SISTEMAS NANOESTRUCTURADOS

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* esanchezlopez@ub.edu
Departamento de Farmacia, Tecnología Farmacéutica y Fisicoquímica
Sección de Fisicoquímica
Sistemas nanoestructurados en el 
tratamiento de enfermedades 
neurodegenerativas
SEMINARIS DE RECERCA 2018
Elena Sánchez López*, Miren Ettcheto, Ana López, Marta Espina, 
Amanda Cano, Jaume Folch, Eliana B Souto, Ana C. Calpena, Antoni 
Camins, Maria Luisa García
Introducción
Materiales y 
métodos
Resultados Conclusiones Agradecimientos
ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
Pérdida progresiva de la estructura
o funciones neuronales
Enfermedades
neurodegenerativas
Enfermedad
de Alzheimer
Glaucoma
ELAEnfermendad
de Parkinson
Enfermedad de 
Hungtinton
Enfermedades
neurodegenerativas
Enfermedad
de Alzheimer
Glaucoma
ELAEnfermendad
de Parkinson
Enfermedad de 
Hungtinton
Mayor frecuencia 
de glaucoma en 
pacientes de EA
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA)
Cada enfermo de Alzheimer cuesta 30.000 €/año
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA)
Se caracteriza por un inicio gradual y un deterioro cognitivo continuo
ENFERMEDAD DE ALZHEIMER (EA)
TRATAMIENTO ACTUAL EA
Donepezilo
Rivastigmina
Memantina
Galantamina
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Antagonista del
receptor NMDA
Inhibidores de la
acetilcolinesterasa
GLAUCOMA
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
2040
111 millones
Segunda causa de ceguera en el mundo (OMS)
GLAUCOMA
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Enfermedad ocular 
Humor vítreo
Humor acuoso
➢ Pérdida de visión: daño en el 
nervio óptico
➢ Aumento de la presión intraocular
ACUMULACIÓN HUMOR ACUOSO
OBTURACIÓN TRABÉCULO
TRATAMIENTO ACTUAL
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
presión intraocular Láser
Trabeculectomia
NINGÚN TRATAMIENTO ACTUAL 
RESULTA TOTALMENTE EFICAZ
Ensayos clínicos de fase III mostratron
que los efectos no eran signiticativos
Glaucoma
MEMANTINA
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Antagonista no competitive del receptor de NMDA
Disminución excitotoxicidad asociada a exceso de GLU
• Prostaglandinas (PGs)
• Prostaciclina: PCI2
•Tromboxano A2
Leucotrienos
Fosfolipasa A2
Acido araquidónico
AINEs
Fosfolípidos
Ciclooxigenasa
Lipooxigenasa
DEXIBUPROFENO
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
BARRERAS: BHE Y BHR
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
TRANSPORTE DE FÁRMACOS AL CEREBRO
Estrategias para el transporte de fármacos al cerebro
Técnicas invasivas Técnicas NO invasivas
Disrupción BHE Liberación directa
Inyección
intraventricular
Inyección
intracerebal
Métodos químicos Métodos biológicos
Modificaciones
químicas del 
fármaco
Liberación
intranasal
Immuno
targeting
Sistemas
nanoestructurados
Terapia
génica
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Introducti
on
Objectiv
es
Materials and 
experimental
Conclusio
ns
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
BARRERAS – GOTAS OCULARES
Película lagrimal
Barrera 
corneal
Barrera 
hematoacuosa
Barrera 
hematoretiniana (BHR)
Humor vítreoHumor acuoso
Retina
SISTEMAS NANOESTRUCTURADOS
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
NPs lipídicas
NPs poliméricas
Sistemas nanoestructurados de liberación
controlada de fármacos (2017SGR1477)
Biocompatible
Biodegradable
No toxico
Hidrofilicidad
Mucoadhesividad
Paso a través de la BHE y BHR
Poly(ethylene glycol)
(PEG)
Ácido poli-(D,L)-láctico-co-glicólico
(PLGA)
SISTEMAS NANOESTRUCTURADOS
C
c.
