Biologia de los microorganismos (525)

Vista previa del material en texto

I N G E N I E R Í A G E N É T I C A Y B I O T E C N O L O G Í A 345
U
N
ID
A
D
 2
se utilizan en una gran variedad de experimentos. Se pueden 
usar para indicar la presencia o ausencia de un elemento gené-
tico particular (como un plásmido) o de DNA insertado en un 
vector. También se pueden fusionar con otros genes o con el 
promotor de otros genes para estudiar su expresión. 
El primer gen usado de manera generalizada como gen 
reportero fue el gen lacZ de Escherichia coli, que codifica la 
enzima �-galactosidasa, necesaria para el catabolismo de la 
lactosa (  Sección 7.3). Las células que producen �-galacto-
sidasa son fáciles de detectar por el color de sus colonias en 
placas indicadoras que contengan el sustrato artificial Xgal 
(5-bromo-4-cloro-3-indolil-�-d-galactopiranósido). El Xgal es 
escindido por la �-galactosidasa y produce un color azul (véase 
la Figura 11.14). La proteína de fluorescencia verde (GFP) 
es muy utilizada como proteína reportera (Figura 11.11). El gen 
de la GFP se clonó inicialmente de la medusa Aequorea vic-
toria, pero se puede expresar en la mayoría de las células. Es 
dirigida como se muestra en la Figura 11.9. Los casetes utili-
zados para sustituir secciones de genes normalmente son del 
mismo tamaño que los fragmentos de DNA de tipo salvaje a los 
que sustituyen.
Otro tipo de mutagénesis por inserción de casete es la que se 
llama interrupción génica. En esta técnica, los casetes se inser-
tan en medio de un gen e interrumpen así la secuencia codifi-
cadora. Los casetes utilizados para las mutaciones por inserción 
pueden tener casi cualquier tamaño, e incluso contener un gen 
entero. Para facilitar el proceso de selección, es frecuente utilizar 
casetes que codifiquen resistencia a algún antibiótico. El proceso 
de interrupción génica se ilustra en la Figura 11.10. En este caso, 
un casete de DNA que contiene un gen que confiere resistencia a 
la kanamicina (el casete Kan) se inserta en un sitio de restricción 
en un gen clonado. A continuación se linealiza el vector que con-
tiene este gen mutante cortándolo con una enzima de restricción 
diferente para impedir su replicación. Por último, el DNA lineal 
se transforma en el hospedador y se selecciona la resistencia a 
la kanamicina. El plásmido linealizado no puede replicarse, de 
modo que las células resistentes se producen principalmente por 
recombinación homóloga (  Sección 10.5) entre el gen mutado 
en el plásmido y el gen de tipo salvaje en el cromosoma.
Obsérvese que cuando se inserta un casete, las células no 
solo adquieren resistencia a antibiótico, sino que además pier-
den la función del gen en el que se ha insertado el casete. Estas 
mutaciones reciben el nombre de mutaciones de desactivación 
(knockout en inglés). Son semejantes a las mutaciones por inser-
ción causadas por transposones (  Sección 10.11), pero aquí 
se elige qué gen mutará. Las mutaciones de desactivación en 
organismos haploides (como los procariotas) producen células 
viables solo si los genes interrumpidos no son esenciales. De 
hecho, la desactivación génica se usa con frecuencia para inves-
tigar si un gen determinado es esencial o no.
MINIRREVISIÓN
 ¿Por qué se utiliza un soporte sólido durante la síntesis 
química de DNA?
 ¿Por qué es útil la mutagénesis dirigida para los enzimólogos?
 ¿Qué son las mutaciones de desactivación?
11.6 Fusiones génicas y genes 
reporteros
La manipulación in vitro del DNA ha revolucionado el estu-
dio de la regulación génica. Se puede formar un gen híbrido 
mediante la fusión de una secuencia codificadora de una pro-
cedencia determinada (el gen reportero) la región reguladora 
de otra. Estas fusiones de genes se utilizan con frecuencia para 
estudiar la regulación génica (  Sección 7.1), particularmente 
cuando el analísis de los niveles de un producto génico natura-
les es dif ícil, costoso o lleva mucho tiempo. Estas fusiones pue-
den servir también para aumentar la expresión de un producto 
génico de interés.
Genes reporteros
La propiedad fundamental de un gen reportero es que codifica 
una proteína fácil de detectar y de ensayar. Los genes reporteros 
Figura 11.10 Interrupción génica por mutagénesis de casete. (a) Una
copia de tipo salvaje clonada del gen X, contenida en un plásmido, se corta 
con EcoRI y se mezcla con el casete de kanamicina. (b) El plásmido cortado y 
el casete se unen para crear un plásmido con el casete de kanamicina como 
una mutación por inserción dentro del gen X. Este nuevo plásmido se corta 
con BamHI y se transforma en una célula. (c) La célula transformada contiene 
el plásmido linealizado con un gen X interrumpido y su propio cromosoma 
con una copia de tipo salvaje del gen. (d) En algunas células, se produce 
recombinación homóloga entre las formas de tipo salvaje y mutante del gen 
X. Las células que pueden crecer en presencia de kanamicina tienen solo una
copia del gen X que está desactivada.
https://booksmedicos.org
	booksmedicos.org
	Botón1: