas Z, 
localizadas en el medio de las bandas I determinan el límite del sarcomere. Los 
filamentos gruesos están formados por la miosina, proteína con capacidad de unirse a 
la actina que posee una unidad catalítica con un sitio que hidroliza ATP, la fuente de 
energía para la contracción muscular. Las moléculas de actina-G se polimerizan en 
filamentos largos y finos formando una hélice con hendiduras donde se localizan las 
moléculas de tropomiosina. Las moléculas de troponina se sitúan a intervalos regulares 
a lo largo de las moléculas de tropomiosina. El complejo troponina tiene tres 
componentes: troponina T que se une a los componentes de la tropomiosina; troponina 
I que inhibe la interacción entre miosina y actina y troponina C que contiene 4 sitios 
HLH para unión de Ca "̂", que es el responsable del iniciode la contracción muscular 
(Loeser y Delbono, 2003). 
1.1.1. La Unidad Motora 
Las motoneuronas, localizadas a nivel de los núcleos motores troncoencefálicos 
y en el asta ventral de la médula espinal, constituyen la vía final común para la 
transmisión de señales de centros motores al músculo esquelético. La motoneurona 
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Introducción 
Sarcómero 
Retículo 
Sarc opla siná tic o 
Mítocondiia Tíibiüo-T Saicoleina 
Figura 1. Esquema tridimensional de la relación entre los elementos de la membrana y la 
organización de los filamentos del aparato contráctil (Adaptada de Leeson y Leeson, 1976, 
WB Sanders). 
integra la información recibida y envia su señal por el axon, que a través de las raíces 
ventrales y nervios periféricos alcanza el músculo. Cada motoneurona inerva un 
número variable de fibras musculares dentro del mismo músculo, pero en vertebrados 
adultos cada fibra muscular recibe innervación de una única motoneurona. Todas las 
motoneuronas que inervan un músculo están agrupadas en uno o, generalmente, en 
varios segmentos de la medula espinal. Las terminaciones axónicas de las 
motoneuronas establecen sinapsis con las fibras musculares a nivel de la placa motora. 
La generación de un potencial de acción en la motoneurona hace que todas las fibras 
musculares con las que establece sinapsis superen el umbral de excitación y se 
contraigan. Por ello, una motoneurona y las fibras musculares que inerva constituyen la 
unidad motora, que es la unidad cuantal mínima de ejecuciónon motora. En base a 
criterios funcionales (velocidad de contracción, índice de fatiga y fuerza tetánica 
generada), se pueden diferenciar tres tipos principales de unidades motoras: S, o 
4 
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Introducción 
lentas; FR, o resistentes a fatiga; y FF, o de fatiga rápida. Las diferencias funcionales 
(Je los distintos tipos de unidades motoras están basadas en diferentes propiedades 
bioquímicas y estructurales de las fibras musculares que las constituyen (Loeser y 
Delbono, 2003). 
1.2. Acoplamiento excitación-contracción en músculo esquelético 
La secuencia de eventos que tienen lugar para la conversión de una señal 
eléctrica (potencial de acción) de la fibra muscular en desarrollo de fuerza se define 
como acoplamiento de excitación-contracción (EC). El potencial de acción en la fibra 
muscular se genera como consecuencia de la liberación de acetilcolina por el terminal 
nervioso a nivel de la placa motora, unión del neurotransmisor a receptores nicotínicos 
de acetilcolina en el elemento post-sináptico (membrana de la fibra muscular o 
sarcolema), y aumento a este nivel de las conductancias al sodio y potasio 
responsables de los potenciales sinápticos que, si superan el umbral de excitación, 
generan la respuesta activa. El potencial de acción muscular es conducido a lo largo 
del sarcolema y por medio de los túbulos-T (Fig. 2) se distribuye la excitación hasta el 
interior de la fibra muscular. La transducción de la señal eléctrica en mecánica requiere 
de la participación de una proteína localizada en la membrana de los túbulos T, el 
receptor de dihidropiridina (DHPR). El DHPR es un canal de Ca "̂" dependiente del 
voltaje, subtipo L, que al ser activado por la despolarización que acompaña al potencial 
de acción sufre un cambio de conformación, asociado a movimientos de carga dentro 
de la membrana y genera una corriente de Ca^* de entrada (Fig.3). Se cree que la 
interacción física entre el DHPR y el receptor de la rianodina (RyR1), un canal de 
liberación de Ca "̂" localizado en la membrana del retículo sarcoplasmático (RS), como 
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Introducción 
Motoneurona 
Triada 
Figura 2. Propagación del potencial de acción a lo largo del sarcolema y en los túbulos-
T. (Adaptada de Heiny, J.A. 2001) 
consecuencia del cambio conformacional del DHPR, produce la activación del RyR1 y 
liberación masiva de Câ "̂ de las cisternas terminales del RS (Schneider y Chandler, 
1973). El Ca "̂" se une a la troponina C y esta por medio de la troponina T desplaza la 
tropomiosina hacia un lado, exponiendo los sitios de unión de la actina y permitiendo la 
formación de los puentes cruzados entre la miosina y los filamentos de actina, que 
median el deslizamiento de los filamentos delgados sobre los gruesos y la generación 
de fuerza (Looser y Delbono, 2003). Por todo esto, el Ca "̂" juega un papel muy 
importante en el desarrollo de la fuerza muscular. La figura 3 representa los pasos del 
proceso de acoplamiento EC en fibras musculares esqueléticas de mamíferos. La 
corriente de Ca "̂" de entrada es debida a la activación de los DHPRs localizados en la 
membrana de los túbulos-T. El movimiento de carga es el resultado del desplazamiento 
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Introducción 
Voltaje de membrana fvn 
-80 mV 
MoElamentos 
Figura 3. Acoplamiento de excitación-contracción en músculo esquelético de mamíferos. 
La corriente de Ca^* entra a través del receptor de dihidropiridina (DHPR) localizado en la 
membrana de los túbulos T. El movimiento de carga es el resultado del movimiento de la 
unidad del DHPR que actúa como sensor de voltaje. La liberación de Câ "" del retículo 
sarcoplasmático (RS) ocurre a través del receptor de la rianodina (RyRI) y produce un 
aumento transitorio de Câ "" en el citoplasma. El Câ "" citoplasmático produce la contracción 
mediante la activación del ciclo de los puentes cruzados. Barras de calibración vertical: 5 nA, 
10 ijMms"\ 5 fjM, y 200 kPa para la corriente de Câ "" y movimiento de carga, liberación de Ca *̂ 
del RS, transitorio de Câ "" y fuerza, respectivamente (Payne y cois., 2004); adaptada de 
Melzer, W., A. Herrmann-Frank, y H. Luttgau. Biochim.Biophys.Acta 1241:59-116, 1995] 
de la subunidad del DHPR que actúa como sensor de voltaje. La liberación de Ca^* del 
RS ocurre a través de la isoforma muscular del receptor de la rianodina (RyRI), cuya 
activación produce el aumento transitorio de la [Ca^*] mioplasmático (transitorio de 
Ca^*). El incremento de la [Ca^^l resulta finalmente en la formación de los puentes 
cruzados y la generación de fuerza. 
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Introducción 
1.3. Subtipos de fibras musculares y tipos de contracción 
Se han identificado distintos tipos de fibras musculares mediante tinciones 
inmunológicas o de ATPasa, basadas en la dependencia del pH de la actividad ATPasa 
de la miosina, que se correlaciona con las propiedades antigénicas de la miosina en 
musculo de contracción rápida y lenta (ver Tabla 1). De acuerdo con la clasificación 
histoquímica, las fibras musculares están divididas en tipo I y tipo II (A, B y X) (Tabla 1). 
