T13 QB - Fosforilación Oxidativa

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teórico 13
Fosforilación Oxidativa
Proceso mediante el cual se genera ATP como resultado de la transferencia de electrones desde el NADH o FADH2 al O2 a través de una serie de transportadores de electrones. Este proceso ocurre en la MITOCONDRIA que se caracteriza por tener 2 sistemas de membrana, donde entre medio de ambas se define un espacio intermembrana y dentro de la membrana interna se encuentra la matriz mitocondrial; en la membrana externa vemos que es semi impermeable a ciertos metabolitos que pasan a través de porinas, mientras que la interna es prácticamente impermeable a cualquier compuesto. Sin embargo, existen diferentes transportadores que regulan lo que pasa a la mitocondria y que no; en la matriz mitocondrial, están las enzimas del ciclo de Krebs, mientras que en la membrana mitocondrial interna (las crestas de la imagen) es donde se encuentran los complejos para el transporte de e-. 
Este proceso empieza con la entrada de e- en la cadena respiratoria, donde diferentes rutas catabólicas catalizan la entrada de e- a través de aceptores universales de e- :
· NADH : aceptor hidrosoluble que se asocia a diferentes hidrogenasas.
· flavoproteínas (FADH2 y FMNH2) : el potencial de oxido reducción depende de la interacción de la proteína con la flavina mononucleótido o con la flavina adenina dinucleótido. 
Esos e- son llevados al complejo de transferencia de e- de la membrana interna, se produce la reducción del O2 y eso se asocia a la transferencia de un gradiente de e- que va a ser el que luego fomenta la síntesis de ATP. 
Los e- son los que producen la reducción del O2, en este proceso que implica la transferencia de e- al O2 hay una diferencia del potencial de reducción muy grande traduciéndose en una diferencia de energía libre (ΔG) muy grande. El valor de la imagen está calculado considerando los potenciales estándar. El cambio de energía libre de Gibbs es >1 de lo que se presenta calculado. 
La energía libre que se libera durante la reacción es aprovechada por la mitocondria para generar otra forma de energía que se conserva en la molécula de ATP.
· La reacción transfiere energía en la creación de un gradiente de H+ (podemos asociar la ecuación de la imagen). Tiene un término que relaciona las cc de protones a ambos lados de la membrana y otro que hace referencia a la diferencia de carga a ambos lados de la membrana.
· Hay una nueva transformación de energía donde por el pasaje de protones, la energía libre se conserva para la síntesis de ATP. La célula transforma una forma de energía en otra para aprovecharla. 
Podemos decir entonces que la fosforilación oxidativa tiene 3 componentes definitorios:
1) Los e- fluyen desde los dadores electrónicos a través de una cadena transportadora ligados a la membrana hasta un aceptor electrónico final con un gran potencial de reducción (O2)
2) La energía libre puesta a disposición por este flujo de e- “cuesta abajo” (reacción exergónica) está acoplada al transporte “cuesta arriba” de protones a través de una membrana impermeable a los H+, conservandose energía libre de oxidación en forma de potencial electroquímico transmembrana. 
3) El flujo transmembrana de H+ a favor de su gradiente de cc mediante canales proteicos proporciona la energía libre para la síntesis de ATP, catalizada por un complejo proteico → ATP sintasa que acopla el flujo de H+ a la fosforilación del ADP. 
Transportadores de electrones 
Para que se de la transferencia de e- se requiere de transportadores de e-, hay diferentes tipos:
· transferencia directa de e-
· transferencia de un ion hidruro (H-) portador de 2e-
· transferencia de un átomo de H (H+ + e-)
Ubiquinona 
Tiene una estructura con cadena isoprenoide, es hidrofóbica y puede alojarse en la bicapa lipídica de la membrana interna. Puede trasladarse de un complejo proteico a otro de la cadena respiratoria.
Puede reducirse parcialmente formando la semiquinona y cuando se reduce totalmente aceptando 2H se forma el ubiquinol. Transporta tanto e- como H+. 
Citocromo
Hay diferentes citocromos (A, B y C). Debido a su grupo prostético HEMO son capaces de absorber la luz visible, cada tipo de citocromo en su estado reducido (Fe2+) tiene 3 bandas de Abs en el espectro visible. Pueden asociarse de forma covalente o no covalente, esto condiciona el potencial de oxidorreducción del hierro y también por el impedimento estérico de la proteína que forman parte. 
