Biologia de los microorganismos (521)

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I N G E N I E R Í A G E N É T I C A Y B I O T E C N O L O G Í A 343
U
N
ID
A
D
 2
réplica en placa para obtener un duplicado de la placa madre 
original en un filtro de membrana sintético, y todas las mani-
pulaciones posteriores se hacen sobre este filtro. Las colonias 
duplicadas se lisan para liberar el antígeno de interés. A con-
tinuación se añade el anticuerpo, que reacciona con el antí-
geno. El anticuerpo que no se ha unido se elimina por lavado 
y se añade un reactivo radiactivo específico que se une al anti-
cuerpo. Se coloca una película de rayos X sobre el filtro y se 
expone. Las colonias radiactivas aparecen como manchas en 
la película de rayos X revelada (Figura 11.8b). La localización 
de las manchas en la película corresponde a la de cada colonia 
que produce la proteína en la placa original. A continuación se 
puede tomar dichas colonias de la placa y hacer subcultivos.
Una limitación a este método es que debe disponerse de un 
anticuerpo específico, que se obtiene inyectando la proteína 
antigénica específica en un animal. Pero para tener éxito, la 
proteína inyectada debe ser pura; de lo contrario, se formarán 
anticuerpos contra múltiples antígenos, lo que provocará resul-
tados falsos positivos. Como es de esperar, estos resultados difi-
cultan el proceso de selección de los clones correctos. 
MINIRREVISIÓN
 ¿Cuál es el propósito de la clonación molecular?
 ¿Cuáles son las funciones de un vector de clonación, de las 
enzimas de restricción y de la DNA-ligasa en la clonación 
molecular?
 ¿Cómo se pueden identificar los genes clonados?
11.5 Métodos moleculares 
de mutagénesis
Como ya hemos visto, los mutágenos convencionales introducen 
mutaciones al azar en el organismo intacto (  Sección 10.4). En 
cambio, la mutagénesis in vitro, más conocida como mutagénesis
dirigida, utiliza DNA sintético y técnicas de clonación de DNA 
para introducir mutaciones en genes en sitios concretos. Además 
de cambiar solo una o unas pocas bases, las mutaciones también 
pueden manipularse mediante la inserción de fragmentos grandes 
de DNA en ubicaciones determinadas de forma precisa.
Síntesis de DNA
Se pueden sintetizar artificialmente fragmentos de DNA para 
usarlos como cebadores o sondas para la reacción en cadena de 
la polimerasa, la hibridación de ácidos nucleicos, o para obte-
ner mutaciones de interés en ubicaciones específicas dentro de 
un gen o regiones reguladoras. Actualmente hay oligonucleó-
tidos de entre 12 a 40 bases disponibles comercialmente, y se 
pueden sintetizar oligonucleótidos de hasta unas 100 bases si es 
necesario. También es posible sintetizar genes enteros si la pro-
teína codificada es pequeña (menos de 600 bp), por ejemplo, las 
subunidades de la insulina (Sección 11.11).
El DNA se sintetiza in vitro mediante un método automati-
zado en fase sólida en el que el primer nucleótido de la cadena 
se sujeta a un soporte insoluble, como esferas diminutas de cris-
tal poroso. Para añadirle cada nucleótido son necesarios varios 
pasos, y la reacción química es complicada. Una vez comple-
tada cada fase, la mezcla de reacción se elimina del soporte 
el antígeno (  Sección 24.4). En este caso la proteína codifi-
cada por el gen clonado es el antígeno. Como el anticuerpo se 
combina específicamente con el antígeno, la localización colo-
nias que contienen el antígeno se puede hacer observando la 
unión del anticuerpo. Dado que solo una pequeña cantidad del 
antígeno está presente en cada colonia, solo se une una pequeña 
cantidad de anticuerpo, de modo que hay que disponer de un 
método de alta sensibilidad para detectar el anticuerpo unido. 
En la práctica, la detección se lleva a cabo con radioisótopos, 
compuestos químicos fluorescentes o enzimas. Estas y otras 
técnicas para detectar antígenos se describen en el Capítulo 27.
En la Figura 11.8b se muestra un esquema del método de 
detección con anticuerpos. Se utiliza el método de siembra de 
Figura 11.8 Búsqueda del clon correcto. (a) Método para detectar
clones recombinantes por hibridación de las colonias con una sonda radiactiva 
de ácido nucleico. La formación de un DNA dúplex une la sonda de DNA a una 
mancha concreta de la membrana. (b) Método para detectar la producción de 
proteínas usando un anticuerpo específico que contiene una señal radiactiva o 
fluorescente. 
Células parcialmente 
lisadas; adición de 
anticuerpos 
específicos; adición 
de agente para 
detectar anticuerpos 
unidos con marcaje 
radioactivo
Bacterias lisadas y DNA 
desnaturalizado; adición 
de sonda (radiactiva) de 
RNA o DNA; lavado para 
eliminar la radiactividad 
no unida
Colonias
transformantes
creciendo sobre aga
Réplica en placa
sobre filtro de
membrana
(a) (b)
Autorradiografía para
detectar la radiactividad
Colonias
positivas
Película
de rayos X
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