Andrologia Fundamentos y metodos

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ANDROLOGIA HUMANA 
Fundamentos y métodos 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MgSc. Yoeli Méndez 
 
 
Factor masculino y reproducción. 
 
Generalmente, se da inicio a la consulta por reproducción asistida luego de que la pareja 
ha mantenido relaciones sexuales, al menos, a lo largo de un año sin lograr un embarazo. 
Es conocido que pueden coexistir patologías en el hombre y la mujer que impiden que 
se concrete la procreación, ya sea que se trate de eventos que alteren la calidad 
espermática o disfunciones del tracto reproductivo de la mujer. Sin embargo, la consulta 
por reproducción asistida permite evidenciar que, en casi el 50% de los casos de fallas 
reproductivas existe participación del factor masculino, bien sea por causas endocrinas, 
inmunológicas, infecciosas, genéticas o por exposición a factores ambientales como la 
temperatura y elementos tóxicos (Teppa-Garrán y Palacios-Torres, 2004). 
 
 
Es imperante realizar, además de la exploración física y la valoración de la historia del 
paciente, la valoración andrología bajo la figura de un espermograma. Este estudio se 
basa en la cuantificación y cualificación de los valores como el volumen, viscosidad, 
concentración, movilidad y morfología de los espermatozoides, así como también en la 
verificación de la integridad de la membrana plasmática, la selección de espermatozoides 
con acrosoma íntegro y la revisión de la capacidad de fecundación de ovocitos y de 
descondensación del DNA espermático (Palma, 2001). 
 
Este tipo de estudio debe ser realizado en unidades especializadas en reproducción 
asistida que cuenten con un personal altamente capacitado, sea un médico o biólogo con 
perfil de andrólogo clínico, y que dispongan de un equipamiento y suministros de la más 
alta calidad para lograr reproducir los eventos fisiológicos propios de la maduración e 
interacción de gametos en el laboratorio y además garantizar la repetibilidad de los 
resultados. 
 
 
 
 
Aparato reproductor masculino 
 
Los órganos sexuales masculinos están constituidos por una compleja disposición de 
órganos genitales internos y externos. Su función es la reproducción y el placer sexual. 
Los órganos genitales internos son las gónadas masculinas (testículos), el epidídimo, una 
variedad de conductos y las glándulas accesorias. El pene y el escroto conforman 
los órganos sexuales externos. 
 
 
La célula espermática. 
1. Morfología del espermatozoide. 
El espermatozoide es el gameto masculino producido en los túbulos seminíferos tras 
el proceso de espermatogénesis. Se encuentra constituido básicamente por tres partes: 
 
- Cabeza: Posee un núcleo haploide, aplanado con forma oval, conteniendo 
cromatina muy compactada por la formación de un complejo DNA-protaminas. El 
acrosoma es un saco delgado membranoso que se halla situado en la región anterior de 
la cabeza. Contiene enzimas acrosómicas como la acrosina y la hialuronidasa que 
participan en el proceso de fecundación. 
 
- Pieza media: Se encuentra en la región media del espermatozoide y alberga las 
mitocondrias que proporcionan la energía para la supervivencia del gameto y el batido 
flagelar. 
 
- Cola: Es un apéndice flagelar ubicado en la parte posterior de la cabeza, en el 
cual se encuentran las mitocondrias de los espermatozoides. Está formada por el cuello 
y los segmentos medio, principal y caudal. Este apéndice brinda al espermatozoide la 
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movilidad requerida para desplazarse hasta el ovocito, a través del tracto genital 
femenino (Hafez y Hafez, 2000). 
El testiculo 
 
Se trata de las gonadas masculinas, dispuestas a modo de par. Esta estructura se 
encuentra bajo resguardo del sistema inmune por acción de la barrera hematotesticular 
y la regulación de su temperatura está garantizada por la función de un complejo de 
capas y musculos entre los que se encuentran el cremaster y dartos, asi como la tunica 
albugínea. 
 
El testiculo se encuentra compuesto por el parénquima testicular, constituido por 
distintos tipos celulares, entre los que se distinguen una línea germinal (esperatogonias, 
espermatocitos y espermatozoides) y una línea somatica (Celulas de Leydig, Sertoli, 
células mioides). 
 
 
2. Espermatogénesis. 
La espermatogénesis es un proceso que tiene lugar en los testículos, a lo largo de 
los túbulos seminíferos, encontrándose regulada por una serie de hormonas como lo son 
la Hormona Liberadora de Gonadotropina (GnRH), la Hormona Folículo Estimulante 
(FSH) y la Hormona Luteinizante (LH), entre otras. La espermatogénesis tiene una 
duración de 62-75 días. 
 
Dicho proceso, a través de sucesivas divisiones celulares y modificaciones nucleares 
y citoplásmicas convierten una célula esférica y dipolide (2n), denominada 
espermatogonio; en cuatro células flageladas y haploides (n), denominadas 
espermatozoides (Roosen-Rungen, 1969). La espermatogénesis se divide en: 
 
 
 
2.1. Espermatocitogénesis. 
 
En esta fase ocurre una proliferación continua de las espermatogonias diploides, 
ubicadas en la región más distal de la luz del túbulo seminífero, para establecer un 
reservorio de células germinales. Dichas espermatogonias se transformarán en 
espermatocitos primarios, los cuales sufrirán la primera división meiótica, para formar 
dos espermatocitos secundarios haploides. Finalmente, ocurre la segunda división 
meiótica, dando origen a dos espermátides, que se caracterizaran por presentar sólo una 
cromátida hermana por cromosoma (Hafez y Hafez, 2000). 
 
 
2.2. Espermiogénesis. 
 
Durante dicha fase, las espermátides sufren modificaciones nucleares y 
citoplásmicas, que comprenden desde la formación de los gránulos proacrosómicos, 
pasando por la remodelación de la cromatina, hasta la formación del flagelo (Olivera y 
col., 2006). 
 
 
La remodelación de la cromatina espermática en esta fase consiste en el intercambio 
de histonas por proteínas de transición denominadas TP1 y TP2, lo que favorecerá una 
mayor condensación del material nuclear al atravesar el epidídimo. El núcleo pasa de ser 
esferoide a aplanado y alargado y los espermatozoides son liberados a la luz del túbulo 
seminífero (Hafez y Hafez, 2000). 
 
2.3. Espermiación. 
Proceso en el que las células espermáticas son liberas del parénquima testicular y se 
dirigen hacia el epidídimo para continuar el proceso de maduración. (Hafez y Hafez, 
2000). 
 
 
 
 
3. Maduración espermática. 
 
 
Los espermatozoides testiculares no poseen el potencial de fecundar al ovocito, por 
tal razón deben sufrir un proceso de maduración que les permita adquirir la capacidad 
de desplazarse hacia el ovocito y penetrarlo. Tales condiciones se adquieren cuando los 
espermatozoides transitan el epidídimo y el tracto genital femenino. 
 
3.1. Tránsito a través del epidídimo. 
 
El tránsito de los espermatozoides a través del epidídimo transcurre a lo largo de 10-
15 días, tiempo en el cual ocurre una modificación extensiva de la membrana plasmática 
de los espermatozoides, donde proteínas de alto peso molecular son sustituidas por 
proteínas de bajo peso molecular. Ocurre también una alteración de la composición de 
los lípidos de membrana, lo que aumenta la fluidez y permeabilidad de la misma. Estas 
modificaciones permiten a los espermatozoides adquirir movilidad y unirse a la zona 
pelúcida de los ovocitos (King, 1993). 
 
