T26 QB - Regulación de la expresión génica

Vista previa del material en texto

@rose.studygram_
Teórico 26
Regulación de la expresión génica
Dado el elevado costo de la síntesis proteica, la regulación de la expresión génica es esencial para conseguir una utilización óptima de la energía disponible. La cc celular de una proteína viene determinada por un delicado equilibrio entre 7 procesos, de los cuales c/u tiene varios puntos potenciales de regulación:
1) Síntesis del ARN primario (transcripción)
2) Modificación postranscripcional del ARNm
3) Degradación del ARNm
4) Síntesis proteica (traducción)
5) Modificación postraduccionales de proteínas
6) Destino y transporte proteico
7) Degradación proteica
CADA PROCESO TIENE SUS PUNTOS DE REGULACIÓN!!!
Estos procesos se resumen en la imagen de abajo, cabe destacar que a diferencia de las células eucariotas, las procariotas no presentan modificaciones postranscripcionales del ARN. 
Algunas definiciones:
→ Regulación de la expresión génica = involucra cada proceso, desde el gen a la proteína
→ Regulación génica = abarca la activación o inactivación de un gen
Principios de la regulación génica
Los genes de los productos se requieren en todo momento, expresándose en un nivel más o menos cte en prácticamente todas las células de una especie u organismo. Tales genes se denominan genes constitutivos, la expresión cte de ESE gen se denomina expresión génica constitutiva. 
· Expresión génica regulada →lleva al aumento o disminución de productos génicos en rta. a señales moleculares. 
· Productos inducibles → productos génicos que aumentan de cc bajo circunstancias moleculares particulares. El proceso por el cual aumentan su expresión se denomina inducción. Ej: enzimas de reparación del ADN inducida por un sist. de proteínas reguladoras que responde a altos niveles de lesiones en el ADN. 
· Productos reprimibles → aquellos que disminuyen su cc en rta. a una señal molecular. El proceso por el cual disminuyen su expresión se denomina represión. Ej: bacterias, la abundancia del Trp provoca la represión de genes de enzimas que catalizan la biosíntesis de Trp. 
Proteínas reguladoras
Las proteínas reguladoras se unen generalmente a secuencias específicas del ADN. Sus afinidades por secuencias diana son aprox. 104 a 106 veces mayores que sus afinidades por cualquier otra secuencia del ADN. 
Para unirse específicamente a las secuencias reguladoras, las proteínas tienen que reconocer características de superficie del ADN. La mayoría son grupos químicos que distinguen las cuatro bases y permiten la discriminacion entre pb son grupos dadores o aceptores de enlaces de hidrógeno que se encuentran expuestos en el SURCO MAYOR del ADN, y la mayoría de los contactos proteína-ADN presentan enlaces hidrógeno que les confieren especificidad. 
Los contactos también son posibles en el SURCO MENOR del ADN, pero en este caso los patrones de enlace hidrógeno no permiten generalmente una fácil discriminacion entre pb. 
· En la figura a se muestran los grupos funcionales de 4 pb expuestos en los surcos mayor y menor del ADN, los átomos aceptores y dadores de PdeH están indicados por discos azules y rojos, respectivamente. Otros átomos de H se indican con discos violeta y los grupo metilo en color amarillo.
· En la figura b se obtienen los patrones de reconocimiento para ca pb, de izq a der, están indicados en la parte inferior. Hay mayor discriminacion en el surco mayor que el menor como se puede observar. 
¿Qué AA de las proteínas reguladoras forman enlaces hidrógeno? 
· Asparagina (Asn)
· Glutamina (Gln)
· Glutamato (Glu)
· Lisina (Lys)
· Arginina (Arg)
Los enlaces hidrógeno que se pueden formar entre Glu o Asn en las posiciones N-6 o N-7 de la A no se forman con ninguna otra base, mientras que un residuo de Arg puede formar 2 enlaces hidrógeno con el N-7 y el O-6 de la G. No obstante, que una proteína pueda reconocer cada pb de más de una manera lleva a la conclusión de que NO EXISTE UN CÓDIGO DE RECONOCIMIENTO de una AA por una pb. 
Motivos de unión al ADN
Se han descrito varios motivos de unión al ADN pero existen 2 que juegan un papel central en la unión al ADN de las proteínas reguladoras:
· hélice-giro-hélice
· dedo de zinc
· homeodominio
Hélice-giro-hélice = crucial para la interacción de muchas proteínas reguladoras bacterianas con el ADN; también se encontraron motivos similares en algunas proteínas reguladoras eucariotas. 
¿Estructura? 20 AA en 2 cortos segmentos ⍺-helicoidales, c/u con siete a nueve residuos de AA, separados por un giro ß. Generalmente la estructura no es estable sola, depende de la estabilidad del resto de la proteína.
Uno de los segmentos helicoidales se denomina hélice de reconocimiento ya que tiene mucho AA que interaccionan con el ADN en el surco mayor; la hélice ß se apila sobre estos segmentos de la estructura proteica de manera que sobresale de la superficie de la proteína. Ej: represor Lac. 
Dedo de zinc = el zinc no interacciona por sí mismo con el ADN; más bien, la coordinación del zinc con los residuos de AA estabiliza el motivo estructural. Varias cadenas laterales hidrofóbicas en el núcleo de la estructura contribuyen a la estabilidad. 
¿Estructura? 30 residuos de AA forman un lazo alargado sujeto por su base ion Zn2+, coordinado con 4 residuos (4 Cys o 2 Cys + 2 His). 
Muchas proteínas de unión en eucariotas poseen dedos de zinc. La interacción de un único dedo de zinc con ADN es débil, y muchas proteínas que se unen al ADN, tienen múltiples dedos de zinc de manera que potencial la unión interaccionando simultáneamente con el ADN. La unión puede variar de secuencia específica a aleatoria. 