Mayormente los citocromos constituyen proteínas integrales de membrana, excepto el citocromo C asociado por interacción electrostática a la cara externa de la membrana mitocondrial interna. 
Proteínas ferrosulfuradas
Poseen centros con hierro coordinado por moléculas de azufre. Estos centros pueden tener diferentes estructuras, la variante de los centros del hierro está coordinado por residuos de His en vez de Cys llamados proteínas ferrosulfuradas de Rieske. 
Estas entidades que transportan e- forman parte de diferentes proteínas de la cadena respiratoria. Es importante que el transporte se lleve a cabo en el ambiente proteico porque permite que la transferencia sea más eficiente y más rápida (si se transfirieron en el espacio la velocidad decrece a medida que aumenta la distancia). 
¿Cómo están ordenados los transportadores?
Primero se pensó en los potenciales de reducción, pensando que la transferencia se produce desde los potenciales más bajos hacia los más altos. Con esto, se armó un ordenamiento de la disposición de los transportadores (EN CONDICIONES ESTÁNDAR). 
En la célula y en la membrana mitocondrial no necesariamente se encuentran en condiciones estándar, por ello se usaron diferentes inhibidores para el análisis experimental de cuales especies estaban reducidas y cuales oxidadas para armar el orden de los transportadores en la cadena respiratoria. 
Flujo de electrones y protones a través de la cadena respiratoria
En la imagen de abajo hay un diagrama general de los complejos donde están los transportadores que constituyen la cadena respiratoria mitocondrial:
I. Complejo NADH deshidrogenasa
II. Succinato deshidrogenasa
III. Ubiquinona, citocromo C oxidorreductasa
IV. Citocromo oxidasa
Complejo I
Es una proteína de 45 subunidades con forma de L, una parte está en la membrana mitocondrial interna y otra hacia la matriz mitocondrial. En la parte de la matriz mitocondrial, dentro de sus cadenas polipeptídicas se encuentra la flavoproteína con 8 centros ferrosulfurados, el NADH cede e- a centros de flavina mononucleótidos que luego van a transferir esos e- a través de diferentes centros ferrosulfurados hasta una molécula de ubiquinona; esta al ser liposoluble viaja a través de la membrana hacia el complejo III. Asociada al complejo I se encuentra asociada el bombeo de H+ desde la matriz a el espacio intermembrana.
Se ha visto que esto está conectado por un alfa hélice anfipática en la cara interna de la membrana mitocondrial interna, esta alfa hélice comunica los cambios que ocurre por la reducción de la ubiquinona con cambios conformacionales a nivel de la parte donde estan los canales para el pasaje de protones desde la matriz al espacio intermembrana. 
Complejo II
La succinato deshidrogenasa, es la enzima del ciclo de Krebs, se produce la oxidación del succinato y los e- son transferidos a FAD2+ y de allí a diferentes centros ferrosulfurados y luego a la ubiquinona que es canalizado por el complejo III. 
Este complejo está formado por 4 subunidades, C y D están en la membrana mitocondrial interna (proteínas integrales) y, A y B están hacia la matriz mitocondrial. Además presenta un centro HEMO que sirve para la ruta que permite la protección frente a especies reactivas del O2 como H2O2 y •O2-
· La ubiquinona además canaliza e- provenientes del glicerol 3P deshidrogenasa por procesos de glucólisis, el glicerol 3P cede sus e- al FAD y éste los transfiere a la ubiquinona.
· Aporta e- la oxidación de los AG, donde la primera reacción es la actividad de la acil CoA deshidrogenasa que canaliza e- al FAD que los transfiere a la flavoproteína transferidorade e- (ETF), luego a la ubiquinona oxidoreductasa (ETF) y esta los transfiere a la ubiquinona. 
Complejo III
En este complejo el ubiquinol reducido transfiere sus e- a 2 moléculas de citocromo (tiene una molécula de hierro complejado a un grupo HEMO). La reacción implica la transferencia de e- de 1 de ubiquinol a 2 de citocromo C. Acopla la transferencia de e- desde el ubiquinol al citocromo c con el transporte vectorial de H+ de la matriz al espacio intermembrana. 
Es un dímero, donde cada uno presenta 11 subunidades, de estas 11 importan las marcadas en la imagen:
· citocromo B con centros HEMO BL y BH
· proteína ferrosulfurada de Rieske, donde el hierro está coordinado por His.