Durante la maduración en el epidídimo se da la sustitución de las proteínas de 
transición por protaminas. Las protaminas son proteínas básicas de bajo peso molecular, 
caracterizadas por ser ricas en residuos de arginina y cisteína, lo que les permite unirse 
al DNA y formar puentes disulfuro inter e intramoleculares,estabilizando y compactando 
altamente la cromatina espermática. En mamíferos, se conocen dos tipos de protaminas, 
la protamina P1 y la protamina P2 (D’Occhio y col., 2007) las cuales se encuentran 
presentes de manera proporcional en el núcleo de espermatozoides humanos 
(Torregrosa y col., 2006). 
 
 
La protamina P1 es una proteína rica en arginina y cisteína compuesta por 50 
aminoácidos aproximadamente. En la mayoría de las especies el dominio de unión al 
DNA consiste en una serie de secuencias que contienen de 3 a 11 residuos de arginina, 
los cuales unen la proteína al material genético (Balhorn, 2007). 
 
 
La protamina P2 es una proteína rica en histidina, constituida por 36-54 aminoácidos 
(D’Occhio y col., 2007), presenta un átomo de zinc unido a residuos de cisteína e histidina 
próximos al extremo carboxiterminal (Bianchi y col., 1992). Estudios sugieren que el zinc 
tiene como función estabilizar la estructura de la protamina, puesto que se ha observado 
que una remoción del zinc nuclear con EDTA promueve la descondensación de la 
cromatina espermática (Gatewood y col., 1990). Así como también se presume que un 
aumento del nivel de zinc nuclear conlleva a mayor condensación de la cromatina 
espermática (Hernández-Ochoa y col., 2005). 
 
 
Esta protamina, a diferencia de la protamina P1 que se sintetiza como una proteína 
madura, es sintetizada como un precursor conocido como pre-P2. El desequilibrio en la 
proporción P1/P2 a causa de la acumulación de la forma inmadura de P2 está asociada 
con la disminución de la concentración y movilidad espermáticas, el aumento de formas 
espermáticas anómalas y la disminución de la integridad del DNA (Torregrosa y col., 
2006). 
 
 
3.2. Capacitación espermática. 
 
Los espermatozoides al ser depositados en el tracto genital femenino inician una 
serie de cambios estructurales que pueden ser reversibles, producto de la remoción de 
factores estabilizantes presentes en el plasma seminal, que les permitirán establecer 
contacto con los ovocitos y penetrarlos. Entre los cambios más importantes se 
encuentran la entrada de Ca2+ al espermatozoide, remoción del colesterol de la superficie 
espermática, incremento de la fluidez de la membrana, cambio en los patrones de 
movilidad espermática y adquisición de la capacidad de sufrir la reacción acrosómica 
(Bedford, 1983; Breitbart y Naor, 1999; De Jonge, 2005). Reacción acrosómica. 
 
La reacción acrosómica es un evento exocitótico que consiste en múltiples fusiones 
entre la membrana plasmática y la membrana acrosomal externa, dando lugar a la 
formación de vesiculaciones, liberación de enzimas como la acrosina y hialuronidasa y a 
la exposición de la membrana acrosomal interna, la cual alberga en sí ligandos para la 
proteína ZP2 del ovocito, los cuales al interaccionar mantienen unidos a ambos gametos 
para la fecundación (Crozet, 1993). 
 
 
 
4. Integridad de la cromatina espermática. 
Por muchos años, los análisis convencionales seminales que incluyen evaluación 
morfológica, concentración, y movilidad espermática fueron suficientes para evaluar la 
calidad seminal. En la última década se ha incluido en tal evaluación la valoración de la 
integridad del DNA espermático (Marchesi y Feng, 2007). La información contenida en 
el DNA del espermatozoide puede verse afectada por las siguientes causas: 
 
 
4.1. Empaquetamiento defectuoso de la cromatina espermática. 
 
La presencia de protaminas asociadas al DNA espermático se encuentra relacionada 
con la formación de un complejo que permite la protección del material genético 
masculino. Una protaminación incompleta puede dejar expuesto dicho material al ataque 
de factores endógenos y exógenos como nucleasas, radicales libres o mutágenos (Oliva, 
2006). 
 
 
Durante la espermatogénesis, el intercambio de histonas por protaminas se 
encuentra asociado a la actividad de la enzima topoisomerasa II. Esta enzima tiene la 
capacidad de realizar cortes y reuniones de la molécula de DNA, disminuyendo la presión 
que sufre dicha molécula debido al superenrollamiento negativo asociado al 
remodelamiento de la cromatina espermática. La inhibición de la actividad ligasa de la 
topoisomerasa II impediría el arreglo de los cortes sufridos inicialmente y se producirían 
espermatozoides morfológicamente normales, pero con daños en la estructura de la 
cromatina (Evenson y col., 2002). 
 
 
Suganuma y col. (2005) demostraron que ratones mutantes para lo genes que 
codifican las proteínas nucleares de transición, TP1 y TP2, sufren daño del DNA al 
realizar el tránsito a través del epidídimo. También, Aoki y col. (2005) demostraron que 
la ausencia de las protaminas P1 y P2 en espermatozoides humanos eleva 
significativamente la fragmentación del DNA espermático. 
 
 
Por otro lado, Hernández-Ochoa y col. (2005) observaron que un aumento del nivel 
de zinc en el espermatozoide está asociado con una mayor condensación nuclear, lo que 
puede generar fallas en el proceso de descondensación de la cromatina causando 
infertilidad (Samocha-Bone y col., 1998). 
 
 
4.2. Apoptosis. 
 
Es un proceso de muerte celular programada basado en un mecanismo genético que 
induce alteraciones celulares, morfológicas y bioquímicas sin causar inflamación bajo 
condiciones fisiológicas normales. Durante la espermatogénesis, se encarga de limitar la 
población de células germinales a la capacidad de acción de las células de Sertoli, las 
cuales participan en el desarrollo de los espermatozoides; eliminando espermatozoides 
que han sufrido un empaquetamiento defectuoso de la cromatina espermática, entre 
otras alteraciones (Marchesi y Feng, 2007). 
 
 
Hombres con parámetros seminales normales raramente expresan marcadores 
apoptóticos (Fas) en la membrana de espermatozoides maduros. En el caso de hombres 
con alteración en la concentración espermática, ha podido observarse la presencia del 
marcador Fas en la superficie de los espermatozoides sumado a la detección de daño 
en el DNA espermático, sugiriendo el desarrollo de lo que se ha denominado “apoptosis 
abortiva” (Sakkas y col., 1999). 
 
 
 
 
4.3. Estrés oxidativo. 
 
El espermatozoide humano es capaz de producir especies de oxígeno reactivas 
(ROS), teniendo una actividad fisiológica importante en la promoción de la fosforilación 
de la tirosina, asociada con la capacitación espermática y la reacción acrosómica (Lópes 
y col., 1998; Bayker y Aitken, 2005). 
 
 
Los espermatozoides son particularmente susceptibles al daño por estrés oxidativo 
debido a la presencia de ácidos grasos insaturados en su membrana y a su baja reserva 
de enzimas antioxidantes. La exposición a ROS no sólo afecta la competencia funcional 
del espermatozoide, sino la integridad del DNA espermático (Twiig y col., 1998; Bayker 
y Aitken, 2005; Marchesi y Feng, 2007). 
 