Los dedos de zinc también funcionan como motivos de unión al ARN; ej: proteínas que se unen al ARNm eucariotas y actúan como represores de la traducción. 
Homeodominio = pertenece a algunas proteínas que actúan como reguladores de la transcripción, especialmente en el desarrollo de los eucariotas.
¿Estructura? 60 AA, fue descrito en genes homeóticos (genes que regulan el desarrollo de los patrones corporales), altamente conservado y se ha identificado en proteínas de una amplia variedad de organismos, humanos incluidos. 
El segmento de unión al ADN está relacionado con el motivo hélice-giro-hélice. La secuencia de ADN que codifica este dominio se llama caja homeo o homeo box. 
Motivo de interacción proteína-proteína
Las proteínas reguladoras contienen dominion para interacciones proteína-proteína; con la ARN pol, otras proteínas reguladoras y otras subunidades de la misma proteína reguladora. Algunos dominios estructurales están implicados en la interacción necesaria para la formación de dímeros que, generalmente, es un requisito previo a la unión al ADN. Estos motivos estructurales intervienen en la interacción son dentro de los más importantes:
· cremallera de leucina
· hélice-lazo-hélice básica
Cremallera de leucina : consiste en una hélice ⍺ anfipática con una serie de residuos hidrofóbicos cc en un lado, con la superficie hidrofóbica formando el área de contacto entre los 2 polipéptidos del dímero. En la séptima posición de las hélices siempre existe un residuo Leu, formando una línea recta a lo largo de la superficie hidrofóbica. 
Las proteínas con cremallera de leucina suelen tener un dominio de unión al ADN separado con una elevada cc de residuos básicos como Lys o Arg, que pueden interaccionar con los fosfatos de carga negativa del esqueleto del ADN. En la imagen los primeros aa representan la porción alfa hélice, y luego una hélice anfipática hidrofóbica de un lado e hidrofílica de otro. 
Hélice-lazo-hélice básica = se da en algunas proteínas eucariotas implicada en el control de la expresión génica durante el desarrollo de organismos multicelulares.
¿Estructura? comparten una región conservada de 50 AA importantes tanto en la unión al ADN como en la dimerización de proteínas. Esta región puede formar 2 hélice ⍺ anfipáticas cortas unidas por un lazo de longitud variables (de allí su nombre, y es diferente al motivo hélice-giro-hélice).
Estos motivos de 2 polipéptidos interaccionan para formar dímeros. 
En la uniónal ADN interviene una corta secuencia de AA adyacentes con abundantes residuos básicos, similar a la cremallera de leucina. Esquema hélice-lazo-hélice:
· segmento de unión al DNA (en rosa) se une con la primera hélice (en rojo)
· el carboxilo terminal de la segunda hélice (en púrpura) se une con el extremo carboxilo-terminal de la segunda subunidad (en gris).
Transcripción 
Facilitada y regulada por la interacción proteína-ADN, especialmente componentes proteicos de la ARN polimerasa. 
ARN polimerasa se une a ADN en promotores → inicia la transcripción en los promotores, como se ve en la imagen de la derecha. La regulación de transcripción puede incluir cambios en el modo en que la ARN polimerasa interacciona con un promotor. 
¿Quién controla la velocidad de la transcripción? Las secuencias de nucleótidos varían considerablemente, los cual influye en la afinidad de unión al ADN y, por lo tanto, en la frecuencia de inicio de la transcripción; en ausencia de proteínas reguladoras, las diferencias en las secuencias del promotor pueden afectar la frecuencia de inicio de la transcripción.
· Genes constitutivos → varían ampliamente e influyen en la interacción ARN pol-promotor, con lo cual influyen en la tasa de inicio de la transcripción; diferencia en la secuencia del promotor permite que la célula sintetice un nivel apropiado de producto. 
· Genes no constitutivos/regulados → el inicio de la transcripción en los promotores de estos genes también se regula por la secuencia del promotor, pero, además, la expresión se halla modulada por las proteínas reguladoras que se unen al promotor o cerca de éste. 
Muchas proteínas actúan potenciando o interfiriendo con la interacción entre la ARN pol y el promotor. 
Proteínas que se unen a promotores o cerca de ellos
Encontramos al menos 3 tipos que regulan el inicio de la transcripción:
1) Factores de especificidad
2) Activadores
3) Represores
(1) FACTORES DE ESPECIFICIDAD
Alteran la especificidad de la RNA polimerasa por un promotor o set de promotores. Podemos mencionar:
→ La subunidad δ del holoenzima de la ARN pol en E.coli, este interviene en el reconocimiento y la unión al promotor. Una única subunidad δ70 reconoce la mayoría de los promotores de E.coli; en ciertas condiciones, esta subunidad es reemplazada por otro factor de especificidad, ej: en un shock térmico δ70 → δ32, la ARN pol es redirigida a otros promotores. 
Este factor posiciona a la ARN pol en un promotor objetivo y facilita el enrollamiento del ADN cerca del sitio de inicio de la transcripción. 
(2) ACTIVADORES
Potencial la interacción RNA polimerasa-promotor por su unión al ADN; esta regulación se denomina regulación positiva. 
En las bacterias, los sitios de unión de los activadores se encuentran a menudo adyacentes a promotores a los que la RNA pol o bien no se une por sí sola o la hace débilmente, de manera que en ausencia del activador la transcripción es escasa. 
· Algunos activadores están normalmente unidos al ADN potenciando la transcripción hasta que la unión de una molécula señal provoca la disociación (caso de la izq).
· En otros casos, el activador se une al ADN sólo después de la interacción con una molécula señal (caso de la der). 
Entonces decimos que la molécula señal puede aumentar o disminuir la transcripción según cómo afecte al activador. 