· citocromo C1 con su centro C1.
En este complejo que implica la transferencia de e- desde ubiquinol a citocromo se produce el ciclo Q.
Ciclo Q
Acopla la transferencia de e- desde el ubiquinol al citocromo C con el transporte de H+ a través de la membrana; facilita el tránsito ¿cómo? 
Oxidative phosphorylation 3 - Complex III and the Q cycle
→ flechas azules: movimiento de e- por el complejo III
→ flechas negras: movimiento de las formas de ubiquinona
Etapa 1 = llega al complejo III el ubiquinol (QH2), en primera instancia se va a unir a un sitio de unión y transfiere 1e- al centro de Rieske del citocromo c1; desde aquí pasa al centro C1 y de allí el e- reduce una primera molécula de citocromo C.
A la vez, el otro e- (QH2) pasa a los centros HEMO BL y BH, y reduce una molécula de ubiquinona (Q) del pool de ubiquinona oxidada dando un semiquinona (•Q-). 
Etapa 2 = Esta vuelve a su posición anterior para aceptar otro e- cuando entra otra molécula de QH2 que transfiere 1e- hacia citocromo c1 y otro a centros HEMO para terminar de reducir a la semiquinona con la captación de 2 H+ del medio → QH2.
Efecto neto: entraron 2 moléculas de ubiquinol y 1 de ubiquinona. Entonces se produce la oxidación de 1 molécula de ubiquinol. Por otro lado, se produjeron 2 moléculas de citocromo C reducidas.
Complejo IV
Presenta 4 subunidades, nos interesan las primeras tres. 
· subunidad 1, hay un centro de Cu asociado a 2 centros HEMO
· subunidad 2, centros de Cu
· subunidad 3, sirve para el bombeo de H+ desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.
Llega el citocromo C reducido y se produce la transferencia de e-, primero hacia el cobre y luego hacia los centros HEMO, y finalmente al cobre. Entre los centros al HEMO ⍺3 y cobre B que se encuentra asociados, se produce la reducción de una molécula de O2 (requiero de 4 e-). 
Mecanismo de acción
1. El citocromo C entra y aporta 1e- que viaja a los centros de cobre al HEMO ⍺ y ⍺3, produciendo la reducción del centro de cobre.
2. Entra un segundo e- que viaja a los centros de cobre al HEMO ⍺ y ⍺3, 
3. Quedando el HEMO ⍺3 reducido.
4. El HEMO ⍺3 reducido tiene alta afinidad por el O2, entonces capta este; 
5. Dado que ambos centros están cercanos se genera entre ellos un puente peróxido, y … 
6. Frente a un nuevo e- y H+ se rompe.
7. Entra otro H+ y otro e- permitiendo la formación de -OH.
8. Con la entrada de otros 2 H+ se logra eliminar 2 H2O, de esta manera la retención del O2 entre ambos centros permite la reducción en pasos de a 1e- sin generar especies reactivas del O2. 				
La estrategia para la reducción segura del O2 reside en que el catalizador no libera intermediarios parcialmente reducidos; la citocromo c oxidasa cumple este requisito mediante la retención del O2 y sus intermediarios de reducción entre los iones Fe y el Cu.
La citocromo oxidasa bombea 4H+ adicionales desde el lado de la matriz hacia el lado citoplasmático de la membrana (2 por cada par de electrones), de modo que en el transcurso de cada vuelta del ciclo desaparecen de la matriz un total de 8 protones. 
Formación de especies reactivas del O2
Son altamente reactivas, y se dan por diferentes cantidades de e-. Estas especies pueden ser perjudiciales para las células y por ello hay defensas:
· No enzimáticas: hay moléculas que canalizan las especies reactivas del O2. 
· Antioxidantes enzimáticas: 
· Superóxido dismutasa → transforma 2 moléculas de igual tipo en 2 entidades diferentes menos reactivas.
· Catalasa → transforma el peróxido en H2O. 
RESUMEN DE LA REACCIÓN COMPLETA
· Mediado por NADH pasan 6 protones
· Mediado por citocromo c pasan 6 protones. 
Fuerza motor motriz
¿Cómo el gradiente de protones puede sintetizar ATP? el gradiente de protones a ambos lados de la membrana genera una diferencia electroquímica que tiene 2 componentes:
· energía química potencial 
· energía eléctrica potencial
Esto implica una conservación de energía libre usada para generar ATP.