 
Bajo condiciones fisiológicas normales el semen humano presenta bajos niveles de 
ROS producidos por el espermatozoide y por leucocitos (Lópes y col., 1998). El 
desarrollo de infecciones del tracto genital masculino desencadena la activación y 
multiplicación leucocitaria, con lo cual los niveles seminales de ROS aumentan, 
disminuyendo la funcionalidad de los espermatozoides (Marchesi y Feng. 2007). 
 
 
 
 
5. Valoración de parámetros seminales. 
 
La evaluación seminal es la primera etapa biopatológica de la valoración de la 
fertilidad de un individuo, la cual se basa en los lineamientos establecidos por la 
Organización Mundial de la Salud (OMS), a excepción de la evaluación morfológica la 
cual se realiza de manera preferencial bajo el criterio estricto de Kruger. Dicha evaluación 
permite conocer las características del plasma seminal, como lo son el aspecto, volumen 
y pH del eyaculado, así como también parámetros propios de los espermatozoides. La 
evaluación espermática se realiza bajo un microscopio de contraste de fase y platina 
calefactora. Se valoranen orden, movilidad, vitalidad, concentración y morfología 
espermática (Tapia y Rojas, 2003). 
 
- Color: Normalmente el eyaculado presenta un color opalescente o blanco 
grisáceo. Un color amarillento puede ser indicativo de prostatitis o vesiculítis crónica. 
Apariencia blanca purulenta es síntoma de infección, mientras que un color pardo en el 
eyaculado indica hemospermia (Poirot y Cherruau, 2005; Vásquez y Vásquez, 2007). 
- 
- Volumen: El volumen medio del eyaculado se encuentra entre 2 y 6ml. Una 
ausencia de eyaculado es denominada aspermia. La hipospermia hace referencia a un 
eyaculado menor de 2ml (Poirot y Cherruau, 2005; Vásquez y Vásquez, 2007). 
 
- Viscosidad: Regularmente el semen debe caer a manera de gotas. Mientras que 
el semen viscoso se aprecia cuando se forma un filamento al manipular con la pipeta 
(Poirot y Cherruau, 2005; Vásquez y Vásquez, 2007). 
 
- pH: Normalmente se encuentra en 7.2 y 8.0, un aumento evoca una afección de 
la próstata (Poirot y Cherruau, 2005). 
 
- Movilidad: Según su tipo de movimiento los espermatozoides se clasifican por la 
OMS en 4 categorías: progresivos y moderados (a), lentos (b), móviles en el sitio (c) o 
inmóviles (d). Estas categorías se expresan en porcentaje. Se considera normal la 
movilidad si el porcentaje de espermatozoides móviles es mayor a 50%. Una disminución 
del porcentaje de movilidad de los espermatozoides es denominada astenospermia 
(Poirot y Cherruau, 2005). 
 
- Vitalidad: Se basa en el uso de una coloración vital, generalmente aplicando 
eosina-nigrosina (Fig 1). El colorante penetra la membrana de los espermatozoides 
muertos tiñéndolos de color rosa (Poirot y Cherruau, 2005) considerándose normal un 
75% de espermatozoides viables (OMS, 1992, Citado en Padrón y col., 1998). 
 
 
Fig 1. Tinción con eosina. (A) Espermatozoide vivo. (B) Espermatozoide teñido, muerto. Bowen y col., 
2006. 
 
- Concentración: Se mide con la ayuda de un hemocitómetro (Fig 2). Se considera 
normal una concentración mayor a 20 millones de espermatozoides/ml y menor a 200 
millones de espermatozoides/ml. Se hace referencia a la oligospermia cuando hay una 
concentración menor a 20 millones de espermatozoides/ml, a polizoospermia cuando la 
concentración es superior a 200 millones de espermatozoides/ml y azoospermia cuando 
hay ausencia de espermatozoides en el eyaculado (Poirot y Cherruau, 2005). 
 
 
Fig 2. Imagen de uno de los subcuadrados de la cuadrícula central de la cámara de Neubauer. (*) 
Espermatozoides excluidos del conteo. 
 
- Morfología: Se valora mediante la realización de un frotis de la muestra teñido con 
Diff Quick® (Fig 3). Los espermatozoides deben ser evaluados bajo el criterio estricto de 
Kruger: una morfología normal por encima del 14% indica un potencial fecundante 
elevado, de 4 a 14% un potencial fecundante bueno, mientras que una morfología normal 
por debajo del 4% indica un potencial fecundante bajo (Kruger y col., 1988). 
 
 
Fig 3. Espermatozoides teñidos con Diff-Quick®. Kruger y Franken, 2004. 
 
 
6. Valoración de la integridad de membranas espermáticas. 
 
6.1. Integridad de membrana plasmática. 
 
El Test de Endósmosis (HOST) se basa en la capacidad de los espermatozoides de 
toro, conejo y hombre para captar agua, observándose modificaciones en la cola de los 
espermatozoides al ser estos incubados en un medio hiposmótico durante un breve 
período (Fig 4). El fenómeno osmótico se aprecia más fácilmente en la cola, ya que en 
ella la membrana está más libre que en la cabeza del espermatozoide. Como condición 
fundamental para el desarrollo de tal fenómeno es necesaria la integridad estructural y 
funcional de la membrana, por lo tanto, la reacción apreciada en la cola del 
espermatozoide indica que la membrana se encuentra activa (Campi y col., 2007). 
 
 
A B 
Fig 4. Test de endósmosis. (A) Espermatozoide reaccionado. (B) Espermatozoide no reaccionado. 
 
 
 
6.2. Reacción acrosómica y capacitación espermática. 
 
La Clortetraciclina (CTC) es un quelato fluorescente de cationes divalentes que se 
fija a las proteínas de la membrana y emite, en presencia de Ca2+, una fluorescencia 
verde de intensidad variable (Fig 5). Este marcador permite analizar las variaciones del 
estado de la membrana, diferenciando espermatozoides no capacitados, capacitados y 
con acrosoma reaccionado (Mattioli y col., 1996. Citado en Matas, 1997). 
 
 
A B C 
Fig 5. Tinción CTC. (A) Espermatozoide no capacitado. (B) Espermatozoide capacitado. (C) 
Espermatozoide con acrosoma reaccionado. Albrizio y col., 2005. 
 
 
Mediante el uso del kit de tinción diferencial Spermac (Fig. 4), se evalúa el estado del 
acrosoma, siendo éste un saco contenedor de enzimas esenciales para la penetración 
del ovocito por el espermatozoide (Crozet, 1993). Un espermatozoide con el acrosoma 
teñido de verde y la región postacrosomal roja se considera como íntegro, mientras que 
un acrosoma rojo o verde con bordes discontinuos representa un espermatozoide 
reaccionado (Baran y col., 2004). La probabilidad de fecundación es alta cuando se 
observa más de un 40% de acrosómas íntegros, buena si la integridad se encuentra 
entre 16% y 40%, y baja si es menor a 16%. 
 
Fig. 4.- Tinción Spermac. (1) Espermatozoide con acrosoma íntegro. (2) Acrosoma reaccionado. (3) 
Membrana acrosomal discontinua. 
 
7. Detección de ETS 
- Chlamydia trachomatis en suero: C. trachomatis es una bacteria Gram negativa 
intracelular considerada como uno de los patógenos de transmisión sexual con mayor 
prevalencia en el mundo (Arráiz y col., 2007). Puede causar una serie de patologías en 
los individuos infectados dependiendo de su sexo, por ejemplo, en la mujer puede causar 
enfermedad pélvica inflamatoria, infertilidad por obstrucción tubárica y embarazo 
ectópico, mientras que en el hombre puede causar uretritis no gonocóccica, proctitis y 
epididimitis (Guerra-Infante y col., 2005). 
 