La regulación positiva por activadores es muy común en eucariotas. Muchos activadores se unen a sitios del ADN denominados potenciadores/secuencias enhancer, que se encuentran LEJOS del promotor, afectan la tasa de transcripción de un promotor que puede estar localizada a miles de pb de distancia. 
(3) REPRESORES
Los represores se unen a sitios específicos del ADN. En las células bacterianas estos sitios se denominan operadores, se encuentran generalmente cerca de un promotor. La unión de la ARN pol, o su movimiento a lo largo del ADN después de la unión, se bloquea cuando el represor se encuentra presente.
Esta regulación se denomina regulación negativa; la unión del represor al ADN se regula por una señal molecular (o efector), que se une al represor y provoca un cambio conformacional. La interacción entre el represor y la molécula señal puede tanto aumentar como disminuir la transcripción. 
· El cambio conformacional puede provocar la disociación del represor unido al ADN del operador, entonces se da el inicio de la transcripción (caso de la izq).
· El cambio conformacional puede causar que el represor se una al operador (caso de la der).
Regulación de la expresión génica en bacterias
Las bacterias tienen un mecanismo sencillo para coordinar la regulación de los genes que codifican productos implicados en una serie de procesos relacionados: los genes se agrupan en el cromosoma y se transcriben juntos. 
El grupo de genes que comparten promotor y secuencias reguladoras adicionales, que funcionan conjuntamente en la regulación, se denomina operón. Es habitual que los operones incluyan de 2 a 6 genes transitorios como una unidad; algunos contienen 20 o más genes. La identidad y el orden de los genes en un operón no son aleatorios.
En muchas ocasiones el mismo operón codifica subunidades de un complejo proteico más grande, es decir, se obtiene un ARNm policistrónico, y la co-transducción permite directamente el ensamblaje del complejo. 
Operón lac
Este operón presentes en las bacterias E.coli que utilizan lactosa como única fuente de C, regula 3 genes del metabolismo:
1. ß-galactosidasa (lac Z), hidroliza la lactosa. 
2. Galactósido permeasa (lac Y), transporta la lactosa. 
3. Tiogalactósido transacetilasa (lac A), este parece ser que modifica los galactósidos tóxicos para facilitar su eliminación de la célula. 
Cada uno de los genes es precedido por un sitio de unión a ribosomas, que dirige independientemente la traducción de cada gen. La regulación del operón lac sigue el modelo de regulación negativa (explicado en el apartado anterior). 
Estructura del operón lac = 
· Promotor P del operón lac
· Promotor Pi propio del gen lac I
· Gen lacI codifica un represor: represor Lac.
· Tres sitios operadores (O1–O3), donde O1 es el operador principal, y los otros son sitios secundarios del operador con menor afinidad por el represor Lac. 
· lacZ : ß-galactosidasa
· lacY: galactosido permeasa
· lacA: tiogalactósido transacetilasa
Operón Lac sujeto a regulación negativa 
El estudio de mutantes del operón lac reveló detalles sobre el funcionamiento del sistema de regulación del operón. 
→ EN AUSENCIA DE LACTOSA, los genes del operón lac están reprimidos; mutaciones en el operón o en otro gen, el gen I, provocan la síntesis constitutiva de los productos génicos.
→ MUTACIÓN DEL GEN I, este puede restablecer su represión mediante la introducción de un gen I funcional dentro de la célula en otra molécula de ADN, lo que muestra que el gen I codifica una molécula difundible que provoca la represión génica. 
Se demostró que el represor Lac es un tetrámero de monómeros idénticos. El operador al que se une más fuertemente es a O1, contiguo al sitio de inicio de la transcripción. El gen I se transcribe a partir del propio promotor Pi, independiente del operón Lac. Para reprimir al operón, el represor Lac parece que se une tanto al operador principal como a uno de los dos sitios secundarios, con el ADN interpuesto formando un lazo; cualquiera de las 2 formas de unión bloquea el inicio de la transcripción. 
¿Cuál es su dominio de unión al DNA? Hélice-giro-hélice 
→ EN PRESENCIA DE LACTOSA, cuando suministramos lactosa, se induce el operón lac. Una molécula inductora se une al sitio específico del represor Lac, produciendo un cambio conformacional, que provoca la disociación del represor del operador. El inductor no es la lactosa sino la alolactosa, un isómero de la lactosa (mirar estructura). Una vez en el interior de E.coli, la lactosa se convierte en alolactosa por una ß-galactosidasa y la liberación del represor Lac permite que los genes del operón lac se expresen y den lugar a un incremento de 103 veces en la cc de ß-galactosidasa. 
Varios ß-galactósidosse relacionan estructuralmente con la alolactosa y son inductores del operón lac, pero no son sustrato de la ß-galactosidasa; otros sí son sustrato, pero no inductores. Como ejemplo de inductor efectivo del operón lac podemos mencionar el isopropil tiogalactósido (IPTG) → este no se puede metabolizar/degradar, lo que nos permite estudiar la función fisiológica de la lactosa como fuente de C para el crecimiento, independientemente de su función a nivel de la regulación de la expresión génica.
Operón Lac sujeto a regulación positiva
El ambiente de una bacteria es demasiado complejo como para que sus genes sean controlados por una sola señal. Otros factores, además de la lactosa, afectan los genes lac, ej: disponibilidad de glucosa. En este caso hablamos de un REGULÓN: una red de operones coordinada por un regulador común. 
→ EN PRESENCIA DE LACTOSA Y ALTA CC DE GLUCOSA, se presenta otro mecanismo de regulación denomina represión por catabolito, impide la expresión de los genes para el catabolismo de la lactosa, la arabinosa y otros azúcares en presencia de glucosa. El efecto de la glucosa se facilita por AMPc, como coactivador, y una proteína activadora llamada proteína receptora de cAMP (CRP o CAP). Con la presencia de glucosa, los bajos niveles de cAMP impiden la formación de CRP-cAMP para su unión al ADN. 
