T27 QB - Tecnología de ADN recombinante

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@rose.studygram_
Teórico 27
Tecnología de ADN recombinante
Comenzamos con un ejemplo … tenemos pacientes diabéticos dependientes de insulina; antes se obtenía por purificación del páncreas de cerdos y hoy, la insulina brindada a estos pacientes consiste en una proteína recombinante, la ventaja de esto es que se pueden obtener grandes cantidades de proteína, en costos más bajos y es más sencilla de purificar. Pero …
¿Qué es una proteína recombinante? Es una proteína producida a partir de un ADN recombinante → unión de fragmentos de ADN de organismos diferentes, aca introducimos el concepto de VECTOR: un fragmento de ADN que funciona como un portador de otro fragmento de ADN que le voy a insertar con el objetivo de producir una proteína recombinante. 
¿Cómo se obtiene un vector recombinante? Tenemos un vector (plásmido) y del cromosoma eucariota donde se marca en rojo el gen que deseo insertar, no necesariamente un cromosoma puede ser un DNA aportado de un lab inserto en otro vector o un fragmento amplificado por PCR, tanto el vector como el gen de interés se cortan con las misma enzimas. Luego se combina el vector digerido con el gen cortado = vector recombinante en presencia de la DNA ligasa que sella las uniones fosfodiéster. 
El vector es introducido en la célula huésped, ej: bacterias, y como tiene un ORI pudiendo autoreplicarse en la cél. huéspedes y al mismo tiempo, el huésped va a dividirse, entonces en corto tiempo se amplifica muchas veces el gen de interés. En todo este proceso hablamos de CLONACIÓN. 
1) aislar un fragmento específico del ADN
2) unir el fragmento a un vector “adecuado”
3) inducir el vector modificado en la cél. hospedadora
4) identificar las cél. que contiene el ADN recombinante
De esta manera obtenemos un CLON: población de organismos que son genéticamente homogéneos ya que proceden del mismo predecesor.
Inserción del ADN 
Se utilizan endonucleasas de restricción, reconocen secuencias específicas del ADN cortando una base determinada generando sitios de restricción. Por otro lado, las ADN ligasas dijimos que se sellan la unión entre el vector y el fragmento de ADN deseado mediante la catalización de los enlaces fosfodiéster. 
Enzimas de restricción
	Tipo I y III
· Grandes complejos con actividad endonucleasa y metilasa
· Cortan el ADN al azar
· Necesitan ATP para actuar
	Tipo II
· Reconocen secuencias de 4 a 6 pb palindrómicas: sitios de restricción. 
· Producen cortes de las 2 hebras de ADN, dejando 2 a 4 nucleótidos desapareados en los extremos = extremos cohesivos.
· Otras pueden producir extremos romos. 
En la imagen se ve una doble hebra de ADN reconocida por EcoRI cortando entre G-AATTC en la secuencia del ADN formando extremos cohesivos; puede suceder también que genere extremos romos como en el ejemplo de la imagen de al lado.
¿Si tengo ambos tipos de enzimas cuál elegiría? EXTREMOS COHESIVOS, preferente ante la generación de extremos romos porque cuando entre el vector digerido con el ADN digerido ya hay presente un apareamiento de bases por complementariedad para que la ADN ligasa selle las uniones; en el caso de los extremos romos solo dependemos de la efectividad de la ligasa para formar el vector recombinante. 
Las enzimas de restricción tienen un nombre correspondiente a las bacterias de las cuales fueron aisladas y el número corresponde a su identificación, ej: EcoRI proviene de Escherichia coli y fue la 1ra identificada. En la imagen se muestra ejemplo de donde reconoce cada enzima de restricción. 
Algunas enzimas de restricción reconocen la misma secuencia y cortan en el mismo lugar, se denominan isoesquizómeros, las que se ven en la imagen de la derecha reconocen la misma secuencia cortando entre G-C ¿qué utilidad tiene esto? si yo necesito cortar en la secuencia y quizás no tengo una de las enzimas pero la otra sí por lo cual, lo aprovecho, 
Encontramos otras enzimas que reconocen la misma secuencia pero cortan en lugares diferentes, se denominan neoesquizomeras mirar el ejemplo de la imagen para entender mejor. 
¿Por qué se cortan con las mismas enzimas de restricción? para que los extremos cohesivos generados faciliten que se apareen el vector con el ADN y poder generar el vector recombinante. 
Se corre riesgo que el vector digerido vuelva a ligarse, entonces cuando se digiere el vector ponemos fosfatasa alcalina quitando los fosfatos y evite que se ligue sobre sí mismo. Cuando pongo el ADN digerido tengo una unión fosfodiéster que no se está formando, pero el plásmido como hay complementariedad de bases y al introducirlo en las bacterias, las bacterias se encargan de rellenar la unión fosfodiéster. Entonces, cuando comienza a autoreplicarse el vector se “soluciona” esa unión y deja de estar el problema del nic (que sería el espacio que queda mirando la imagen). 
Vectores de clonación
Molécula de ADN replicante y estable a la cual se puede adherir un fragmento de ADN extraño para introducirlo en una célula. Características:
· Origen de replicación, que asegura que el vector se reproduzca dentro de la célula. Debe ser extracromosómico al cromosoma del huésped. En este caso, debo elegir la célula huésped a utilizar y en función de eso elegir el vector con el ORI para el huésped, ej: para células bacterianas elijo un vector que tenga un ORI bacteriano y para levaduras elijo un vector que tenga un ORI de levaduras sino no sucede nada. 
· Marcadores seleccionables, que permiten seleccionar o identificar todas las células que contienen el vector.
· Uno o más sitios de restricción únicos dentro de los cuales puede insertarse un fragmento de ADN.