 d
el
 a
ct
iv
o
d1
Efecto tóxico
d2 d3 d4
Formulación 
convencional
Nanopartículas
Rango 
terapéutico
Ineficacia
Tiempo
 Actividad 
farmacológica
 Biodisponibilidad
Proteínas
Enzimas
Película 
lagrimal
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Dexibuprofen (DXI)
Memantine (MEM)
OBJETIVOS
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Elaboración
Optimización
Interacciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
PLGA-PEG
Acetona
PVA (H2O)
DXI
ELABORACIÓN DE NANOPARTÍCULAS
Difusión disolvente PVA
EA
Agitación
magnética
PVA 0,3%
+
H2O
W/O/W
PLGA-PEG
Fase
acuosa 1 
(W1)
Fase orgánica
MEM
+
H2O
AE + PLGA-PEG
W/O
PLGA-PEG
PVA
Fase
orgánica
PVA
+
H2O
W/O/W
Fase 
acuosa 2
 (W2)
Fase 
acuosa
interna
MEM
Método de 
desplazamiento
de solvente
Método de doble emulsión
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
TAMAÑO DE PARTÍCULA Y CARGA SUPERFICIAL
Tamaño promedio (Zav) ≤ 200 nm
Carga superficial (potencial zeta, ZP) ≈ -25 mV
Índice de polidispersión (IP) ≤ 0.1
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
EFICIENCIA DE ASOCIACIÓN
HPLC-UV/vis
HPLC/MS/MS
EE (%)=
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑓á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜 −𝐹á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜 𝑙𝑖𝑏𝑟𝑒
𝐶𝑎𝑛𝑡𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑓á𝑟𝑚𝑎𝑐𝑜
Fármaco libre
Dexibuprofeno (DXI)Memantina (MEM)
XIC of +MRM (2 pairs): 180.300/163.200 Da from Sample 76 (D_FREE_11) of 20140225.wiff (Turbo Spray) Max. 3.2e6 cps.
1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0
Time, min
0.0
2.0e5
4.0e5
6.0e5
8.0e5
1.0e6
1.2e6
1.4e6
1.6e6
1.8e6
2.0e6
2.2e6
2.4e6
2.6e6
2.8e6
3.0e6
3.2e6
In
te
n
s
it
y
, 
c
p
s
3.53
Elaboración
Optimización
Interacciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización Y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
Diseño factorial (DoE)
PARÁMETROS DE 
SONICACIÓN
VARIABLES 
INDEPENDIENTES
VARIABLES 
DEPENDIENTES
-1.68 -1 0 +1 +1.68
Amplitud de onda (%) 21.6 25 30 35 38.4
Tiempo 1a sonicación (s) 13 20 30 40 47
Tiempo 2a sonicación (s) 79 120 180 240 281
Amplitud de onda (%)
Tiempo 1a sonicación (s)
Tiempo 2a sonicación (s)
Tamaño promedio (nm)
Índice de polidispersión (PI)
Carga superficial (ZP, mV)
EE (%)
OPTIMIZACIÓN
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Amplitud Tiempo 1a sonic Tiempo 2a sonic Tamaño 
promedio
(nm)
PI ZP (mV) EE (%)Coded 
level
(%)
Coded 
level
(s)
Coded 
level
(s)
Factorial points
F1 -1 25.0 -1 20.0 -1 120.0 390.4 ± 2.2 0.213 ± 0.039 -6.73 ± 0.04 3.46
F2 1 35.0 -1 20.0 -1 120.0 249.7 ± 4.7 0.069 ± 0.022 -6.33 ± 0.49 9.59
F3 -1 25.0 1 40.0 -1 120.0 184.6 ± 0.7 0.125 ± 0.023 -6.43 ± 0.45 42.57
F4 1 35.0 1 40.0 -1 120.0 227.0 ± 2.6 0.057 ± 0.019 -6.72 ± 0.33 36.89
F5 -1 25.0 -1 20.0 1 240.0 243.0 ± 0.9 0.194 ± 0.012 -6.72 ± 0.24 7.43
F6 1 35.0 -1 20.0 1 240.0 248.1 ± 1.9 0.053 ± 0.037 -6.48 ± 0.15 14.69
F7 -1 25.0 1 40.0 1 240.0 258.7 ± 4.5 0.198 ± 0.011 -6.35 ± 0.33 22.63
F8 1 35.0 1 40.0 1 240.0 206.4 ± 1.2 0.061 ± 0.045 -6.67 ± 0.30 2.88
Axial points