¿Cómo es su estructura? CAP es un homodímero con sitios de unión al ADN y cAMP. La unión está facilitada por hélice-giro-hélice del dominio de unión al ADN de la proteína. 
→ EN PRESENCIA DE LACTOSA Y BAJA CC DE GLUCOSA, la CRP-cAMP se une a un sitio cerca del promotor lac y estimula 50 veces la transcripción del ARN, por lo tanto, es un elemento de regulación positiva sensible a niveles de glucosa. CRP-cAMP sólo actúa cuando el represor Lac se ha disociado.
Operón del Triptófano 
Este operón se encuentra en E.coli, contiene 5 genes de las enzimas requeridas para convertir el corsimato → Trp, donde 2 de las enzimas catalizan más de un paso en la vía. 
El mRNA del operón Trp tiene una vida media de 3 min, lo que permite a la célula que responda rápidamente a las necesidades cambiantes de ese AA. 
El represor Trp es un homodímero:
→ EN ALTA CC DE Trp, este AA se une al represor provocando un cambio conformacional que permite que el represor se una al operador Trp. El sitio del operador se solapa con el promotor, por lo que la unión del represor bloquea la unión de la RNA polimerasa. 
Diferentes cc de Trp pueden variar la velocidad de síntesis de enzimas biosintéticas en un intervalo de 700 veces. 
Mecanismo de atenuación 
Cuando finaliza la represión, y se restablece la transcripción, la velocidad se ajusta mediante una segunda regulación llamada atenuación de la transcripción = la transcripción se inicia, pero es interrumpida bruscamente ANTES de que se transcriban los genes del operón. Es sensible DIRECTAMENTE A LA CC DE AA. 
Este mecanismo utiliza señales codificantes en 4 secuencias dentro de una región guia de 162 nucleótidos en el extremo 5´ del mRNA:
· Región atenuadora, en las secuencias 3 y 4. Estas se aparean para formar una horquilla atenuadora rica en G-C, seguida de residuos U; actúa como terminador de la transcripción. 
· Secuencia de complemento, ubicada en la secuencia 2. Si se aparea la secuencia 2 con 3 no se produce la estructura atenuadora = continuación de la transcripción con los genes biosintéticos trp.
· Secuencia reguladora, ubicada en la secuencia 1; es fundamental para determinar si la secuencia 3 se aparea con la secuencia 2 o con la 4. Por lo tanto, la formación de la horquilla atenuadora depende de cómo se de la traducción en la secuencia reguladora 1 que codifica un péptido guía de 14 AA, dos de los cuales son Trp.
→ EN ALTA CC DE Trp, las cc de tRNA cargado con Trp (Trp-ARNmTrp) son altas = traducción rápida, pasando por los 2 codones del Trp de la secuencia 1 hasta la 2 antes de que la secuencia 3 sea sintetizada por la ARN polimerasa, esto hace que la secuencia 2 quede cubierta por el ribosoma y no se aparee con la secuencia 3 cuando esta se sintetiza = formación de la estructura atenuadora y se interrumpe la transcripción. 
→ EN BAJA CC DE Trp, en este caso, el ribosoma se atasca en los 2 codones para el Trp de la secuencia 1 debido a la menor cantidad de Trp-ARNmTrp, entonces la secuencia 2 esta libre para aparearse con la secuencia 3, lo que permite que se produzca la transcripción.
Respuesta SOS: daño extenso en el ADN
 Una lesión extensa en el ADN del cromosoma bacteriano produce la inducción de muchos genes situados a gran distancia, muchos de estos están implicados en la reparación del ADN; por ello, esta rta se llama mecanismo SOS. Las proteínas de regulación clave son la proteína RecA y el represor LexA. 
· Represor LexA = inhibe la transcripción de los genes SOS y la inducción de la rta SOS requiere de su eliminación. Se une a cajas SOS. 
· Se inactiva cuando cataliza su propia rotura en un enlace peptídico Ala-Gly específico, en 2 fragmentos proteicos. A pH fisiológico la reacción requiere de la proteína RecA, esta función para facilitar el autocorte de Lex A se denomina actividad coproteasa. 
· Proteína RecA = proporciona una conexión funcional entre la señal biológica (lesión ADN) y la inducción de los genes SOS. Una grave lesión del ADN produce numerosas zonas de ADN monohebra, y solo RecA unida al ADN monohebra puede facilitar la rotura de LexA = inducción del mecanismo SOS. 
Síntesis de proteínas ribosomales 
Coordinada con la síntesis de ARNr
En las bacterias un incremento en la demanda celular de síntesis proteica se satisface mediante el incremento del número de ribosomas en lugar de alterar la actividad de los mismos. A tasas altas de crecimiento, los ribosomas constituyen apox. 45% del peso celular seco; la proporción de recursos dedicados hacia los ribosomas es tan grande, y la función de estos tan importante, que las células tienen que coordinar la síntesis de los componentes ribosómicos:
· proteínas (proteínas r)
· ARN (ARNr)
Estos mecanismos de regulación tienen lugar a nivel de la traducción. En la imagen de abajo, se muestra una retroalimentación traduccional en algunos operones de proteínas ribosomicas:
· Rojo: proteínas r que actúan como represores, uniéndose al sitio indicado en el ARNm.
· Púrpura: genes que codifican subunidades de ARN Pol
· Azul: genes que codifican factores de elongación. 
· L1-L34: genes de las proteínas r de la subunidad ribosómica grande (50S)
· S1-S21: genes de las proteínas r de la subunidad pequeña (30S).
Los operones de las proteínas r se regulan principalmente mediante un mecanismo de retroalimentación traduccional; una proteína r codificada por un operón también actúa de represor traduccional, uniéndose al mRNA transcrito de su propio operón, bloquea así la traducción de todos los genes codificados por el mensajero. En general, la proteína r que desempeña el papel de represor también se une directamente a un rRNA, ello asegura que la traducción que codifica proteínas r solo se reprima cuando la síntesis de estas proteínas r exceda lo necesario para producir ribosomas funcionales. De esta forma, se mantiene en equilibrio la síntesis de proteínas r con la disponibilidad de rRNA. 