Las fibras humanas se clasifican en rápidas y lentas en base a sus propiedades de 
contracción en respuesta a una estimulación aislada (genera un único potencial de 
acción). Las fibras rápidas, también denominadas tipo II, glicolíticas o blancas, se 
contraen en menos de 10 ms y participan mayoritariamente en movimientosrápidos, 
finos y precisos. Las fibras lentas, también denominadas tipo I, oxidativas o rojas, 
muestran un tiempo de contracción de hasta 100 ms y participan en movimientos 
sostenidos y menos precisos. En contra de lo pensado en el pasado, las fibras 
musculares son estructuras dinámicas con una capacidad de adaptación excepcional. 
Sus perfiles fenotípicos pueden ser afectados tanto por la inervación, el ejercicio, 
sobrecarga mecánica e inactividad, hormonas y envejecimiento (Greenlund y Nair, 
2003; Pette y Staron, 2001). 
1.4. Importancia de la pérdida de la función muscular con la edad 
La población de ancianos esta creciendo a nivel mundial. En la actualidad, en los 
Estados Unidos solamente hay alrededor de 39 millones de individuos mayores de 65 
años de edad y este número sigue creciendo, aumentando así la demanda y los gastos 
del cuidado a largo plazo. En el año 2001, la administración del cuidado y la salud de 
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Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
Tabla 1. 
Clasificación histoquímica de las fibras musculares 
Subtipos de Características 
fibras funcionales e 
musculares histoquímicas 
Tinción de ATPasa 
Tipo 1 
Tipo HA 
Tipo MB 
Tipo IIX 
Contracción 
lenta, oxidativa 
Contracción 
rápida, 
oxidativa, 
glicolítica 
Contracción 
rápida, 
glicolítica 
Fetal 
pH9.4 
Clara 
Oscura 
Oscura 
Oscura 
pH4.6 
Clara 
Clara 
Oscura 
Oscura 
pH4.3 
Oscura 
Clara 
Oscura 
Oscura 
Adaptada de (Loeser y Delbono, 2003) 
EEUU gastó aproxinnadamente 103 billones de dólares en residencias para la tercera 
edad y este gasto aumentara hasta mas de 183 billones (un aumento del 77 %) en el 
2010. Por lo tanto, el envejecimiento representa un tema muy relevante tanto desde el 
punto de vista de la salud como socioeconómico. La asistencia a residencias de la 
tercera edad es requerida con mayor frecuencia por ancianos que no son capaces de 
cuidar de si mismos. Aunque la pérdida de independencia ocurre a varios niveles, la 
disminución de fuerza muscular se considera una de las causas mas importantes que 
produce fragilidad y discapacidad en los ancianos. La disminución de fuerza muscular 
es responsable de caídas y fracturas que pueden agravar otros cuadros clínicos y 
contribuyen enormemente a la discapacidad en los ancianos (Greenlund y Nair, 2003). 
Así pues, a medida que la población envejece, se vuelve más importante comprender 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
(OS mecanismos responsables de la disminución de fuerza muscular para contribuir al 
desarrollo de tratamientos e intervenciones que contrarresten la pérdida de función y 
masa muscular con el envejecimiento, y mejoren así la calidad de vida de los ancianos. 
1.5. Mecanismos responsables de la pérdida de la función muscular con el 
enveiecimiento 
A pesar de la importancia de la fuerza muscular en la prevención de 
discapacidades, los mecanismos responsables de este fenómeno sólo se conocen 
parcialmente. No obstante, en los últimos años se han realizado estudios a nivel 
morfológico, celular y molecular de los mecanismos responsables de la pérdida de 
función muscular, tanto en humanos como en modelos animales de envejecimiento. 
Los factores que determinan alteraciones del músculo esquelético se pueden englobar 
en cuatro grupos: 1) primariamente neurogénicos, 2) primariamente miogénicos, 3) la 
combinación de alteraciones musculares y neurales y 4) mecanismos generales 
relacionados con el músculo esquelético (Tabla 2) (Loeser y Delbono, 2003). 
1.5.1. Mecanismos primariamente neurogénicos 
Los mecanismos primariamente neurogénicos incluyen la reducción en el 
número y/o tamaño de las motoneuronas espinales, y alteraciones en el flujo axonal y 
en la unión neuromuscular. Cada uno de estos factores, individualmente o en 
combinación, produce denervación muscular crónica y remodelado de las unidades 
motoras. No sorprende, por tanto, que algunos ancianos presenten evidencias 
electromiográficas de denervación muscular, sugiriendo alteraciones de las 
motoneuronas que no se vinculan a la clásica enfermedad amiotrófica (esclerosis 
10 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
lateral amiotrófica). La denervación muscular se asocia con la reinervación de fibras, 
que se refleja en la agrupación de fibras musculares en secciones histológicas. Los 
ciclos de denervación muscular asociados con la reinervación son los responsables de 
la remodelación de las unidades motoras. En la actualidad no está claramente 
establecida la importancia funcional de este remodelado de las unidades que se 
produce con el envejecimiento. El remodelaje de motoneuronas que ocurre con el 
envejecimiento involucra fundamentalmente la denervación de fibras rápidas y la 
reinervación de estas fibras por colaterales axónicas de motoneuronas que inervan 
fibras lentas. De esta forma, el remodelado de las unidades motoras se acompaña de 
cambios en la distribución del tipo de fibras en músculos mixtos. A pesar de que la 
reinervación de fibras musculares tiende a compensar la denervación, con el 
envejecimiento, se produce una pérdida neta de fibras musculares indicando que el 
grado de denervación de fibras musculares excede al de reinervación. No está claro si 
la denervación muscular es debida a alteraciones en las motoneuronas, en los 
terminales nerviosos, o en el transporte axonal. La velocidad de conducción de los 
nervios periféricos no se afecta significativamente con el envejecimiento (Loeser y 
Delbono, 2003), sugiriendo que con el envejecimiento no existen probablemente 
alteraciones en la mielina o reducciones importantes en el calibre de los axones. 
Aunque se ha sugerido que la denervación es un factor que contribuye a las 
alteraciones del músculo esquelético observadas con el envejecimiento, el nivel de 
denervación en músculos individuales y su efecto en músculos de humanos esta por 
determinar. 
1.5.2. Mecanismos primariamente miogénicos 
Estudios previos han contemplado la hipótesis de que la pérdida de masa 
11 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
Tabla 2 
Patogenia de las Alteraciones del Músculo Esquelético con el Envejecimiento 
I. Alteraciones primariamente neurogénicas 
A. Motoneuronas espinales 
1. Reducción en el número 
2. Reducción de tamaño 
B. Alteraciones del flujo axonal 
C. Alteraciones de la transmisión neuromuscular 
1. Disminución del número de terminales nerviosos 
2. Reducción de la liberación de neurotransmisor 
3. Disminución del número de receptores de Acetilcolina 
II. Alteraciones primariamente miógénicas 
A. Daño causado por contracción 
B. Disminución de la estabilidad de los puentes de actina-miosina 
C. Alteraciones de la señal de transducción (factores tróficos/resistencia a 
hormonas) 
D. Disminución de la proliferación de las células satélite 
III. Combinación de factores 
A. Músculos en suspensión 
B. Desacoplamiento de excitación-contracción 
iV. Mecanismos generales relacionados con el músculo esquelético 
A. Estrés oxidative 
B. Mutaciones del DNA mitocondrial 
C. Vasculopatías relacionadas con el envejecimiento 
Adaptada de Loeser y Delbono, 2003. 