Modelo quimiosmótico: la energía electroquímica asociada a la diferencia en la cc de H+ y a la separación de cargas a través de la membrana mitocondrial (fuerza protón motriz) impulsa la síntesis de ATP a medida que los H+ fluyen de manera pasiva de vuelta a la matriz a través de un poro asociado a ATP sintasa.
Entonces, hay un pasaje de protones que se acumulan en el espacio intermembrana y luego cuando esos protones pasan a favor de gradiente por la ATP sintasa, eso se acopla a la síntesis de ATP. 
Para demostrar la hipótesis se usó el experimento usando vesículas con bacteriorodopsina que cuando es iluminada es capaz de bombear protones. Descubriendo que es necesario que se genere el gradiente de protones por la cadena respiratoria para que se produzca la síntesis de ATP. 
Esto se verificó con los ensayos de la imagen a la derecha, para verificar el acoplamiento de ambos procesos pusieron mitocondrias aisladas en un medio midiendo el consumo de O2 y la cc de ATP generada. A las mitocondrias se les aportaba sustratos para la generación de ATP pero sin sustratos oxidables; si no hay sustrato para oxidar no funcionaba la cadena respiratoria entonces por más que haya ADP + Pi NO HAY SÍNTESIS DE ATP. Recién al agregar un sustrato oxidable se desencadena el consumo de O2 y la síntesis de ATP. 
El hecho de que estén acoplados también indican lo contrario, que si agrego solo succinato pero no los sustratos para el ATP, no se produce la respiración ni la síntesis de ATP. Si pongo succinato pero no se puede generar ATP en un primer momento hay respiración celular, eso genera la creación del gradiente de H+ pero si los H+ no pueden entrar y generar ATP por bloqueo entonces el potencial electroquímico en algún momento es tan grande que no puede seguir progresando por el aumento de la energía libre que no se disipa.
ATP sintasa
Tiene 2 dominios funcionales F0 y F1.
· F0, inmerso en la membrana mitocondrial interna y constituye el poro protónico por el cual ingresan protones a la matriz.
· F1, está en la matriz mitocondrial y es la porción capaz de sintetizar ATP. 
Síntesis de ATP
Se vio que la ATP sintasa, en la superficie la energía libre es prácticamente 0. En el gráfico muestra lo que ocurre en solución, la ATP sintasa fomenta la síntesis de ATP pq estabiliza ese ATP que se forma. 
El principal problema de la ATP sintasa es la liberación del ATP a solución, lo que se necesita es que los protones liberen el ATP que se sintetiza.
¿Cómo el flujo de protones produce la liberación del ATP? El F1 donde se produce el ATP tiene 9 subunidades, en la subunidad ß es el sitio catalítico donde se sintetiza el ATP; también presenta una subunidad 𝛾 que tiene 2 dominios donde uno sirve como eje que conecta con F0 y otro interacciona con 1 de las subunidades ß, luego tenemos una subunidad 𝝐 y subunidad δ. 
El F0 tiene 3 subunidades A, B y C. La subunidad C constituye el poro protónico, la A está en contacto con la C y la subunidad B fijan todo a la membrana (haciendo referencia a donde se sintetiza el ATP). El rotor de subunidades C rota a medida que los protones atraviesan las subunidades C, a medida que ocurre esto, transfieren en movimiento a las subunidades 𝝐 y 𝛾, haciendo que 𝛾 alterne su u¡interacción con las subunidades ß induciendo en estas la conformación ß vacía generando que el ATP se libere. 
Catálisis rotacional 
Las diferentes subunidadesß se produce la síntesis de ATP y según su interacción con la subunidad 𝛾 tienen distintas conformaciones. Cuando adquiere la ß vacía induce cambios conformacionales de modo que las otras subunidades ß adquieren conformación ß-ATP y ß-ADP; por cada vuelta de 𝛾 las subunidades ß pasan por las 3 conformaciones:
· ß vacía
· ß-ATP
· ß-ADP
CADA VUELTA DEL CICLO LIBERA 3 ATP
Flujo de protones impulsa la rotación del complejo F0
ATP Synthase
En la imagen, se ven que interviene la subunidad A y C del F0 de la ATP sintasa. Un residuo de aspartato en la subunidad C y arginina en la subunidad A, la subunidad A tiene 2 semiconductos que se conecta con el espacio intermembrana y con la matriz mitocondrial (sin atravesar).