El sitio de unión del mRNA para el represor se ubica cerca del sitio de inicio de la traducción de uno de los genes del operón, generalmente en el primer gen. Como en estos mRNA para proteínas r la traducción de un gen depende de todos los demás, cuando ese gen se ve afectado no se lleva a cabo la traducción de los demás genes. 
En algunos casos la traducción de múltiples genes parece que se bloquea mediante el plegamiento del mRNA en una estructura tridimensional compleja que se estabiliza tanto por apareamiento interno como por la unión de la proteína represora de la traducción. Cuando el represor se encuentra ausente, la unión del ribosoma y la traducción de uno o más genes elimina la estructura plegada del mRNA, lo que permite la traducción de genes. 
Disponibilidad de aminoácidos
En E.coli la síntesis de rRNA a partirde los 7 operones de rRNA responde a la tasa de crecimiento celular y a los cambios de disponibilidad de nutrientes cruciales, especialmente aminoácidos. Este tipo de regulación se denomina respuesta severa. 
→ CC BAJAS DE AA, hay un cese en la síntesis de rRNA. La deficiencia de estos provoca la unión de tRNA descargados al sitio A de los ribosomas; ello desencadena una secuencia de acontecimientos que comienza con la unión de la enzima factor de respuesta severa (proteína RelA) al ribosoma → este cataliza la formación del nucleótido guanosina tetrafosfato (ppGpp) ¿cómo? Se produce la siguiente reacción:
GTP + ATP → pppGpp + AMP
 Luego, una fosfohidrolasa elimina un fosfato y pppGpp → ppGpp, un aumento brusco de estos produce una gran reducción de la síntesis de rRNA, debido a la unión del ppGpp a la RNA polimerasa. 
Algunos ARNs participan en la regulación génica
Una vez sintetizado el ARNm, sus funciones pueden ser controladas por proteínas de unión a ARN, ej: proteínas r, o por un ARN. Una molécula distintas de ARN puede unir al ARNm “en trans” y afectar su actividad. Alternativamente, una parte del mismo ARNm puede regular su propia función; cuando una parte de una molécula afecta la función de otra parte de ella misma se dice que actúa “en cis”. 
Regulación en trans 
Ejemplo: regulación del ARNm del gen rpoS, que codifica ẟ38, la célula utiliza este factor de especificidad en situaciones de estrés → como la entrada a la fase estacionaria, y ẟ38 es necesario para la transcripción de un gran número de genes de rta. a estrés. El ARNm de ẟ38 se presenta en la mayoría de las circunstancias en muy baja cc, pero no se traduce porque una estructura en horquilla impide su unión al ribosoma; en ciertas condiciones el estrés produce uno o dos RNA pequeños (ARNs) de función especial:
· DsrA (región A corriente abajo)
· RprA (RNA A regulador de Rpos)
Que se aparean con una de las hebras de la horquilla en el ARNm, desorganizandola y, en consecuencia, permitiendo la traducción de rpoS → REGULACIÓN EN TRANS. 
Otro ARNs es OxyS (gen S de stress oxidativo), este inhibe la traducción de rpoS posiblemente por aparearse con el sitio de unión a ribosomas del ARNm. 
Regulación en cis
Pone en juego una clase de estructuras del ARN llamada ribointerruptores/riboswitches → son segmentos dentro de un mRNA que unen metabolitos generando un cambio conformacional que afecta la expresión de la proteína codificada. A nivel de los ribointerruptores adquieren una conformación en el espacio denominados unos APTÁMEROS localizados en el 5´ UTR de ciertos ARNm bacterianos. La unión de un ARNm ribointerruptor al ligando apropiado causa un cambio conformacional que inhibe la transcripción mediante la estabilización de una estructura de terminación de transcripción prematura, o bien se inhibe la traducción por oclusión de unión al ribosoma.
¿Qué función cumplen los riboswitches? Permiten a los mARN participar en su propia regulación y responder a cambios de concentraciones del ligando. La mayor parte de los genes regulados implican la síntesis o el transporte del ligando que se une al ribointerruptor, entonces si el ligando tiene altas cc el ribointerruptor inhibe la expresión de genes que lo repongan. CADA RIBOSWITCH UNE UN SOLO LIGANDO.
Regulación por recombinación genética
La bacteria Salmonella typhimurium, que vive en los intestinos de mamíferos, se mueve haciendo girar los flagelos de su superficie celular. Las muchas copias de la proteína flagelina, que forman los flagelos, son diana de los sistemas inmunitarios de mamíferos. Pero las cél. Salmonella posee un mecanismo que elude la rta. inmune: alterna entre 2 proteínas flagelinas distintas (FljB y FliC), utilizando un proceso de variación de fase. 
Este cambio se produce por una inversión periódica de un segmento del ADN que contiene el promotor de un gen de flagelina, se da una reacción de recombinación específica de sitio donde actúa una recombinasa Hin sobre secuencias de 14 pb en cada uno de los segmentos del ADN. Cuando se haya en determinada orientación expresa FljB y un gen de represión para FljA que anula el gen FliC; cada cierto número de replicación se invierte y el gen fliC se induce a medida que desaparece el represor. 
Regulación de la expresión génica en eucariotas
	En bacterias, la ARN pol tiene acceso a todos los promotores y puede unirse e iniciar la transcripción con cierta eficiencia sin necesidad de activadores/represores
	
	En eucariotas, los promotores fuertes se encuentran inactivos in vivo en ausencia de proteínas reguladoras.