La detección de C. trachomatis se realiza directamente en el plasma seminal o 
aislando la fracción sérica de la muestra sanguínea del paciente para, posteriormente 
mediante técnicas inmunológicas, determinar la presencia de anticuerpos IgG e IgA anti-
C. trachomatis (Cravioto y col., 2003). 
 
- Espermocultivo: Es el cultivo de semen para su estudio bacteriológico, 
identificando los diversos grupos bacterianos que se pueden encontrar presentes en los 
mismos, como por ejemplo, gonococos (Baracaldo y Ward, 2008). 
 
- Mycoplasma/Ureaplasma: Mycoplasma y Ureaplasma son microorganismos 
oportunistas que pueden formar parte de la flora normal del tracto genital de personas 
sexualmente activas (Castellano-González y col., 2007). Sin embargo, al darse las 
condiciones necesarias, estas bacterias pueden colonizar la región y causar trastornos 
que conllevan a la infertilidad como, por ejemplo, enfermedad pélvica inflamatoria, 
uretritis, endometritis, alteraciones morfológicas en las colas y la región media de los 
espermatozoides infectados, así como disminución en la movilidad y en la reacción 
acrosómica, entre otros (Fagundo-Sierra y col., 2006). 
 
Su detección puede realizarse por siembra en medio de cultivo suplementado con 
arginina, para el caso de Mycoplasma; o con úrea, para Ureaplasma. Luego de incubar 
los medios sembrados se evalúa el cambio de coloración, que de haber ocurrido indica 
un resultado positivo, en caso contrario el resultado es negativo (Fernández y col., 2007). 
 
 
8. Congelación de semen. 
 
La congelación de semen (Fig. 5) consiste, básicamente, en detener los procesos 
vitales de los espermatozoides por falta de disponibilidad del medio acuoso, siendo este 
necesario para llevar a cabo una serie de procesos bioquímicos celulares fundamentales. 
 
 
Fig. .- Tanque de nitrógeno con muestras seminales. 
 Para tales fines se emplean diluyentes que le brindan a los espermatozoides energía 
y condiciones depH y osmolaridad equilibradas, entre otras; así como también se hace 
uso de sustancias denominadas crioprotectores y de nitrógeno líquido. Los 
crioprotectores son todas aquellas moléculas que se emplean para proteger a los 
espermatozoides durante los procesos de congelación y descongelación, siendo los más 
utilizados el glicerol y la yema de huevo de gallina (RED-LARA, 2006). 
 
Este procedimiento se realiza, generalmente, cuando el paciente será sometido a 
quimioterapia, no se encuentra presente al momento de la inseminación homóloga (RED-
LARA, 2006) o para preservar gametos debido a escasa concentración. 
 
 
9. Preparación de semen para Inseminación Artificial. 
 
La inseminación artificial consiste en el depósito de espermatozoides, previamente 
preparados, del esposo o de un donante en la vagina o útero de la paciente, para tratar 
de obtener un embarazo, como medida drástica frente a problemas de infertilidad (Criollo, 
s.f.). 
 
Desde 1785, fecha en la cual se realizó la primera inseminación artificial utilizando 
una pluma de ave (Fontes y col., 2001), hasta la actualidad han surgido una serie de 
innovaciones tecnológicas y procedimentales que han permitido un manejo adecuado en 
la preparación de la muestra seminal, fase de altísima importancia en el logro de éxito 
de fecundación. 
 
La preparación de la muestra consiste en capacitar y recuperar los espermatozoides 
móviles, bien sea por Gradiente de densidads de densidad o swim-up; evaluar los 
parámetros seminales básicos y resuspender en medios específicos que favorecen el 
proceso de fecundación (Fontes y col., 2001), por ejemplo, el medio G-IVF. 
 
 
 
 
10. Eyaculación retrógrada. 
 
El proceso de eyaculación puede decirse que consta de tres fases, siendo estas la 
emisión de semen desde el vaso deferente hasta la uretra posterior, luego la contracción 
de la uretra posterior y el cierre del esfínter vesical y, finalmente, gracias a la contracción 
de los músculos bulbocavernoso e isquiocavernoso se produce la eyaculación (Hershlag, 
1991; Citado en Enríquez y col., 2004). 
 
La eyaculación retrógrada es responsable de 0.3% a 2% de los casos de infertilidad 
masculina, debido a un problema en el cierre del esfínter que comunica a la vejiga con 
la uretra y las vesículas seminales. A raíz de esto, el eyaculado en vez de salir al exterior 
es vertido en la vejiga, imposibilitando el depósito de los espermatozoides en la vagina 
(Yavetz y col., 1994). 
 
 
11. Hibridación in situ Fluorescente. 
 
La obtención de embriones anómalos debido a factor masculino tras la realización 
de Técnicas de Reproducción Asistida (TRA), especialmente cuando hacen uso de éstas 
individuos teratozoospérmicos (Calogero y col., 2001), demanda el diseño de técnicas 
que permitan la detección de aneuploidías en los espermatozoides. 
 
La Hibridación in situ Fluorescente es una técnica que combina la citogenética con 
la biología molecular, mediante el uso de fluorocromos unidos a sondas de ADN de 
secuencias específicas para determinados cromosomas (Fig. 6). 
 
 
Fig. 6.- Hibridación in situ Fluorescente. 
 
Generalmente, los cromosomas evaluados mediante esta técnica suelen ser los 
cromosomas X, Y, 13, 18, y 21, por ser responsables de síndromes de alta frecuencia 
poblacional como el Síndrome de Down y el Síndrome de Edwards (Downie y col., 1997). 
De esta manera puede estudiarse la conformación cromosómica de los espermatozoides 
y determinar la factibilidad de su uso en TRA. 
 
 
12. Fragmentación del ADN. 
 
Por muchos años, los análisis convencionales seminales que incluyen evaluación 
morfológica, concentración, y movilidad espermática fueron suficientes para evaluar la 
calidad seminal. Ahora, la evaluación científica y clínica toma en cuenta la valoración de 
la integridad del ADN espermático (Marchesi y Feng, 2007). 
 
 La información contenida en el ADN del espermatozoide puede verse afectada por 
el empaquetamiento defectuoso del mismo (Oliva, 2006), apoptosis (Sakkas y col., 1999) 
por la acción de especies de oxígeno reactivas (Twiig y col., 1998) o por agentes 
exógenos como la paroxetina, una droga antidepresiva; metales pesados (Hernández-
Ochoa y col., 2005), entre otros. 
 
En la década de los 80 el Dr. Donald Evenson realizó una de las contribuciones más 
importantes en el campo de la reproducción asistida, el desarrollo del Ensayo del Análisis 
de la Estructura de la Cromatina Espermática (SCSA). Esta novedosa técnica permitió 
evaluar la susceptibilidad de la cromatina espermática a sufrir desnaturalización por 
exposición a bajo pH, brindando evidencias de la relación entre el estado de la cromatina, 
la función espermática y el éxito reproductivo (Evenson y col., 2002). 
 
El Test de Dispersión de la Cromatina Espermática (SCD) se basa en la 
descondensación de la cromatina espermática, y la acción de un agente cromogénico, 
como Diff-Quick® para microscopía de campo claro, entre otros. La formación de halos 
de dispersión de la cromatina (Fig. 7) tras el uso del Kit Halosperm es directamente 
proporcional a la integridad del ADN (Fernández y col., 2003). 
 