F9 1.68 38.4 0 30.0 0 180.0 222.4 ± 2.4 0.033 ± 0.011 -5.63 ± 0.37 39.12
F10 -1.68 21.6 0 30.0 0 180.0 162.6 ± 0.4 0.262 ± 0.012 -6.83 ± 0.37 39.36
F11 0 30.0 1.68 47.0 0 180.0 226.7 ± 4.4 0.236 ± 0.011 -6.49 ± 0.25 19.94
F12 0 30.0 -1.68 13.0 0 180.0 196.8 ± 2.5 0.103 ± 0.056 -6.47 ± 0.55 43.10
F13 0 30.0 0 30.0 1.68 281.0 239.8 ± 0.7 0.056 ± 0.020 -5.77 ± 0.47 23.39
F14 0 30.0 0 30.0 -1.68 79.0 382.6 ± 5.2 0.221 ± 0.011 -5.93 ± 0.21 33.95
Center points
F15 0 30.0 0 30.0 0 180.0 220.1 ± 5.6 0.059 ± 0.019 -5.36 ± 0.03 24.01
F16 0 30.0 0 30.0 0 180.0 222.1 ± 3.6 0.062 ± 0.021 -5.36 ± 0.11 23.23
Amplitude (%)
PI
0.00
0.04
0.08
0.12
0.16
0.20
0.24
0.28
0.32
0.36
0.40
0.44
1 st sonication time (s)
PI
Estimated Response Surface
21 24 27 30 33 36 39 13
23
33
43
53
0
0.1
0.2
0.3
0.4
Son necesarias amplitudes altas (≥ 38%) para obtener NPs pequeñas y 
monodispersas
Tiempo 2a sonicación:180 s
La interacción entre la 1a y 2a 
sonicación aumenta el
tamaño promedio
OPTIMIZACIÓN - QBD
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Tamaño promedio ≤ 200 nm
PI ≤ 0.1
ZP - 25 mV
EA 80-99%
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
CARACTERIZACIÓN
Elaboración
OptimizaciónInteracciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización Y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
Aumenta la Tg (Tg PLGA-PEG 47.30 
OC)
No descomposición MEM
INTERACCIONES FÁRMACO-POLÍMERO
MEM NPs
25-350 oC
10 oC/min
DSC
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Perfil similar al del polímero
Pequeños picos de DXI
0 10 20 30 40 50
0
20000
40000
60000
DXI
PVA
PLGA 5% PEG
DXI NPs
2 ()
In
te
n
si
ty
 (
a
.u
.)
INTERACCIONES FÁRMACO-POLÍMERO
DXI NPs
XRD
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Elaboración
Optimización
Interacciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización Y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
Diálisis directa
LIBERACIÓN IN VITRO
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
0 10 20 30 40
0
20
40
60
80
 MEM NPsFree MEM
Time (h)
C
u
m
u
la
te
d
 a
m
o
u
n
t 
(m
g
)
Free MEM MEM NPs
Bmax 60,51 ± 0,94 56,29 ± 0,94
Kd 0,38 ± 0,04 0,74 ± 0,05
r2 0,9905 0,9957
0 2 4 6 8 10 12
0
20
40
60
80
100
DXI NPs
DXI
Parameters DXI NSs Free DXI
Bmax (% ) 62.16 ± 1.11 110.40 ± 1.63
Kd (h) 0.64 ± 0.05 0.56 ± 0.04
R² 0.9249 0.9452
Sy.x 3.42 5.26
Time (h)
C
u
m
u
la
ti
v
e
 D
X
I 
r
e
le
a
se
d
 (
%
)
LIBERACIÓN IN VITRO
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Diálisis inversa
0 2 4 6
0
1 0
2 0
3 0
T im e (h )
C
u
m
u
la
t
iv
e
 M
E
M
 (
%
/c
m
2
)
0 1 2 3 4 5 6
0 .0
0 .2
0 .4
0 .6
0 .8
1 .0
T im e (h )
C
u
m
u
la
ti
v
e
 M
E
M
 (
%
/c
m
2
)
Corneal
Escleral
Células de diffusion de Franz
http://permegear.com/franz-cells/
PERMACIÓN CORNEAL Y ESCLERAL
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Elaboración
Optimización
Interacciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización Y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
Luz emitida
Luz emitida
Transmisión (T)
Retrodispersión (BS)
 =180°
 =135°
TurbiscanLab®