1. Acceso a promotores restringido por cromatina
2. Predominan mecanismos positivos de regulación antes que negativos
3. Mecanismos que involucran IncARNs son comunes en regulación transcripcional. 
4. Proteínas reguladoras complejas
5. Transcripción separada de la traducción 
Remodelación de la cromatina
En un cél. eucariota típica, alrededor del 10% de la cromatina se encuentra condensada en mayor proporción que el resto de la cromatina, a esto se le denomina heterocromatina, es transcripcionalmente inactiva. Se asocia generalmente a estructuras cromosómicas definidas, ej: centrómeros. La cromatina restante, menos condensada, se denomina eucromatina. 
La transcripción se encuentra reprimida cuando su ADN está condensada en heterocromatina, una parte de la eucromatina (no toda) es transcripcionalmente activa; estas últimas se distinguen de la heterocromatina por los cambios de la REMODELACIÓN DE LA CROMATINA, son:
1) Posicionamiento de los nucleosomas
2) Presencia de variantes de histonas
3) Modificación covalente de nucleosomas
Existen 4 filias. de complejos que remodelan la cromatina, van a desenrollar, translocar, eliminar o cambiar nucleosomas en el ADN, hidrolizando ATP en el proceso. En algunos casos, catalizan el intercambio de pares de histonas en los nucleosomas para alterar su composición.
Familia SWI/SNF → existen 2 complejos pertenecientes a esta familia, remodelan a la cromatina de manera que los nucleosomas se espacian más irregularmente. Además, estimulan la unión de factores de transcripción. 
Cada complejo incluye un bromodominio cerca del C-terminal de la subunidad ATPasa activa que interacción con las colas acetiladas de las histonas.
Familia ISWI → optimizan el espaciado de los nucleosomas para permitir el ensamblaje de la cromatina y el silenciamiento transcripcional.
Familia CHD → los diferentes miembros tiene funciones ya sea de expulsión de nucleosomas para activar la transcripción o ensamblar la cromatina reprimiendo la misma. 
Familia INO80 → tiene variedad de funciones para activar la transcripción y la reparación del ADN. Un miembro de esta es SWR1 : promueve el intercambio de subunidades en los nucleosomas para introducir variantes de histonas, regiones transcripcionalmente activas. 
Modificación covalente de histonas
Esto altera principalmente la cromatina transcripcionalmente activa; las histonas internas se modifican por 
· metilación de residuos Lys o Arg
· fosforilación de residuos Ser o Ther
· acetilación
· ubiquitinación
Algunas de las modificaciones son esenciales para la interacción con proteínas que juegan un papel clave en la transcripción. La acetilación y metilación son importantes para la activación de la cromatina en la transcripción. 
La cromatina transcripcionalmente activa presenta:
· Estructura más abierta
· Composición ↓ H1 y ↑ H3.3 y H2AZ
· Modificaciones covalente
· Desmetilación del C (ADN)
Acetilación 
Durante la transcripción la histona H3 es metilada en la Lys4 cerca del extremo 5´ de la región codificante, y en la Lys36 a lo largo de toda la región codificante. Esto permite la unión de histona acetiltransferasas (HAT), que acetilan residuos Lys específicos:
· Tipo B HATs
· acetilan histonas en el citosol y luego se transportan al núcleo
· Se ensamblan en el nucleosoma con la ayuda de otras proteínas
· Tipo A HATs,
· actúan en el núcleo activando nucleosoma para la transcripción
· reduciría la afinidad de histonas por el ADN y regula la interacción proteína–proteínaPara inactivar la transcripción se desacetila por acción de la histona desacetilasas (HDACs) o se metila Lys-9 e H3. 
Metilación
La metilación en la citosina apaga los genes, atrayendo proteínas que bloquean la expresión de genes, esta metilación puede ser transmitida a las cél. de la progenie por una enzima que copia el patrón a la cadena hija inmediatamente luego de la replicación sin alterar la secuencia nucleotídica → herencia epigenética. 
 La impronta genética no está completamente definida, pero en estos casos, la metilación regula la expresión de alelos maternos o paternos de ciertos genes al inicio del desarrollo. 
Fosforilación
Algunas hormonas no esteroideas usan diferentes mecanismos
· INSULINA se une a un receptor de superficie y a través de una serie de eventos de fosforilación, fosforila proteínas de unión al ADN que altera la interacción como un factor de transcripción. 
Se produce la activación de 2o mensajeros que conducen a la activación de factores de transcripción
· Ejemplo: vía ß-adrenérgica, el cAMP activa la protein kinase A (PKA), PKA entra al núcleo y fosforila “cAMP response element-binding protein” (CREB), un activador de la transcripción.
Regulación positiva de la transcripción
Como se dijo al inicio, la transcripción es dependiente de la acción de múltiples proteínas reguladoras. El empaquetamiento de la cromatina hace inaccesible a la mayoría de los promotores; por lo tanto, los genes normalmente permanecen silenciosos en ausencia de la regulación de otro tipo. La estructura de la cromatina afecta el acceso, la presencia de represores que se unen al ADN para imposibilitar el acceso de la ARN pol resulta redundante y por ello otros factores favorecen la utilización de la regulación positiva; dos de ellos se consideran los más importantes ¿por qué necesito de activadores?:
1) el gran tamaño del genoma eucariota. La unión no específica de proteínas reguladoras conlleva a un problema en los grandes genomas, ya que la posibilidad de que una determinada secuencia de unión específica se encuentre al azar en un sitio inapropiado también aumenta con el tamaño. SE LE DA IMPORTANCIA AL CONTROL COMBINATORIO. 
Hay posibilidad de mejorar la especificidad con diversas proteínas reguladoras positivas de unión a secuencias específicas en el ADN para activar un gen; el número promedio de sitios de regulación es de 6. 
