Ependimoma (29)

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OBTENCIÓN DE UNA LINEA CELULAR DERIVADA DE UN 
EPENDIMOMA HUMANO Y ADAPTACIÓN DE LA 
 LINEA A CULTIVOS EN SUSPENSIÓN. 
 
 
 
 
 
 
KARLA TATIANA ROMERO CAMPO 
 
 
 
 
 
 
TRABAJO DE GRADO 
Presentado como requisito parcial 
Para optar al título de 
Bióloga 
 
 
 
 
 
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA 
FACULTAD DE CIENCIAS 
CARRERA DE BIOLOGIA 
Bogotá, D. C. 
19 de Julio de 2007 
 
 1
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
NOTA DE ADVERTENCIA 
 
Artículo 23 de la Resolución N° 13 de Julio de 1946 
“La Universidad no se hace responsable por los conceptos 
emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo 
velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la 
moral católica y por que las tesis no contengan ataques 
personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas 
el anhelo de buscar la verdad y la justicia”. 
 
 
 
 
 
 
 
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OBTENCIÓN DE UNA LINEA CELULAR DERIVADA DE UN 
EPENDIMOMA HUMANO Y ADAPTACIÓN DE LA 
 LINEA A CULTIVOS EN SUSPENSIÓN. 
 
 
 
 
 
KARLA TATIANA ROMERO CAMPO 
 
 
 
 
 
 
 
 
APROBADO 
 
 
 
 
______________________________ 
Jairo Alfonso Tovar Franco, Ph.D 
Director 
 
 
 
__________________________ _________________________ 
 Magdalena Anguiano, PhD. Henry Córdoba, PhD. 
 Jurado Jurado 
 
 3
 
 
OBTENCIÓN DE UNA LINEA CELULAR DERIVADA DE UN 
EPENDIMOMA HUMANO Y ADAPTACIÓN DE LA 
 LINEA A CULTIVOS EN SUSPENSIÓN. 
 
 
 
 
 
KARLA TATIANA ROMERO CAMPO 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APROBADO 
 
 
 
 
 
 
_____________________________ ____________________________ 
 Angela Umaña, M. Phil. Andrea Forero, Bióloga 
 Decana Académico Director de Carrera 
 
Agradecimientos 
 4
 
 
 
A Jairo Tovar por su orientación, exigencia, conocimiento y apoyo en el 
desarrollo de este trabajo. 
 
A Maria Fernanda Gutiérrez por sus correcciones y sinceridad para lograr 
finalizar este trabajo. 
 
A Ludís Morales, Ingrid Schuler y Andrea Forero por orientarme en momentos de 
confusión. 
 
A Maria José Contreras, Eliana Báez y Marta Ariza, por su ayuda, apoyo y 
compañía en todo momento. 
 
A el grupo de Neurobioquímica en general por sus correcciones y orientación. 
 
A mis padres por su apoyo incondicional, su paciencia y cariño. 
 
A Andrea por su apoyo y cariño de hermana dándome momentos de distracción 
cuando más lo necesitaba. 
 
A Hermman por sus correcciones, apoyo y cariño de hermano y por su crítica 
positiva a este trabajo como biólogo. 
 
Y en general a todas las personas que me acompañaron en este proceso; Gracias. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 5
 
 
TABLA DE CONTENIDOS 
 
Resumen ......................................................................................................................... 11 
1. Introducción .......................................................................................................... 12 
2. Marco teórico y revisión de literatura. ................................................................ 14 
2.1. Células del Sistema Nervioso. ....................................................................... 14 
2.2.1. Neuronas ............................................................................................. 14 
2.1.2. Glia ...................................................................................................... 15 
2.1.2.1. Astrocitos ......................................................................................... 16 
2.1.2.2. Oligodendrocitos .............................................................................. 17 
2.1.2.3. Células ependimarias (ependimocitos) ............................................ 17 
2.2. Tumores Cerebrales ....................................................................................... 17 
2.2.1. Díagnostico tumores cerebrales .......................................................... 18 
2.2.2. Grado de los tumores - Malignidad ..................................................... 19 
2.2.3. Clases de Tumores .............................................................................. 20 
2.3. Utilidad de cultivos y líneas celulares derivadas de sistema nervioso en 
biotecnología. ........................................................................................................ 21 
2.3.1. Modalidades de cultivo celular ........................................................... 22 
2.3.1.1. Cultivos en Monocapa (células adherentes) ..................................... 22 
2.3.1.2. Cultivos en Suspensión .................................................................... 23 
2.3.2. Cultivo de células animales en suspensión ......................................... 24 
2.3.3. Líneas celulares derivadas de sistema nervioso .................................. 30 
2.4. Ependimocitos en el epitelio y Ependimoma ................................................. 33 
2.4.1. Funciones del epitelio ependimario .................................................... 34 
2.4.2. Ependimoma ....................................................................................... 35 
2.4.3. Metabolismo de los ependimocitos .................................................... 37 
3. Formulación del problema y justificación .......................................................... 40 
3.1. Formulación del problema ............................................................................. 40 
3.2. Pregunta de investigación .............................................................................. 40 
3.3. Justificación de la investigación ................................................................... 40 
4. Objetivos ................................................................................................................ 41 
4.1. Objetivo General ............................................................................................ 41 
4.2. Objetivos específicos ..................................................................................... 41 
5. Materiales y Métodos ............................................................................................ 41 
5.1. Materiales ....................................................................................................... 41 
5.2. Equipos ........................................................................................................... 42 
5.3. Métodos .......................................................................................................... 42 
5.3.1. Seguimiento citomorfológico de las células cultivadas en monocapa. 42 
5.3.2. Preparación del cultivo de células en placa......................................... 42 
5.3.3. Caracterización inmunohistoquímica del ependimoma ...................... 43 
5.3.4. Almacenamiento y reconstitución de los cultivos celulares. .............. 44 
 6
 
 
5.3.4.1. Congelamiento ................................................................................. 44 
5.3.4.2. Descongelamiento ............................................................................ 44 
5.3.5. Adaptación de células a un cultivo en suspensión. ............................. 45 
5.3.6. Estadística ........................................................................................... 45 
5.3.7. Aspectos éticos .................................................................................... 45 
5.3.8. Cuadro procedimental ......................................................................... 46 
6. Resultados .............................................................................................................. 47 
6.1. Características inmunohistoquímicas del ependimoma ................................. 47 
6.2. Obtención de Linea Celular Primaria .............................................................51 
6.3. Curva de crecimiento en cultivos en monocapa. ............................................ 54 
6.3. Cultivos en suspensión utilizando 10 % y 5 % de Suero Fetal Bovino. ........ 57 
6.4.Características inmunocitoquímicas del ependimoma .................................... 69 
6.5. Análisis Estadístico ........................................................................................ 72 
7. Discusión ................................................................................................................ 72 
7.1. Características inmunohistoquímicas del ependimoma. ................................ 72 
7.2. Obtención de una Línea Celular Primaria ...................................................... 74 
7.3. Curva de crecimiento en cultivos en monocapa. ............................................ 74 
7.4. Cultivos en suspensión utilizando 10 % y 5 % de Suero Fetal Bovino ......... 75 
8. Conclusiones .......................................................................................................... 79 
9. Recomendaciones .................................................................................................. 80 
10. Referencias bibliográficas .................................................................................... 81 
 
ANEXOS ........................................................................................................................ 92 
Anexo 1. Composición y preparación de las soluciones. ..................................... 92 
Anexo 2. Preparación del cultivo primario. .......................................................... 94 
Anexo 3. Caracterización inmunocitoquímica del cultivo primario. .................... 95 
Anexo 4. Formulario de consentimiento de los sujetos para la investigación ...... 96 
Anexo 5. Recolección de las muestras .................................................................. 97 
Anexo 6: Montaje de Spinner ............................................................................. 102 
Anexo 7: Prueba de contraste Shapiro-Wilk (Normalidad) y Prueba de Levene 
(Homogeneidad de Varianza). ............................................................................ 104 
Anexo 8: Análisis de varianza ANOVA. ............................................................ 110 
Anexo 9: Test de rango múltiple de DUNCAN (tratamiento con 5% de SFB) .. 113 
Anexo 10: Test de rango múltiple de DUNCAN (tratamiento con 10% de SFB).
 ............................................................................................................................. 116 
 
 
 7
 
 
INDICE DE TABLAS 
 
Tabla 1. Promedio de conteo de células*107/mL con Azul de Tripano. 
Tabla 2. Resultados del crecimiento en un Spinner (10% SFB) de células 
derivadas de un ependimoma humano adaptadas a suspensión. 
Tabla 3. Resultados del crecimiento en un Spinner (10% SFB) de células 
derivadas de un ependimoma humano adaptadas a suspensión. 
Tabla 4. Resultados del crecimiento en un Spinner (5% SFB) de células 
derivadas de un ependimoma humano adaptadas a suspensión. 
Tabla 5. Resultados del crecimiento en un Spinner (5% SFB) de células derivadas 
de un ependimoma humano adaptadas a suspensión. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 8
 