Marcadores de selección
POSITIVO: permiten el crecimiento celular 
· Antibiótico
· Marcador: proteína codificada por el plásmido que da un color determinado
NEGATIVO: inhiben el crecimiento celular
En el esquema de la imagen vemos cómo se inserta el vector recombinante a las bacterias donde algunas van a incorporarlo y otras no, para poder identificarlo puedo hacer crecer a las bacterias en un medio selectivo si utilizo un vector que le confiere resistencia a algún antibiótico, ej: ampicilina:
· bacterias que incorporaron el vector van a crecer en presencia de ampicilina
· bacterias que no incorporan el vector no van a crecer/mueren
En la placa de cultivo observamos puntos blancos que corresponden a colonias bacterianas que fueron transformadas con un vector recombinante y que son resistentes a ampicilina.
Vectores de clonación 
· Plásmidos: genes pequeños 1,3 kpb
· Bacteriofagos
· Cósmidos
· Cromosomas bacterianos artificiales
· Cromosomas artificiales de levaduras: genes de 1000 kpb
El vector que yo elija va a depender del TAMAÑO DEL GEN que se desee insertar en el vector de clonación. 
Plásmidos
Moléculas de doble cadena de DNA circular que se replican con independencia del cromosoma del huésped. Tamaño del plásmido: 1 a 400 kpb para introducir ADN pequeños; vemos representado un vector plasmídico con sus sitios de restricción, el ORI de tipo bacteriano si utilizo bacterios o eucariota si uso mamíferos y el gen de demarcación. 
Los plásmidos se clasifican según el número de copias:
· Plásmidos relajados 
Alto número de copias (10-100 copias / célula) Inhiben la replicación cuando se alcanza un cierto número de copias
· Plásmidos no relajados (“stringent”) 
Bajo número de copias (2-4 copias/célula) Mecanismo preciso de regulación
Incompatibilidad de plásmidos: cuando tienen el mismo origen de replicación. Si yo tengo 2 plásmidos de igual ORI con genes diferentes, y lo introduzco en la cél. se produce la incompatibilidad, si yo quiero obtener un clon debo poner plásmidos de ≠ ORI. 
Los plásmidos también se clasifican según el rango de huésped:
· Plásmidos de rango estrecho 
Solo pueden replicarse en una sola especie. Ej: pUC, pBR, pET
· Plásmidos de rango amplio 
Pueden replicarse en varias especies. Capaces de expresar sus genes en distinto tipos de bacterias Ej: RK2, RSF1010
Plásmido pBR322 tiene el ORI, el gen de resistencia a ampicilina y el sitio de clonado donde se ubica un gen que le confiere resistenciaa la tetraciclina. Tengo 2 marcadores de selección, este plásmido produce de 10 a 50 copias/cél.
¿De qué me sirve tener 2 marcadores de selección? si inserto el gen justo en el sitio con el marcador para Tetr puedo sembrar en diferentes placas:
· Placa con ampicilina, aquellas células que hayan incorporado el vector recombinante van a crecer y las que incorporaron el vector religado también. 
· Placa con ampicilina + tetraciclina, aquellas células que hayan incorporado el vector recombinante no van a crecer, si encontramos hay bacterias que crecen en este medio significa que incorporaron el vector religado (no tiene el fragmento de ADN inserto).
Entonces esto me permite descartar aquellas células que hayan incorporado el vector religado. 
Plásmido pUC tiene el marcador resistente a ampicilina y otro gen que codifica para el operón lacZ que induce la expresión de ß-galactosidasa ¿qué me genera esto? si le agrego un producto X-gal se veran de color azul, otra manera de seleccionarlo. 
Bacteriofagos
El fago 𝛌 tiene una cabeza con ADN de aprox 50 kpb para poder infectar a la cél. (si tiene menos no infecta la célula) y de allí sigue 2 vías:
· lítica donde se replica y lisa la célula liberando los fagos formados
· lisogénica donde el fago se integra en el cromosoma del huésped, luego de una situación de estrés el fago se separa y pasa a la via lítica. 
¿cómo obtengo ADN recombinante? Se trabajó con el ADN de la cabeza del fago, de los 50 kpb hay 20 que pueden ser reemplazados, esto le sirve a fago para poder integrarse al cromosoma del huésped. 
Se corta los 20 kpb que forma el ADN de la cabeza del fago y se reemplaza por el gen de interés. Aquellos fagos que infectan tiene el ADN recombinante del tamaño del fago. 
Cósmidos
Permiten un inserto de DNA de hasta 45 kpb. Tienen las propiedades de plásmidos y bacteriófagos, contiene un origen de replicación que le permite ser mantenido como plásmido dentro de la bacteria. Adopta estructura del fago, pero una vez que infectó a la bacteria, se circulariza por secuencias cos y toma forma de plásmido. 
Cromosomas bacterianos artificiales
Plásmidos diseñados para la clonación de fragmentos de ADN muy largos (100 a 300 kpb). Permite tener insertado un gen completo. Usados para bibliotecas genómicas generalmente. 
Tiene genes que otorgan resistencia a antibióticos, genes para lacZ y se digiere con las enzimas igual que el ADN exógeno. La selección es como mencionamos ya sea por antibiótico o por selección de colonias coloreadas. 
· El tamaño del inserto supera varias veces al del vector
· Bajo número de copias (1-2/cell) 
· Contienen marcador de selección y de screening
Debajo se muestra una tabla que compara los distintos vectores con la capacidad de tamaño de ADN que puede ser insertado. 
Pero a veces el objetivo no es sólo replicar el gen, sino también producir la proteína que codifica ese gen…
Vectores de expresión
Contienen secuencias cortas de ADN que proveen las instrucciones para el aparato transcriptor y traductor de la célula huésped.
Señales de expresión en procariotas
· PROMOTOR: región de ADN que interacciona con el aparato transcripcional (ARN polimerasa + factores auxiliares) para iniciar la transcripción de la secuencia contigua. La fuerza del promotor afecta el rendimiento de la expresión génica. Son regulados por moléculas represoras que se unen a sitios próximos o dentro del promotor, impidiendo el inicio de la transcripción. 