2) la mayor eficiencia de la regulación positiva. Supongamos que en vez de generar conjunto de proteínas que regulan un gen positivamente, se produce una estrategia para generar una regulación negativa; si ~20.000 genes del genoma humano se regulan negativamente, cada célula debería sintetizar en todo momento el mismo número de represores diferentes en cc necesaria para que se unan específicamente a los genes “no deseados”. En cambio, si se regula positivamente, como la mayoría de genes se encuentran inaccesibles (están inactivos), las células tienen que sintetizar solamente proteínas activadoras necesarias para que se una la ARN polimerarasa y dar inicio a la transcripción del subconjunto de genes necesarios para esa célula. 
Existen ejemplos de regulación negativa en cél. eucariotas, desde levaduras hasta humanos. Incluyen IncRNAs. 
Activadores y coactivadores de unión al ADN
Analizamos la interacción entre los promotores y la RNA polimerasa (Pol II), que es la responsable de la síntesis de los mRNA eucariotas. Aunque la mayoría de los promotores incluye la caja TATA y secuencias Inr (iniciador), estos varían en número y localización de secuencias adicionales necesarias para la regulación de la transcripción. 
Las secuencias reguladoras adicionales, unidas por factores de transcripción se denominan:
· Potenciadores en eucariotas. Cuando está unido a las proteínas reguladoras, el potenciador aumenta la transcripción de los promotores cercanos, independientemente de su orientación en el ADN. 
· Secuencias activadoras corriente arriba (UAS) en levaduras. Funcionan similar a los potenciadores aunque deben estar situados corriente arriba y a no más de unos pocos centenares de pb del sitio de inicio de la transcripción. 
La unión eficaz de la holoenzima de la Pol II a uno de sus promotores requiere de la acción de 5 proteínas combinadas:
1) ACTIVADORES DE LA TRANSCRIPCIÓN → se unen a potenciadores y UAS
· Facilitan la transcripción de centenares de promotores o de unos pocos. 
· Pueden tener dominios de unión al ADN, a (múltiples) proteína/s o a molécula señal (estructura modular) : sensibles a la unión de moléculas señal, para activar o desactivar la transcripción.
· Control combinatorio: 6 o más enhancers son unidos por 6 o más activadores transcripcionales. 
Ej: la proteína NF-𝜿B activa la transcripción de varios genes de rta. inmune y producción de citocinas; puede unirse a enhancers del ADN o a un IncRNA. 
2) REGULADORES ARQUITECTÓNICOS → facilitan la formación de lazos en el ADN
· El bucle (loop) de ADN permite que enhancer distantes modulen el ensamblado en el promotor de manera directa. 
· Estas proteínas se unen al ADN con especificidad limitada
· Abundantes en la cromatina
Ej: proteínas HMG (High Mobility Group)
3) PROTEÍNAS DE MODIFICACIÓN Y REMODELACIÓN DE LA CROMATINA (explicadas previamente)
4) COACTIVADORES → necesarios para la comunicación entre activadores y el complejo formado por la Pol II y los factores de transcripción basales. Además, participan en la formación del complejo de pre-iniciación (PIC). Interactúa con proteínas, no con ADN. 
Un coactivador eucariota destacado es el MEDIADOR:
· 20 o más péptidos altamente conservados
· Se une al dominio carboxilo terminal (CTD) de la ARN Pol II
· Requerido para la transcripción basal y regulada
· Provee superficie para el ensamblaje de otros complejos
· Funciona en o cerca del TATA box
· 4 subunidades de un complejo adicional que interacción con el mediador y que pueden inhibir la transcripción
5) FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN BASAL 
Encontramos en estos el primer componente que se une en la formación de un PIC es la proteína de unión a TATA (TBP); en promotores sin secuencia TATA TBP es parte de un complejo mayor denominado TTFIID.
El complejo incluye factores TFIIB, TFIIE, TFIIF, TFIIH, Pol II y tal vez, TFIIA. Generalmente no es suficiente para iniciar la transcripción, y no suele formarse si el promotor está escondido en la cromatina; por lo que, la regulación positiva depende tanto de activadores como coactivadores donde el mediador interacción con TFIIH y TFIIE permitiendo el reclutamiento del PIC. 
Activación de la transcripción 
En la figura 28-30 se observa la secuencia de sucesos de la activación transcripcional en un promotor de Pol II, el orden exacto puede variar, pero el modelo enseña los principios de la activación como ruta común. La unión de activadores a menudo desencadena la activación del promotor, y puede permitir la unión de otros, que termina con el desplazamiento gradual de algunos nucleosomas. 
1) Los activadores se unen al ADN y reclutan complejos modificadores de histonas y de remodelación de cromatina, y un coactivador como el mediador. 
2) El mediador facilita la unión de TBP (o TFIID) y TFIIB
3) Seguido de la unión de los demás factores de transcripción y la Pol II
4) Las fosforilación del C-terminal de la Pol II produce el inicio de la transcripción (no se muestra en el esquema)
→ Los represores (y IncRNAs) interfieren en la comunicación entre la Pol II y los activadores. 
Activación transcripcional reversible → no es frecuente, pero algunas proteínas reguladoras eucariotas se unen a los promotores de la Pol II o con activadores transcripcionales actuando como represores, inhibiendo la formación de PIC activo. 
· Activadores pueden adoptar múltiples conformaciones donde actúan como activadores (+) o represores (-) transcripcionales. Ej: receptores de hormonas esteroides, funcionan como activadores cuando está presente una señal hormonal determinada; cuando la hormona está ausente, las proteínas receptoras revierten a una conformación de represores, impidiendo la formacióndel PIC. 
· En algunos casos…
· la represión involucra el restablecimiento de las histonas y la cromatina al estado inactivo
· el represor se une al mediador y bloquea la transcripción
Metabolismo de galactosa en levaduras
· Regulación + y -
Las enzimas necesarias para la importación y el metabolismo de la galactosa en levaduras están codificados en genes dispersos en varios cromosomas. Cada gen GAL se transcribe separadamente y las células de levadura no tienen operones como las bacterias. Sin embargo, todos los genes GAL tienen:
→ promotores similares. 