 
INDICE DE FIGURAS 
Figura 1. Prueba Eosina / Hematoxilina 
Figura 2. Prueba Proteína Ki-67. 
Figura 3. Prueba Proteína Ácida Fibrilar de la Glia (PAFG). 
Figura 4. Prueba Proteína S-100. 
Figura 5. Prueba Sinaptofisina. 
Figura 6. Cultivo en Monocapa de células derivadas de ependimoma. 
Figura 7. Evolución del número de células a lo largo del tiempo de cultivo en 
monocapa. 
Figura 8. Viabilidad a lo largo del tiempo de cultivo en monocapa. 
Figura 9. Evolución del contenido de DNA (μg/mL) a lo largo del tiempo de 
cultivo en monocapa. 
Figura 10. Cantidad de Proteína (g/mL) a lo largo del cultivo en monocapa. 
Figura 11. Cantidad de Proteína (g/mL) a lo largo del cultivo en monocapa. 
Figura 12. Evolución del número de células/100mL con Azul de Tripano 
cultivadas en Spinner. 
Figura 13. Evolución del número de células/100mL con Cristal Violeta cultivadas 
en Spinner. 
Figura 14. Evolución de la viabilidad a lo largo del tiempo cultivos en Spinner. 
Figura 15. Evolución de la cantidad de proteína soluble a lo largo del tiempo. 
Cultivos en Spinner. 
Figura 16. Evolución de la cantidad de proteína soluble a lo largo del tiempo. 
Cultivos en Spinner. 
Figura 17. Evolución de la cantidad de proteína celular a lo largo del tiempo. 
Cultivos en Spinner. 
Figura 18. Evolución de la cantidad de proteína celular a lo largo del tiempo. 
Cultivos en Spinner. 
Figura 19. Evolución de la cantidad de proteína total a lo largo del tiempo. 
Cultivos en Spinner. 
Figura 20. Evolución de la cantidad de proteína celular a lo largo del tiempo. 
Cultivos en Spinner. 
 9
 
 
Figura 21. Evolución de la Contenido de DNA a lo largo del tiempo. Cultivos en 
Spinner. 
Figura 22. Evolución de la Biomasa a lo largo del tiempo. Cultivos en Spinner. 
Figura 23. Evolución del pH a lo largo del tiempo. Cultivos en Spinner al 10% y 
5% de SFB. 
Figura 24. Prueba Proteína Ácida Fibrilar de la Glia (PAFG) y Sinaptofisina. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 10
 
 
 
Resumen 
La productividad de las células adherentes es relativamente baja y es necesario 
contar con un mecanismo que produzca una gran concentración de éstas para 
alcanzar un mejor rendimiento. El cultivo de células en suspensión tiene algunas 
ventajas de interés industrial: mayor facilidad de manipulación y pase de un 
cultivo al siguiente pues no requieren separación del sustrato mediante 
tripsinización y tiene posibilidad de escalamiento incrementando la biomasa. En 
este trabajo se buscó la adaptación de células adherentes derivadas de 
ependimoma a cultivos en suspensión buscando aumentar la productividad en 
biomasa y disminuyendo la cantidad de suero necesario para mantener su 
crecimiento. 
Se obtuvo una muestra de un paciente con diagnostico clínico e histopatológico de 
ependimoma anaplásico grado II; se realizó la caracterización mediante 
inmunohistoquímica en cortes de tejido y por inmunocitoquímica sobre células 
cultivadas a partir de tumor utilizando diferentes marcadores (PAFG, S-100, Ki-
67, Sinaptofisina y Eosina-hematoxilina). De este tejido se cultivaron las células 
haciendo tres pases y obteniendo una línea celular primaria, la cual se adaptó a 
suspensión (spinner), determinando inmunicitoquímicas del ependimoma in Vitro. 
Se observó que las pruebas inmunohistoquímicas concordaban con las pruebas 
inmunocitoquímicas realizadas y a su vez ratificadas por el lento crecimiento de 
las células cultivadas en monocapa, y su grado de atípia celular. Las células 
cultivadas en monocapa soportaron 3 pases (64 DIV) antes de volverse una línea 
celular primaria y disminuir su crecimiento y viabilidad. Los cultivos en 
monocapa son menos productivos que aquellos en spinner. La productividad es 
directamente proporcional a la concentración de suero fetal bovino en el medio de 
cultivo. La adaptación de estas células a cultivos en suspensión se evidenció en el 
momento en que este presentó mayor cantidad de células en menor número de 
días sin variar su viabilidad. 
 
 
 
 11
 
 
1. Introducción 
La expectativa a nivel mundial de la obtención de productos farmacéuticos va en 
aumento, ya que ayuda a tratamientos de millones de individuos afectados por 
diferentes enfermedades; esto unido con la demanda de la producción esperada de 
compañías biotecnológicas que crean terapias, ha impulsado la necesidad de 
desarrollar métodos de cultivo de gran potencial. Descubrimientos acelerados en 
esta área, apoyados con uso de sistemas de modelos animales, están permitiendo 
realizar experimentos más rápida y eficazmente (Kallos, 2003). Optimizar el 
crecimiento de células madreneuronales y progenitoras neurales (NSCs/NPs) 
(Lin, 2004; Goh, 2003) se ha vuelto una prioridad, y es así como el desarrollo de 
protocolos para este tipo de células capaces de autorenovarse y dar lugar a 
neuronas y glia eficazmente en cultivos en suspensión para biorreactores, se ha 
incrementado en los últimos años (Kallos, 1999a; Abranches, 2003). Igualmente 
se están trabajando astrocitomas y glioblastomas en suspensión acoplados a 
microacarreadores en biorreactores (Sa Santos, 2005; Barnea, 1999). No obstante, 
la industria requiere disponer de una alta densidad de células que tengan la 
capacidad de mantener su viabilidad y productividad en cultivos en suspensión 
por un tiempo prolongado (Goswami, 1999; Kanemura, 2002). Uno de los 
objetivos de este trabajo en contribuir a desarrollar un línea celular de origen 
tumoral que permita a los investigadores trabajar en áreas médicas y 
biotecnológicas. 
El cultivo de células animales ha adquirido gran importancia en los últimos años 
ya que pueden ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes de uso 
farmacéutico y a que se les pueden efectuar modificaciones que no son posibles ni 
en levaduras ni en bacterias. Pero la productividad de este tipo de células es 
relativamente baja y es necesario contar con una gran concentración de las 
mismas para alcanzar un mejor rendimiento. En las líneas celulares que provienen 
de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, algunas tienen la 
propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensión después de un período 
de adaptación. El cultivo de células en suspensión es ideal cuando se busca la 
 12
 
 
elaboración de productos extracelulares e intracelulares o cuando se presentan 
problemas con la capacidad de anclaje de un determinado tipo de célula. 
En este trabajo se demostró que los cultivos celulares derivados de ependimoma 
pueden ser adaptados al crecimiento en cultivos en suspensión agitada en spinner. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 13
 
 
2. Marco teórico y revisión de literatura. 
2.1. Células del Sistema Nervioso. 
Además de las neuronas, el sistema nervioso está constituido por células gliales. 
Al conjunto de células gliales se las denomina genéricamente glía o neuroglía. 
Hay alrededor de 10 a 50 veces más células gliales que neuronas (Kandel, 2001). 
La glia cumple funciones de sostén y nutrición. Esto es debido a que en el sistema 
nervioso no existe tejido conectivo. Estas células han seguido un desarrollo 
embriogénico y ontogénico diferente al de las neuronas. Debido a que son menos 
diferenciadas que las neuronas, conservan la capacidad mitótica y son las que se 
encargan de la reparación (no regeneración) de las lesiones del sistema nervioso 
(Kandel, 2001). 
2.2.1. Neuronas 
A pesar de que existe gran variedad de tipos neuronales (por su tamaño, forma y 
organización), las células nerviosas comparten una serie de características 
generales (Purves, 2007). 
Estas células conducen señales a través del axón, una prolongación que se 
extiende desde el cuerpo de la neurona hacia afuera, y reciben información a 
través de las dendritas, otras ramas de la célula que se dirigen hacia el soma o 
cuerpo neuronal. La capacidad del axón para conducir impulsos nerviosos 
aumenta significativamente por la mielina, capa formada por células 
especializadas que producen una membrana adiposa que envuelve al axón varias 
veces, en forma concéntrica. La mielina de estas membranas protege el impulso 
nervioso de las interferencias del medio, disminuyendo la pérdida de corriente 
eléctrica y aumentando la velocidad con la que ésta se conduce por la fibra 
nerviosa. En el sistema nervioso las neuronas se organizan por medio de cúmulos 
de células en sitios relativamente circunscritos. Esta acumulación de cuerpos 
neuronales, a diferencia del aspecto que tienen los haces de fibras, constituye la 
sustancia gris (que en el tejido fresco es más bien rosa grisáceo) y se organiza 
 14
 
 
frecuentemente en núcleos. Las áreas de fibras o tractos nerviosos, 
particularmente mielinizados, constituyen la sustancia blanca (Purves, 2007) 
Tanto la producción del impulso nervioso como su conducción a través de los 
nervios o de las fibras musculares se deben a las características especiales de la 
membrana neuronal. En particular, a su capacidad de filtrar en forma selectiva las 
pequeñas moléculas cargadas que existen en el medio: los iones. Las células 
excitables tienen la propiedad de poder mantener diferentes concentraciones de 
iones a uno y otro lado de su membrana plasmática. Gracias a esta diferencia de 
concentración iónica existe una diferencia de potencial (es decir, de voltaje) a 
ambos lados de esta membrana. Esta diferencia de potencial está dada por una 
acumulación de iones de sodio (Na+) en el exterior de la célula y de iones de 
potasio (K+) en el interior (Kandel, 2001). 
2.1.2. Glia 
Existen tres tipos de células gliales: los astrocitos, los oligodendrocitos y las 
células ependimales y son las encargadas de "sostener" a las neuronas, no sólo 
desde el punto de vista espacial, sino también metabólico, endocrino e 
inmunológico (Bustamante, 2001). 
La glia también tiene relación con el desarrollo cerebral. Se ha visto que existen 
células gliales que orientan a los axones en su camino hacia el establecimiento de 
conexiones a larga distancia. Estas células proveen al axón de sustancias de 
adhesión celular y de factores tróficos, que le sirven a la terminación nerviosa 
para aumentar su superficie en direcciones específicas, para así ir avanzando hacia 
su blanco. Estas señales son críticas para el establecimiento de los circuitos 
funcionales que organizan más tarde secuencias complejas de reacciones. Las 
células gliales, que no han mostrado aún su complejidad real, se especializan tanto 
como las neuronas (Bustamante, 2001). 
 