12 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contraccióny la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
muscular puede ser responsable de la disminución de fuerza nriuscular. Sin embargo, la 
disminución de fuerza con el envejecimiento es mayor que la disminución de masa 
muscular en humanos (Brooks y Faulkner, 1988). Estudios in vitro sobre contractilidad 
realizados en músculos de ratones y ratas han revelado una disminución de fuerza 
específica (fuerza normalizada por el área de la sección transversal del músculo) con la 
edad (Brooks y Faulkner, 1994a). Esto sugiere que la capacidad intrínseca del músculo 
esquelético de generar fuerza esta alterada en mamíferos de edad avanzada, incluidos 
los humanos (Delbono, 2002). Varios mecanismos primariamente miogénicos podrían 
ser responsables de la disminución de fuerza específica con el envejecimiento, estos 
incluyen: /) Alteraciones en la capacidad de recuperación después de daños inducidos 
por contracciones (Brooks y Faulkner, 1990), //) disminución de la estabilidad de los 
puentes de actina-miosina (Lowe y cois., 2002), iii) alteraciones en la transducción de la 
señal en el músculo (acoplamiento de excitación-contracción) (Delbono, 2003) y iv) 
disminución de la proliferación de las células satélite (Rennie y cois., 2004). 
Las alteraciones producidas por la contracción han sido relacionadas con un 
aumento de la fragilidad mecánica y una disminución de la capacidad restaurativa con 
la edad, fenómeno que no ha sido bien caracterizado. Cuando los músculos 
experimentan repetidos ciclos de contracción/relajación sufren un daño que se acentúa 
de forma significativa en animales viejos. Además, los músculos de animales viejos se 
recuperan más lentamente que los de animales jóvenes o incluso no llegan a 
recuperarse de forma completa (Brooks y Faulkner, 1990). 
Alteraciones que impiden la activación completa de la maquinaria contráctil para 
desarrollar fuerza pueden contribuir a la disminución de fuerza específica. Existen 
numerosos datos experimentales que indican que con el envejecimiento se produce 
una disminución de fuerza específica en los distintos tipos de fibras musculares (I, lia, 
y llb/llx), tanto de músculos humanos como de rata (Frontera y cois., 2000; Larsson y 
13 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
cols., 1997; Li y Larsson, 1996; Lowe y cols., 2002; Thompson y Brown, 1999). La 
observación de que fibras musculares carentes de membrana externa de músculos de 
humanos ancianos y otros mamíferos pequeños desarrollan menos fuerza específica 
que la de músculos de individuos jóvenes cuando son activadas a nivel máximo sugiere 
que la capacidad intrínseca de generar fuerza del aparato miofibrilar está alterada 
(Lowe y cois., 2002). Los experimentos realizados en células sin sarcolema no reflejan 
las alteraciones en el proceso de acoplamiento excitación-contracción, ya que las fibras 
carecen de membrana plasmática y, por ello, cualquier cambio en la fuerza contráctil 
generada en fibras de animales viejos refleja directamente alteraciones del aparato 
contráctil. 
El proceso de acoplamiento de EC se ha demostrado que está alterado con el 
envejecimiento. En 1995, Delbono y cois propusieron, por primera vez, que el 
mecanismo de acoplamiento de EC esta alterado en músculo esquelético de mamíferos 
viejos. Desde entonces se han descrito nuevas evidencias experimentales que apoyan 
esta hipótesis (Ryan y cois., 2000; Delbono, 2003) (ver abajo). 
Las fibras musculares de mamíferos adultos son células completamente 
diferenciadas y; por ello, carecen de actividad mitótica para producir mionúcleos 
adicionales cuando aumenta la síntesis de proteínas y el músculo se hipertrofia. El 
incremento en el número de mionúcleos se obtiene por diferenciación de células 
satélite, que están localizadas en las invaginaciones del sarcolema debajo de la lámina 
basal. Dado que para alcanzar una hipertrofia muscular se requiere la activación de 
estas células es posible que en la atrofia o en las alteraciones del proceso de 
regeneración que sufren los músculos de sujetos de avanzada edad si que pueda estar 
disminuida la capacidad proliferativa y el número de estas células satélite. (Decary y 
cois., 1997; Renault y cois., 2002; Rennie y cois., 2004). 
14 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
introducción 
Otros mecanismos generales relacionados con el músculo esquelético son: daño 
oxidative (Weindruch, 1995), mutaciones en el DNA de la mitocondria (Hoopes, 2002) y 
vasculopatías relacionadas con el envejecimiento (Rogers y Evans, 1993). 
1.6. El desacoplamíento de EC como mecanismo responsable de la 
debilidad muscular 
Aunque se ha propuesto que son varios los mecanismos que causan la 
disminución de fuerza específica (ver arriba Mecanismos primariamente miogénicos), 
este trabajo esta enfocado en los mecanismos que alteran el acoplamiento EC. 
La hipótesis del desacoplamiento EC sugiere que con el envejecimiento se 
produce una reducción en el número y/o función de los DHPR y RyRI, lo que 
DISMINUCIÓN DE LA 
EXPRESIÓN DE DHPR Y RyRI 
EN MÚSCULO ESQUELÉTICO 
^ ' 
DISME^ÍUCIÓN DEL 
NÚMERO DE DHPR EN EL 
SARCOLEMAYRyRl 
OR RyRI 
y r 
DESACOPLAMÍENTO 
ENTRE DHPR-RyRl 
^ r 
REDUCCIÓN DE LA 
LIBERACIÓN DE Ca^^ 
DEL RETÍCULO 
SARCOPLÁSMICO 
^ r 
DISMESrUCIÓN DE LA 
FUERZA ESPECÍFICA 
Fulgura 4. Esquema de la hipótesis del desacoplamiento de excitación-contracción con el 
envejecimiento (Adaptada de Delbono, 2002). 
15 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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Introducción 
disminuye la liberación de Ca^* del RS (retículo sarcoplasmático) y, como 
consecuencia, la fuerza específica (Delbono y cois., 1995) (Fig.4). 
Para estudiar los cambios que se producen con el envejecimiento en el 
acoplamiento EC se ha determinado en fibras musculares de animales jóvenes y viejos 
los siguientes parámetros: el movimiento de carga, la corriente de Câ "̂ del DHPR y el 
transitorio de Ca^* mioplasmático. Las principales conclusiones aportadas por estos 
estudios son: i) El número de DHPR y DHPR/RyR1 en el músculo extensor común de 
los dedos (EDL) disminuye con el envejecimiento (Renganathan y cois., 1997a; Ryan y 
cois., 2000); ii) el movimiento de carga y la corriente de Ca "̂" del DHPR disminuyen con 
la edad en fibras del músculo cuadríceps de humanos y en el flexor corto de los dedos 
(FDB) (Delbono y cois., 1995; Wang y cois., 2000); iii) El incremento transitorio de la 
[Ca "̂"]; disminuye con la edad (Delbono y cois., 1995; Wang y cois., 2000). El 
porcentaje de reducción de la liberación de Ca^* intracelular (transitorio de Ca^*) es 
similar al de la disminución del número de DHPR y el movimiento de carga. 
1.7. La técnica de la fibra única e intacta como excelente aproximación 
experimental para determinar la fuerza específica del músculo esquelético 
La preparación de fibra única e intacta ha mostrado ser muy útil para determinar 
la fuerza específica en músculo esquelético (Lannergren y Westerbiad, 1987). La fibra 
única tiene todos los elementos necesarios para reproducir la contracción muscular, 
manteniendo el sistema de túbulos T, sarcolema y retículo sarcoplasmático intactos. De 
esta forma se pueden realizar estudios funcionales que relacionen cambios controlados 
en el voltaje con valores de fuerza específica ycambios en la [Ca^^ji, mediados por la 
liberación de Ca "̂" del RS. En fibras musculares de ratones adultos jóvenes, pero no de 
16 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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Introducción 
ratones viejos, se han obtenido registros simultáneos de la fuerza específica y de la 
[Ca^*], (Lannergren y Westerbiad, 1987). 