→ están regulados por un conjunto común de genes
PROMOTORES: consisten en una secuencia TATA y las secuencias Inr, asi como secuencias activadoras del lado 5´ (UASG). La regulación génica implica interacción entre Gal4p y otras 2 proteínas, Gal80p y Gal3p. 
· Gal4p + Gal80p forma un complejo que impide la función activadora de Gal4p sobre los promotores. 
· Cuando Gal3p se une al complejo Gal4p-Gal80p permite que funcione como un activador de diferentes promotores GAL. EN PRESENCIA DE GALACTOSA. 
Podemos encontrar otros complejos como:
· Complejo SAGA, acetilación de histonas. 
· Complejo SWI/SNF, remodelación de la cromatina. 
EN PRESENCIA DE GLUCOSA, genes GAL reprimidos, independientemente de la presencia de galactosa. 
Regulación por señales intercelulares e intracelulares
Hormonas esteroideas → interaccionan con receptores intracelulares que son activadores transcripcionales; aquellas hormonas muy hidrofóbicas viajan en sangre unidas a proteínas transportadoras y en el tejido diana atraviesan la MP por difusión simple. Una vez dentro, se une a uno de 2 tipos de receptores nucleares. En ambos casos, el complejo hormona-receptores actúa por unión al ADN como elementos de rta- hormonal (HRE), la interacción se da por dedos de zinc. Actúan como activadores: reclutan coactivadores y Pol II para iniciar la transcripción. 
· Tipo I monomérico (NR) en el citoplasma, formando un complejo con una proteína de shock térmico (Hsp70) - hormonas sexuales y glucocorticoides. Cuando se une la hormona, la Hsp70 se disocia de su represor y dimeriza exponiendo una señal de localización nuclear, migra al núcleo uniéndose a HRE y actúa como activador.
· Tipo II en el núcleo, unidos a un HRE del ADN y a un correpresor que lo mantiene inactivo - hormonas tiroideas. Cuando la hormona llega al núcleo se une al heterodímero de THR y RXR, causa un cambio conformacional para la disociación del correpresor y actúa como activador. 
Las secuencias de unión al ADN a las cuales se unen son similares en longitud y estructura, pero con diferente secuencia. Cada receptor presenta una secuencia consenso a la cual se une correctamente, esta presenta 2 secuencias de 6 nucleótidos, contiguos o separados por 3 nucleótidos, en tándem o en palindromo. 
Regulación de la traducción
Algunos mARNs eucariotas sufren represión traduccional. Cuatro mecanismos principales
1) Fosforilación de los factores de iniciación, actúa como un mecanismo general de la traducción. Las formas fosforiladas son a menudo menos activas y provocan la depresión general de la traducción. 
2) Represores traduccionales, proteínas que se unen al 3´ UTR. Una vez unidas, interacciona con factores de inicio de la traducción unidos al mRNA o con la subunidad ribosómica 40S impidiendo el inicio de la traducción. 
3) Disrupción de la interacción eIF4E y eIF4G por proteínas de unión. Cuando el crecimiento es lento, estas proteínas limitan la traducción uniéndose al sitio de eIF4E que normalmente interacciona con eIF4G. 
4) Regulación mediada por RNA (gene silencing). 
Otras formas de expresión génica en eucariotas
ARN no codificantes (non-coding RNA, ncRNA)
· miRNA controlan la traducción
· snRNA involucrados en el splicing
· snoRNA modificaciones en ARNr
· rRNA, rRNA
Se pueden agrupar según largo, localización o función. La más común es según el largo que puede ser pequeños ARN o largos ARN, la diferencia se da por <200 pb son pequeños y >200 pb son largos aunque es arbitrario.
¿A qué nivel intervienen los LncARN?
¿Y los miARN?
Silenciamiento post-transcripcional de genes
Existe una síntesis de ARN no codificante; pri-miRNA y luego hay una endonucleasa (Drosha y Diecer) que cliva a este para tener hélices separadas y pasa a llamarse pre-miRNA, este se une a una exportina y por uso de GTP sale del núcleo. Obtengo el pre-miRNA en el citoplasma donde es atacado por otra endonucleasa que lo cliva y transforma en miRNA, se libera una de las cadenas de miRNA hibridizado, y comienza a reclutar a proteínas como argonautas, se elimina la hebra de ARN complementaria formando el complejo de silenciamiento inducido por ARN, entonces sensan los ARNm; si encuentran un sitio donde pueda hibridar con el ARNm reclutan a este complejo denominado complejo RISC:
· Si hibridiza perfectamente el miARN con el ARNm = degradación TOTAL del ARNm
· Hibridación parcial = degradación PARCIAL del ARNm y no se puede traducir. 
Existen muchos mecanismos por los cuales se puede regular el ARNm de una cél. a otra.
Este sistema permite hacer un método de interferencia que funciona de igual manera, pero el siRNA no es sintetizado por la cél. sino que se aporta de forma exógena un ARN doble cadena. Se aprovecha el mecanismo del complejo RISC para silenciar artificialmente genes.
En el esquema de abajo se muestran ambos procesos de silenciamiento de ARNm, del lado derecho encontramos la formación del miRNA que luego interacciona con las proteínas argonautas; del lado izquierdo vemos como el siRNA el cliva por Diecer e interacciona con las proteínas argonautas.
IncRNA
Estos son los ARN circulares que como no codificantes, muchos de ellos provienen de intrones donde cuando se elimina un intrón el acercamiento de 2 exones genera un loop. Este IncRNA podría llegar a ser un mecanismo para controlar el silenciamiento, porque podría pegar los miRNA con proteínas argonautas para quitarlas del medio e inhibir el silenciamiento.