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Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. Transferencia de embriones bovinos in vitro (Revisión de literatura) Transfer of bovine embryos in vitro (Review of literatura) Juan José Sánchez Tirado Estudiante Seminario de Profundización en Reproducción Bovina Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Cooperativa de Colombia, Sede Ibagué http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. Juancho.950710@hotmail.com RESUMEN El mejoramiento genético en el ganado bovino ha tenido un gran crecimiento debido a las demandas de producción y nutricionales por parte del ser humano queriendo día a día tener alimentos de gran calidad. Se han generado diversas metodologías para aumentar la carga animal entre las cuales una de las más importantes es la del sexaje de embriones que surge para reproducir una mayor cantidad de animales de buena genética en un menor tiempo además de disminuir el intervalo entre generaciones y aumentar el proceso de selección alcanzado un gran número de progenie de donadoras valiosas que permitirá incrementar la producción animal. PALABRAS CLAVES: sexaje, embriones, citometria de flujo. ABSTRACT The similar genetic improvement in cattle has had DUE Great Growth Demands and nutritional Production by Human Being wanting Day to Day Having high-quality food. Have the generated several methodologies to increase Is the load Among the animals which one of the most important is that of sexing embryos wave paragraph Play A mayor number of animals of good genetic in less time: In addition to decreasing the interval between augmenter generations and the selection process achieved a great number of valuable donor Progenie which will increase animal production. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. KEYWORDS: sexing, embryos, flow citometry INTRODUCCION Las tecnologías de reproducción animal han llegado a su mejor momento en mercados nacionales e internacionales para mejorar las especies para el mercado y gustos del consumidor. La transferencia de embriones en ganado bovino tiene como énfasis reproducir una mayor cantidad de animales de buena genética y fenotipo en un menor tiempo. Las tecnologías de transferencia de embriones han mejorado las expectativas de producción de ganado de leche y carne a nivel nacional e internacional con el fin de mejorar los hatos para conseguir mejores rendimientos y mejor beneficio económico (1). El éxito económico de los programas de transferencia de embriones está en la genética utilizada, manejo de ganado, administración y mercadeo. Seleccionar la vaca ganadora, el toro apto para el cruce, el manejo de la receptora, programas de sincronización y súper ovulación, la educación y capacitación técnica del personal para atender el manejo y la crianza de animales superiores, son los factores que afectan el resultado, costos y beneficios de los programas de transferencia (1). En los últimos años los programas de transferencia han crecido demasiado en los estados unidos, Brasil y Colombia. La aplicación de esta tecnología se realiza en http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. ganado de leche y carne por la alta demanda de productos lácteos y cárnicos en el mundo (2). La inseminación artificial es utilizada para aumentar la descendencia de toro de gran valor, la transferencia de embriones es empleada para incrementar la producción de ternero de las mejores vacas. Puede usarse para inducir gestaciones gemelares, acelerar un programa de selección o para exportar animales a diferentes países y eliminar el problema de adaptación a diferentes climas a través del mejoramiento genético (3). FACTORES INFLUYENTES EN LA TRANSFERENCIA DE EMBRIONES IN VITRO Hay diferentes tipos de factores que pueden influir en un programa de transferencia de embriones como por ejemplo el protocolo a utilizar, las hormonas con las que se trabaje, la nutrición, la raza, la edad, el clima, el manejo. Todos estos aspectos pueden afectar o mejorar un programa de transferencia de embriones (1). Las hormonas tienen que ser aplicadas en las cantidades indicadas, momentos y forma adecuada. La persona encargada debe estar bien capacitada ya que estas hormonas se aplican de forma intramuscular (4). En el aspecto nutricional es una condición corporal óptima para trabajar una vaca y tener resultados efectivos, en el ganado de carne es de 5 a 6 y en el ganado lechero http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. es