El RS desempeña un papel importante en la regulación del Ca "̂" mioplasmático. 
La magnitud del incremento de la [Ca^""]! libre durante la contracción es el mayor 
determinante del desarrollo de fuerza y depende de varios factores, siendo uno de ellos 
el contenido de Ca^* del RS. Una menor cantidad de Câ "̂ en el RS podría ser la causa 
de la disminución de fuerza específica con la edad. Aunque experimentos de fijación de 
voltaje en células humanas han demostrado que existe una cantidad extra de Ca "̂" 
disponible en el RS en fibras de ratones viejos, se desconoce todavía si este Ca^* está 
también disponible en fibras únicas musculares durante la contracción evocada por un 
estímulo eléctrico. Además, si esta cantidad de Ca "̂" extra pudiera ser liberada, no se 
sabe si el resultado sería un aumento del desarrollo de fuerza en fibras de ratones 
viejos. La cafeína es un activador muy potente del RyRI y se ha utilizado ampliamente 
para aumentar la liberación de Câ "̂ del RS. Experimentos con cafeína en células 
únicas de músculo de ratones jóvenes y viejos podrían proveer información muy útil en 
lo que al contenido de Ca^* del RS se refiere. 
1.8. Eventos elementales de liberación de Ca^^fEELC) - (Chispas de Ca^ )̂ 
delRS 
Los eventos elementales de liberación de Ca^* del RS, también denominados 
chispas de Câ "̂ , son fenómenos discretos y localizados que surgen de la apertura de 
un grupo pequeño de canales-RyR1s de liberación de Ca "̂̂ . El concepto de que es 
necesaria una elevación espacial homogénea del Ca^* citoplasmático para el 
reconocimiento de una señal de Ca^* ha sido totalmente abandonado con el 
descubrimiento de las chispas de Ca^*. Las chispas de Ca^* presumiblemente ocurren 
17 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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Introducción 
en tal alta frecuencia y número durante la despolarización de la fibra muscular, que los 
eventos individuales son difíciles de distinguir durante el transitorio de Ca^''. El 
desarrollo de condiciones experimentales bajo las cuales las chispas de Ca "̂" pueden 
ser observadas y caracterizadas ha constituido un enorme avance en el estudio del 
proceso de liberación de Ca "̂" del RS (Schneider y Ward, 2002). Las chispas de Ca "̂" 
son capaces de elevar localmente la [Ca "̂̂ ]; a valores muy altos (10-100 pM), mientras 
que el aumento global de la [Ca "̂"]! es de menos de 2 nM (Jaggar y cois., 2000). Las 
chispas de Ca "̂" se detectaron por primera vez con imágenes de microscopia confocal 
en células musculares cardíacas (Cheng y cois., 1993) y más tarde en una variedad de 
tejidos incluyendo el músculo esquelético de anfibios y mamíferos (Fig. 5) (Klein y cois., 
1996) (Shirokova y cois., 1998; Tsugorka y cois., 1995). 
Figura 5. Chispas de Câ ^ registradas en una fibra del músculo EDL de un ratón joven. 
Las imágenes corresponden a una serie de 50 imágenes tomadas a una velocidad de 3 
s/imagen con una resolución espacial de 512x512 píxeles y tamaño de pixel de 0.134 pm. 
Las chispas de Ca "̂" han sido estudiadas para entender el proceso celular de la 
liberación de Ca "̂" y su control, ya que aportan información sobre la apertura de los 
RyRIs (dispersión espacial, amplitud y duración) en células vivas. El análisis de las 
propiedades de las chispas ayudara a conocer mejor el proceso de acoplamiento EC y 
a comprender las alteraciones que experimenta este proceso en estados 
patofisiológicos como la hipertrofia cardíaca., paro cardíaco e hipertermia maligna 
(Cheng y cois., 1999). Por ejemplo, se ha demostrado que las chispas de Ca "̂" 
espontáneas están significativamente alteradas en la disfunción del músculo 
18 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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Introducción 
esquelético asociada a la insuficiencia cardíaca congestiva (Ward y cois., 2003). El 
estudio de las chispas de Ca^* también esta siendo utilizado para determinar algunos 
aspectos de la regulación metabólica de la liberación de Ca "̂" por el RyR1 (Isaeva y 
Shirokova, 2003a). Esta aproximación experimental es de gran relevancia ya que 
existen evidencias que indican que la modulación y función de la actividad del RyR1 
esta alterada con la edad (Margreth y cois., 1999). Hasta ahora no se ha realizado 
ningún estudio sobre chispas de Ca^* en músculo esquelético de mamíferos viejos. 
1.9. El músculo esquelético y el factor de crecimiento similar a la insulina 
detipoKIGF-D 
IGF-1 es un peptide estructuralmente similar a la proinsulina que tiene como 
función principal el producir el crecimiento y diferenciación del músculo esquelético 
(Florini y cois., 1996). Con la edad, la producción y actividad del eje de la hormona del 
crecimiento/ IGF-1 disminuye lo cual se ha asociado con el aumento de los procesos 
catabólicos (Lamberts y cois., 1997) que llevan a la pérdida de masa muscular y fuerza. 
La expresión de IGF-1 en fibras musculares, mediante la infección de un adenovirus, 
previene la pérdida de masa y fuerza muscular con el envejecimiento mediante la 
estimulación de la regeneración del músculo a través de la activación de las células 
satélite (Barton-Davis y cois., 1998). Además, la expresión de la isoforma muscular de 
IGF-1 produjo hipertrofia sostenida y regeneración en músculo esquelético de animales 
viejos (Musaro y cois., 2001). La expresión de IGF-1 dirigida específicamente al 
músculo esquelético puede prevenir algunos aspectos de las alteraciones en el 
mecanismo de acoplamiento de EC, como por ejemplo: i) IGF-1 previene la disminución 
del número de DHPRs con el envejecimiento (Renganathan y cois., 1998) 
(Renganathan y cois., 1997b); ii) protege de la disminución del movimiento de carga del 
19 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Introducción 
DHPR y de la liberación de Ca "̂" intracelular en fibras del músculo FDB de ratones 
viejos (Wang y cois., 2002); iii) puede estimular la transcripción de la subunidad a1S 
del DHPRR en células musculares mediante la acción sobre el factor de transcripción 
CREB (Zheng y cois., 2002a); este proceso ocurre mediante un mecanismo que 
involucra a las proteínas calcioneurina y calmodulina cinasa (Zheng y cois., 2004); y iv) 
protege de alteraciones en el área pre y post sináptica de la unión neuromuscular 
(Messi y Delbono, 2003). Sin embargo, no existe información sobre el efecto de IGF-1 
en la eficiencia del proceso de contracción muscular o la capacidad generadora de 
fuerza específica. El impacto de los cambios arriba mencionados sobre la contractilidad 
de fibras únicas necesita ser investigado mediante la medida de la fuerza específica y 
el Câ "̂ intracelular en fibras únicas de músculos de animales IGF-1- transgénicos. 
20 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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2. Objetivos 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contraccióny la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
Tesis doctoral de la Universidad de Alicante. Tesi doctoral de la Universitat d´Alacant.2004.