 
A B C D 
 
Fig. 7.- Halos de dispersión de la cromatina. (A-B) Espermatozoides con ADN íntegro, (C-D) 
Espermatozoides con ADN fragmentado. Laboratorios INDAS S.A, 2005. 
 
 
13. Test de Peroxidasa. 
 
El test de peroxidasa se emplea para identificar leucocitos en el semen. Los 
leucocitos son peroxidasa positivos, tiñéndose de rosa, mientras que las células 
germinales son peroxidasa negativos, tiñéndose de marrón. Se considera 
leucocitospermia a más de un millón de leucocitos por ml de semen, lo que indica una 
posible infección (Vásquez y Vásquez, 2007). 
 
La presencia de leucocitos en el semen puede resultar perjudicial puesto que los 
espermatozoides son particularmente susceptibles al daño por estrés oxidativo, debido 
a la presencia de ácidos grasos insaturados en su membrana y a su baja reserva de 
enzimas antioxidantes. La exposición a Especies de Oxígeno Reactivas (ROS) no sólo 
afecta la competencia funcional del espermatozoide, sino la integridad del DNA 
espermático (Twiig y col., 1998; Bayker y Aitken, 2005; Marchesi y Feng, 2007). 
 
Bajo condiciones fisiológicas normales el semen humano presenta bajos niveles de 
ROS producidos por el espermatozoide y por leucocitos (Lópes y col., 1998). El 
desarrollo de infecciones del tracto genital masculino desencadena la activación y 
multiplicación leucocitaria, con lo cual los niveles seminales de ROS aumentan, 
disminuyendo la funcionalidad de los espermatozoides (Marchesi y Feng. 2007). 
 
14. MAR test (Mixed globulin reaction test). 
 
Entre las parejas que acuden a consultas médicas por infertilidad, un 9% son 
incapaces de concebir debido a la presencia de anticuerpos antiespermatozoide (AAE) 
(Impey, 1999. Citado en Burden y col., 2006), los cuales aglutinan entre 10-40 % de los 
gametos (Comhaire y Vermeulen, 1995). 
 
Los AAE pueden encontrarse tanto en hombres como en mujeres. En los hombres 
estos anticuerpos pueden hallarse en plasma seminal o en sangre, mientras que en las 
mujeres pueden presentarse en el moco cervical, en los fluidos genitales o en sangre 
(Brugo-Olmedo y col., 2003). 
 
La aparición de AAE en hombres está relacionada con una ruptura de la barrera 
hematotesticular y una exposición de los espermatozoides al sistema inmunitario. La 
rotura de dicha barrera puede ser causada por orquitis alérgica, orquitis infecciosa, 
obstrucción de la vía seminal, y biopsia testicular, entre otras (Sístole Urología, 2001). 
 
El MarScreen (Fig. 8) es un kit que permite la detección de anticuerpos 
antiespermáticos, bien sea en plasma seminal o en suero sanguíneo. Está conformado 
por, 
 
 
 
• Un conjugado anticuerpo-esfera de látex. 
- IgA-Esferas rojas. 
- IgM-Esferas verdes. 
- IgG-Esferas azules. 
 
• Antisuero contra IgA,IgM e IgG humanas. 
 
 
Fig. 8.- MarScreen®. Conjugado IgG-Esferas y Antisuero anti-IgG. Bioscreen Inc., 2008. 
 Este kit permite detectar la presencia de anticuerpos unidos a la superficie de los 
espermatozoides, al observarse bajo el microscopio la unión de pequeñas esferas a la 
cabeza y cuello de los mismos (Bioscreen Inc., 2008). 
 
 
15. Test de embarazo. 
 
Luego de que la paciente ha sido sometida a TRA, bien sea por inseminación artificial 
o transferencia de embriones, se realiza en el laboratorio una prueba de embarazo 
cualitativa empleando el Kit Wondfo Pregnancy Test (Fig. 9) para la detección de la 
presencia de la hormona Gonadotropina Coriónica Humana en el suero de la paciente. 
 
 
 
 
Fig. 9.- Test de embarazo Wondfo. 
 
Pasados cinco minutos, se observa la aparición de una línea roja, que es la marca 
control del test. En caso de resultar positiva la prueba aparecerá a la derecha de la línea 
roja otra línea similar (Fig. 10). 
 
 
 
Fig. 10.- Test de embarazo positivo. 
 
 
 
 
Valoración de la integridad de la cromatina espermática. 
 
En la actualidad existen varios métodos para evaluar la integridad de la cromatina 
espermática, entre ellos el TUNEL (Terminal deoxynucleotidil transferase dUTP nick end 
labellin) que cuantifica la incorporación de desoxiuridina trifosfato biotinilada al DNA 
emitiendo una señal que indica la proporción de roturas en el DNA (Twigg y col., 1998), 
y el SCSA (Sperm Chromatin Structure Assay) que se basa en la incorporación de 
naranja de acridina al DNA tras una desnaturalización inducida por ácidos (Evenson y 
col., 1980). De manera más novedosa se encuentran el SCD (Sperm Chromatin 
Dispersion test, Fernández y col., 2003) y la tinción diferencial Diff-Quick® (Sousa y col., 
2009). 
 
 
 
8.1 Test de dispersión de la cromatina espermática. 
 
El test de dispersión de la cromatina espermática se basa en la aplicación de una 
solución ácida desnaturalizante que permite la descondensación de la cromatina 
espermática, una solución lítica que promueve la desproteinización de la membrana, y la 
acción de un agente cromogénico como puede ser el DAPI (4′,6-diamidino-2-fenilindol 
diclorhidrato) para microscopía de flourescencia o Diff-Quick® para microscopía de 
campo claro (Fig 6), entre otros (Fernández y col., 2003). 
 
 
 A B C D E 
Fig 6. Halos de dispersión de la cromatina espermática. (A-B) Espermatozoides con DNA íntegro. (C-E) 
Espermatozoides con DNA fragmentado. Laboratorios INDAS S.A., 2005. 
 
 
La desnaturalización del DNA seguida por una remoción de las proteínas nucleares 
genera nucleoides parcialmente desproteinizados en los que los bucles de DNA se 
expanden formando halos de dispersión de la cromatina espermática (Laboratorios 
INDAS S.A, 2005). La evaluación se realiza en base a la observación de la presencia o 
ausencia de halos, clasificando como espermatozoides con DNA fragmentado aquellos 
que carezcan de halo o que presenten un halo de tamaño muy pequeño, y como no 
fragmentados aquellos que presenten grandes halos de dispersión de la cromatina 
espermática (Fernández y col., 2003). 
 
 
 
8.2 Tinción diferencial Diff-Quick®. 
 
La tinción Diff-Quick® se basa en el patrón de tinción de las cabezas espermáticas 
(Fig 7). Espermatozoides normales presentan una tinción rosa débil, mediada por la 
interacción la eosina con proteínas cargadas positivamente, mientras que 
espermatozoides anormales, presentan una tinción azul oscura por la unión de la tiazina 
al DNA. Esta tinción permite evaluar el grado de compactación de la cromatina 
espermática y, por ende, la integridad de la misma (Sousa y col., 2009). 
 
 
A B 
Fig 7. Tinción Diff-Quick®. (A) Espermatozoide débilmente teñido de rosa. (B) Espermatozoide 
fuertemente teñido de azul. Sousa y col., 2009. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
METODOS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. Procedimiento para la Recolección de muestra. 
 
