Descarga la aplicación para disfrutar aún más
Vista previa del material en texto
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES Facultad de Ciencias Exactas y Naturales Departamento de Química Biológica Valorización de la fracción proteica del suero de leche de búfala. Estudio y diseño de nano-microestructuras para la vehiculización de las vitaminas E y B9 Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en el área Química Biológica Ing. Leandro Fabian Bustos Director de tesis: Dr. Oscar Edgardo Pérez Director Adjunto: Dr. Franco Emanuel Vasile Consejero de estudios: Dr. Patricio Craig Lugares de trabajo: Laboratorio de Alimentos Funcionales, Instituto de Investigaciones en Procesos Tecnológicos Avanzados - INIPTA. Laboratorio Interdisciplinario de Dinámica Celular y Nanoherramientas, Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Ciudad de Buenos Aires, 2023 RESUMEN Valorización de la fracción proteica del suero de leche de búfala. Estudio y diseño de nano-microestructuras para la vehiculización de las vitaminas E y B9 La producción de leche de búfala (Bubalus bubalis) plantea inminentes oportunidades de desarrollo agroindustrial, especialmente en la región NEA, en la que las condiciones ambientales han favorecido la cría de búfalos. Actualmente, la leche que se produce en Argentina se destina principalmente a la producción de quesos, con la consecuente generación de lactosuero, el cual es actualmente desaprovechado. En este contexto, el objetivo de esta Tesis fue contribuir al agregado de valor del lactosuero bubalino mediante su utilización en el desarrollo de complejos moleculares cuyo tamaño los ubica en la nanoescala para la vehiculización de vitaminas E (acetato de α-tocoferol, TOC) y B9 (ácido fólico, AF). Con esta finalidad, se realizó en primera instancia la obtención a escala de laboratorio y caracterización fisicoquímica y molecular de un concentrado proteico de lactosuero bubalino (BWPC), el cual presentó 56 % de proteínas de totales, distribuidas en 6 fracciones principales siendo la β- lactoglobulina (β-lg) la más abundante (43,3 %). Las proteínas presentaron una composición de elementos de estructura secundaria predominantemente del tipo hojas β (58,6 %), presentaron estabilidad coloidal evaluado en términos de tamaño de partícula y potencial-ζ. Seguidamente, se estudió la formación de complejos entre proteínas del BWPC y las vitaminas TOC y AF en buffer fosfato a pH 7. La aplicación de técnicas espectrofotométricas, espectrofluorométricas y simulaciones moleculares in-sílico evidenciaron la interacción molecular, constituyendo sistemas mixtos. Se aplicaron numerosos modelos a los datos experimentales, derivados de la espectroscopía de fluorescencia, obteniéndose constantes de unión de 7,83x103 y 2,59x104 M-1 para TOC y AF, respectivamente, las cuales disminuyeron ante la desnaturalización química de las proteínas BWPC. La formación de complejos en términos de encapsulación, permitió alcanzar eficiencias de hasta 81,8 %, con capacidades de carga de 187,5 mg vitamina/g BWPC, habiéndose demostrado además la habilidad del BWPC de proteger ambas vitaminas ante injurias ambientales. Los complejos moleculares BWPC – TOC y BWPC – AF mostraron la habilidad de reducir eficientemente la tensión superficial en sistemas aire/agua (A/W), formando films superficiales con carácter mayormente sólido, generando espumas estables. Luego de verificar la funcionalidad del BWPC como carrier de vitaminas E y B9, se estudió en última instancia la bioaccesibilidad mediante digestiones simuladas in-vitro. A través de estos ensayos se constató la capacidad del BWPC para transportar y liberar el bioactivo en la fase intestinal, lo que aumenta las probabilidades de absorción. A nivel intestinal, los resultados de esta investigación permiten concluir acerca de la factibilidad de utilizar el lactosuero bubalino para el delivery de las vitaminas E y B9, lo cual ofrece una alternativa para el aprovechamiento de este efluente, y a su vez sentando las bases para el diseño de nuevas plataformas de encapsulación para la protección de compuestos bioactivos sensibles. Palabras clave: leche de búfala, lactosuero bubalino, vitamina E, vitamina B9, propiedades superficiales aire/agua, bioaccesibilidad. ABSTRACT Valorization of buffalo whey protein fraction. Study and design of nano-microstructures for the E and B9 vitamins delivery The production of buffalo milk (Bubalus bubalis) offers eminent opportunities for the agro- industrial development, especially for the NEA region, where environmental conditions have favored the buffalo breeding. Currently, the buffalo milk produced in Argentina is mainly used for cheese production, with the consequent generation of whey, which is currently wasted. In this context, the objective of this Thesis was to contribute to the increase in the added value of buffalo whey through its use in the development of molecular complexes for the delivery of vitamins E (α-tocopherol acetate, TOC) and B9 (folic acid, AF) whose size fall into the nanoscale. For this purpose, as a first instance, a buffalo whey protein concentrate (BWPC) was obtained, at laboratory scale. Physicochemical and molecular characterization of BWPC was performed, which