Objetivos 
2. Objetivos 
A pesar de la importancia de la conservación de la fuerza muscular en la 
prevención de la discapacidad física, los mecanismos biológicos responsables del 
deterioro funcional y estructural del músculo esquelético asociados al envejecimiento se 
conocen sólo parcialmente. Se desconoce si la debilidad muscular es consecuencia de 
alteraciones en las propiedades intrínsecas de las fibras musculares, y/o de un mayor 
nivel de fatiga de las mismas, que conduce a un menor desarrollo de fuerza durante el 
proceso de envejecimiento. Uno de los eventos cruciales del proceso que lleva a la 
contracción muscular (el acoplamiento de excitación-contracción-EC) es la liberación de 
Ca^* del retículo sarcoplasmático (RS). No se sabe si una alteración en el proceso de 
liberación de Ca^* en células de ratones viejos es responsable de la disminución de 
fuerza específica. Además, la debilidad muscular esta asociada a la disminución de los 
niveles circulantes del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1), que ocurre 
durante el envejecimiento. Aunque se ha demostrado que IGF-1 puede restaurar 
algunos aspectos del acoplamiento de EC durante la edad avanzada no se sabe si este 
factor puede restaurar la fuerza muscular específica. Por todo ello, en este trabajo se 
estudiara si la debilidad muscular que ocurre con el envejecimiento es una 
consecuencia de alteraciones en las propiedades intrínsecas de las fibras musculares, 
y/o de un mayor nivel de fatiga de las mismas. Además, estudiaremos, utilizando la 
técnica de contracción de fibra única e intacta, si la disminución de la fuerza específica 
esta asociada a la disminución de la liberación de Ca^* del RS, y si esta disminución se 
puede prevenir mediante la expresión transgénica de IGF-1 en el músculo esquelético. 
Para ello: 
22 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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Objetivos 
1) Se medirán las propiedades contráctiles de fibras únicas del músculo 
esquelético lento y rápido de ratones jóvenes, de edad mediana y viejos, utilizando la 
técnica de contracción de fibra única intacta, para determinar si la disminución de 
fuerza específica con el envejecimiento es el resultado de alteraciones en las fibras que 
componen el músculo. 
2) Se determinará el nivel de fatiga de fibras únicas del músculo esquelético de 
ratones jóvenes y viejos para saber si la resistencia muscular contribuye a una 
limitación de la fuerza desarrollada por el músculo esquelético de mamíferos de edad 
avanzada. 
3) De existir cambios en los niveles de fuerza específica con la edad se 
estudiará si la disminución de la fuerza específica que ocurre con el envejecimiento 
esta asociada a una disminución de la liberación de Ca "̂" del RS. Para ello, mediremos, 
simultáneamente, los niveles de Ca "̂" intracelular y la fuerza especifica de fibras 
musculares esqueléticas de ratones jóvenes y viejos. 
4) De existir una disminución en la liberación de Ca "̂" del RS se estudiará la 
fuerza específica y la liberación de Ca^* en fibras musculares de ratones transgénicos-
lGF-1 para determinar si la expresión transgénica de IGF-1 en músculo esquelético 
puede prevenir la disminución de la liberación de Ca "̂" del RS y/o la fuerza específica. 
5) Por último, y en el caso de que exista una disminución en la liberación de 
Ca "̂" del RS se caracterizarán los eventos elementales de la liberación de Ca "̂" (EELC-
0 chispas de Ca "̂") en fibras musculares de ratones jóvenes y viejos. El estudio de las 
chispas de Ca^* nos permitirá averiguar si existen alteraciones en los RyR1s que 
contribuyen al proceso de desacoplamiento de EC. 
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Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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3. Material y Métodos 
Alteraciones del acoplamiento excitación-contracción y la función del factor de crecimiento(..). Estela González Rodríguez.
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Material y Métodos 
3. MATERIAL Y MÉTODOS 
3.1. Disección v montaje de fibras únicas e intactas 
Mediante disección se aislaron fibras únicas e intactas de los músculos EDL y 
soleo de ratones de 2 a 6 (joven; n=17) de 12 a16 (edad mediana; n= 7) y de 20-24 
meses de edad (viejo; n=15) de cepa DBA (colonia del Instituto Nacional de Harían-
Instituto Nacional del envejecimiento-NIA) o FVB (nuestra colonia). También se aislaron 
fibras del músculo FDB de ratones de 2-4 meses de edad de cepa DBA o FVB. Ambas 
cepas se han utilizado en estudios previos como modelo de animal de envejecimiento 
(Bakker y cois., 1997a; Renganathan y cois., 1998). Los procedimientos con animales 
siguieron un protocolo previamente aprobado por el comité del cuidado y uso de 
animales de la Universidad de Wake Forest (Winston-Salem, NC, USA). Los animales 
se sacrificaron mediante dislocación cervical y los músculos se disecaron de ambas 
patas posteriores. Las fibras únicas fueron disecadas bajo estereoscopio (30-50X), 
poniendo especial atención en dejar la menor cantidad posible de restos celulares de 
células vecinas. Para permitir un montaje estable y seguro de la fibra, la conexión de la 
fibra con el tejido conectivo y los tendones se mantuvo intacta. Los tendones fueron 
fijados con unos micro-clips hechos de papel de aluminio y la preparación transferida a 
la cámara de registro. Las fibras musculares fueron montadas entre un transductor de 
fuerza (403 A Aurora Scientific) y un microposicionador que permitió la regulación de la 
longitud de la fibra. Las fibras fueron perfundidas continuamente con la solución de 
registro (concentraciones expresadas en mM: NaCI 121, KCI 5, CaCb 1.8, MgCb 0.5, 
NaH2P04 0.4, NaHCOs 24, glucosa 5.5) aireada continuamente con una mezcla de 5% 
CO2 y 95% O2 para conseguir un pH de 7.4. Para el registro se ajustó la longitud de las 
fibras musculares de tal forma que pudieran desarrollar la fuerza máxima en respuesta 
25 
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Material y Métodos 
a la estimulación eléctrica. 
3.2. Registros de contracción de fibra única 
Las fibras se estimularon directamente mediante un campo eléctrico generado 
entre dos electrodos de platino conectados a un estimulador con unidad de aislamiento 
eléctrico. Trenes de pulsos rectangulares de frecuencia variable, entre 5 y 100 Hz, de 
una duración de 350 ms se aplicaron mediante estimulación eléctrica con un intervalo 
de 5 minutos para determinar la fuerza máxima específica. Trenes de duración más 
larga fueron necesarios para conseguir la fuerza máxima específica en células del 
músculo soleo. Para la adquisición de datos se utilizó un ordenador personal, un 
convertidor analógico digital (Digidata 1200, Axon Instruments, Foster City, CA) y el 
programa de adquisición y análisis PCLAMP (Axon Instruments). El diámetro de la 
célula fue medido en la cámara de registro a una magnificación de 200-400X por dos 
investigadores y la sección transversal calculada como n(cl/2)^, donde d es el diámetro 
de la célula. 
Un experimento típico se desarrolló de la siguiente manera: La fibra muscular 
intacta fue montada en la cámara de registro y estirada hasta alcanzar la longitud 
óptima (Lo) (longitud que permite el desarrollo de la fuerza máxima) mediante 
estimulación breve. Después de obtenerLo, las fibras se dejaron descansar entre 5-7 
min. Seguidamente se estudió la relación fuerza-frecuencia mediante la aplicación de 
trenes de pulsos eléctricos de 350 ms de duración a diferentes frecuencias, que 
variaron, de forma creciente, entre 5 y 200 Hz. Cuando dos frecuencias consecutivas 
desarrollaron la misma fuerza, la frecuencia siguiente no fue aplicada, con el fin de 
reducir la duración del experimento. 