La toma de la muestra seminal debe realizarse tras un período de abstinencia sexual 
de 3 a 5 días. 
 
El paciente debe haber orinado mínimo 1 hora antes de colectar la muestra. Luego 
de lavar bien con agua y jabón sus manos y genitales, debe obtener la muestra seminal 
por masturbación y depositarla en recipiente para examen de orina estéril (p.e.Urolab). 
La muestra debe ser entregada al Laboratorio de Andrología en el transcurso de 1 hora, 
y debe estar identificada con el nombre del paciente, edad, fecha de nacimiento, C.I., 
nombre de la esposa, nombre del médico tratante, examen a realizar, hora de la toma, 
días de abstinencia e indicación de fracción perdida. Al entregar la muestra al laboratorio 
se debe hacer también la entrega de los exámenes de VIH, VDRL, Hepatitis B y C 
vigentes. 
 
 
2. Procedimiento para el Lavado de una muestra seminal. 
 
Tras la recolección de la muestra esta debe dejarse reposar por un período mínimo 
de 20 minutos, tiempo en el cual se produce su licuefacción. Transcurrido este tiempo se 
coloca una gota de la suspensión espermática con una pipeta Pasteur sobre un 
portaobjetos para evaluar la movilidad espermática, de esta gota se toman 10µl para 
realizar una dilución 1:20 y evaluar la concentración espermática en la cámara de 
Neubauer. 
 
El resto de la muestra es colocado en un tubo estéril para medir su volumen, y se 
añade a este tubo el mismo volumen en medio HAM’S-F10 suplementado con Albúmina 
Sérica Humana (HSA) al 0.05%, se homogeniza y se centrifuga a 1600rpm por 5 minutos 
(Fig. 13). 
 
 
 
Fig. 13.- Centrifuga empleada para lavados. 
 
Luego se descarta el sobrenadante y se resuspende el pellet en 1ml de medio nuevo. 
 
 
3. Procedimiento para la Recuperación de espermatozoides móviles 
(REM). 
 
En un tubo estéril deben colocarse en el siguiente orden 1ml de Gradiente de 
densidad 90% y 1ml de Gradiente de densidad 40%. Luego, con mucho cuidado, debe 
colocarse la muestra seminal sobre la capa de Gradiente de densidad 40% y debe 
determinarse el volumen de la misma. 
 
A continuación, debe centrifugarse la muestra a 750rpm por 12 minutos. Luego, con 
una pipeta pasteur que contiene una pequeña fracción de medio HAM’S-F10 en la punta 
debe sustraerse el pellet del tubo, con cuidado de no romper las capas del Gradiente de 
densidad y residuos. El pellet debe ser depositado en un tubo que contiene 4ml de medio 
HAM’S-F10 suplementado, se homogeniza y se centrifuga a 1600rpm por 5 minutos. 
Finalmente, se descarta el sobrenadante y el pellet es resuspendido en 1ml de medio 
HAM’S-F10, de donde se evalúa la concentración y movilidad final de la muestra. 
 
4. Procedimiento para la realización del Espermograma. 
 
Luego de colectada la muestra debe esperarse la licuefacción de la misma en el 
transcurso de 20 minutos a 1 hora, para posteriormente homogeneizar y evaluar en 
condiciones de esterilidad. 
 
- Color 
 
Se observa inmediatamente luego de la licuefacción. (Poirot y Cherruau, 2005; 
Vásquez y Vásquez, 2007). 
 
- Volumen 
 
Se mide empleando un tubo graduado (Poirot y Cherruau, 2005; Vásquez y Vásquez, 
2007). 
 
- Viscosidad 
 
Se evalúa haciendo pasar la muestra por una pipeta (Fig. 14) y observando si el 
semen cae a manera de gotas o como filamento. (Poirot y Cherruau, 2005; Vásquez y 
Vásquez, 2007). 
 
 
Fig. 14.- Evaluación de viscosidad. 
 
- pH 
 
Se colocan 10µL del semen sobre papel de pH y luego de 30 seg se compara con la escala 
de referencia. 
 
- Movilidad espermática 
 
Deben dispensarse 10µL de la muestra en un portaobjetos y cubrirse con un 
cubreobjetos. Bajo el microscopio de contraste de fases, con un objetivo de 40X, se 
realiza un conteo de 100 espermatozoides en 5 campos microscópicos delimitados por 
líneas imaginarias y se clasificanlos tipos de movilidad, expresándolos en porcentaje 
(Poirot y Cherruau, 2005). Los móviles se clasificaran como: 
 
• Rápidos: Los que presenten movilidad progresiva rápida y lineal. 
• Moderados: Los que presenten movilidad progresiva no lineal. 
• Lentos: Los que presenten movilidad progresiva lenta. 
• In situ: Los que presenten movilidad no progresiva. 
 
 
- Vitalidad espermática 
 
Se realiza colocando 10µL de semen en un portaobjetos, y añadiendo una gota de eosina 
amarilla 0.5% (p/v) en solución salina (Fig. 15). 
 
 
Fig. 15.- Preparación de prueba de vitalidad espermática. 
 
 Se observa bajo el microscopio y se cuentan 100 espermatozoides inmóviles, los cuales se 
clasifican en vivos y muertos y se expresa el resultado de manera porcentual (Poirot y Cherruau, 
2005). 
 
• Vivos: No teñidos. 
• Muertos: Teñidos de rojo. 
 
 
- Concentración espermática 
 
Se coloca una gota de semen diluido en agua destilada en una proporción 1:20 en la cámara 
de Neubauer y se procede a contar el número de espermatozoides (n) que se encuentren en los 
subcuadrados de las esquinas y el subcuadrado central de la cuadrícula. Para calcular la 
concentración se empleará la siguiente fórmula, 
 
[esp] = n x 5 cuadrados x dilución x volumen del hemocitómetro 
Por convención, los espermatozoides que se encuentren sobre los márgenes inferior y 
derecho de los cuadrados no serán contados (Fig. 16). 
 
 
Fig. 16.-Conteo de espermatozoides en Cámara de Neubauer. (*) Espermatozoides excluidos del conteo 
en uno de los subcuadrados de la cuadrícula central. 
 
- Morfología espermática 
 
Se realiza un frotis de la muestra fresca en un portaobjetos. Luego de dejar secar 
muy bien a temperatura ambiente, se tiñe con el kit HEMA 3 STAIN (Fig. 17), que consta 
de un fijador que se deja actuar por 1 minuto y dos colorantes que deben actuar por 3 
minutos cada uno. Finalmente, se deja secar la muestra para luego observar al 
microscopio con un aumento de 100X bajo aceite de inmersión, clasificando los 
espermatozoides en normales y anormales (bien sea por anomalías de cabeza, pieza 
media o cola). 
 
 
Fig. 17.- Tinción con Kit HEMA 3 STAIN. 
- Sobrevida: 
 
El REM con una concentración que no supere los 200mil espermatozoides por ml 
debe dejarse incubando en medio HAM’S-F10 suplementado de 18 a 20 horas en un 
tubo con la tapa semiabierta. Luego de transcurrido el tiempo debe evaluarse la movilidad 
espermática, considerándose normal un valor de 60%. 
 
5. Procedimiento para la realización del Perfil andrológico. 
 
El perfil andrológico incluye la realización del espermograma, integridad acrosómica, 
C. trachomatis en suero, cultivo de semen y Mycoplasma/Ureaplasma. 
 
- Integridad acrosómica. 
 