 
 15
 
 
2.1.2.1. Astrocitos 
Los astrocitos son el tipo celular más abundante en la glia. Su morfología es 
estrellada por la gran cantidad de prolongaciones llamadas pies que irradían del 
soma hacia células vecinas. Algunas de estas prolongaciones están en contacto 
con un vaso sanguíneo (capilar) formando podocitos (también llamados procesos 
pediculares o pies perivasculares), o también pueden rodear las sinapsis nerviosas 
(Kiernan, 2006). 
El núcleo de los astrocitos es más claro que el de otras células de la glía, y el 
citoplasma contiene numerosos gránulos de glucógeno y filamentos intermedios, 
compuestos de GFAP (proteína ácida fibrilar glial), que sólo se encuentran en 
astrocitos (Kiernan, 2006). 
La principal tarea de los astrocitos es unir las neuronas a los capilares sanguíneos, 
así como también la de mantener una concentración equilibrada entre el medio 
extracelular y el intracelular previniendo el ingreso de determinadas sustancias 
posiblemente nocivas. Además participan en los procesos de regeneración de 
lesiones en el Sistema Nervioso, aumentando su tamaño y enviando sus 
proyecciones para rellenar la zona dañada. Se pueden diferenciar dos clases 
principales de astrocitos (Kiernan, 2006). 
Astrocitos protoplasmaticos: Se encuentran principalmente en la sustancia gris, y 
poseen prolongaciones citoplasmáticas de forma muy variable. 
Astrocitos fibrosos: En sus prolongaciones existe una gran cantidad de fibrillas 
(gliofibrillas). Se encuentran, sobre todo en la sustancia blanca. Presentan 
prolongaciones más largas y menos ramificadas que los astrocitos 
protoplasmáticos. 
Los astrocitos cumplen la función de sostén mecánico, y facilitan la migración de 
las neuronas durante el desarrollo del sistema nervioso. Además ejercen una 
actividad moduladora sobre la comunicación neuronal, al eliminar 
 16
 
 
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Gliofibrillas&action=edit
neurotransmisores, proveer sus precursores y mantener concentracionesen el 
medio extracelular. 
2.1.2.2. Oligodendrocitos 
Los oligodendrocitos o en conjunto oligodendroglía son más pequeños que los 
astrocitos y tienen pocas prolongaciones. Además de la función de sostén y unión, 
se encargan de formar la capa de mielina en el sistema nervioso central 
(Bustamante, 2001). 
2.1.2.3. Células ependimarias (ependimocitos) 
Las células del epitelio ependimario (epéndimocitos, tanicitos) revisten los 
ventrículos del encéfalo y del conducto ependimario de la médula espinal que 
contienen al líquido cefaloraquídeo (LCR) (Moynihan, 2003). 
Los tanicitos son células de contacto entre el tercer ventrículo del cerebro y la 
eminencia medía hipotalámica. Su función no es bien conocida, y se les ha 
atribuido un papel de transporte de sustancias entre el LCR del tercer ventrículo y 
el sistema porta hipofisiario. Pueden considerarse una variedad especializada de 
células ependimarias (Moynihan, 2003). 
 
2.2. Tumores Cerebrales 
Los cambios celulares característicos del cáncer son iniciados por diversos grados 
de interacción entre factores propios del huésped y agentes exógenos. Si bien hay 
factores presentes en el huésped, distintos de los genes, que desempeñan una 
función en el desarrollo de la enfermedad, se reconoce cada vez la influencia 
genética en algunos de ellos. 
Según la OMS (Organización Mundíal de la Salud) se produce el cáncer debido a 
las mutaciones en los genes responsables de la multiplicación y reparación de las 
células (OMS, 2004). 
 
 17
 
 
http://es.wikipedia.org/wiki/Oligodendrocito
http://es.wikipedia.org/wiki/Mielina
http://es.wikipedia.org/wiki/Sistema_nervioso_central
http://es.wikipedia.org/wiki/Epitelio
http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_ependimaria
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Ep%C3%A9ndimo&action=edit
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Tercer_ventr%C3%ADculo&action=edit
http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Eminencia_media&action=edit
http://es.wikipedia.org/wiki/Hipot%C3%A1lamo
http://es.wikipedia.org/wiki/LCR
http://es.wikipedia.org/wiki/Sistema_porta
http://es.wikipedia.org/wiki/Hip%C3%B3fisis
Las mutaciones en el gen p53 son muy comunes en los cánceres humanos, por la 
cual no se da la regulación transcripcional que suprime la proliferación celular 
inducida por oncogenes de la apoptosis (Ellison, 1992; Alderson, 1995). Se 
encontró que las mutaciones del gen p53 están presentes en más del 30% de los 
gliomas (evento temprano) por lo cual se cree que estas anormalidades están 
relacionadas con el desarrollo de los gliomas. 
 
Se conoce que las mutaciones del gen p53 en tumores cerebrales primarios y las 
mutaciones presentes de este mismo gen en líneas celulares de gliomas son 
similares, lo cual demuestra la utilidad e importancia de las líneas como 
herramientas confiables para la investigación de la restauración de enfermedades 
neurológicas en forma natural (Steinbach, 2004; Shu, 1998). 
 
En contraste, ahora se considera que los llamados polimorfismos metabólicos, es 
decir, las diferencias en la forma en que las personas metabolizan los 
carcinógenos químicos, pueden explicar las diferencias de la sensibilidad de los 
individuos al cáncer, y que estos polimorfismos son controlados a nivel celular 
por mutaciones en genes específicos. 
2.2.1. Díagnostico tumores cerebrales 
Se utilizan pruebas que examinan el cerebro y la médula espinal para detectar un 
tumor cerebral. Se pueden utilizar las pruebas y los procedimientos siguientes: 
• Exploración por TAC (Tomografía Axial Computarizada): procedimiento 
en el cual se toma una serie de imágenes detalladas de áreas internas del 
cuerpo, desde ángulos diferentes. Las imágenes son creadas por una 
computadora conectada a una máquina de rayos X. Se inyecta un tinte en 
una vena o se ingiere a fin de que los órganos o los tejidos se destaquen 
más claramente (OMS). 
• IRM (Imaginología por Resonancia Magnética): procedimiento que usa un 
imán, ondas de radio y una computadora para crear imágenes detalladas 
del cerebro y la médula espinal. Se inyecta una sustancia llamada 
gadolinio en una vena del paciente. El gadolinio se acumula alrededor de 
 18
 
 
las células cancerosas a fin de que estas se muestren más claramente en la 
imagen (OMS). 
El tumor cerebral en el adulto se díagnostica y se extirpa medíante cirugía. 
2.2.2. Grado de los tumores - Malignidad 
El grado de un tumor se refiere a cuán anormales parezcan las células cancerosas 
bajo un microscopio y cuál es la probabilidad de que el tumor crezca y se 
disemine. La siguiente clasificación es la clasificación según la Organización 
Mundíal de la Salud: 
Grado I 
El tumor crece lentamente, tiene células de apariencia similar a las células 
normales y pocas veces se disemina hasta los tejidos cercanos. Es posible que se 
pueda extirpar todo el tumor medíante cirugía. 
Grado II 
El tumor crece lentamente, pero puede haberse diseminado a los tejidos cercanos 
y puede convertirse en un tumor de grado más alto. 
Grado III 
El tumor crece rápidamente, es probable que se disemine hasta el tejido vecino y 
el aspecto de las células tumorales es muy diferente del de las células normales. 
Grado IV 
El tumor crece en forma muy dinámica, tiene células con aspecto muy diferente al 
de las células normales y es difícil tratarlo con éxito. 
La probabilidad de recuperación (pronóstico) y selección de tratamiento 
dependerán del tipo, grado y ubicación del tumor, y si quedan células cancerosas 
después de la cirugía o se han diseminado hasta otras partes del cerebro. 
 19
 
 
 
2.2.3. Clases de Tumores 
Para el tratamiento, los tumores cerebrales se clasifican por el tipo de célula en la 
que comenzó el tumor, la ubicación del tumor en el sistema nervioso central y el 
grado del tumor. 
Existen diferentes tipos de tumores cerebrales, tales como: Gliomas del tronco 
encefálico, Tumor astrocítico pinea, Astrocitoma pilocítico (grado I), Astrocitoma 
difuso (grado II), Astrocitoma anaplásico (grado III), Glioblastoma (grado IV), 
Tumores oligodendrogliales: Oligodendroglioma (grado II), Oligodendroglioma 
anaplásico (grado III), Gliomas mixtos: Oligoastrocitoma (grado II), 
Oligoastrocitoma anaplásico (grado III); Meduloblastoma (grado IV), Tumores 
parenquimales pineales: Pineocitomas (grado II), Pineoblastomas (grado IV), 
Tumores meníngeos: Meningioma de grado I, Meningiomas de grado II y III y 
hemangiopericitomas (Instituto Nacional del Cancer, 2007). 
El tipo de tumor que se trabaja en este trabajo son los Tumores ependimales. 
Los tumores ependimales generalmente empiezan en las células que revisten los 
espacios del cerebro y alrededor de la médula espinal. Estos espacios contienen 
líquido cefalorraquídeo, un líquido que amortigua y protege el cerebro y la médula 
espinal. Los grados de los tumores ependimales son los siguientes (Instituto 
Nacional del Cancer, 2007). 
• Ependimomas de grado I y grado II: estos ependimomas son de 
crecimiento lento y tienen células de aspecto muy parecido al de las 
células normales. Generalmente, pueden ser extirpados completamente 
medíante cirugía. 
Ependimoma anaplásico (de grado II): Presenta gran indiferenciacion y 
crecimiento rápido o lento. 
 20
 