26 
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Material y Métodos 
3.3. Registros de contracción de los experimentos de fatiga 
Se utilizaron dos protocolos para el estudio de fatiga, llamados de intervalo corto 
(IC) y de intervalo largo (IL). Ambos protocolos fueron estudiados a la frecuencia que 
evocó la fuerza máxima (ver capítulo I). Los trenes de pulsos fueron de 350 ms de 
duración y el intervalo entre trenes fue de 1 ó 3.65 s para los protocolos IC o IL, 
respectivamente; estos protocolos se aplicaron durante 5 y 10 min. para IC y IL, 
respectivamente. Las células de los músculos EDL fueron de contracción rápida, 
mientras que las del soleo de contracción lenta. Para determinar si una célula es de 
contracción rápida o lenta se midieron varios parámetros: tiempo al pico de contracción, 
tiempo de relajación media y duración de la estimulación necesaria para desarrollar la 
fuerza máxima. 
3.4. Experimentos de contracción de músculo entero 
Para los experimentos de contracción de músculo entero la parte distal del 
músculo FDB fue disecado de ambas patas traseras del ratón. El músculo fue montado 
entre un transductor de fuerza 404A (Aurora Scientific) (complianza: 0.1 pm mN-1, 
frecuencia de resonancia: 2 KHz) y un microposicionador ajustable para permitir el 
control de la posición y la longitud del músculo. El músculo se perfundió continuamente 
por medio de una bomba peristáltica, de forma similar a como se ha descrito 
previamente en la sección de experimentos de fibra única. 
Los registros de contracción y el análisis de experimentos de músculo entero 
siguieron la misma técnica descrita para los experimentos de fibra única con algunas 
modificaciones. Para producir la contracción máxima a diferentes frecuencias se 
aplicaron normalmente trenes de pulsos de 500 ms. En ocasiones, se aplicaron trenes 
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Material y Métodos 
de mayor duración, cuando la contracción no alcanzó un nivel estable de meseta 
durante el estimulo. El diámetro del músculo se midió en la cámara de registro a través 
de un microscopio a una magnificación de 30X o con preparaciones histológicas de 
secciones transversales. Estas últimas fueron adquiridas digitalmente y el área de las 
secciones se midió usando el programa Isee (Inovision, Durhan, NC, USA). El área de 
la sección transversal (AST) de cada músculo se midió trazando una región de interés 
(RDI) en la imagen digital a lo largo del borde de varias secciones de cada músculo. El 
área se calculó en base a las dimensiones de altura y anchura de cada pixel y al 
número total de píxeles en la RDI. 
3.5. Registros de Câ ^ intracelular en fibras únicas intactas de FDB 
La [Ca^*]i de una fibra muscular se registró simultáneamente con la fuerza 
específica, usando el indicador de fluorescencia fluo-3-AM (Molecular Probes, Eugene, 
OR, USA). Las fibras se incubaron con 5 f̂ M fluo 3-AM por 30-40 min usando una 
concentración preparada de fluo 3-AM de 1 mM en DMSO, lo que permitió una muy 
baja concentración de DMSO en la cámara de registro durante la incubación (<0.5%). 
Después de la incubación las células se perfundieron con solución de registro durante 5 
min antes de empezar el protocolo de contracción. Para los registros de fluorescencia 
la fibra se iluminó con un rayo láser de longitud de onda 488 nm. El rayo láser pasó a 
través de un módulo de sean OZ (Noran Instruments Confocal System, Middieton, Wl, 
USA) y a través de un objetivo Fluar 20 X (Zeiss, Oberkochen, Germany) montado en 
un microscopio invertido (Axiovert S100 2TV, Zeiss) antes de iluminar la preparación. 
La fluorescencia emitida fue recogida por el objetivo y dirigida al módulo de sean OZ, 
en la configuración "sin banda" y a través del filtro de emisión de longitud de onda de 
500 nm antes de ser recogida por el fotomultiplicador y digitalizada (Fig. 6). El control 
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Material y Métodos 
de los equipos, la adquisición de las imágenes y el procesado se hicieron a través del 
programa Intervision (Noran Instruments) en un ordenador Silicon Graphics 02 
(Mountain View, Ca, USA). 
Para el análisis de datos, varias RDI fueron seleccionadas de cada célula y los 
valores de la emisión máxima de fluorescencia fueron utilizados para las 
comparaciones estadísticas. 
Objetivo 
jjlaiio de foco 
Figura 6. Esquema del microscopio utilizado para los registros de fluorescencia 
3.6. Calibración del indicador Fluo 3-AM y cálculo de la concentración 
jntracelular de Câ ^ 
Para cuantificar la [Ca^*]¡, las señales fluorescentes se transformaron en 
concentraciones de Ca "̂". Para ello, se calibró en fibras musculares la fluorescencia 
29 
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Material y Métodos 
emitida por fluo S-AIVI a distintas concentraciones de Ca^*. Aunque la constante de 
disociación, Kd, es una propiedad del indicador de Câ "*" y por ello tiene un valor 
relativamente constante, se conoce que puede ser afectada por diversos factores como 
el pH, la viscosidad y la fuerza iónica, entre otros. Debido a esto, medimos la Kd del 
indicador fluo 3-AM para Ca^* en células disociadas de músculo FDB. Los músculos 
FDB de ratones jóvenes fueron incubados con colagenasa a una concentración de 
2mg/mL (Sigma, St. Louis, MO, USA) en una solución de disociación que contenía 155 
mM aspartate de cesio, 5 mM aspartate de magnesio y 10 mM HEPES (pH 7.4 con 
CsOH) (Beam y Franzini-Armstrong, 1997), durante 3h a 37 C. Las fibras musculares 
se disociaron usando pipetas Pasteur de diferentes tamaños de punta. Seguidamente, 
las fibras fueron incubadas con fluo 3-AM (5 p-M) durante 30-40 min. Tras la incubación, 
se lavó el fluo 3-AM y las células fueron expuestas a soluciones estandarizadas de 
diferentes concentraciones de Ca^*. La concentración de Ca "̂" en las soluciones 
estandarizadas se calculó de acuerdo con el procedimiento previamente descrito (Tsien 
y Pozzan, 1989). En estas condiciones se midió la fluorescencia basal. Después, las 
fibras se permeabilizaron con el detergente saponina a una concentración de 0.01% 
para permitir la entrada de Ca^* y se midió la fluorescencia máxima alcanzada antes de 
que las células se movieran o su forma se distorsionara. Los valores correspondientes 
a cada punto experimental se obtuvieron de la media de al menos 4 células. La 
fluorescencia a diferentes niveles de Ca "̂" se normalizó con la fluorescencia máxima y 
los valores de la media se ajustaron a la siguiente ecuación: y= 1/(1+(Kd/[Ca^''])) (Wang 
y cois., 1999a). La Kd de fluo 3-AM, medida en estas condiciones, fue 708 nM. La 
[Ca^*]¡ se calculó usando la siguiente ecuación: [Ca^*] = Kd (F-Fmin)/(Fmax-F) (Tsien y 
Pozzan, 1989), donde Kd es la constante de disociación; F el valor de fluorescencia de 
picoregistrado en cada célula; Fmax, la fluorescencia máxima, que se midió al final del 
experimento en cada célula, perfundiendo solución Ringer con 0.01% de saponina; y 
30 
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Material y Métodos 
Fmin, la fluorescencia en condiciones de reposo, que se midió en un grupo de células 
equilibradas con 2 mM BAPTA AM. Este procedimiento dio resultados similares a los 
obtenidos en células individuales disecadas manualmente y que no habían sido 
incubadas con BAPTA-AM. 