de 2.5 a 3 una vaca muy gorda acumula demasiada grasa subcutánea y alrededor de los ovarios lo que afecta las drogas utilizadas (5). El estado nutricional de la vaca donante afecta la tasa de ovulación y fecundación como la viabilidad de los embriones. El estado nutricional de las vacas receptoras es menos críticas que las donantes (6). Las razas cebuinas (bos inducus) necesitan menor cantidad o dosis de drogas como la FCH que las razas europeas (bos Taurus) (7). Las razas europeas tienen menor respuesta en la recuperación de embriones después del protocolo de súper ovulación, en comparación de la raza ovina (8). Hay beneficios en las vacas lecheras por su docilidad debido a que estas están en mayor contacto con las personas en cambio las de carne están menos acostumbradas al manejo y no son tan dóciles siendo sensibles al estrés (8). La edad, el ambiente son factores que también pueden influir drásticamente en la cantidad y la calidad del embrión. Una vaca que no se encuentre en una condición optima gastara mucha más energía en su adaptación que en la producción de embriones (9). TRANSFERENCIA IN VITRO http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. Un desarrollo muy importante en la biotecnología fue la producción in vitro de embriones bovinos la cual aseguran una alta preñez cuando son transferidos a hembras receptoras obteniendo nacimientos de crías optimas y saludables (10). El primer informe del nacimiento de un ternero con la técnica de producción in vivo fue en 1970 y se llevó a cabo por Sreenan. No se reportó ningún informe de animales producidos por fecundación in vitro, la técnica en producción in vivo fue muy utilizada en los años 70 a principio de los 80 se produjo un becerro por fertilización in vitro. La primera ternera que nació por fertilización in vitro peso 45kg y no presentó ninguna anomalía desde entonces las tecnologías mejoraron ya que las fertilizaciones eran viables en condiciones artificiales (11). Hay dos formas para la recolección de ovocitos, los cuales pueden ser recuperados de ovarios que provienen de animales de mataderos o de animales vivos a través de una técnica llamada aspiración folicular. Los ovarios son recolectados de hembras sacrificadas y luego aspirados para obtención de folículos que deben tener un diámetro entre 3 y 6 ml (12). Esta técnica es útil para un último aprovechamiento de hembras sacrificadas por motivos sanitarios, accidentes u otros (13). de cada vaca se pueden obtener de 15 a 20 óvulos lo que permitirá obtener de 2 a 6 óvulos para transferir (14). El uso de la tecnología de aspiración folicular y de aspiración in vitro unos científicos en 1998 obtuvieron entre 0.6 y 3.5 embriones con un promedio de 1.5 embriones por semana. Dayan et consiguieron 1.48 preñeces por procedimiento en 937 secciones de aspiración folicular practicada a 321 animales en conclusión una http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. donadora que es sometida a aspiraciones foliculares semanalmente la velocidad de multiplicación de su linaje es muy acelerada (15). Las técnicas de aspiración in vitro son modelos que se pueden utilizar en varios tipos de vacas por ejemplo las novillas, vacas vacías, vacas de primer tercio y las vacas seniles. Además, estas técnicas se pueden implementar en vacas con problemas reproductivos (16) (17). ASPIRACIÓN FOLICULAR La técnica de fecundación in vitro consiste en cinco fases básicas para para preparación de los ovocitos y embriones. La primera de ellas es la aspiración de ovocitos en la cual se recuperan de hembras vivas por una punción transvaginal guiada por un ecógrafo especial para este tipo de procesos (18). la aspiración se realiza por medio de un equipo de ultrasonido aloka SDD 500 con un transductor microconvexo de 5 mHz el cual es adaptado o una guía de bioxida Chuck bolland. La aspiración de los folículos se realiza con agujas de calibre 18 conectada a un tubo de estéril de 50ml mediante una conducción de teflón. El equipo de aspiración se completa con una bomba de vacío accionada por un pedal que aplicara una aspiración de 50 a 53 mm Hg (20ml/minuto) (19). Luego de la aspiración folicular, el contenido aspirado es lavado y filtrado por medio de unos filtros especiales para la recolección, conteo y selección de los ovocitos por medio de microscopios y micropipetas. Después de ser seleccionados son clasificados de acuerdo a su morfología, los criterios de clasificación son de acuerdo al número de camadas