· OPERADOR: sitios de unión de proteínas y factores auxiliares, represores o activadores. Esta señal puede o no estar. 
· TERMINADORES de la transcripción: es la señal que determina el fin de la transcripción, que detiene a la ARN polimerasa. 
· SITIO de UNIÓN al RIBOSOMA (RBS): una secuencia de ADN que, cuando se transcribe en ARN, produce un sitio de fijación al ribosoma bacteriano y así permite la traducción del RNAm a proteína. 
En la imagen se ve el vector de expresión con sitios de clonado donde inserto el gen de interés, la señal para la terminación de la transcripción se ubica DESPUÉS del gen y las señal para la unión de ribosomas está ANTES del gen; el promotor así como el operador también están antes del gen y las demás señales. A veces hay genes que actúan como represores o inductores. Encontramos los marcadores de selección y el ORI para el huespues donde voy a introducir el vector. 
La inserción de un gen en un vector no implica que va a ser expresado exitosamente
Los vectores se modifican para controlar: 
· Transcripción
· Traducción
· Estabilidad proteica
· Secreción de la proteína
Las bacterias no secretan proteínas al medio extracelular, entonces en grandes cantidades de proteínas se forman agregados llamados cuerpos de inclusión dentro de la bacteria. Entonces se manipulan los niveles de expresión para disminuir estos problemas. 
Manipulación de la expresión de un gen 
· Secuencias del promotor y terminación de la transcripción
· La fuerza de unión al sitio del ribosoma
· Número de copias del gen clonado
· Si el gen es de expresión transitoria o estable
· La eficiencia de la traducción en el huésped
· La localización final de la proteína foránea
· Estabilidad intrínseca de la proteína
No existe una estrategia simple para lograr la máxima expresión de un gen clonado
PROMOTOR
· Fuerte: alta afinidad por la RNA polimerasa, por ende ocurre la transcripción eficientemente. A veces es nocivo para el huésped (energía y mal funcionamiento celular)
· Regulable: permite regular la transcripción a través de la interacción con inductores o represores
Mejor opción: P fuerte regulable. 
En la imagen se ve un ejemplo de un promotor regulable, donde hay presente un represor que sí está presente no hay transcripción; si al medio le agrego un efector que se une al represor, este no impide la transcripción y ahora se da la transcripción y traducción de la proteína.
También puede estar regulado por un activador, donde el promotor se acelera su transcripción, si agrego un efector que se une al activador bloqueo su actividad y la transcripción se da en condiciones normales. 
Ejemplo: Lac o Trp, otros son Tac o Trc que son 10 veces más efectivos
Otra estrategia para regular al promotor es, por ej: plásmido pCP3 donde el promotor y el Ori están regulador por un represor sensible a la T que impide la transcripción a T bajas, a 42oC se degrada e inicia la transcripción aumentando 600 copias/cél. 
SITIO DE UNIÓN A RIBOSOMAS
Secuencia de 6-8 nucleótidos del RNAm que se aparea con la secuencia complementaria del RNA de la subunidad ribosomal pequeña. Cuanto más fuerte es la unión del RNAm al ribosomal, mayor es la eficiencia de la traducción. 
8 nucleótidos después del rbs va el codón de inicio ATG. 
Hay algunos ARNt que se encuentran en baja cantidad en las cél. pero sucede que genes cuando se transcriben necesitan de gran cantidad de los ARNt, entonces no es suficiente producir la cantidad de proteína necesaria debido a que hay un déficit de ARNt; tenemos cél. modificadas genéticamente que producen una alta cantidad de ARNt y puede mejorar la producción de proteínas. 
ESTABILIDAD DE LA PROTEÍNA
· Es importante la secuencia N-terminal de la proteína, ya que uno puede incorporar AA y aumenta la estabilidad sin modificar su actividad biológica. En la tabla se ve la ß-galactosidasa que según que AA se le agregue al N-terminal se modifica su vida media. 
· La presencia de puentes disulfuro modifica su estabilidad, sobre todo para expresar en bacterias.
· La secuencia PEST, son secuencias que contienen alta cantidad de Pro, Glu, Thr, Ser y esto disminuye la estabilidad.
Cuando uno expresa un gen en una bacteria, debe tener en cuenta:
· Estabilidad de proteínas
· Correcto plegamiento
· Secreción al medio extracelular (tiorredoxina)
· En bacterias: se acumulan cuerpos de inclusión con lo cual se vuelve difícil purificarlas. Para evitar esto, el gen de interés se lo fusiona al gen de la tiorredoxina, entonces cuando esta se transcribe y traduce conseguimos una proteína fusionada a la tiorredoxina : se acumula cerca de la paredbacteriana, entonces le aplicó un shock osm para que salga al exterior y arrastra a la proteína de interés, luego habría que cortar a la tiorredoxina y obtener la proteína de interés. 
tPA: activador de plasminógeno tisular (17 puentes S-S) (para trombos) presenta mal plegamiento cuando hay poca proteína formadora de puentes disulfuro de E. Coli (bola roja). Se le incorpora un plásmido que codifica para proteínas formadoras de puente S-S, El tPA se pliega correctamente cuando aumenta la cantidad de proteína formadora de puentes disulfuro de E. Coli (bola roja). 
Para que la bacteria pueda secretar las proteínas al medio, la proteína de interés puede fusionarse a una señal hacia al exterior o introducir en las bacterias el vector con el gen + vector que tiene el gen que codifica para la bacteriocina → activa la PLA que degrada los fosfolípidos de membrana, dejando poros y asi la proteína puede ser secretada. 
Expresión estable
Transitorio → 2 o 3 días de producción de proteínas, luego la cél. se muere
≠
Estable → el gen se integra al cromosoma de la cél. huésped, los niveles son más bajos. 