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
ESTUDIOS DE ESTABILIDAD
Fenómenos de Inestabilidad
Cambios Velocidad Migración Modificación del Tamaño
Sedimentación Creaming
Floculación
(reversible con 
agitación)
Coalescencia
(irreversible)
0.00
5.00
10.00
15.00
20.00
25.00
30.00
1.00 6.00 11.00 16.00 21.00
B
a
ck
sc
a
tt
er
in
g
 (
%
)
Height (mm)
MES 0
MES 1
MES 2
MES 3
MES 4
MES 5
MES 6
Month 0
Month 1
Month 2
Month 3
Month 4
Month 5
Month 6
Estables a 4 oC, 25 oC
ESTUDIOS DE ESTABILIDAD
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Sistemas termodinámicamente 
inestables
4 oC
25 oC
38 oC
Elaboración
Optimización
Interacciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización Y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
ESTUDIOS DE LIOFILIZACIÓN
T
 (
ºC
)
CONGELACIÓN
Tiempo (h)
SECADO PRIMARIO
(SUBLIMACIÓN)
SECADO SECUNDARIO
(DESORCIÓN)
Anillado
T
 (
ºC
)
CONGELACIÓN
Tiempo (h)
SECADO PRIMARIO
(SUBLIMACIÓN)
SECADO SECUNDARIO
(DESORCIÓN)
Anillado
Vapor 
de agua
Líquido Congelado Secando Seco Sellado
Vapor 
de agua
Líquido Congelado Secando Seco Sellado
Sólido Líquido Gas
Fusión Evaporación
Licuefacción
S u b l i m a c i ó n
C o n d e n s a c i ó n
Congelación
Crioprotecor %
Mannitol 5,5
Fructosa 6,0
Sacarosa 10,5
Trehalosa 11,8
Mannitol
Trehalosa
SacarosaFructosa
ESTUDIOS DE LIOFILIZACIÓN
Osmolaridad
280 mOsm/l
Etapas Temperatura (oC) Presión (bar) Tiempo (h)
Congelación -50 1 4 h
Secado primario -34 354 16 h
Secado secundario 25 354 2 h
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Crioprotector
RATIO ANTES /DESPUÉS LIOFILIZAR
Tamaño (nm) PI ZP (mV)
Mannitol 0.52 0.37 1.18
Sacarosa 0.98 1.11 0.97
Trehalosa 0.96 0.65 0.78
- 0.04 0.20 1.69
Crioprotector
RATIO ANTES /DESPUÉS LIOFILIZAR
Tamaño (nm) PI ZP (mV)
Manitol 0.20 0.04 0.95
Sacarosa 0.97 0.74 0.90
Trehalosa 0.96 0.80 0.98
- 0.03 0.06 1.16
ESTUDIOS DE LIOFILIZACIÓN
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
LIOFILIZACIÓN
Resuspensión
Tamaño, PI, ZP
Tamaño, PI, ZP
DXI NPs
MEM NPs
PLGA-PEG 5% termosensible -----> Calor y óxido de etileno
No varían las propiedades fisicoquímicas
ESTERILIZACIÓN
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Tamaño, PI, ZP, EE
✓ Alto poder de penetración
✓ Baja reactividad química
✓ Bajos niveles de residuos
Elaboración
Optimización
Interacciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización Y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
0
.5 1 5 1
0
1
5
0
20
40
60
80
100
120
M E M N P (2 4 h )
M E M (2 4 h )
M E M N P (4 8 h )
M E M (4 8 h )
$$
C o n c e n tr a t io n ( M )
C
e
ll
 v
ia
b
il
it
y
 (
%
 o
f
 c
o
n
t
r
o
l)
*
* **
$ $$
$ $$
$ $$ $ $$
*
* **
* **
* *** **
Células Y-79 (retinoblastoma)
MEM citotóxica ≥ 5 µM
MEM-NP no citotóxicas
http://www.abpbio.com/product/cell-quant-alamarblue-cell-viability-reagent/
ESTUDIOS DE CITOTOXICIDAD
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Alamar Blue
45% en la barrera
No causan
disrupción de la BHE
bEnd.3 cells
Astrocytes
1 hora
TRANSPORTE IN VITRO A TRAVÉS DE LA BHE
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Elaboración