 
2.3. Utilidad de cultivos y líneas celulares derivadas de sistema nervioso en 
biotecnología. 
El crecimiento de las células en un cultivo celular depende de la supervivencia de 
éstas a las diferentes técnicas de disgregación y a la capacidad de adherirse al 
sustrato o de sobrevivir en suspensión. Las células capaces de proliferar podrían 
aumentar, otros tipos de células podrían sobrevivir pero no aumentar y otras 
podrían ser capaces de sobrevivir en condiciones especiales. Además el 
crecimiento celular va ligado al espacio del cultivo, ya que unas células detienen 
su crecimiento, mientras que otras lo incrementan (Freshney, 1995). 
Los cultivos de células y tejidos puedenser altamente sensibles a las sustancias 
químicas y permitir a los investigadores estudiar partes del cuerpo específicas. Se 
han utilizado cultivos de células en investigaciones para el cáncer, Parkinson, 
SIDA, desarrollo de medicamentos, toxicidad y Alzheimer. Son el producto de la 
colección de células vegetales o animales de diferentes órganos, colocadas en 
condiciones especiales propicias para su sobrevivencia y multiplicación, 
manteniendo para esto todas sus funciones metabólicas de una manera semejante a 
las que tenía en el huésped. 
Los cultivos de células animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de 
anclaje (adherencia), y sí han sido aisladas recientemente de un órgano 
determinado o si provienen de células que han sufrido modificación. 
De acuerdo a su capacidad de adherencia o no a una superficie determinada 
pueden crecer formando monocapa o en suspensión respectivamente, lo que está 
muy asociado con el tipo de célula de la cual derivan: por lo general las células 
provenientes de órganos, crecen en monocapa. Igualmente, existen células que 
pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en suspensión, ejemplo 
son las células HeLa que son células transformadas derivadas de cultivos en 
monocapa (Freshney, 1995). 
Cuando el cultivo proviene de células que han sido disgregadas de un tejido 
original tomado de un órgano de un animal recién sacrificado, reciben el nombre 
 21
 
 
de: cultivo primario. Cuando éste cultivo primario es sometido a procesos de 
transformación que le confiere capacidad ilimitada de multiplicación, reciben el 
nombre de: líneas celulares. Cuando en el cultivo coexisten dos tipos de células 
de linajes diferentes que se pueden separar recibe el nombre de: cocultivo o 
hibridomas (Freshney, 1995). 
2.3.1. Modalidades de cultivo celular 
 
Existen dos modalidades de cultivo según la morfología de las células, estas 
modalidades son: cultivo en monocapa (células adherentes) o cultivo en 
suspensión (células sencillas o en agregados) 
 
2.3.1.1. Cultivos en Monocapa (células adherentes) 
Las células crecen formando una monocapa que cubre la superficie de crecimiento 
(confluencia), lo que hace que su multiplicación sea inhibida cuando establecen 
contacto entre sí (quiescencia). Los recipientes para el cultivo de células 
estacionarias son generalmente cajas de Petri o frascos para el cultivo de tejido 
(Roux), que pueden ser de plástico o de vidrio previamente tratado y su 
desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes 
proteolíticos como la tripsina (Freshney, 1995). 
Los cultivos celulares adherentes se clasifican como: neuronales, fibroblastos 
endoteliales y epiteliales. Existen de cada tipo celular líneas reconocidas, 
utilizadas para investigación. En las neuronales es conocida la línea celular SH – 
SY5Y, la cual es derivada de neuroblastoma humano. En los fibroblastos la línea 
MRC-5 al igual que la línea Vero, derivadas de pulmón embrionario humano y 
riñón de mono verde africano respectivamente. En las Endoteliales existe la línea 
celular BAE-1, derivadas de bazo canceroso y finalmente de las células 
adherentes clasificadas como epiteliales, existen las líneas celulares reconocidas 
como CHO (Ovario de Hamster Chino) y HeLa (derivada de células cancerigenas 
de cerviz humano). 
 
 22
 
 
2.3.1.2. Cultivos en Suspensión 
Los cultivos celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de 
anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en 
suspensión después de un período de adaptación. El proceso de cultivo continuo 
ofrece factores económicos decisivos (utilización de mejores equipos, reducida 
manipulación) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala de 
operación. 
Los cultivos celulares en suspensión puedes ser libres o en agregados. Los libres 
son cultivos en los cuales el crecimiento es individual, sin ningún tipo de unión 
entre ellas, lo contrario de las células que crecen en agregados, formando grupos 
celulares. 
De la modalidad de cultivos en suspensión libre es reconocida la línea Nawalwa 
derivada de linfocitos B de un linfoma de Burkitt y de la línea celular WEHI-231 
derivada de linfoma de células B inmaduras. 
 
Cuando es necesaria la adaptación de células adherentes a cultivos en suspensión, 
después de tener un stock de células y de seleccionar la modalidad de cultivo, se 
sigue a la posterior adaptación en donde existen diferentes sistemas de cultivo, 
con algunas modificaciones, multiplatos, inmovilizadas, spinner y columnas, para 
llegar al mismo objetivo. De estos sistemas de cultivo el spinner es un mecanismo 
sencillo en donde solo se tiene la variación de la velocidad en la agitación 
mecánica. 
 
En estos cultivos es necesario tener en cuenta los aspectos metabólicos de las 
células animales cultivadas in vitro para posterior producción de 
biofarmaceuticos. Tales como conocer y entender el metabolismo celular para así 
desarrollar los procesos adecuados. Se debe formular un medio de cultivo según 
los requerimientos nutricionales, seleccionar la modalidad del cultivo, el 
mejoramiento global del proceso y la aplicación de ingeniería metabólica 
correspondiente, la cual no es necesaria cuando las células liberan al medio 
 23
 
 
enzimas que permiten la autosostenibilidad del cultivo, es decir enzimas que 
utilicen los desechos metabólicos celulares. 
 
Cuando se habla de mejoramiento global del proceso de cultivo, uno de los puntos 
para tener en cuenta es la concentración de suero fetal bovino que se agrega, para 
así simplificar la formulación del medio de cultivo; además porque actúa como 
inhibidor de las proteasas, protege contra daño mecánico, aunque al mismo tiempo 
incrementa la carga proteica aumentando el riesgo de contaminación. Los cultivos 
sin suero son de mayor facilidad para la purificación de proteínas. La composición 
de este es definida, ayudadando así a tener mayor regulación y seguridad, aunque 
el crecimiento es menor, es necesaria la formulación del medio de cultivo caso por 
caso y una menor estabilidad del producto de interés. 
 
2.3.2. Cultivo de células animales en suspensión 
 
El diseño y el uso de un sistema que permite a la proliferación activa de células de 
mamíferos, como unidades individuales, en el estado sumergido, parecerían ser de 
valor a individuos interesados en investigaciones que se relacionan con la cinética 
total de la interacción de virus de anfitrión/célula y a estudios que requieren las 
altas concentraciones de células de tejido uniformes o virus. 
 
En 1957 se presentaron datos que establecen la viabilidad de obtener la 
proliferación uniforme de células de mamíferos en suspensión en volúmenes hasta 
de 3 Litros. Varios tipos de sistemas inestables han sido sugeridos para permitir el 
crecimiento de células de tejido en el estado de suspensión, como son la coctelera 
rotatoria de Earle et al., (1954), el tubo de caída de Owens et al., (1953), el tubo 
de rodillo de Graham y Siminovitch (1955), el agitador suspendido en los frascos 
Erlenmeyer de Cereza y Casco (1956), el tubo de rodillo hexagonal de Powell 
(1954), y la coctelera de muñeca de Hardy Marrón (1957), así como el agitador de 
cristal de Danés (1957). Así, en sistemas de frasco de agitacion hay una tendencia 
marcada hacia la formación de gránulos grandes. Además, precipitados proteícos 
se forman con frecuencia (McLimans, 1957). 
 24
 
 
 
Varios autores hay ensayado y utilizado los cultivos en suspensión para realizar 
investigaciones que requieren gran cantidad de células, adaptando diferentes tipos 
de células en cultivos en spinner y observando gran crecimiento en un periodo 
relativamente corto de tiempo. 
 
En 2006 se realizaron estudios sobre los efectos hidrodinamicos de la formación 
de agregados celulares de células HEK 293 en cultivos en spinner,utilizando 
250mL de solución con agitación de 25, 50, 75 y 100r/min. Observaron la 
distribución de conjuntos de célula, la densidad de células viables, la viabilidad, 
la tasa de consumo específica de glucosa, de producción específica de lactato y 
lactato transformado, así como también el contenido de proteínas y de DNA del 
cultivo, observando el crecimiento y el metabolismo de células HEK293 en 
cultivos en suspensión en spinner. En este estudio se encontró que la agitación 
juega un papel importante en la formación de conjuntos de célula HEK293 y en la 
distribución. La viabilidad celular se mantuvo en el rango de 80 a 90% con los 
índices metabólicos, al igual que se mantuvo constante la producción de glucosa, 
lactato y lactato transformado (lac/glc). Estos resultados mostraron la 
transferencia proporcionada suficiente de masas para apoyar el crecimiento 
normal y el metabolismo de células HEK293 en cultivos en suspensión, así como 
también el contenido de proteínas y de DNA del cultivo, concluyendo el 
importante papel que desempeña la agitación en la agregación celular. (Liu, 
2006). 
 