Cuando un plásmido es transferido a un huésped puede pasar:
1. Que se mantenga como plásmido
2. Que se pierda
3. Que se integre al cromosoma del huésped
4. Un gen del plásmido se recombine con un gen homólogo de la célula
(3) INTEGRACIÓN EN EL ADN CROMOSÓMICO
Produce proteínas en menor cantidad, lo ideal es hacer la integración aunque no es facil. Tenemos el plásmido y el gen (forma de herradura) que se integra en el cromosoma del huésped ¿Características del vector de expresión?
· El gen clonado se liga a un P regulable dentro o adyacente al sitio del DNA cromosómico. Debe estar flanqueado por secuencias de ADN homóloga a las secuencias del cromosoma de la cél. huésped para que haya recombinación homóloga. 
· El gen entrante debe tener similitud de secuencia de aprox 50 bases con el DNA cromosómico.
· Plásmido no replicativo dentro del huésped.
· A veces se integra el plásmido completo.
La introducción de una proteína foránea y producción en ↑ cantidades implica un alto gasto energético para la célula = ↓ crecimiento celular
· Plásmido con alto número de copias (requiere > E para la replicación y mantenimiento)
· Cantidad limitada de O2 (es insuficiente para el metabolismo celular y mantenimiento del plásmido y expresión) 
· Sobreproducción de la proteína depleta el pool de algunos RNAt y aminoácidos
· La proteína foránea puede interferir con el funcionamiento del huésped
En la tabla se representa como cambia la velocidad de crecimiento al incorporar plásmidos con alto número de copias. 
¿Qué consecuencia tiene introducir una proteína foránea?
· ↓ velocidad de crecimiento celular
· El gen puede ser eliminado
· Cambio en el tamaño y forma celular
· Errores de traducción por la limitación en los RNAt y aminoácidos. 
· Esto produce proteínas más inmunogénicas ya que no tienen la misma secuencia, en su actividad y estabilidad
Para evitar esto:
· Usar plásmido de bajo número de copias
· Integrar el DNA foráneo al cromosoma celular
· Usar P regulable
Señales de expresión en eucariotas
Lo marcado en negrita es aquello adicional que presenta un vector para eucariotas. 
· Promotor de la transcripción
· Señales de finalización de transcripción y traducción 
· Secuencia de poliadenilación del RNAm 
· Gen marcador de selección
· Origen de replicación para eucariotas
· Origen de replicación para procariotas, esto es útil para poder amplificar el gen en cél. bacterianas a bajo costo y alta velocidad. 
· Marcador de selección en procariotas
· Secuencia complementaria al DNA cromosómico (para expresión estable)
Se ve un ejemplo de un vector de expresión en eucariotas con ambos Ori, el gen de resistencia para E.coli y para eucariotas, los sitios de clonado y señal de terminación.
 
Vector de expresión en levaduras
Vector típico llamado plásmido 2 µm con el Ori para levaduras y Ori el E.coli para amplificarlo ¿cómo selecciono? Generalmente se utilizan aminoácidos, gen LEU2, incorporó el vector en una cepa que no produzca leucina donde aquellas que incorporen el vector van a poder producir Leu y crecen. 
Este vector se usa en una cepa de levaduras Leu- (selección), produce un alto número de copias (30/celula) y sirve para expresión estable pero con plásmido cortados, de esta manera se linealiza el vector y al estar flanqueado por las secuencias de ADN del genoma de levadura sucede recombinación homóloga quedando inserto en el cromosoma del huésped. 
Baculovirus
Son virus que infectan insectos, este sistema es muy bueno ya que las bacterias no tienen modificaciones post-traduccionales mientras que las células eucariotas si. Este sistema permite expresar proteínas muy parecidas a su forma nativa. 
Este virus se encuentra en 2 formas:
1) Forma de brote (budded). Se desintegra el polihedron. No puede infectar a huéspedes, pero sí a células de insectos en cultivo. 
2) Forma ocluida (es la que infecta). El virus está inmerso en una matriz de polihedrina (polihedron). El promotor para la polihedrina es fuerte, por ende se consiguen ↑ transcripciones. 
El virus entra por la boca del insecto, cuando llega al intestino la matriz se degrada y el brote entra a la célula para replicarse.
 
¿Cómo obtengo un virus recombinante?
1. Construcción del vector de transferencia. Se tiene el ADN + promotor + sitio de clonado + sitio de terminación, está flanqueado por secuencias de ADN que son homólogas al ADN del virus.
2. Cotransfeccion de células de insectos con el vector de transferencia + ADN del baculovirus. El segmento en amarillo forma parte del vector de transferencia, mientras que lo naranja es el genoma del baculovirus, cuando enfrente ambos al tener la secuencia de ADN homologa al genoma del virus se genera una recombinación homologa quedandome el gen de interés donde se encontraba el gen la polhidrina, quedando el vector recombinante del baculovirus que lo llamarems BACNIDO.
Las células de insecto producen proteínas similares a la proteína nativa, por ello se utilizan estos vectores. 
Vectores de expresión en mamíferos
Tiene un Ori en eucariotas, para que se pueda expresar en la cél. huésped, un promotor y un intrón que mejora la traducción del gen seguido de los sitios de clonado, y los sitios de poliadenilación + terminación de la transcripción. Encontramos también un Ori para E.coli y un gen que confiere resistencia a ampicilina, esto me sirve para amplificar el gen.
Generalmente se utiliza para seleccionar las poblaciones eucariotas genes que codifican para algunas proteínas. 
Para incorporar el vector, podrían utilizarse células que sean deficientes en esa proteína, ej: vector que codifique para la proteína dihidrofolato reductasa, utilizo células que no sintetizan esta proteína y entonces cuando hago la selección en un medio sin nucleótidos y sobreviven aquellas células que hayan incorporado el vector para que la enzima transforme dUMP → dUTP y puedan crecer.