de cúmulos y aspecto del citoplasma (20). Los ovocitos se clasifican en cinco http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. categorías, la primera categoría son ovocitos con más de tres capas de células de cúmulos compactas y con citoplasma homogéneo uniformemente granulado, la categoría 2 son ovocitos con menos de tres capas de células del cúmulo y citoplasma generalmente homogéneo (21). La categoría 3 son ovocitos con una sola capa de células del cumulus y citoplasma de aspecto irregular con áreas oscuras (22). Categoría 4 ovocitos desnudos y la categoría 5 son ovocitos con cumulu expandido (22). El proceso de aspiración folicular en el ganado bovino vivo debe realizarse con una tranquilizarían del animal, además de una anestesia vía epidural para minimizar los esfuerzos y mejorar la manipulación. Se lava la región perineal para la eliminación de la contaminación luego se introduce el transductor hasta el fondo del saco vaginal y con la ayuda de la palpación rectal se ubican los ovarios frente al transductor para tener una buena vista de los folículos y poder comenzar la aspiración, se deben de aspirar los folículos con un diámetro mayor a 2 ml (19). SELECCIÓN OVÁRICA La vaca es un especie mono ovulatoria por lo que la mayor parte de los Ovocitos obtenidos tras la aspiración están destinados a degenerar. Esto hace necesario estimar la calidad de los ovocios antes de ser utilizados para la maduración in vitro, ya que solamente una parte de los mismos tienen la capacidad de ser fecundados y soportar el desarrollo embrionario (31). http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. La selección de los Ovocitos se realiza generalmente en base a tres criterios el diámetro del ovocito, el aspecto de su citoplasma y las características del cumulo que rodea. El diámetro de los Ovocitos condiciona su capacidad para madurar (18), de tal forma que los Ovocitos bovinos con un diámetro inferior a 120 um se encuentran todavía en fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad para madurar (27). Los Ovocitos rodeados por un cumulo compacto formado por varias capas de células, presentan mayores porcentajes de maduración, fecundación y de desarrollo hasta blastocistos, que los que carecen de cumulo o los que están rodeados solamente por la corona radiada (24). Se ha tratado de establecer una relación entre el aspecto del citoplasma y la competencia del ovocito para madurar, ser fecundado y soportar el desarrollo posterior (25). Asi se ha comprobado que los ovocito que presentan un citoplasma oscuro muestran una acumulación de lípidos y un bue potencial para el desarrollo, mientras que los que presentan un citoplasma palido tinen una baa densidad de orgánulos y escaso potencial de desarrollo. Por otra parte, cuando el citoplasma es negro, los Ovocitos están envejecidos y tienen un potencial para soportar el desarrollo muy bajo (26). Luego de la clasificación ovárica estos son lavados en soluciones de TMC 199 suplementado con 10 % de suero fetal bovino. Los ovocitos son introducidos en criotubos para un baño María que oscila entre los 30 a 34°C para después ser madurados y fecundados (19). http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. MADURACIÓN OVOCITOS La maduración de los ovocitos consiste en pasar del estadio de profase de MI hasta el de MII. Los ovocitos son transferidos a unas placas de maduración in vitro con micro gotas de medio TMC 199 suplementado con suero fetal bovino al 10%, 5ug/ml LH e,0,1 ug/ml de estradiol cubiertas con aceite mineral. Los ovocitos son encubados por 24 horas en atmosfera controlada con 5% CO2 y 100% de humedad (23). La teoría de la maduración consiste en que el ovocito complete la meiosis en respuesta al pico ovulatorio de LH en maduración in vitro. 24 horas es necesario para que el ovocito complete su maduración nuclear alcanzando el estadio de MII. También es muy importante que exista una maduración citoplasmática ya que esta prepara al ovocito para soportar la fertilización y aportar los nutrientes requeridos para el desarrollo embrionario. (28) Cuando los Ovocitos son aspirados desde los folículos reanudan espontáneamente la meiosis y al ser cultivados in vitro continúan con los procesos de maduración. La composición de los medios de cultivo y el ambiente controlado deben brindar un ambiente adecuado para que la maduración ocurra en 24 horas de un modo similar a lo que sucede in vivo durante más de dos ciclos estrales en el bovino. (29) FECUNDACIÓN