En 2001 se desarrollo investigación en células de la línea celular CHO (Chinese 
Hamster Ovary) utilizando 10% de SFB + medio DMEM en cultivos en spinner, 
evaluando los efectos de diversos antioxidantes en los niveles de apoptosis 
celular. En este estudio se compararon los efectos antioxidativos en cultivos en 
suspensión libres de suero, bajos en suero y con 10%, observando que los 
porcentajes apoptóticos de las células cultivadas en medio libre de suero fue 
mayor que en células con contenido de suero en el medio. Las concentraciones de 
célula viables en el cultivo celular sin SFB con GSH y en el cultivo bajo en suero 
 25
 
 
con GSH y VCP fueron de de 0.57, 1.04 y 1.69 x 10 (5) cells/ml, respectivamente, 
mientras aquellos donde no se utilizó suero y cultivos bajos en suero sin los 
antioxidantes eran sólo 2.33 y 1.17 x 10 (3) cells/ml, respectivamente. 
Los porcentajes de células apoptóticas en el cultivo sin suero y bajo en suero con 
VCP fue de (73.2, el 44.6 %) y GSH (76.9, el 38.6 %). El porcentaje de células 
que tienen un alto potencial en la membrana mitocondrial entre las células viables 
en los cultivos con antioxidantes fueron claramente más altas que los cultivos sin 
los antioxidantes. La producción de tPA en el cultivo sin suero y bajo en suero 
con VCP (0.282, 2.92 mg/l) o GSH (1.01, 1.61 mg/l) era notablemente más alta 
que en los cultivos sin antioxidantes (0.275, 0.689 mg/l). Por consiguiente, la 
supresión de apoptosis por el mantenimiento del potencial de la membrana 
mitocondrial por VCP O GSH causo un aumento marcado de la producción tPA 
por células CHO en el cultivo sin suero y bajo en suero. (Yun, 2001). 
 
En 2003 se presentaron resultados del estudio realizado en células 
hematopoyeticas cultivadas en biorreactor y en spinner, comparando la estabilidad 
y homogeneidad de la evolución del cultivo en los dos sistemas de cultivo a gran 
escala. (Chi, 2003). 
 
En 2004 se utilizaron spinners para cultivar células del septo nasal (condrocitos) 
observando la alta producción (en dos semanas se incrementó la población 14 
veces con respecto a la inicial) de este tipo de células al utilizar cultivos en 
suspensión por medio de spinner para así poder evaluar las aplicaciones en 
reconstrucción craneomaxilofacial y prácticas de ortopedía (Shikani, 2004). 
 
En 2005 se realizaron cultivos en suspensión de células de mamífero utilizando 
spinner para la aplicación de biotecnología a gran escala, para así aumentar la 
productividad y densidad celular. En este estudio se utilizaron células HEK 293 
y CHO que producían 7 x 106 cel/mL y 5 x 105 cel/mL respectivamente, en 
cultivos realizados en spinner (Muller, 2005). 
 
 26
 
 
En 2003 se presento un trabajo basado en el mejoramiento de cultivos en 
suspensión de células de insecto utilizando spinner. Experimentaron las 
características de crecimiento de Spodoptera frugiperda, utilizando células 
estándar de esta especie, (Sf9). Utilizaron también varios modelos y formas de 
spinner, observando la igualdad de condiciones en la producción de las células 
pero al modificar las formas geométricas del agitador se evidenció que el 
crecimiento disminuía notablemente. Al igual que se notó que los cambios en el 
cultivo se deben a contaminación en el medio (Annathur, 2003). 
 
En 1983 se realizaron experimentos en los que se utilizaron células de 
adenocarcinoma humano de colon LS174T cultivándolas en monocapa, spinner y 
cultivos tripsinizados; el estudio mostró que la producción de células cultivas en 
spinner fue mayor que en las células cultivadas en monocapa, lo cual permitía la 
producción de liposomas y actinomicin D (Tom, 1983). 
 
En 1983 se presentó un estudio encaminado a la producción del factor de 
crecimiento neural (NGF) en células PC12 derivadas de feocromocitoma en 
cultivos en suspensión los cuales no producen neuritas en este cultivo pero si 
forman pequeñas extensiones comparables con las producidas en células de este 
tipo cultivadas en monocapa. Estas extensiones son importantes en la locomoción 
y transporte del citoesqueleto, componentes de membrana y neurotransmisores. 
(Tischelr, 1983). 
 
Se presentó un trabajo en 1980, titulado «Crecimiento de líneas celulares de 
mamíferos en cultivos en spinner» demostrando que células derivadas de 
embriones, de adultos normales o de tejidos malignos pueden ser adaptadas a 
crecimiento de larga duración con medio apropiado y en agitación permanente. Al 
igual, se demostró que la adaptación de diferentes tipos celulares que 
naturalmente crecen en monocapa adheridas a superficies pueden ser adaptados a 
suspensión en un tiempo relativamente corto (de una a tres semanas). Igualmente 
en ese trabajo se describen detalladamente las características para mantener 
cultivos de células animales cultivas en spinner (Hlubinova, 1980). 
 27
 
 
 
En 1973 se realizó un estudio sobre el crecimiento de fibroblastos de hámster en 
cultivos en monocapa y en cultivos en suspensión utilizando spinner. Este estudio 
se realizó para observar la diferencia en cuanto a producción de la síntesis del 
glicolípido de Forssman (GL-5) en células de dos clones de hamsters. Sin 
embargo, este caso es el único en mostrar fallas en los cultivos realizados en 
spinner en cuanto a la respuesta densidad-dependiente (Sakiyama, 1973). 
 
En 2006 se realizó un estudio utilizando células derivadas de embriones del 
insecto lepidóptero Anticarsia gemmatalis, para constituir un sustrato celular 
adecuado para la producción in vitro del virus de la poliedrosis nuclear múltiple 
de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV), un baculovirus extensamente utilizado 
como insecticida biológico para controlar la oruga de las leguminosas, una plaga 
principal de los cultivos de soya. Las células UFL-AG-286 fueron adaptadas al 
cultivo en suspensión agitada. Los cultivos adaptados crecieron con un tiempo de 
duplicación de 28,9 horas, y alcanzaron una densidad celular máxima de 3,70 x 
106 células/mL (Gioria, 2006). 
 
En 1999 se realizó un estudio sobre la eliminación de suero en los medio para 
cultivos celulares. Observaron que el crecimiento de líneas células utilizadas en 
biofarmacéutica en ausencia del suero animal, ha sido intentado por muchos 
investigadores para mejorar el proceso y la calidad del producto, previniendo la 
exposición a agentes adventicios, y reduciendo gastos. Revisiones en la literatura 
sugieren que estudios académicos sobre el medio sin suero han sido buscados 
durante décadas, con variación en los niveles de éxito para tipos diferentes de 
células y líneas celulares en términos de alcanzar el crecimiento, conservando la 
función. 
El trabajo reciente con células CHO y con algúnos hibridomas ha sido acertado 
para propagar células en mayor escala en cultivosen suspensión en ausencia 
total de suero, conservando la capacidad de producción. En algunos casos, esto 
puede ser alcanzado no sólo sin el suero, sino también sin el empleo de otras 
proteínas extraídas de animales (Lubiniecki, 1999). 
 28
 
 
 
En 1991 se estudió la tecnología básica para las condiciones de cultivo de células 
para la producción de sustancias útiles como citoquinas. Varias clases de 
citoquinas pueden ser presentadas y expresadas en células Namalwa KJM-1. 
Algunos de estos fueron producidos en grandes cantidades por el empleo de un 
método de amplificación génico con genes dhfr, aun cuando las células Namalwa 
KJM-1 contuvieran genes endógenos dhfr. Para la producción estable de la 
proteína objetivo, las células Namalwa KJM-1 fueron útiles para esta producción, 
debido a que no tienen ninguna actividad eficaz endógena de proteasas en el 
medio condicionado. Usando cultivos en suspensión y un sistema de diálisis, la 
productividad específica de las proteínas objetivo no disminuyó en una alta 
densidad de células (Hosoi, 1991). 
 
En 1991 se realizó un estudio que llevo a observar que los Hibridomas se presta 
particularmente bien a técnicas de cultivo a gran escala ya que ellos crecen como 
células individuales en la suspensión sin requerir suero en el medio a una densidad 
similar a la adquirida en cultivos con suero animal, produciendo anticuerpos en 
igual cantidad. Esta revisión se concentró principalmente en el cultivo de 
hibridomas en medio libre de sueros con el objetivo de producir anticuerpos 
monoclonales (Merten, 1991). 
 
En el 2007 se examinó el gran potencial de las células del tallo cerebral humano 
embrionario (hES), células que ofrecen la oportunidad de estudíar procesos 
básicos del desarrollo in vitro así como para la producción de medicamentos, 
siendo estos usados como modelos de enfermedades, o la futura terapia celular. 
El requisito mas importante para la generación de progenies de células nerviosas 
humanas representa el requisito previo más importante. En este estudio se usaron 
seis líneas celulares hES para evaluar condiciones definidas para la diferenciación 
de los nervios en cultivos en suspensión y adherentes sin utilizar suero fetal, 
células alimentadoras o acido retinoico en ninguna parte del proceso. 
Supervisando la neurogénesis de cada una de las líneas usadas, en su morfología 
mediante ensayos inmunocitoquímicos y ensayos de RT-PCR (Nat, 2007). 
 29
 
 
 
En 2006 investigadores trabajaron en el aislamiento y el cultivo de tumores 
cerebrales humanos obtenidos en operación quirúrgica y estudíaron sus 
características biológicas. Los gliomas fueron totalmente cortados, tripsinizados, y 
filtrados para preparar suspensiones de células individuales. Las células fueron 
cultivadas en medio sin suero, purificadas y cultivadas continuamente in vitro 
para obtener esferas de células de tumor. Indujeron a las células tumorales del 5° 
pase a crecer con 10 % de FBS, y la expresión de marcadores de diferenciación 
de células como Nestin, MAP2, GFAP fue evaluada con técnicas 
immunocitoquimicas. Estas células mantuvieron un estado de crecimiento 
parecido a una esfera in vitro (3 meses, 14 pasos), al igual que autorenovarse, 
proliferar y condicionalmente diferenciarse en MAP2 (+) Y GFAP (+) células. Sin 
embargo, las células no tuvieron estas propiedades (Huang, 2006). 
 