Los promotores de mamíferos son fuertes, no regulables. Solo se usan inducibles si la proteína es tóxica para la célula. Además un vector de expresión presenta otras señales:
· Secuencia Kozak (alrededor del codón de inicio AUG) para el inicio de la traducción 
· Secuencia señal para facilitar la secreción 
· Tag, para facilitar la purificación de la proteína
· Secuencia de clivaje proteolítica para remover el tag 
· Codón stop para asegurar la finalización de la traducción
· UTR (regiones no traducidas) para una eficiente traducción y estabilidad del RNAm
Supongamos que quiero expresar 2 proteínas (⍺ y ß) dentro de la célula ¿cómo logro la combinación de 2 proteínas?
Uno toma 2 vectores, el gen que codifica para ⍺ y otro gen que codifica para ß, ambos presentan los sitios de poliadenilación y terminación SIEMPRE después del gen, cada método tiene un método de selección diferente. Esto permite identificar la población que haya incorporado ambos vectores, aquellas que sobrevivan en el medio con ambos marcadores son las que los incorporaron; 
Surge un problema → uno delos vectores se puede perder y la cantidad que se expresa de una subunidad no es la misma que la otra, entonces se suele usar un vector de doble casette = tenemos ambos genes en el vector con un único medio de selección, pero ambos tiene promotores diferentes c/u con sitio de poliadenilación y terminación de la transcripción. Vuelve a suceder que como los promotores son diferentes, por más que sean fuertes, puede que los niveles de ambas proteínas no sean los mismos. 
En este caso introducimos a los vectores bicistronicos = que uno puede disminuir los problemas para expresar 2 proteínas; hay un único método de selección, pero tambien un ÚNICO PROMOTOR, entonces encontraremos al promotor seguido del gen para la subunidad ⍺ + IRES (sitio de entrada ribosómico interno) + subunidad ß y finalmente la señal de poliadenilación con la señal de terminación.
¿Qué es el IRES? Cuando se transcriba obtenemos un ARN bicistrónico, con el mensajero para ⍺ y ß, y la secuencia IRES permite que se una el ribosoma para que se traduzca el gen ß. Hay una traducción simultánea de proteínas a partir de un ARNm policistrónico. 
Marcadores de selección de mamíferos
Se encuentran algunos marcadores, ej: MTX se agrega e inhibe a la dihidrofolato reductasa.
Manipulación de células de mamíferos 
Alto número de vector recombinante
Existe una estrategia que se utiliza para enriquecer la población celular con el gen de interés. En el ejemplo de la imagen se ven células deficientes en dihidrofolato reductasa, se les incorpora un vector recombinante que expresa el gen para la enzima. Si las pongo en presencia de Metotrexato (MTX) que inhibe la enzima, solo la célula que incorporó el vector recombinante resiste. Ahora voy a aumentar la cc del inhibidor, sobreviven aquellas células que tienen un alto número de copias en el vector recombinante, sigo subiendo la cc de inhibidor y así sucesivamente para enriquecer a la población en células con alto número de vector recombinante. 
Manipulación para aumentar la productividad por p53
Otra manera es, como mencionamos la alta demanda de O2 hace que se produzca un factor p53 en condiciones normales que lleva a la apoptosis de la cél. por el stress. En base a esto, se suele incorporar un gen en el vector para MDM2 que al expresarse se une a p53 inhibiendo la apoptosis y muerte celular. 
Aumentar la expresión por piruvato carboxilasa
Si hay poco O2, la glucólisis sucede en condiciones anaeróbicas produciendo LACTATO = ↓pH, entonces se transfectan a las células con el gen para piruvato carboxilasa para producir oxalacetato que es el intermediario del ciclo de Krebs. 
Vector lanzadera
Permite la propagación en células de 2 o más especies. Tiene señales que le permite reconocer la bacteria para hacer el clonado y amplificar el vector, además presenta señales para introducirlo en células eucariotas y expresar una proteína. 
En la imagen vemos un vector que contiene un gen que codifica para la proteína fluorescente amarilla, en el 5´MCS y 3´MCS se encuentra el sitio se clonado donde ubico mi gen de interés y cuando se lea obtendré la proteína funcional amarilla. Encontramos un promotor Lac, gen que le confiere resistencia a la ampicilina y el Ori, f
Transformación de células procariota
Se dice que la célula es competente cuando la bacteria incorpora el gen foráneo. ¿Qué métodos se utilizan para transformar bacterias?
1) ßCaCl2 frío, y luego shock térmico a 42 C (2 min): esto produce la apertura de poros en la membrana. 1 célula transformada cada 1000 células 
Eficiencia de la transformación es aprox 107 a 108 colonias transformadas por µg de DNA plasmídico.
2) Electroporación: campo eléctrico de alto voltaje. Produce permeabilización de la membrana 109 colonias transformadas por µg de DNA plasmídico pequeños y 106 para plásmidos más grandes. También para BAC.
3) Conjugación, necesitamos un vector conjugativo, es decir, tiene señales que permiten la unión célula-célula. El gen de interés se ubica en una célula movilizable, al tener estos tipos células con célula F- y F+, el vector conjugativo en la célula F+ crea unión célula-célula para el pasaje hacia la célula F- transformándola en F+
Transfección de células eucariotas
Hablamos de transfección cuando la célula incorpora el vector recombinante ¿Qué métodos se utilizan para transfectar células? 
1) Por entrada directa: electroporación, microinyección (individual), “gene gun” (o biobalística, disparo de partículas de oro recubiertas de ADN hacia la célula utilizando altas presiones de gas) puede suceder que por el mismo disparo las células se rompen. EFICIENTE. 