http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. Obtenidos los ovocitos maduros se debe lograr la fecundación de los mismo, se incuban con los espermatozoides capacitaos en un medio tyroide, suplementado con fuentes energéticas como piruvato o lactato y albumina sérica (27). En la especie bovina la capacitación espermática se ve favorecida por incorporación de heparina al medio (28). Los espermtazoides que se requieran para fecundar deben estar vivos y móviles durante un periodo de 6 a 24 horas, luego de un proceso de selección y capacitación espermática que nos permita a su vez deshacernos de componentes del plasma seminal, crioprotectores y espermatozoides muertos o con escasa vitalidad. La capacitación espermática se logra exponiendo los espermatozoides vivos a concentraciones de heparina y cafeína, entre otras. Estas sustancias logran estimular el proceso de capacitación del espermatozoide que lo prepara para interaccionar y fecundar el ovulo (29). Los espermatozoides deben cruzar por un proceso de maduración el cual incluye la eliminación de todos los elementos presentes plasma seminal componentes del diluyente en caso de sémenes congelados descongelados y contaminantes. Este proceso se realiza mediantes técnicas basadas en la migración de los espermatozoides swin up, la centrifugación en gradientes de densidad percoll y filtración por una lana de vidrio. La maduración espermática habitualmente se establece en el tracto reproductivo, pero se puede realizar por medio de unos procedimientos los cuales incluyen incorporaciones (30). http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. Luego de maduración ovocitaria estos son cultivados con espermatozoides en medios especiales y en un ambiente controlado por estufas de cultivo por un tiempo comprendido de entre 5 a 24 horas dependiendo del protocolo (31). CULTIVO IN VITRO Existen tres categorías para los cultivos utilizados para los embriones. Los indefinidos, cuando se utiliza suero, cocultivo con células somáticas; semidefinidos cuando se omite el cocultivo y el suero se remplaza por albumina sérica y definidos, cuando el suero se remplaza por macromoléculas como el polivinil alcohol o la polivinil pirrolidona (32). Los primeros intentos de cultivar embriones bovinos in vitro se toparon con la dificultad de que los embriones no superaban la etapa 8 a 16 células, situación denominada BLOQUEO DE DESARROLLO (33), que no implicaba la muerte inmediata del embrión, pero que era irreversible. Para evitar este bloqueo se utilizó el cocultivo con células somáticas o los medios condicionados por dichas células (34). Y se suplementaron con suero (35). Sin embargo, con el tiempo se demostró que las aplicaciones de estos procedimientos de cultivo generaban diversos inconvenientes. En primer lugar, esta metodología que utilizaba medios indefinidos, dificulta notablemente el conocimiento de las necesidades de os embriones durante sus etapas de desarrollo temprano. Además, estas condiciones suponen un elevado riesgo de incorporar patógenos durante el cultivo. Por otra parte, diversos estudios han demostrado que la incorporación de suero al medio de cultivo es uno de los http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. principales factores responsables de la presentación del síndrome de exceso de volumen fetal y de a baja resistencia a la crio preservación de los embriones obtenidos (36). Diversos autores trataron de determinar los mecanismos a través de los cuales el cocultivo con células somáticas produce sus efectos beneficiosos y frutos de estos trabajos se establecieron varias hipótesis: producción de compuestos con actividad mitogenica para las células embrionarias , producción de sustancias que favorecen la diferenciación celular, eliminación o degradación de algunas sustancias embriotoxicas presentes en el medio de cultivo, modificación de algunas concentraciones de sustratos energéticos. No obstante, durante este mismo periodo se obtuvieron suficientes evidencias de que necesidad de utilizar un cocultivo con células somáticas era consecuencia de que las inapropiadas condiciones de cultivo utilizadas (composición del medio, atmosfera, gaseosa) (38) (39) (40). Así se ha podido comprobar que cuando las composiciones del medio de cultivo es adecuada y la tensión de O2 es reducida, es posible lograr elevados porcentajes de blastocistos en ausencia de células somáticas (41). Una vez comprobada la posibilidad de eliminar el cocultvo con células