Se realiza un frotis de la muestra y se deja secar bien. Se procede a teñir con el Kit 
Spermac, el cual consta de un fijador a base de formalina, un colorante A, un colorante 
B y un colorante C (Tabla # 1). 
 
Se deja secar la lámina y se observa al microscopio bajo objetivo de inmersión. Se 
clasifican 100 espermatozoides y se expresan los resultados de manera porcentual. 
 
Reactivo Tiempo 
Fijador 5 minutos 
Colorante A 2 minutos 
Colorante B 1 minuto 
Colorante C 1 minuto 
 
Tabla #1.- Tiempos de acción de reactivos del Kit Spermac. 
 
La clasificación se realiza de la siguiente manera, 
 
 
• No reaccionados: Aquellos que presenten el acrosoma teñido uniformemente de 
color verde y la región postacrsomal roja. 
 
• Reaccionados: Aquellos que carezcan de acrosoma o que presenten 
discontinuidad de membrana (Baran y col., 2004). 
 
- C. trachomatis en suero. 
 
Se toman los sueros de la pareja y se envían, debidamente rotulados, al Laboratorio 
AVILAB, donde se procesarán para anticuerpos IgA e IgG anti-C. trachomatis. 
 
- Espermocultivo. 
 
Se toma la muestra de semen del paciente y se envía al Laboratorio AVILAB rotulada 
con el nombre, C.I. del paciente y fecha de envío, para ser evaluada en el transcurso de 
la primera hora de tomada la muestra. 
 
- Mycoplasma/Ureaplasma. 
 
Se toma la muestra de semen del paciente y se envía al Laboratorio AVILAB rotulada 
con el nombre, C.I. del paciente y fecha de envío, para ser evaluada en el transcurso de 
la primera hora de tomada la muestra. 
 
 
6. Procedimiento para la Congelación de espermatozoides. 
 
Tras la toma de la muestra, deben dejarse transcurrir 20 minutos para que ocurra la 
licuefacción de la misma. A continuación, deben evaluarse la movilidad y la 
concentración espermáticas para el reporte. 
 
La muestra debe ser diluida en proporción 1:1 con el agente crioprotector y se debe 
dispensar en cuantos crioviales (Fig. 18) sea necesario. 
 
 
Fig. 18.- Criovial para preservación de espermatozoides. 
 
Cada criovial debe llevar rotulado el nombre del paciente, fecha de congelación, 
médico tratante y motivo de congelación. 
 
 
7. Procedimiento para la Descongelación de espermatozoides. 
 
Luego de ubicar la muestra del paciente en el tanque de nitrógeno, se toma el criovial 
y se coloca sobre el mesón a temperatura ambiente hasta su licuefacción. 
Posteriormente, el criovial es sumergido en un recipiente con agua a 37ºC y se coloca 
en la incubadora. 
 
Para evaluar la calidad de los espermatozoides deben observarse la concentración 
y la movilidad espermáticas tras la realización de un lavado. Finalmente, la muestra se 
resuspende en 1ml de medio G-IVF y puede emplearse para inseminación artificial, FIV 
o ICSI. 
 
 
8. Preparación de muestra de semen para Inseminación artificial. 
 
Luego de colectada la muestra seminal se procede a evaluar la concentración, la 
vitalidad y la movilidad espermáticas. Se realiza un REM, centrifugando a 750rpm por 12 
minutos, se extrae el pellet y se resuspende en 8ml de medio HAM’S-F10 para realizar 
un lavado, centrifugando a 1600rpm por 5 minutos. Seguidamente se extrae el 
sobrenadante y se evalúa la concentración y la movilidad espermáticas. 
Se resuspende la muestra en medio G-IVF y se dispensa en la jeringa destinada para 
Inseminación artificial, acompañándola de la Cánula Cook (Fig. 19). 
 
 
Fig. 19.- Cánulas y jeringas para Inseminación artificial. 
 
 
9. Procedimiento para obtención y procesamiento de muestras en pacientes con 
Eyaculación retrógrada. 
 
- Obtención de la muestra. 
 
El paciente debe consumir una cucharadita de bicarbonato de sodio tres veces al día 
por tres días antes de la colecta de la muestra. El día de la obtención, el paciente debe 
tomar una cucharadita de bicarbonato de sodio en el desayuno, y dirigirse al Laboratorio 
de Andrología. 
 
Se suministra al paciente un Urolab, donde debe depositar una pequeña fracción de 
orina (Fig. 20). Dicha muestra debe entregarse al laboratorio, para la medición del pH. 
 
 
Fig. 20.- Orina colectada para evaluación de pH. 
 
Si el pH es menor a 8, entonces el paciente debe consumir un vaso de agua con una 
cucharadita de bicarbonato de sodio y repetir el procedimiento en una hora. Si el pH se 
encuentra en 8, entonces se suministran al paciente varios Urolabs numerados que 
contienen medio HAM’S-F10. 
 
El paciente debe masturbarse y, a continuación, debe recolectar la orina en los 
Urolabs suministrados. Finalmente, debe entregar cada una de las muestras al 
laboratorio para su análisis. 
 
 
- Procesamiento de la muestra. 
 
Se preparan de 6 a 12 tubos con 4ml de medio HAM’S-F10 y se dispensa la muestra 
en fracciones iguales para cada tubo. Se realiza un lavado, centrifugando a 1600rpm por 
5 minutos, se toman cada uno de los pellets y se agregar en un tubo que contendrá 10ml 
de medio HAM’S-F10 y se realiza un lavado nuevamente. Luego de la centrifugación se 
descarta el sobrenadante y se agrega 1ml de nuevo medio. Finalmente, se hace una 
REM para Inseminación intrauterina. 
 
 
10. Procedimiento de Fijación de espermatozoides para FISH. 
 
Tras la toma dela muestra debe evaluarse la movilidad y la concentración 
espermáticas. A continuación se realiza un lavado con Buffer fosfato (PBS), 
centrifugando a 2500rpm por 10 minutos. Debe descartarse el sobrenadante, añadir 3ml 
de solución hipotónica e incubar por 30 minutos a 37ºC. 
 
Luego de transcurrido el tiempo de incubación, debe homogeneizarse la muestra y 
añadir 3ml de Carnoy para centrifugar nuevamente a 2500rpm por 10 minutos. El pellet 
debe ser resuspendido en Carnoy y debe colocarse en la nevera por 45 minutos. 
 
Deben colocarse 2 gotas de la muestra en un portaobjeto limpio, dejándolas caer 
desde 10cm de altura aproximadamente. Se observará al microscopio para confirmar la 
presencia de espermatozoides y, finalmente, la muestra fijada debe ser enviada a 
Reprogenetics (Lima, Perú) para la realización de FISH. 
 
 
 
11. Procedimiento para la realización del Test de peroxidasa. 
 
Deben colocarse en un portaobjetos 10µl de semen 10µl del reactivo de peroxidasa 
y 10µl de peróxido de hidrógeno, se homogeniza y se observa rápidamente bajo el 
microscopio. Se cuentan 100 células redondas, clasificándolas en células blancas (rosa) 
o en células germinales (marrones). Los resultados se expresan de manera porcentual. 
Si el número de células blancas es mayor al 10%, el test es positivo. 
 
 
12. Procedimiento para la realización del MAR Test. 
 
 
- Método directo. 
 