2) Moléculas que actúan como carriers: fosfato de calcio (produce la precipitación del vector en la membrana para ser endocitado), dextrano DEAE, liposomas (este interacciona con la membrana e ingresa a la célula). POCO EFICIENTE 20%
3) Por vectores virales: lentivirus, adenovirus, retrovirus (alta eficiencia de transfección). MUY EFICIENTE. 
Vectores virales = tiene un ARN que cuando infecta a la célula por la transcriptasa reversa se transcribe el ARN → ADN y por una integrasa se integra en el núcleo. Aunque no puedo regular en qué sitio del genoma es introducido el gen, entonces puede suceder que se altere otro gen esencial para la célula. 
¿Dónde se inserta el gen? Los genes gag, pol y env, que le permiten replicarse al virus en el huésped y formar las partículas víricas, son reemplazados por el DNA foráneo. Si el virus sigue conservando secuencias LTR le permitirán integrarse al genoma y las secuencias psi le sirven para el empaquetamiento en partículas víricas. 
¿Qué tipos de virus encontramos?
· Retrovirus → DNA inserto hasta 8 kpb
· Baja eficiencia de transfección.
· Células en proliferación solamente. 
· Integración en el genoma del huésped al azar (expresión estable)
· No produce respuesta inmunitaria
· Expresión a largo plazo 
· Adenovirus (replicación-deficiente) → DNA inserto hasta 20 kpb
· DNA lineal de doble cadena de aprox 36 kb. Carecen de un mecanismo que permita su integración en el genoma del huésped, por ende el gen es expresado por un corto tiempo (expresión transiente)
· células que no se dividen y en división
· Induce respuestas inflamatorias y tóxicas 
· Lentivirus (HIV) (retrovirus)
· Infectan las células sin formar viriones.
· Pueden infectar células que no se dividen.
· Persisten toda la vida porque se integran al genoma del huésped al azar y evaden el sistema inmunitario (alto grado de mutación)
· Adeno-asociado virus
· Genoma pequeño (5 kb)
· Replicación-deficiente
· En ausencia del helper, se integra al cromosoma del huésped.
· Usado para terapia génica 
· Baculovirus
· Infectan insectos 
· Expresión transiente
La estructura de la proteína recombinante debe ser lo más parecida posible a la proteína natural
Objetivos de la expresión de proteínas en la producción industrial:
· Fermentación segura y bajo control
· Bajo costo
· Alto nivel de proteína recombinante (g/L y no mg/L) 
· Facilidad de recuperar proteínas expresadas
· Que la proteína expresada no se degrade
Sistema de expresión: 
	VENTAJAS 
	DESVENTAJAS
	Escherichia coli (bacteria)
	· Productividad en el orden de g/L
· Alta tasa de crecimiento
· Bajo costo de cultivo 
· Amplio conocimiento de su genética y fisiología 
· Gran variedad de vectores
· Altísima eficiencia de transformación 
· Alta acumulación de proteínas recombinantes (30% del total celular) 
· Fermentaciones muy bien conocidas 
· Recuperación y lisis celular muy sencilla
	· Dificultad plegamiento proteico 
· Limitada capacidad de formación de puentes S-S - 
· Dificultad de obtención de proteínas solubles
· Imposibilidad de realizar modificaciones post-traduccionales 
· Producción de endotoxinas contaminantes (pirógenos) 
· Casi imposible de excretar al medio extracelular 
· Formaciòn de cuerpos de inclusión: agregados insolubles de proteína. Se forman con proteínas muy hidrofóbicas, o que no se pliegan bien en la bacteria. También cuando el nivel de expresión es demasiado elevado.
	Bacillus subtilis (bacteria)
	· Rendimientosde expresión muy altos (>10 g/L) 
· Fermentaciones sencillas
· Secretan proteínas al medio de cultivo. Se reducen los riesgos de contaminación proteínas del huésped
· Fácil de manipular
	· Rango limitado de vectores 
· Los vectores optimizados son privados
· No glicosila
	Levaduras
	· Organismos unicelulares eucariotas de fácil crecimiento (y bajo costo) y manipulación, con genoma bien conocido. 
· Facilita el plegamiento de proteínas 
· Secreción de proteínas
· No libera endotoxinas (pirógenos)
· No degrada la proteína heteróloga
· Ciertas modificaciones post-traduccionales: glicosilación, acetilación, fosforilaciones, procesamiento proteolítico de precursores
· Adaptables a fermentación a gran escala y bajo costo 
· Rendimiento moderado.
	· Hiperglicosilación
· Eficiencia de transformación baja-media 
· Un rango limitado de vectores 
· Genes expresados se deben incorporar de manera estable
	Insectos
	· Glicosilación (excepto galactosa y ácido siálico) 
· Escalable a volúmenes grandes
· Muy altos niveles de expresión: el P de poliedrina es fuerte 
· Capacidad de incorporar grandes inserciones de ADN, de hasta 100 kpb 
· Capacidad de splicing. 
· Simplicidad de tecnología. 
	· Un sistema de transformación altamente específico (Baculovirus) 
· Cultivo fastidioso 
· Tiempo de crecimiento muy lento (tiempo de doblaje es 20 h)
· Altos costos de cultivo
	Mamíferos (más ideal)
	· Secreción extracelular 
· Modificaciones post-traduccionales
· Glicosilación bastante precisa
	· Productividad en el orden de g/L a mg/L 
· Alto costo
· Lento crecimiento y requerimiento nutricionales complejos
· Muy susceptibles a contaminación
· Muy sensibles al estrés 
Resumiendo las comparaciones en esta imagen:
Factores que influyen sobre la expresión de proteínas:
1) Célula huésped
2) Vector de expresión
3) Condiciones de cultivo/inducción
Cambiando 1 o más factores influye drásticamente en los niveles de expresión, en la solubilidad y en la estabilidad de la proteína de interés. No hay una estrategia simple para obtener la máxima expresión de una proteína, tener en cuenta: 
· Secuencias del P y terminador de transcripción 
· La fuerza del sitio de unión de ribosomas 
· El número de copias del gen clonado 
· Si el gen queda en el plásmido o se integra al genoma del huésped 
· La localización celular final de la proteína foránea sintetizada 
· La eficiencia de la traducción en el huésped 
· La estabilidad intrínseca de la proteína codificada en el huésped
¿Cómo encontramos el gen de interés?