somáticas, el siguiente reto fue el tratar de eliminar otros componentes causantes de la indefinición del medio, suero o albumina sérica, sustituyéndolos por macromoléculas sintéticas. Los primeros estudios donde se demostró la posibilidad de cultivar los zigotos bovinos hasta blastocitos en un medio completamente definido, obteniendo de un pequeño número de gestaciones (42). http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. Los medios simples más utilizados para el cultivo de los embriones bovinos son: el fluido oviductual sintético, cuya composición fue establecida por Tervit 1972 en base a los componentes encontrados en el fluido oviductual ovino (43). Estos medios han sido suplementados con numerosos componentes al objeto de satisfacer las necesidades nutricionales de los embriones. El componente nuevo que más ha contribuido a incrementar la eficacia de estos medios simples son los aminoácidos esenciales y no esenciales (44). Sin embargo estos medios aun necesitan ser mejorados sensiblemente, puesto que el cultivo de los embriones producidos in vitro en el interior del oviducto incrementa notablemente la calidad de los mismos. Las células resultantes de la fertilización in vitro son cambiadas del medio de fecundación a un medio de cultivo embrionario donde los embriones continúan su división celular a 8, 16 y 32 células hasta llegar a mórulas y blastocitos. Al llegar a estos estadios, los embriones pueden ser trasferidos a vacas receptoras en fresco o congelados para su posterior uso. Durante esta etapa destacan la presencia en el medio de cultivo de diversas fuentes de energía como la glucosa y aminoácidos esenciales y no esenciales (44). Luego de la maduración in vitro, aproximadamente el 90% de los Ovocitos inmaduros puestos a cultivar alcanzan metafase II y expulsan el primer cuerpo polar. De estos aproximadamente el 80% son fecundados y comienzan a dividir, al menos, hasta el estadio de 2, 4 células. Sin embargo solo un 25 a 40 % alcanzan el estadio de blastocito o blastocito expandido. El cultivo embrionario corresponde al paso más http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. prolongado dentro del proceso, es el periodo que determina la eficiencia global del sistema asi como la calidad de los embriones obtenidos (25). Los componentes abióticos evaluados en un medio de cultivo son varios entre los cuales la osmolarida, esta es la capacidad que tienen los embriones de absorber agua del medio que se encuentran, para lograr el punto de equilibrio entre las sustancias disueltas en el medio y las presentes en el embrión. Esto induce en una estabilización de la presión osmótica (41). El pH sirve para evaluar el ambiente de los cultivos. La mayoría de los embriones de mamíferos cultivados in vitro poseen un pH neutro o ligeramente alcalino. Los porcentajes de CO2 y O2 deben ser similares a los encontraos en el oviducto de algunas vacas. Los más utilizados son 5% O2, 90% N2 y 5% CO2, para una excelente maduración y fecundación de los Ovocitos, y también para un buen desarrollo embrionario (41). La relación sodio potasio que se debe obtener es de niveles bajos de sodio y altos de potasio en comparación con los niveles plasmáticos (40). El agua es el elemento de mayor proporción en un medio de cultivo y su pureza está altamente relacionada con el desarrollo embrionario. Algunos medios utilizan agua bidestilada, para reducir las posibilidades de que resulten problemas con metales pesados encontrados en mayor proporción en el agua utilizados (41). Existen diferentes compuestos orgánicos que benefician el medio de cultivo de los embriones promoviendo su vitalidad, hay fuentes de energía como lactato, piruvato http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. y glucosa, que son moléculas que fortalecen la energía del embrión en su cultivo además de participar en la síntesis de percusores de ácidos nucleicos y de lípidos y su disponibilidad será importante durante la eclosión fuera de la zona pelucida (41). Con respeto a los lípidos, poco se sabe acerca de la importancia que tendrían en la producción de energía durante el desarrollo embrionario temprano. Sin embargo en los últimos años se ha debatido la posibilidad de mejorar la viabilidad de los embriones crio preservados a través de la adición de ciertos componentes lipídicos a los medios de cultivo, específicamente ácido lnoleico no como fuente energética, sino como fluidificador de las membranas plasmáticas (44). Las fuentes