El aspartato cercano a la arginina de la subunidad A está desprotonado, se genera una interacción electrostática entre el aspartato y la arginina. Como el espacio intermembrana presenta mayor cc de H+ y por ello, los H+ entran por el canal de la subunidad A protonando al aspartato, eso hace que se desensamble la arginina y el aspartato. La arginina con carga (+) buscará otro aspartato para interaccionan, entonces irá al de la subunidad C de al lado, que está en contacto con el semi conducto en relación con la matriz mitocondrial, al interacción con el aspártico propiciona la salida de este último hacia la matriz mitocondrial. Finalmente, se acomoda la subunidad para establecer una mejor interacción electrostática con la arginina y se produce el movimiento de la subunidad C y volvemos a la situación inicial. 
Transportadores mitocondriales
Translocasa de ADP y Pi
Permiten la salida de ATP de la matriz mitocondrial hacia el espacio intermembrana para que luego pase al citosol. El ADP se genera fuera de la célula, este ingresa a la mitocondria para sintetizar ATP.
Esta transferencia implica la entrada de 3 cargas negativas y la salida de 4 cargas negativas, por lo tanto, está favorecido por el potencial eléctrico a ambos lados de la membrana. También se requiere de la entrada de Pi, para ello se utiliza un cotransportador paralelo que permite la entrada de Pi en contra del gradiente, a través de la entrada de H+ a favor de gradiente. 
Sistema de lanzadera
El NADH generado fuera de la mitocondria, ingresa a la mitocondria por los sistemas lanzadera.
Lanzadera malato-aspartato
En hígado, riñón y corazón se utiliza la lanzadera malato-aspartato. 
El NADH citosólico produce la reducción de una molécula de oxalacetato a malato, el malato entra por el transportador ⍺ cetoglutarato y dentro de la mitocondria vuelve a ser oxidado con la formación de NADH que va al complejo I de la cadena respiratoria. 
Por reacciones de transaminación se recupera el oxalacetato.
Lanzadera del glicerol-3P
Implica la formación de glicerol 3P a partir de la dihidroxiacetona fosfato. El NAD+ produce la reducción del glicerol 3P y luego la glicerol 3P deshidrogenasa capta los e- por moléculas FAD que son transferidos a la ubiquinona y luego al complejo III.
La entrada a nivel del complejo I produce mayor cantidad de protones que en este caso, que se entra directamente al complejo III, es decir, se produce mayor gradiente electroquímico. 
Razón P/O
Es el rendimiento en moléculas de ATP que genera la oxidación de 1 molécula del dador de e-, es decir, cuántos ATP se genera por molécula de NADH, FADH, etc. Para esto hay que saber:
· el gradiente de protones generado
· cuántos de los protones me pueden generar ATP
Para 1 molécula de ATP se utilizan 4 protones ¿por qué? para dar una vuelta completa de las subunidades C, teniendo en cuenta que hay 9 subunidades, se requieren de 9 protones, para ⅓ de vuelta necesito 3 protones y con 3 protones género 1 ATP pero además necesito del funcionamiento de los transportadores de ATP, ADP y Pi lo que consume gradiente electroquímico (1 protón). Entonces el total requiero de 4 protones para 1 molécula de ATP, 3 para generar ATP y 1 para que se libere.
Entonces, por 10 protones que se transfieren de la oxidación del NADH hay un rendimiento de 2,5. Para el succinato el rendimiento será de 1,5. 
En base a esto, uno podría sacar el rendimiento energético. 
Regulación de la fosforilación oxidativa
· Control por aceptor: cuando hay disponibilidad de ADP como sustrato de fosforilación. 
· Cociente de acción de masas: la mitocondria puede sensar pequeños cambios donde este cociente debe mantenerse relativamente cte → [ATP]/[ADP][Pi]
· IF1: proteína inhibidora que impide la hidrólisis de ATP durante la hipoxia (cuando la célula no tiene O2). La ATP sintasa podrá hidrolizar el poco ATP, entonces a bajo pH IF1 dimeriza e interacciona con la ATP sintasa inhibiendola. Cuando se restituye el O2, baja el pH intracelular e IF1 se disocia.			
· Las concentraciones relativas de ATP y ADP controlan no sólo las velocidades de transferencia electrónica y fosforilación oxidativa, sino también las velocidades del ciclo del ácido cítrico, oxidación del piruvato y glucólisis.