· Genotecas genómicas → presenta el vector con el genoma completo
· Genoteca de cDNA → son vectores que tienen inserto el ADN que es copia de un ARNm que se expresa en la célula. 
Se utilizan las genotecas porque encontrar lo que buscamos es como buscar una aguja (gen) en un pajar (genoteca), 
¿cómo se construye una biblioteca genómica? El genoma completo de un organismo particular se corta en millares de fragmentos y todos esos fragmentos son clonados por inserción en un vector de clonación (fagos, BAC, YAC). Cada uno ellos tiene una porción del genoma, obteniendo la libreria 
¿Cómo se construye la biblioteca de cDNA? Es una genoteca que sólo contiene los genes que se expresan, o sea, que se transcriben en ARN. Carece de las secuencias no codificantes. Por ende la proteína puede expresarse en procariotas, (que no pueden remover los intrones). 
Se aisló el ARNm molde, se lo híbrida con un oligonucleótido y en presencia de la transcriptasa reversa + nucleótidos, se sintetiza la hebra de ADN complementaria a la hebra de ARNm aislado, entonces el híbrido ARNm + ADN se pone en presencia de álcali quedando el ADN monohebra y la ADN polimerasa termina sintetizando la hebra complementaria obteniendo el ADN copia del ARNm. 
¿Qué biblioteca utilizo entonces? cDNA!! En la genómica encontramos el gen completo con intrones y exones, pero el cDNA solamente está la secuencia codificante entonces me aseguro de que la proteína se va a expresar:
Ventajas:
· Enriquecida en fragmentos provenientes de los genes transcriptos en forma activa
· Los intrones no interrumpen las secuencias clonadas 
Desventajas: 
· Contiene sólo secuencias presentes en ARNm maduro. Intrones, secuencias de promotores y reguladores ausentes. 
· La frecuencia de una secuencia de ADN particular depende de la abundancia del ARNm correspondiente en el tejido
¿Qué vector contiene nuestro gen de interés? Se identifica utilizando SONDAS, podemos utilizar:
· Oligonucleótido (tag), cadena corta de AN que híbrida con el ADN buscado, este se encuentra marcado
· Sonda de cDNA
· Anticuerpo, el vector debe ser capaz de expresar la proteína para poder utilizarlo
· Un sustrato para medir la actividad enzimática, el vector debe ser capaz de expresar la proteína para poder utilizarlo. 
Hibridación del ADN
Compramos primers (30 pb) que tienen una secuencia complementaria al ADN de interés, presentan una marca (marcado con *) que la enfrentarla con el ADN que esta desnaturalizado se híbrida y enfría rápidamente, entonces la sonda híbrida en su secuencia complementaria y al tener un tag puede identificarse. 
En la imagen de abajo se muestran placas con colonias de bacterias que crecieron en un medio selectivo, se les pone un papel de nitrocelulosa sobre la placa para que queden adheridas al papel, se tratan con álcali para la ruptura de las células y ADN desnaturalizado y se lo expone a las sondas complementarias que presentan una marca fucsia. 
¿Cómo se obtiene la sonda cuando el gen no ha sido aislado? En caso de no conocer la secuencia de mi gen de interés, puede:
1. utilizar un gen proveniente de otro organismo para determinar aproximadamente la sonda teniendo en cuenta esa secuencia, ej: busco gen de insulina utilizo gen de vaca. 
2. a partir de la secuencia de la proteína, ej: la secuencia de la proteína me fijo que triplete codifica para cada aa, entonces diseño una sonda en la zona de menor degeneramiento, es decir, donde haya menores variaciones en los tripletes que codifican para los aa. 
3. bancos de datos de ADN (info de genes de gran variedad de organismos)
Complementación génica
Tengo una cél. deficiente en un gen que es el de interés. Ej: gen de interés dihidrofolato reductasa, utilizo células que no tengan ese gen entonces al transformarla/transfectarla (depende si uso procariotas o eucariotas) con cada vector, solo viven aquellas que incorporan el gen de la dihidrofolato reductasa al ponerla en un medio sin nucleótidos. Aquellas que incorporaron otros vectores sin ese gen no sobreviven.
Proteínas modificadas
Al alterar la estructura de un gen se pueden obtener proteínas modificadas ¿para qué? para estudiar la estructura en relación a la función y/o obtener proteínas con mejores o nuevas propiedades:
· Modificación en la Km y Vmax para mejorar la eficiencia catalítica de una enzima 
· Cambios en la estabilidad térmica y pH 
· Modificación en la reactividad de una enzima 
· Modificación de la unión del sustrato a una enzima 
· Aumento de la estabilidad de una proteína a proteasas 
· Alteración de la regulación alostérica de una enzima
Este tipo de modificaciones se lleva a cabo por mutagénesis dirigida
Mutagénesis dirigida
Consiste en incorporar mutaciones en lugares determinados del gen. 
Secuencia de ADN corta
Yo tengo el vector recombinante con el gen de interés, una secuencia corta de nucleótidos se corta con enzimas de restricción y es reemplazada por un oligonucleótido sintético corto que contiene la secuencia mutada deseada. Al expresarse tengo la mutación incorporada.