En un portaobjeto se colocan 5µl del conjugado anticuerpo-esfera, 5µl de antisuero 
y 5µl de semen, se homogeniza y se cubre con un cubreobjeto y luego de 2 minutos se 
observa bajo el microscopio y se cuentan 100 espermatozoides móviles, los cuales 
deben clasificarse en unidos a las esferas y no unidos. Los resultados se expresan en 
porcentaje, si hay más de 10% de espermatozoides unidos a esferas el test es positivo. 
 
 
 
 
- Método indirecto. 
 
Este método se aplica para evaluar la presencia de anticuerpos antiespermáticos en 
el suero sanguíneo, tanto en la mujer como en el hombre. Si el método directo resulta 
negativo para el semen del esposo, entonces pueden usarse estos espermatozoides 
para el método indirecto, en caso contrario se emplea un control negativo. 
 
El suero sanguíneo se descomplementa a 56ºC por 30 minutos y luego se diluye en 
un proporción 1:10 en medio HAM’S-F10. Se añaden a la muestra 50µl del REM 
obtenido, ajustado a una concentración de 20 millones de espermatozoides y se incuba 
a 37ºC por 1 hora. Luego se colocan 5µl del complejo anticuerpo-esfera, 5µl de antisuero 
y 5µl de los espermatozoides incubados, se homogeniza y se cubre con un cubreobjeto. 
Se esperan 2 minutos y se observa bajo el microscopio clasificando los espermatozoides 
de la misma manera que en el método directo. 
 
 
13. Procedimiento para la realización de Test de embarazo. 
 
De una muestra de sangre de la paciente se aísla la fracción sérica, se toma de la 
nevera una prueba de embarazo cualitativa Wondfo y se coloca en la incubadora a 37ºC 
por 5 minutos. Se colocan 5 gotas del suero en el orificio de la prueba y se lee el resultado 
en 5 minutos. Una línea rosada indica resultado negativo, dos líneas rosadas indican un 
resultado positivo. 
 
El resto del suero sanguíneo se envía al Laboratorio AVILAB para la realización de una 
prueba cuantitativa. 
 
 
 
14. Evaluación de la integridad de la membrana plasmática. 
 
La evaluación de la integridad de membrana se realizó aplicando el Test Hiposmótico 
(HOST). En 500µl de solución hiposmótica (Citrato de sodio al 1%) se colocaron 125μl 
de semen y se incubó a 37 ºC por 30 min. Para medir el hinchamiento espermático se 
tomó una gota de la solución y se colocó sobre una lámina portaobjetos, con su 
respectivo cubreobjetos. Se procedió a observar bajo el microscopio de contraste de fase 
a 400X, contando 100 espermatozoides por muestra, considerándose como viables 
aquellos que presentaron cola curvada o enrollada (Giraldo y col., 2006). 
 
 
 
15. Evaluación de la reacción acrosómica y capacitación 
espermática. 
 
Se colocaron 100µl de una suspensión espermática en un vial, posteriormente se 
añadieron 100µl de una solución de CTC (20mM Tris–HCl, 130 mM NaCl, 5 mM L-
cisteína y 750 mM Clortetraciclina) y se mezclaron con cuidado. Luego de 10 segundos 
se detuvo la reacción por adición de 16µl de una solución de paraformaldehído al 12.5% 
v/v en 0,5M de Tris-HCl, las muestras se mantuvieron a 4 ºC en la oscuridad hasta su 
evaluación dentro de las 24h posteriores a la preparación. Se evaluaron 100 
espermatozoides por muestra (Valeris y col., 2008). Los espermatozoides fueron 
clasificados de la siguiente forma: 
 
- No capacitados (NC): Cabeza del espermatozoide con fluorescencia verde 
brillante distribuida uniformemente, pudiéndose presentar o no una fuerte tinción del 
segmento ecuatorial. 
 
- Capacitados (C): Región acrosomal verde fluorescente y región postacrosomal 
oscura. 
 
- Acrosoma reaccionado (AR): Cabeza del espermatozoide veteada de verde 
fluorescente, verde en la región postacrosomal o sin fluorescencia. 
 
- 
 
16. Evaluación de la fragmentación del DNA espermático. 
 
 
La muestra de semen fue diluida en medio para manipulación de espermatozoides 
llevándola a una concentración de 5-10x106 espermatozoides/ml. La suspensión 
espermática fue mezclada con 1% de agarosa acuosa de bajo punto de fusión a 37 ºC, 
para obtener una concentración final de agarosa de 0.7%. En láminas portaobjetos 
recubiertas con agarosa estándar 0.65% y secadas a 80 ºC, se dispensaron alícuotas de 
30μl de la mezcla anterior, se colocaron cubreobjetos y se dejó solidificar a 4 ºC por 4 
min. Posteriormente se retiraron los cubreobjetos con sumo cuidado y las láminas fueron 
sumergidas inmediatamente de manera horizontal en una bandeja con un preparado 
fresco de solución ácida desnaturalizante (0.08N HCl) por 7 min a 22ºC en la oscuridad. 
 
A continuación las láminas fueron transferidas a una bandeja con la solución lítica y 
neutralizante 1 (0.4M Tris, 0.8M DTT, 1%SDS y 50mM EDTA, pH 7.5) por 10 min a 
temperatura ambiente. Seguidamente se procedió a incubar en una solución lítica y 
neutralizante 2 (0.4M Tris, 2M NaCl y 1% SDS, pH 7.5) por 5 min a temperatura ambiente. 
Las láminas fueron lavadas en Buffer Tris-borato-EDTA (0.09M Tris-borato y 0.002M 
EDTA, pH 7.5) por 2 min, deshidratadas secuencialmente en etanol 70%, 90% y 100% 
por 2 min, y secadas al aire (Fernández y col., 2003). Las muestras fueron teñidas con 
la solución de wright y se contaron 100 espermatozoides por muestra. Los resultados se 
evaluaron bajo los siguientes parámetros: 
 
Espermatozoides sin DNA fragmentado: 
 
- Halo grande: Espermatozoides cuyo grosor del halo es igual o mayor a la longitud 
del diámetro menor del nucleoide. 
 
- Halo mediano: El grosor del halo está comprendido entre mayor que 1/3 del 
diámetro menor del nucleoide y menor que el diámetro menor del nucleoide. 
 
Espermatozoides con DNA fragmentado: 
 
- Halo pequeño: El grosor del halo es igual o menor que 1/3 del diámetro menor del 
nucleoide, pudiendo ser de forma irregular o prácticamente inapreciable. 
- Sin halo. 
 
- Sin halo y degradados: Aquellos espermatozoides que, sin mostrar halo, 
presentan el nucleoide fragmentado en gránulos o muestran una tinción muy débil. 
 
 
 
17. Evaluación de la compactación de la cromatina espermática. 
 
 
Se realizó un frotis con 20µl de la suspensión espermática y se dejó secar al aire para 
proceder al tratamiento con el kit Diff-Quick®. A continuación, se colocó la lámina 
portaobjetos con la muestra en la solución fijadora (Metanol) por 10 segundos, luego se 
transfirió al colorante 1 (Eosina) y tras 10 segundos se extrajo la lámina y se lavó 
suavemente. Por último, se tiñó con el colorante 2 (Tiazina) por 10 segundos, se lavó 
suavemente y se dejó secar al aire. La muestra fue observada bajo el microscopio de 
contraste de fases conel objetivo de 100x, se contaron 100 espermatozoides 
clasificándolos como espermatozoides con cromatina compactada (Debilmente teñidos / 
Rosa) y como espermatozoides con cromatina descompactada (Fuertemente teñidos / 
Azules) (Sousa y col., 2009).