3.7. Análisis del tipo de fibra en músculo esquelético 
Después de los registros de contracción, los músculos FDB se recogieron de la 
cámara de registro, se estiraron a una longitud aproximada a la U, se sumergieron en 
medio OCT (Tissue-Tek, Torrance, CA, USA), y se congelaron rápidamente en 2 -
metilbutano (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA) enfriado en hielo seco a -40 C. 
Los músculos se conservaron a -80 C hasta ser usados posteriormente. Las muestras 
congeladas se seccionaron en un criostato (Leica CM3000, Nussioch, Germany) a 21 
C. Las secciones (10 ¡am) se guardaron a 4 C hasta ser procesadas para 
inmunohistoquímica. Para la identificación de los tipos de fibras, las secciones 
musculares fueron expuestas a anticuerpos primarios NCL-MHCs (tipo I), NCL-MHCf 
(rápidas totales) (Novocastra, Newcastle upon Tyne, UK), A4.74 (type IIA) (Alexis 
Biochemicals, San Diego, CA, USA), o BF-F3 (tipo MB) (ATCC, Rockville, MD, USA) a 
una dilución de 1:20 en PBS. Como anticuerpo secundario se usó un conjugado de 
conejo anti-ratón fluoresceína isotiocianato (FITC) a una dilución de 1:100. El tipo IIX se 
obtuvo restando las fibras de tipo HA y MB al número total de fibras rápidas detectado 
con el anticuerpo NCL-MHCf (Novocastra). Como en FDB no se detectaron fibras de 
tipo MB, el músculo EDL fue usado como control positivo para el anticuerpo BF-F3. La 
fluorescencia de las secciones fue adquirida usando un microscopio invertido (Axiovert 
100, Zeiss) y un sistema de imagen con una cámara CCD PXL-EEV-37 (Photometries, 
Tucson, AZ, USA). El programa Isee de Inovision se utilizó en una estación de trabajo 
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Material y Métodos 
Silicon Graphics O2 para el procesado de las imágenes. 
3.8. Medida de la concentración de IGF-1 en músculo FDB 
Para medir la concentración de IGF-1 humano (hlGF-1) en los músculos FDB se 
utilizó el kit Active IGF-1 Elisa (DSL-10-5600, Diagnostic System Laboratories, Inc., 
Webster, TX, USA). Los músculos individuales de animales control y transgénicos se 
congelaron en nitrógeno líquido y se guardaron a -80 C para su uso posterior. Los 
músculos fueron descongelados en solución de ensayo (1 mg de músculo en 10 |JL de 
solución de ensayo), homogeneizados, sonicados y centrifugados durante 10 min a 
12000g. El sobrenadante y el estándar se añadieron en los pozos y se incubaron con el 
complejo anticuerpo-enzima durante 2 h. Después de lavar este complejo, se 
añadieron, secuencialmente, la solución de cromógeno tetrametilbenzidina (TMB) y la 
solución de parado. La absorbancia de cada pozo se determinó a 450 nm en un lector 
de microplaca AB Biosystem. Para la normalización, la concentración de proteína en 
los sobrenadantes se midió usando el ensayo de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, 
USA). El límite de detección de hlGF-1 fue 0.03 ng (g proteína)"\ 
3.9. Preparación de las fibras musculares para el registro de chispas de 
Caf: 
Los músculos EDL de ambas patas traseras fueron disecados de ratones 
jóvenes (3-6 meses de edad; n= 7) y viejos (21-24, n= 10) de cepa FVB, DBA y CB6F1. 
Los restos de vasos sanguíneos, nervios y el tejido conectivo que rodea al músculo 
fueron eliminados y los músculos se trataron con colagenasa 2 mg/ml y 10% suero 
bovino fetal durante 10-15 min en una solución que contenía (en mM): ácido aspártico 
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Material y Métodos 
155, aspartato de magnesio 5 mM y Hepes 10, pH 7.4 ajustado con CsOH (Beam y 
Franzini-Armstrong, 1997). Los músculos fueros transferidos después a una solución 
relajante que contenía (in mM): ácido glutámico 140, Hepes 10, glucosa 5, EGTA 1, 
MgCb 10, CaCl2 0.3, pH 7 (ajustado con KOH) y segmentos de células individuales 
fueron disecados cuidadosamente y fijados en una posición ligeramente estirada (a 
longitud de sarcomere de 2.5-3 )j,m) al fondo de una cámara de Lucite de 200 ML- Las 
fibras se permeabilizaron con saponina 0.01% durante 2 min en la solución relajante. 
Las células se incubaron después con fluo-4 en una solución interna que contenía (en 
mM): glutamato de sodio, 140; Hepes, 10; glucosa, 5; EGTA, 0.5; NaaATP, 5; 
fosfocreatina-Na2, 5; MgCb, 5.5, CaCb, 0.9 y fluo-4 0.08 (Molecular Probes, Eugene, 
OR, USA), pH: 7 (Kirsch y cois., 2001). Los productos químicos utilizados se diluyeron 
en solución interna el día del experimento a partir de las siguientes soluciones 
concentradas: rianodina, 10 mM (Calbiochem, La Jolla, CA, USA), Imperatoxina-A, 10 
Î M (Alomone Labs, Jerusalem, Israel) diluidas en agua destilada. La solución 
concentrada de cafeína (100 mM) (Sigma, ST. Louis, MO, USA) se preparó en solución 
interna el día del experimento. Las soluciones de Carbonyl cyanide p-
(Trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) (Sigma, ST. Louis, MO, USA) (39 mM) y 
ologomicina (Sigma, St. Louis, MO, USA) (10 mM) se prepararon en etanol 95 y 100 %, 
respectivamente. 
2+ 3.10. Imágenes de fluorescencia de las chispas Ca 
La cámara experimental se montó en la base de un microscopio invertido 
Axiovert 100 (Zeiss, Oberkochen, Alemania) equipado con un sistema de láser confocal 
(Radiance 2100 K1, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA). Las fibras se 
observaron a través de un objetivo C-Apochromat de inmersión en agua de 40X y 
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Material y Métodos 
apertura 1.2 (Zeiss) usando un láser de Criptón-Argón de longitud de onda 488 nm. La 
fluorescencia emitida se midió a 528 ± 25 nm. Para la mayoría de los experimentos la 
intensidad del láser se mantuvo entre el 6-12% con un filtro de densidad neutra. Se 
tomaron dos tipos de imágenes: de cuadro completo xy y de escan de línea xt. Las 
imágenes xy tuvieron una dimensión 512x512 píxeles, siendo el tamaño del pixel de 
0;134 \xm, en ambas direcciones, xe y, donde imágenes consecutivas se tomaron cada 
1.2 y 3.2 s. La fibra se orientó de forma paralela al eje x de escaneo. Se registraron 
series de 50 imágenes en 3-5 sitios diferentes en cada fibra. Las imágenes de escan de 
línea se adquirieron de 512 píxeles (0.134 pm/pixel) en la dirección x y 1000 píxeles (2 
ms/línea) en la dirección t. Se escaneó la totalidad del diámetro de la célula a intervalos 
de 20 píxeles. Para la adquisición de imágenes se utilizó el programa Radiance 
LaserSharp 2000 sofware (Bio-RAD). 