En 2006 se realizó cultivo y subcultivo para células de glioma e investigaron el 
potencial de diferenciación de estas. Las células de glioma humano fueron 
disociadas mecánicamente y luego cultivadas en medio N2 o el B27 con el factor 
de crecimiento básico de fibroblasto (bFGF) y el factor de crecimiento epidérmico 
(EGF), identificados inmunocitoquímicamente. Los gliomas humanos fueron 
cultivados satisfactoriamente con crecimiento celular individual de células en 
suspensión, las cuales pueden ser cultivadas y pasadas a cultivos en monocapa. La 
mayoría de las células expresaron vimentin y nestin, que son los marcadores para 
células de tallo de los nervios. Igualmente se diferenciaron en neuronas y 
astrocitos, y expresaron proteína ácida fibrilar de la glia (GAFP) y beta III-
tubulina respectivamente (Yang, 2006). 
 
2.3.3. Líneas celulares derivadas de sistema nervioso 
 
Una de las herramientas más eficientes para el estudio del desarrollo neural y la 
restauración de enfermedades neurológicas, es el sistema modelo que ofrecen las 
líneas celulares inmortalizadas; de igual manera las líneas y cultivos primarios son 
de vital importancia en estudios oncogénicos para el establecimiento de 
 30
 
 
características y funciones de las células precursoras de tumores. Recientemente 
se han obtenido líneas celulares de neuroblastomas y gliomas, partiendo de células 
tumorales únicas, brindando una oportunidad para la investigación de diferencias 
fundamentales entre glia y neuronas. Algunas de estas líneas celulares han sido 
producidas con ayuda de técnicas en ingeniería genética básicamente con 
inserción de genes en células inmortales ya existentes o por inmortalización de 
cultivos celulares primarios. Este método mencionado ofrece grandes ventajas 
para producir poblaciones numerosas de un mismo tipo de célula por medio de 
clonación, las cuales pueden ser manipuladas medíante cultivos con condiciones 
controladas (Hülsen, 2004; Geller, 1991). 
 
Las líneas celulares ofrecen características ventajosas en comparación a los 
cultivos primarios. Ejemplo de esto es la fácil manipulación y el crecimiento 
continuo de un mayor número de células. Claro está, con la desventaja de perder 
propiedades con relación a la muestra tumoral inicial (Gil – Salu, 2002; Westphal, 
1998). Existen aspectos relevantes al momento de iniciar o trabajar con una línea 
celular; la línea celular surge de un cultivo primario, es por esto que se hace 
necesaria la caracterización de las células por su origen gliar (determinante al 
momento de conocer el linaje) (Westphal, 1998). Como primera medida es 
necesario entender que los tumores gliales representan el más común de los 
tumores intracraneanos, debido a sus características sobresalientes de malignidad, 
resistencia a terapias tales como quimioterapia e irradíación antes de la cirugía, así 
como también de la rápida evolución de los mismos (Escobar, 2002; Kleihues, 
2000). 
 
Como antes ya se había mencionado, en las líneas celulares se encuentran 
múltiples clones celulares neuronales. Ejemplo de esto son las líneas celulares 
C1300 de células neuronales, C6 y CHB de astrocitomas (McMorris, 1973) y las 
líneas de células de Schwann RN-2 (Pfeiffer, 1972). A continuación se expondrá 
brevemente la importancia de cada una de estas líneas celulares de orígenes 
cerebrales diversos. 
 
 31
 
 
La línea C1300 induce el incremento de producción de AMP cíclico (cAMP), como 
también el aumento de la actividad de Tirosin hidroxilasa y dopamina β-
hidroxilasa (Waymire, 1978). Es importante resaltar que el AMP cíclico estimula 
el crecimiento de neuritas en neuroblastomas cultivados (Rindler, 1978). 
 
La línea C6 y CHB resaltan otra importante función de las líneas celulares, la cual 
se basa en la producción de proteínas en altos niveles, lo cual es de gran 
importancia en la industria farmacéutica. Esta línea presenta niveles altos de la 
proteína S-100, molécula característica del cerebro de vertebrados, debido a su 
papel en el desarrollo y fisiología del cerebro (Phillips, 1993) y por el control que 
ejerce sobre la actividad de la trombina, involucrada en mitogénesis y 
diferenciación (Dinhanich, 1991) y encontrada en tumores cerebrales de humanos 
y animales (McMorris, 1973; Benda, 1968; Phillips, 1993). 
 
La línea de células de Schwann RN-2 tiene como característica importante la 
capacidad relativa de responder al factor de crecimiento S-100, sugiriendo así que 
las células de Schwann de rata, porel estímulo crónico mitogénico pueden 
proporcionar un modelo experimental de animal para schwannomas humano y 
neurofibromas. 
Es conocida la posibilidad de cultivar células tumorales malignas in vitro para 
posterior estudio y así obtener líneas celulares de tumores tomados por biopsias de 
pacientes (Ridder, 1987; Bjerkvig, 1990). 
 
Estas líneas pueden mantenerse durante varios meses congeladas, revivirlas y 
transferirlas a cultivos en monocapa o en suspensión. Al mismo tiempo, se pueden 
reimplantar en modelos animales para usarse como una medida para la migración 
de la célula tumoral bajo condiciones reguladas (Bjerkvig, 1986) o para la 
caracterización del genotipo y fenotipo de las células invasivas (Bigner, 1987; 
Bjerkvig, 1989). En estudios histológicos de tumores malignos del cerebro de 
ratas y humanos, los tumores se han propagado a astrocitomas, 
oligodendrogliomas, glioblastomas, schwannomas y meduloblastomas malignos 
(Bjerkvig, 1990). Es interesante que algunos explantes de tumores sólidos retienen 
 32
 
 
sus características histológicas in vitro como por ejemplo los glioblastomas o 
schwannomas. Sin embargo, en muestras pequeñas de tejido tumoral, la 
caracterización biológica es más fiable que la histológica (Hülser, 2004). 
 
Con esta gran cantidad de métodos de cultivo, dirigido al estudio de las 
poblaciones de células nerviosas, esta disponible una potente herramienta para el 
estudio de invasiones en el tejido de cerebro in vivo. Como puede apreciarse, los 
conocimientos básicos sobre el metabolismo de estas células tumorales las haría 
más manipulables para producir proteínas y metabolitos que podrían explotarse a 
nivel industrial utilizando ingeniería metabólica. 
 
2.4. Ependimocitos en el epitelio y Ependimoma 
Las células ependimales son células que recubren los ventrículos en la parte 
central del cerebro y la médula espinal y proveen la vía a través de la cual circula 
el líquido cefalorraquídeo. Las células gliales normales crecen y se dividen muy 
lentamente. La mayoría de los tumores del cerebro y de la médula espinal se 
originan a partir de las células gliales (Gatta, 2002). 
El epitelio ependimario está formado por células gliales de origen 
neuroectodérmico que revisten las cavidades que derivan del tubo nervioso: el 
epéndimo y los ventrículos cerebrales. Durante el desarrollo, el epitelio que tapiza 
las cavidades del SNC forma la "zona ventricular" y su proliferación da lugar a los 
neuroblastos y glioblastos que se diferenciarán para formar las neuronas y las 
células gliales del SNC. Cuando las células de la zona ventricular dejan de 
dividirse se diferencian para formar el epitelio ependimario (Moynihan, 2003). 
 
El epitelio ependimario es un epitelio simple cúbico-cilíndrico ciliado en el que se 
pueden distinguir dos tipos diferentes de células ependimarias: los ependimocitos 
propiamente dichos y los tanicitos. En algunas zonas de la luz ependimaria o 
ventricular existen unas células aisladas sobre la superficie de los ependimocitos: 
células supraependimarias. Estas células supraependimarias tienen expansiones 
 33
 
 
citoplasmáticas y parece que pueden penetrar en el tejido nervioso y convertirse 
en macrófagos. En la superficie del epitelio ependimario también pueden 
encontrarse terminaciones sensoriales (Moynihan, 2003) 
 
• La superficie apical está cubierta de abundantes cilios y de algunas 
microvellosidades (Akimoto, 1993). 
 
• Las superficies laterales de células adyacentes están unidas por zónulas 
adherentes y uniones tipo "gap", pero no hay uniones ocluyentes (Akimoto, 
1993). 
 
• La superficie basal está apoyada directamente (sin membrana basal) sobre 
una capa subependimaria formada por astrocitos y células microgliales, y 
sus prolongaciones (Akimoto, 1993). 
 
• El citoplasma contiene fascículos de filamentos intermedios y un cúmulo de 
mitocondrias en el polo apical, además de los cuerpos basales donde se 
originan los cilios (Akimoto, 1993). 
 
• El núcleo es ovalado o redondo y su superficie es regular (Brisson, 2002). 
 
2.4.1. Funciones del epitelio ependimario 
 
Las principales funciones del epitelio ependimario son: 
• Movilizar el líquido cefalorraquídeo (LCR) que rellena las cavidades 
ventriculares y ependimaria 
• Capturar residuos del LCR (gracias a una lectina con propiedades adhesivas 
que hay en la superficie de las células ependimarias) 
• Soporte mecánico (por las prolongaciones de los tanicitos) 
• Recepción sensorial (por las terminaciones sensoriales supraependimarias) 
 34
 
 
• Intercambio de sustancias: el epitelio ependimario juega un papel 
importante en el intercambio de sustancias que tiene lugar entre el líquido 
cefalorraquídeo (que ocupa la cavidad ependimaria y los ventrículos) y el 
tejido nervioso. Los productos que se encuentran el LCR pueden alcanzar el 
espacio intercelular del tejido nervioso puesto que no existen uniones 
ocluyentes entre los ependimocitos. 
 