Un único aminoácido
Puedo generar un cambio de 1 solo AA cambiando una única base de la secuencia del gen de interés. Vuelvo a tener en la imagen el plásmido con el gen de interés, entonces se diseñan primers donde cambió una única base, el plásmido se desnaturaliza y se aparea con los primers que se aparean por complementariedad de bases, luego la ADN polimerasa termina de sintetizar la hebra y se digiere el molde de ADN quedando el vector con la mutación incorporada en una sola base. Se transformanlas células quienes intentan reparar esa mutación, entonces tengo 50% población reparada y 50% incorporada ¿cómo las selección? hibridación de sonda que contiene la mutación. 
Utilizando PCR
· La mutación se introduce en la MITAD de la secuencia del primer
· Mutación: puntual, deleción o inserción 
Es necesario conocer la secuencia del DNA, este es un método muy facil ya que desde el primer puedo incorporar la mutación.
Animales transgénicos
Albergan y expresan genes que fueron introducidos en su línea germinal. Esto permite estudiar la relación estructura-actividad ¿cómo se introduce el ADN extraño?
1) Vectores retrovirales que infectan las células de un embrión en un estadío temprano previo a la implantación en una hembra receptiva. 
PROBLEMA: tamaño < 8kpb y requiere de un helper para poder ser incorporado, puede suceder que el helper se incorpore al genoma; suelen utilizarse lentivirus. 
2) Microinyección en el núcleo del espermatozoide de un huevo fertilizado. 
A la hembra se le da un tratamiento para que produzca gran cantidad de óvulos (35 óvulos), luego se produce el apareamiento y se sacan los embriones, en el núcleo del macho se hace la microinyección del transgen (ADN lineal), así los huevos son implantados en una hembra pseudopreñada ya que tiene el útero preparado para implantación. Solo 5% de los huevos inoculados progresan a un animal transgénico. 
3) Introducción de células madres (stem cells) embrionarias modificadas genéticamente en un embrión antes de la implantación en una hembra receptiva. 
Se toman los blastocistos, se sacan las células y éstas se transfectan con el transgen. Se las pone en un medio selectivo para enriquecer las células con el transgen y luego vuelven a ser implantadas en el blastocisto.
Este método es útil para silenciar un gen y obtener un animal KO.
Silenciamiento de genes: animal KO
El ADN incorporado contiene una mutación que desactiva un gen. Permite estudiar la función de un gen determinado. En la imagen tenemos el cromosoma del animal, por ejemplo, presenta 5 exones del gen que quiero silenciar (supongamos que hablamos del gen de insulina); el vector que voy a incorporar por las stem cells tiene otro gen al mismo nivel del gen de insulina bloqueando los exones 2-4, por recombinación homóloga el gen sMG bloquea la expresión del gen que deseo obteniendo así un animal KO. 
Proteínas de fusión (proteína + Tag)
Las fusiones permiten:
1) Direccionar la localización de proteínas de fusión en bacterias:
a) Periplasma: fácil purificación, pocas proteínas contaminantes, ambiente favorable para el buen plegamiento y la formación de puentes disulfuro. 
b) Secreción al medio: pocas proteínas contaminantes, fácil purificación. 
2) Direccionar la proteína a diferentes compartimentos celulares.
3) Aumentar la vida media de la proteína.
4) Purificación de la proteína recombinante 
5) Aumentar la solubilidad de las proteínas de fusión.
6) Investigar interacción proteína-proteína
7) Localización de proteínas en células eucariotas por fusión a proteínas o Tags fluorescentes (microscopía de fluorescencia) o Tags contra los que hay anticuerpos comerciales (inmunofluorescencia).
Cuando se genera una proteína de fusión hay que tener en cuenta:
· Perturbación de la fisiología celular
· Función y estructura proteica.
· Expresión proteica 
· Localización celular 
· Cambio en la vida media
Obtención de una proteína de fusión
En la imagen se muestra un vector que tiene un gen que codifica para una proteína marcada en color amarillo, y la proteína de interés será insertada en el marco de lectura antes del gen que codifica para un gen YFP (proteína fluorescente amarilla). Entonces cuando se transcribe y traduce, se expresa la proteína fusionada a la YFP. 
Si se trabaja con un receptor, tengo el receptor de membrana fusionado a la YPF. En la imagen de microscopía confocal de las células CHO se aprecia un color blanco la proteína fluorescente que estaría marcando la presencia de la proteína de interés dentro de la célula. 
Investigación de interacción proteína-proteína
Ej: un receptor se fusiona a la mitad de una YFP y otro receptor se fusiona a la otra mitad de la YFP, si ambos receptores interaccionan se forma un barril como muestra la imagen y recién a esa altura emite fluorescencia. Las imágenes muestran como se ve cuando está solo la mitad de la proteína unida y no hay fluorescencia, a diferencia de cuando interaccionan las proteínas se muestra fluorescencia y cada punto denota la interacción entre los 2 receptores → técnica de complementación de fluorescencia bimolecular. 
FRET (transferencia de energía resonante), consiste en la transferencia de energía de una proteína a la otra .
¿Qué se necesita para que haya FRET? 
1) Sólo si la emisión de la 1, a quien llamaremos donor, coincide con la absorción de la 2, a quien llamaremos aceptor. Si hay FRET, observo una disminución en la emisión de fluorescencia del donor (D) y un aumento en la emisión de energía del aceptor (A).
2) Además de esto, la distancia entre las proteínas que interaccionan debe ser <10nm.
3) la orientación de los dipolos deben ser paralelos para que haya transferencia de energía. 
El FRET puede ser intramolecular o intermolecular, el primero me permite observar:
· Cambios de conformación de proteína
· Medir actividad enzimática
· Como biosensor
Ejemplo con AMPc, sin presencia de AMPc la proteína presenta una conformación que permite el acercamiento entre el donor y aceptor para que se produzca FRET, en presencia de AMPc este se une al receptor cambiando su conformación y alejando al donor del aceptor dejando de haber fluorescencia.
Puede suceder que no se veo FRET pero no quiere decir que no hay interacción, ya que si la orientación de los dipolos no es adecuada no hay FRET por más que estén interaccionando.