3.11. Análisis de las imágenes de chispas de Câ ^ 
La detección de los eventos espontáneos de la liberación de Câ "̂ (EELC) se 
llevó a cabo de dos formas: visualmente por dos investigadores y automáticamente 
usando una versión modificada del programa descrito por Cheng y cois, (1999). Este 
programa utiliza IDL 5.6 (Interactive Data Language, Research Systems Inc., Boulder,CO., USA). El Dr. Sandor Gyorke (Dpt. de Fisiología, Texas, Tech University Health 
and Sciences Center) cedió generosamente una versión modificada del programa. El 
número de eventos por imagen se utilizó para el cálculo de los parámetros estadísticos 
de la frecuencia de eventos en las series xyt (Kirsch y cois., 2001). La fluorescencia de 
base (Fo) se determinó calculando la fluorescencia media de la imagen sin procesar 
excluyendo posibles eventos (áreas de píxeles continuos que exhibieron una 
fluorescencia > 1.5 veces la desviación estándar (DE) por encima de la fluorescencia 
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Material y Métodos 
media de la fibra). La normalización de regiones de la imagen que contenían EELC se 
llevó a cabo calculando el cociente F{x,y) o F{x,t) entre Fo(x) (Kirsch y cois., 2001). Las 
regiones de posibles eventos locales de Ca "̂" se identificaron en las imágenes AF/Fo 
como regiones continuas de píxeles con intensidad de fluorescencia > 2 DE por encima 
de la fluorescencia media (Chun y cois., 2003). Las imágenes de fluorescencia 
normalizadas fueron filtradas con un filtro kernel de 3 píxeles de tamaño. De las 
imágenes de fluorescencia normalizadas y filtradas que contenían EELC se 
determinaron cuatro parámetros: i) la amplitud (AF/Fo): fluorescencia máxima 
normalizada en el área de la imagen que contiene el evento. Sólo se seleccionaron 
eventos con F/Fo > 0.2 ; ii) duración a la mitad del máximo (DMM): el tiempo 
correspondiente al número de píxeles cuya amplitud es mayor que la amplitud media 
(la mitad de la amplitud máxima); iii) tiempo de ascenso: el tiempo entre el 10% y el 
pico de amplitud; y iv) ancho a la mitad del máximo (AMM): la longitud correspondiente 
al número de píxeles cuya amplitud es mayor que la amplitud media (ver Fig. 7; Kirsch 
y cois., 2001). 
AF/F=0.5 
F/F. 
DMM 
Tiempo (ins) 
Figura 7. Medida de los parámetros morfológicos de los EELC. MM corresponde a la mitad del 
máximo (Adaptada de Ward y Schneider, 2002) 
35 
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Material y Métodos 
3.12. Composición de cadena pesada de miosina (CPM) 
La composición de CPM de las fibras se determinó mediante gel de 
electroforesis de poliacrilamida (SDS-PAGE), como se ha descrito previamente (Giulian 
y cois., 1983; Messi y Delbono, 2003) con algunas modificaciones. En breve, las fibras 
únicas musculares se disolvieron en 40 n\ de una solución que contenía: TRIS, 62.5 
mM, 1% de azul de bromofenol, 15% de glicerol, 5% betamercaptoetanol e inhibidor de 
proteasas (1 tableta/10 mL Complete Mini: roche Diagnostic, Mannheim, Germany), 
después del experimento de registro de chispas de Câ "*̂ y se guardaron a -80 C. 
Todas las muestras se utilizaron para la electroforesis entre 1 y 4 semanas después de 
los registros de Ca "̂". El día del experimento, las muestras se sonicaron en hielo 
durante 2 min con un desmembranador sónico (Modelo 60, Fisher Scientific). 
Posteriormente, se incubaron durante 5 min a 95 C. Debido a la ausencia de 
standards comercialmente disponibles en el mercado, un grupo de músculos que 
contenía los cuatro tipos de MCP (I, Ha, lib y llx) o el diafragma de rata fueron utilizados 
como referencias estándar. La concentración de acrilamida fue de 4 % en el gel de 
apilamiento y de 6% en el gel de corrido. La matriz del gel incluyó glicerol al 30%. Para 
la detección de la MCP se utilizó el kit Silver stain plus (Bio-Rad). 
3.13. Preparación de las membranas e Inmunobiots del RvR 
Las fracciones de membrana se prepararon de 12 músculos EDL disecados de 3 
ratones jóvenes y 3 viejos. Para cada experimento se agruparon las membranas de dos 
músculos y se realizaron 3 Western blots con muestras de ratones jóvenes y viejos. Un 
grupo mixto de músculos de las extremidades traseras de rana Northern leopard se 
utilizó como referencia positiva para ambos, RyRa y RyR[3, que son los homólogos de 
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Material y Métodos 
RyR1 y RyR3 (Chun y cois., 2003). Los músculos EDL se homogeneizaron 
manualmente en 150 |jl de solución de homogeneización enfriada en hielo (20 mM 
Hepes, pH 7.4, 250 mM sucrosa, y un mezcla de inhibidor de proteasas, Roche) con 
pipetas de diferentes tamaños de punta. Las fracciones de membrana se extrajeron 
añadiendo 150 pl de solución de extracción (5 mM NaPOa, 75 mM NaCI, 1% Triton-X 
100, 1% deoxicolato, 0.1% SDS), que también contenía el inhibidor de proteasas, y se 
centrifugaron a 10000 g durante 15 min. Las proteínas en el sobrenadante se 
separaron en geles SDS-PAGE 4% para la separación del RyR (Zheng y cois., 2002a; 
Chun y cois., 2003) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno -
PVDF (Hybond-P, Amersham Biosciences) en la solución de transferencia (12 mM 
TRIS-base, 92 mM glicina, 0.02 % SDS y 20% metanol) a 25 V durante la noche a 4°C. 
En cada línea se cargó la misma cantidad de proteína (40pg). Analizamos la expresión 
de la ATPasa de calcio del retículo endoplásmico de fibras rápidas (SERCA-1), cuya 
expresión no cambia con el envejecimiento, como control interno para el cargado del 
gel (Ferrington y cois., 1997). Las membranas PVDF se bloquearon durante 3 h en una 
solución de bloqueo que contenía: 5% de leche desnatada (Carnation) en 150 mM 
NaCI, 10 mM Tris.HCI, pH 7.4, 0.1% Tween 20 (Tris buffer sodium Tween, TBST) a 
temperatura ambiente. Las membranas se Incubaron después con el anticuerpo 
monoclonal de RyR (Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa) 
diluido a 1:5000 en solución de bloqueo a temperatura ambiente durante 1h, y se 
lavaron posteriormente 3 veces en TBST sin Tween-20. Después se incubaron durante 
1h con el anticuerpo secundario anti-ratón conjugado con peroxidasa, diluido a 1:10000 
en leche en polvo 5% TBST (Amersham Biosciences). Posteriormente, las membranas 
se lavaron tres veces durante 5 min cada vez en TBS, 0.05% Tween 20 y una vez en 
TBS. Finalmente, las membranas se incubaron en el reactivo de quimioluminiscencia 
(ECL) (Pierce, Rockford, IL) y se visualizaron en película de rayos X. 
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Material y Métodos 
3.14. Análisis estadístico 
Todos los valores han sido expresados como la media ± el error estándar de la 
media (ESM) o la desviación estándar (DS) con el número de observaciones (n). 
El análisis estadístico para los experimentos de fibra única de EDL , soleo y FDB 
se ha desarrollado con el test del análisis de la varianza (ANOVA) seguido de los tests 
de BONFERRONI o DUNN o Student-Newman-Keuls dependiendo de la distribución de 
los datos. Se aceptó como límite de significación un valor de p<0.05. 
Para comparar los resultados de los experimentos de fatiga se utilizó el análisis 
de la varianza (ANOVA) seguido de los test de Bonferroni o DUNN, y las pruebas CHI-
cuadrado y Fisher, de acuerdo con la distribución de los datos. 
Los experimentos de las chispas de Câ "̂ se compararon utilizando los test 
paramétricos Student t-test, paired t-test y el test de Mann Whitney Rank sum. 
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