Cuando se dividen aumentan la progenie neuronal y glial. Se ha propuesto, 
además, que se dividen asimétricamente para formar células hijas las cuales 
permanecen indiferenciadas en la capa ependimaria mientras otras células se 
mueven hacia la capa baja subventricular, para ser una fuente precursora de 
neuronas y glia que migran hacia sus destinos finales. En experimentos con ratas a 
las que se les produjo una lesión en su médula espinal se encontró, que la división 
de las células vástago se incrementaba dramáticamente, para generar astrocitos 
migratorios dentro del área lesionada, evento aún desconocido en seres humanos 
(Hutchins, 1998). 
 
2.4.2. Ependimoma 
Los tumores primarios del sistema nervioso central (SNC) se encuentran en 
alrededor del 1% de las autopsias de hospitales generales, sin considerar las 
metástasis, que del total de los tumores del SNC representan alrededor del 30%. 
Los ependimomas son tumores del SNC que provienen de la pared del sistema 
ventricular a lo largo del eje entero craneoespinal (Kleihues, 2002). Aunque 
ependimomas de regiones diferentes del SNC son histológicamente similares, 
ellos son clínica (Moynihan, 2003) y genéticamente (Ebert, 1999; Taylor, 2005) 
distintos, sugiriendo que representan una colección de enfermedades diferentes. 
 
Los ependimomas son tumores que surgen en todos los lugares del SNC. Poco se 
conoce en cuanto a los procesos celulares y moleculares que generan estos 
tumores (menos del 5% de los estudios de investigación de tumores cerebrales en 
 35
 
 
los últimos 5 años han sido sobre ependimomas). Esta carencia de conocimiento 
ha obstaculizado esfuerzos para reducir la mortalidad significativa asociada con 
ependimoma (Poppleton, 2007). A pesar que en la parte clínica los casos de 
ependimoma son mas del 6%, muy pocos datos nuevos se han recolectado sobre la 
biología y el tratamiento del ependimoma durante los últimos 20 años (Gatta, 
2002). 
Los tumores neuroepiteliales, salvo casos muy excepcionales, no dan metástasis 
fuera del SNC. Para explicar este hecho se han argumentado, entre otras razones, 
la ausencia de vasos linfáticos en el sistema nervioso central y entre éste y los 
demás órganos, y la rareza de invasión vascular sanguínea por parte de un tumor 
neuroepitelial. Ciertos tumores neuroepiteliales pueden dar metástasis 
intraorgánicas a través del líquido cefalorraquídeo, tales como el meduloblastoma, 
el ependimoma, el oligodendroglioma y el glioblastoma multiforme (Poppleton, 
2007). 
Los ependimomas presentan una frecuencia relativa de alrededor del 5% de los 
tumores primarios, la mayor parte de los ependimomas intracraneanos ocurre en la 
primera década; en cambio, la mayoría de los de la médula espinal se presenta en 
adultos, estos tumores no tiene predilección por sexo aunque presentan un leve 
predominio en los hombres; siempre tienen relación de continuidad con alguna 
zona del epéndimo. Pororden de frecuencia se presentan en hemisferios 
cerebrales, piso del cuarto ventrículo y médula espinal. Algunos de estos últimos 
se originan en el filum terminale; son los ependimomas de la cauda equina 
(Chuaqui, 1996). 
Macroscopícamente el tejido tumoral es grisáceo, granuloso, frecuentemente con 
transformación quística, y a veces con calcificaciones. Mientras que 
microscópicamente presentan un parénquima tumoral hecho de células de 
medíano tamaño, núcleos circulares u ovalados, citoplasma en regular cuantía, 
eosinófilo pálido. La celularidad y carga cromática de los núcleos es variable. Este 
tipo de tumores tiene una microarquitectura frecuente de corona radíada y menos 
frecuente en rosetas y túbulos. Los de la cauda equina tienen característicamente 
 36
 
 
degeneración mixoide, lo que hace que las coronas radíadas aparezcan como 
pseudopapilas; se los llama ependimomas mixopapilares (Chuaqui, 1996). 
2.4.3. Metabolismo de los ependimocitos 
Glutamina sintetasa 
La glutamina sintetasa (GS), es una proteína que cataliza la conversión de 
amoníaco y glutamato a glutamina. En el sistema nervioso de los vertebrados la 
glutamina sintetasa está presente en todas partes del cerebro jugando un papel 
central en la desintoxicación de amoníaco cerebral y en la regulación metabólica 
del neurotransmisor glutamato. La GS esta localizada principalmente en 
astrocitos, tanto in vivo como in vitro. Además, la GS ha sido descrita en células 
radíales de la glial y en algunas células ependimales en vertebrados inferiores. Y 
tambien se ha reportado que se encuentra en oligodendrocitos (Niño, 2005). 
La glutamina sintetasa esta implicada en la destoxificación del amonio en el 
cerebro. Esta enzima se encuentra exclusivamente en los astrocitos y, en estos, 
específicamente en el citosol. La actividad de la enzima aumenta hasta las dos 
primeras semanas de vida postnatal. Los niveles de la actividad de la GS están 
relacionados con la maduración de los astrocitos por lo que se ha propuesto que la 
GS puede ser utilizada como una enzima marcadora de la maduración de los 
astrocitos. Sin embargo, no hay un apreciable incremento de la actividad de esta 
enzima en cultivos primarios de astrocitos, indicando que la diferenciación de 
estas células está seriamente limitada en cultivo. No obstante, la magnitud de este 
efecto se disminuye en cocultivos con neuronas, que inducen la actividad de la GS 
en los astrocitos. Estos resultados sugieren que, durante el desarrollo, las neuronas 
juegan un papel importante en la diferenciación de los astrocitos. Por otro lado, 
experimentos de resonancia magnética nuclear (NMR) con (1-13C)-glucosa, han 
puesto de manifiesto que los astrocitos en cultivo liberan glutamato al medio, lo 
que indica que in vitro existe actividad de la GS (Niño, 2005). 
Uno de los papeles más importantes de los astrocitos en el cerebro es proteger las 
neuronas contra la excitocisidad debido a la captura de el exceso de amoníaco y 
glutamato y convirtiéndolo en glutamina vía GS. La Glutamina liberada al 
 37
 
 
espacio extracelular por la accion de la GS, puede ser usada por neuronas como un 
precursor de glutamato. El glutamato liberado por neuronas entonces puede ser 
capturado por astrocitos y convertido de nuevo en glutamina (Hertz et al., 1978). 
Los niveles normales de amoníaco en el cerebro aparecen cuando los astrocitos 
convierten glutamato a glutamina, manteniendo el glutamato intracelular en un 
nivel muy bajo. 
La GS glial también puede estar implicado en estados patológicos cerebrales por 
el aumento o disminución de los niveles de la enzima, aunque la respuesta 
especifica responde específicamente de la lesión. Por ejemplo, la actividad de la 
GS disminuye en la corteza cerebral en la enfermedad de Alzheimer, en particular 
en los alrededores de placas seniles. GS también se disminuye en las condiciones 
de privación de glucosa. Sin embargo, GS aumenta después de isquemias al igual 
que en casos de hiperamonemia en astrocitos que normalmente no muestra GS-
inmunoreactividad (Niño, 2005). 
La expresión de la enzima glutamina sintetasa (GS) fue estudíada en varios 
tumores humanos cerebrales y comparado con resultados obtenidos de la 
expresión de la proteína acida fibrilar de la glia (GFAP) utilizando 
immunoperoxidasa indirecto y métodos peroxidase-anti-peroxidase. Los 
Astrocitomas dieron positivo para GS, los ependimomas fueron débilmente 
positivo, aunque mostro una reacción densa GFAP fuera descubierta alrededor de 
vasos sanguíneos; posiblemente debido a la presencia de procesos del pie 
astrocitico. Oligodendrocitomas y meningiomas fueron generalmente negativos 
(Pilkington, 1982). 
La presencia de esta enzima fue reportada en 1984 en una investigación sobre la 
heterogeneidad celular en cultivos primarios de células cerebrales haciendo 
pruebas inmunocitoquímicas para ver la localizacion de la glutamina sintetasa, 
proteína acida fibrilar de la glia, galactocerebrosidos y fibronectina, localizadas 
por inmunofluorescencia. Encontrando que aproximadamente la mitad de la 
proteína acida fibrilar de la glia la contienen los astroblastos. En los cultivos 
celulares que reportaban presencia de glutamina sintetasa, no se reportó presencia 
 38
 
 
de fibronectina. Esto sugiere la presencia de dos poblaciones diferentes de células 
en los cultivos (Hallermayer, 1984) 
En 1986 se reportó de nuevo la expresión de proteína acida fibrilar de la glia, 
proteína S100 y glutamina sintetasa en ependimocitos. La expresión de estas tres 
proteínas en células ependimales de raton fueron estudíada por el empleo de la 
técnica immunocitoquímica peroxidasa-antiperoxidase en cultivos celulares in 
vitro. (Didier, 1986). 
En 1998, se reportó la presencia en ependimocitos de la enzima glutamina 
sintetasa en una revision sobre la expresión de glutamina sintetasa, ademas de la 
morfología de estas celulas y cuales son los efectos del galactosil-ceramida en la 
expresión de la GS. Igualmente dan nuevas ideas sobre resultados relatados en 
otras publicaciones sobre el cultivo in vitro de células ependimales y las 
expresiones neuropeptidicas y neurosecretoras reguladas por la activación 
serotoninergica (Gabrion, 1998). 
En 1993, se realizó el análisis inmunohistoquímico de Glutamina sintetasa en 
tejido de tumor normal cerebral, usando el anticuerpo anti-GS. La GS no estaba 
presente en absoluto en las células ependimales pero si fue visto en astrocitos. De 
otra manera, GS fue expresado sólo en las células de tumor metastaticas 
cerebrales. La expresión de GS en el cerebro normal reflejó la función innata por 
su presencia pronunciada en el astrocitos, donde la transmisión de ácido glutamico 
era abundante. Este encuentro junto con la expresión histological relacionada con 
la malignidad de GS en el astrocitomas y ependimomas sugiere que esto pudiera 
ser no sólo un marcador útil para el díagnóstico de tumor pathologico, sino 
también útil para evaluar cataplasia funcional de células que componen tumor o su 
potencial de proliferación (Akimoto, 1993). 
En el año 2002, se establecieron condiciones para el cultivo a largo plazo de 
ependimocitos humanos tumorales. Histológica e inmunológicamente, mostraron 
que los rasgos de estas células cultivadas eran similares a los del tumor in vivo. Y 
advierten que este modelo de cultivo puede representar un nuevo instrumento 
 39
 
 
poderoso para estudiar nuevas estrategias de entrega terapéuticas en células 
tumorales (Brisson, 2002). 
 