Optimización
Interacciones fármaco-
polímero
Comportamiento 
biofarmacéutico
Estabilidad
Liofilización Y 
esterilización
Citotoxicidad
Eficacia terapéutica
FÁRMACO LIBRE PLGA-PEG NPs
Ratones transgénicos APP/PS1
Ratones salvajes WT (C57Bl6)
8 h tratamiento
40 h no tratadas
CONTROL
DXI
MEM
NPs DXI
NPs MEM
MODELO DE RATÓN PARA LA EA
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
6 días de entrenamiento
Séptimo dia: test
APP/PS1 MEM NPs: < 40s
U
nt
re
at
ed
M
EM
M
EM
 N
Ps
0
10
20
30
40
50
60
70
*
APP/PS1 mice
E
sc
a
p
e
 l
a
te
n
c
y
 (
s)
MORRIS WATER MAZE
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
MODELO DE RATÓN PARA LA EA
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
PLGA-PEG NPs Fármaco libre No tratados
APP/PS1
MEM MEM NPs
IMMUNOHISTOQUÍMICA
No tratados
IMMUNOHISTOQUÍMICA
No tratados DXI DXI NPs
APP/PS1
Aplicación producto
HET-CAM test Draize test
Product Assay OII Classification
MEM HET-CAM 1.85 ± 0.15 Ligeramente irritante
Draize 4.00 ± 1.00
MEM NP
DXI
DXI NP
HET-CAM 0.13 ± 0.01 No irritante
No irritante
Draize
Draize
HET-CAM
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
0.00 ± 0.00
5 min
TOLERANCIA OCULAR
Introducción Materiales y métodos Resultados ConclusionesIntroducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Hemorragia
Vasoconstricción
Coagulación
10 ratas /grupo
Suero fisiológico
NPs MEM
OHT unilateral
Control negativo
2 gotas al día
durante 3 semanas
MODELO ANIMAL DE GLAUCOMA
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Modelo OHT
Inyección Suero salino hipertónico
(venas episclerales)
Ratas
0 5 1 0 1 5 2 0 2 5
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5 O H T o n ly
O H T M E M N P
O H T c o -e y e
* * *
* *
$ $ $
$ $ $
T im e p o s t O H T (d a y s )
I
O
P
 (
m
m
H
g
)
No se observaron
diferencias significativas
EFICACIA TERAPÉUTICA EN EL GLAUCOMA
Presión intraocular (IOP)
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
N
a
iv
e 
c o
n
tr
o
l
OH
T
 o
n
ly
O
H
T
 +
 M
E
M
 N
P
s
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
****
****
R
G
C
 D
e
n
s
it
y
 (
c
e
ll
s
/m
m
2
)
RGC marcados con Brn3a
(RGC specific nuclear-localized transcription factor)
Las NPs MEM son neuroprotectoras
EFICACIA TERAPÉUTICA EN EL GLAUCOMA
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
Optimizado y 
desarrollado
sistemas
nanoestructurados
Estables
Liofilizar
Liberación
prolongada
Eficaces contra la 
enfermedad de 
Alzheimer
Eficaces para el 
tratamiento del 
glaucoma
Introducción Materiales y métodos Resultados Conclusiones
UTAD
Faculty of Biology
Sistemas nanoestructurados de liberación controlada de fármacos
Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación, UB.
Departamento de Farmacología, Toxicología y Química terapéutica. 
Facultad de Farmacia y Ciencias de la Alimentación, UB.
Universidad de Tràs-os-Montes e Alto Douro. Vila Real. Portugal
Faculty of Pharmacy, University of Coimbra, Portugal
Institute of ophthalmology, University College of London, United 
Kingdom.
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