proteicas como los aminoácidos participan en la regulación embrionaria además de ser fuente de energía, como buffer intracelular y para la síntesis de proteínas. Se ha demostrado que los aminoácidos no esenciales favorecerían el desarrollo en estadios tempranos y los esenciales harían lo mismo en embriones de más de ocho células (43). Se utiliza suero bovino o albumina seria bovina como fuente de proteínas a los medios de cultivo embrionario, aunque los resultados obtenidos tanto en producción como en sobrevida poscriopreservacion tras su inclusión son contradictorios y motivo de numerosos estudios. La albumina bovina favorece y protege a los embriones de sustancias toxicas como metales pesados, aporta factores de crecimiento, reduce la tensión superficial del medio, evitando que los embriones se adhieran a las placas (42.) http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. CLASIFICACIÓN EMBRIONARIA De acuerdo a las normas IETS, el código para clasificar la calidad embrionaria basada en la integridad morfológica de los embriones es de tipo numérico. Los códigos de calidad embrionaria varían de 1 a 4. El primero es un embrión excelente con masa embrionaria esférica y simétrica, con células blastómeros uniformes en cuanto al tamaño, color y densidad. Las irregularidades deberían ser relativamente menores, y al menos el 85% del material celular debe ser una masa embrionaria intacta y viable. La zona pelucida deberá presentar superficies lisas, sin superficies cóncavas, planas o delgadas que pudieran causar adhesión de los embriones al material utlizao durante las manipulaciones. La segunda es un embrión con forma irregular moderada en cuanto al aspecto, forma, tamaño, color y densidad de las células. Al menos el 50% del material celular deberá encontrarse intacto y corresponderá con una masa embrionaria viable. El tercer embrión es regular con irregularidades maores en la forma y tamaño de la masa embrionaria, asi como en el tamaño, color y densidad de células individuales. Al menos el 25% del material celular deberá encontrase intacto y corresponderá con una masa embrionaria viable. El cuarto es un embrión malo con formas degeneradas no viables (44). TRANSFERENCIA La transferencia del embrión a la vaca se puede realizar mediante dos procesos. Uno consiste en una transferencia quirúrgica realizando una laparotomía en la fosa http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. paralumbar del animal llegando directamente al útero y poder depositarlo directamente (45). La otra técnica consiste en una transferencia no quirúrgica donde solo se realiza una anestesia epidural y local para tener un mejor manejo del animal. Primero se debe sincronizar el animal en el día 7 del ciclo estral igualmente los embriones deben encontrasen en el día 7 y estar depositados en un pajilla esterilizada de 0.25 0.5 ml, después se conecta con la pistola para poder realizar su debido deposito via vaginal hacia el cuerpo del útero (45). CONCLUSIÓN La transferencia de embriones vitro es una técnica de alta valor científico debido a que impacta directamente en los índices reproductivos y producticos de cualquier producción mejorando su clasificación genética y obteniendo mucho más rápido estudios de progenie de sus ejemplares. La transferencia de embriones debe realizarse bajo estrictos protocolos de bioseguridad para los espermatozoides, óvulos y los mismos embriones para minimizar la mortalidad en estos. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. La transferencia de embriones in vitro es una técnica de alto valor adquisitivo y además exige mucho conocimiento por parte e las personas que la vallan a utilizar. La calidad de los Ovocitos es un factor esencial que afecta el éxito de los sistemas de producción de embriones in vitro. Es una biotecnología útil para conservar material genético. http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ Este obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Orellana. .J.C, Peralta. E.M. (2007). Manual de procedimientos para laboratorio de transferencia de embriones en bovinos de la empresa Genetic Resouces international (GRI) and sexing technologies. 2. Tailor, R. Field. T. 2001. Scientific farms animal production: an introduction to animal science. Seventh Edition. Colorado state university. USA.744p. 3. Phillips, C. 2003. Principios de producción bovina. Zaragosa, España. Ed. Acribia. S.A. 341p. 4. Becaluba, F. 2007. 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