3. Formulación del problema y justificación 
3.1. Formulación del problema 
El cultivo de células animales ha adquirido gran importancia en los últimos años 
en vista de que este tipo de células pueden ser utilizadas para la producción de 
proteínas recombinantes de uso farmacéutico, ya que en ellas se pueden efectuar 
glicosilaciones que no son posibles ni en levaduras ni en bacterias.Los ependimomas son tumores primarios del sistema nervioso, que afectan a 
niños y adultos. La incidencia poblacional estimada en nuestro medio de los 
ependimomas malignos es de aproximadamente 4 casos por 100.000 
habitantes/año. Si bien la incidencia poblacional de los gliomas no es muy alta en 
términos relativos, la falta de un tratamiento eficaz supone un problema médico de 
gran importancia. Además, los ependimomas representan el 3 - 9% de los tumores 
neuroepiteliales de pacientes de edades inferiores a 9 años. 
3.2. Pregunta de investigación 
¿Existe diferencia en el crecimiento y productividad de cultivos de células 
derivadas de ependimoma adaptadas a suspensión utilizando diferentes 
concentraciones de Suero Fetal Bovino? 
3.3. Justificación de la investigación 
La productividad de las células adherentes es relativamente baja y es necesario 
contar con un mecanismo que produzca una gran concentración de células para 
alcanzar un mejor rendimiento, este mecanismo es el cultivo de las mismas células 
animales pero en suspensión. A pesar de que existen células que solamente crecen 
en suspensión, la mayor parte de las células que se mantienen en cultivo proceden 
de disgregación tisular o de tumores que necesitan adherirse al sustrato para 
mantenerse. El cultivo de células en suspensión tiene algunas ventajas de interés 
 40
 
 
industrial: mayor facilidad de manipulación y pase de un cultivo al siguiente 
(replaqueo) pues no requieren separación del sustrato medíante tripsinización; 
posibilidad de escalamiento a mayor escala incrementando la biomasa. Sin 
embargo también tiene algunas desventajas: son cultivos homogéneos en los que 
se pierden interacciones celulares y existe gran dificultad en la purificación de los 
productos principalmente proteínas por la utilización de suero. 
En este trabajo se buscará la adaptación de células adherentes, de origen nervioso, 
a cultivos en suspensión buscando aumentar la productividad medida como 
biomasa y disminuyendo al máximo la cantidad de suero necesario para mantener 
su crecimiento. 
4. Objetivos 
4.1. Objetivo General 
• Obtener una línea celular primaria de un ependimoma humano y 
adaptar las células adherentes derivadas del tumor a cultivos en 
suspensión (spinner). 
4.2. Objetivos específicos 
• Determinar las características inmunohistoquímicas del ependimoma. 
• Mantener in vitro y determinar las características inmunocitoquímicas 
de las células derivadas de ependimoma. 
• Criopreservar la línea celular obtenida. 
• Adaptar la línea de células derivadas del ependimoma a suspensión 
utilizando Spinner y evaluar su crecimiento y productividad de un 
cultivo. 
 
5. Materiales y Métodos 
5.1. Materiales 
Biopsia de ependimoma; cajas de 12 pozos estériles; tubos Falcón (15 ml); celdas 
para espectrofotómetro; tubos Eppendorf; azul de tripano; PBS; tubos de ensayo; 
tripsina; agua desionizada; frascos Roux; botellas estériles (Shott®); suero fetal 
 41
 
 
bovino (BFS); pipetas; micropipetas; gasa; algodón; filtro; medio Eagle 
modificado por Dulbecco (DMEM); azul de Comassie, cristal violeta. 
 
Las muestras fueron obtenidas de biopsias de pacientes díagnosticados con 
ependimoma, a partir de neurocirugía en el Hospital San Ignacio. La muestra se 
dividio en dos partes una fue fijada en formol (Laboratorio de Neuropatología) y 
la otra fue enfriada asépticamente y trasladada al laboratorio de 
Neurobioquímica, para hacer el proceso de disgregación e iniciación del cultivo 
en monocapa (Ver anexo 1). 
 
5.2. Equipos 
Centrifuga; sonicador; incubadora; agitador magnético; cámara de Neubauer; 
cabina de flujo laminar; bomba de vació; microscopio invertido; spinner; 
espectrofotómetro. 
 
5.3. Métodos 
5.3.1. Seguimiento citomorfológico de las células cultivadas en monocapa. 
Se identificaron las diversas variaciones morfológicas con prolongaciones 
celulares, cuerpos celulares de forma plana y alargada de forma que coincidiera 
con lo descrito por otros autores. Al final del cultivo se formó una monocapa 
homogénea de células. Se observó un crecimiento logarítmico de la población de 
células desde el primer momento del cultivo hasta que llegaron a la confluencia. 
 
5.3.2. Preparación del cultivo de células en placa 
Para la realización de los cultivos, una fracción de tejido del tumor cerebral se 
sometió a un proceso de disociación mecánica en el laboratorio de 
Neurobioquímica. (Tovar, 1995). 
Se sembraron explantes del tumor en 5mL de medio DMEM más 10% de SFB en 
frascos Roux y incubaron a 37°C con un 5% de CO2. Se hizó seguimiento en el 
microscopio para ver si aumentaba la cantidad de células. Cuando las cajas tenían 
 42
 
 
un 90% de confluencia se realizó un replaqueo de células, el cual consistió, en 
succionar el medio (se debe estar seguro que las células estan adheridas a la placa) 
por medio de una bomba de vacio bajo cámara de flujo laminar. Posteriormente 
las cajas se lavaron con 3 mL de PBS, se succionó el PBS y se adicionaron 3mL 
de Tripsina-EDTA al 10%; y se llevó la caja a incubadora por 5 minutos. Posterior 
a esto se retiró de la incubadora y se golpeó la base; se miró al microscopio para 
asegurarse que las células se despegaron de esta. Se adicionaron 3 mL de DMEM 
+ SFB y se recogió en un tubo Falcom. Posteriormente se centrifugó a 1800 rpm 
por 5 min; se succionó el sobrenadante y se resuspendieron las células en 1 mL 
de DMEM + SFB. Se hizó conteo de células en la camara de Neubauer y se 
siembra en cajas Roux según el número de células existentes (900000/mL). Este 
proceso se lleva a cabo tres veces, llevando el cultivo al tercer pase, en donde se 
siembran en pozos y se hizo la curva de crecimiento. 
En los cultivos adherentes en pozos, se trabajaron 3 por día (cada tres días) para 
determinar número de células, cantidad de proteína, contenido de DNA. Para la 
determinación del número de células se utilizó la solución de azul de tripano (5%) 
para células viables. 
 
La determinación de proteína se realizó por la técnica de Bradford y UV 
(Stoscheck, 1990; Copeland, 1994). La cuantificación de la cantidad de DNA se 
llevó a cabo por la técnica espectrofotometrica; las muestras se llevaron a una 
celda de cuarzo para su lectura a 260, 280nm de absorbancia en un 
espectrofotómetro de luz ultravioleta (Current, 1989) (ver anexo 5). 
 
5.3.3. Caracterización inmunohistoquímica del ependimoma 
Una fracción del tumor fue fijado en formol al 10 % en buffer fosfato pH 7.2, 
deshidratado e incluido en parafina en láminas con HISTOGRIP para evitar el 
desprendimiento del tejido. Posteriormente se lavó con TRIS, se secó y colocó en 
solución bloqueadora para evitar marcaje de sitios inespecíficos; posteriormente 
se escurrió y se colocaron los anticuerpos: proteína ácida fibrilar de la glía 
(GFAP), Sinaptofisina, proteína Ki-67 y proteína S-100 en cámara húmeda. Se 
 43
 
 
lavó con TRIS y se secó cada lámina manualmente. Se agregó avidina-biotina, se 
lavó con TRIS y se reveló con díaminobenzidina (DAB). Se hizo contraste con 
hematoxilina de 30 a 45 seg, se enjuagó, deshidrató y montó. Esta caracterización 
se llevó a cabo en el laboratorio de Neuropatología (Gil-Salu, 2002) (ver anexo 3). 
 
5.3.4. Almacenamiento y reconstitución de los cultivos celulares. 
5.3.4.1. Congelamiento 
Protocolo 
1. Resuspender la monocapa empleando cell scraper. 
2. Centrifugar a 500g por 5 minutos. 
3. Retirar el sobrenadante. 
4. Resuspender suavemente el botón celular y adicional 1 mL de medio de 
congelamiento (Medio de congelamiento: 10% de dimetil sulfoxido 
(DMS) en FBS). 
5. Tomar la suspensión y depositarla en un criovial. 
6. Congelar a -70°C durante 24 horas y luego llevar a nitrógeno líquido. 
 
5.3.4.2. Descongelamiento 
Protocolo 
1. Preparar un tubo para centrifuga con 9 ml de medio sin suero fetal bovino. 
2. Tomar el criovial y llevarlo a 37°C en baño de