contained 56 % of proteins, distributed in 6 main fractions, being β- lactoglobulin (β-lg) the most abundant (43.3%). The proteins fraction of BWPC presented a composition of secondary structure elements predominantly β-sheet type (58.6 %) with colloidal stability as evaluated in terms of particles sizes and ζ-potential. Next, the formation of complexes between BWPC proteins and the vitamins TOC and AF was studied in phosphate buffer at pH 7. The application of spectrophotometric and spectrofluorometric approaches jointly with in-silico molecular simulations evidenced the molecular interaction and the constitution of mixed systems made of proteins and vitamins. Numerous mathematical models were applied to the experimental data derived from fluorescence spectroscopy, obtaining the binding constants of 7.83x103 and 2.59x104 M-1, for BWPC - TOC and BWPC – AF complexes, respectively, which decreased after the chemical denaturation of BWPC proteins. The formation of complexes in terms of encapsulation, allowed reaching efficiencies of up to 81.8 %, with loading capacities of 187.5 mg vitamin/g BWPC. The capacity of BWPC to protect both vitamins against environmental injuries was also demonstrated. The molecular complexes showed the ability to efficiently reduce the surface tension at the air/water (A/W) systems, forming films surfaces mostly with solid character and generating stable foams. After verifying the functionality of the BWPC as a carrier for vitamins E and B9, the bioaccessibility of the vitamins was ultimately studied by using an in-vitro simulated digestion assay. Through these tests, the ability of BWPC to transport and release the bioactive up to the end of the intestinal phase was verified, which increases the chances of further enabling the correct absorption at the intestinal level. The results of this Thesis allow us to conclude about the feasibility of using buffalo whey for the delivery of vitamins E and B9, which offers an alternative for the use of this effluent, and in turn, laying the foundations for the design of new encapsulation platforms exerting protection of sensitive bioactive compounds. keywords: buffalo milk, buffalo whey, vitamin E, vitamin B9, air/water superface properties, bioaccessibility. AGRADECIMIENTOS Agradezco a Jesús y a la Virgen María, a mis padres Ángela y Gabriel, y a mi hermana Mariana, por su acompañamiento incondicional. A los Dres. Oscar Pérez y Franco Vasile, y a la Dra. María Alicia Judis, por brindarme la posibilidad de conocer y disfrutar de este estilo de vida, que es La Investigación. Por transferirmeno solamente conocimientos, sino también valores. Por sus consejos y por ajustar mi forma de pensar de tal manera de ser un mejor profesional. A CONICET por la beca otorgada. A la Universidad Nacional del Chaco Austral – UNCAUS y a la FCEN de la Universidad de Buenos Aires por brindarme recursos y el lugar de trabajo. A la Bqa. Ana María Romero e Ing. Marina Doval por su acompañamiento y generosidad. A los Dres. de la Universidad de Sevilla, Cecilio Carrera Sanchez y Víctor Pizones Ruiz- Henestrosa, junto con la Asociación Universitaria Iberoamericana de Postgrado - AUIP, por brindarme la posibilidad de realizar una estancia de investigación en la Facultad de Ingeniería Química de la Universidad de Sevilla. A mis compañeros de UNCAUS, Andrea, Ariel y Ricardo, y compañeres de Exactas, Regina, Paula, Agus, Ceci, Ale, Lau, Leo, Guille y Dani, por su acompañamiento, predisposición y empatía. A los productores bubalinos de Chaco, Corrientes y Formosa por proveernos con enorme generosidad de la leche de búfala necesaria para el desarrollo de esta Tesis. ÍNDICE Capítulo I. Introducción General ............................................................................................ 1 I.1. La leche búfala y lactosuero bubalino .......................................................................... 2 I.2. Nano-microestructuras y alimentos funcionales ........................................................... 5 I.3. Nanovehiculización de vitaminas ................................................................................. 8 I.3.1. Vitamina E ........................................................................................................... 10 I.3.2. Vitamina B9 ......................................................................................................... 14 I.4. Hipótesis y Objetivos .................................................................................................. 19 I.4.1. Hipótesis .............................................................................................................. 19 I.4.2. Objetivo general de la Tesis ................................................................................ 19 I.4.3. En este contexto se proponen los siguientes objetivos específicos ..................... 20 Capítulo II. Obtención y Caracterización del BWPC. Estudio de las Interacciones moleculares .............................................................................................................................. 21 II.1. Introducción ............................................................................................................... 22 II.1.2. Hipótesis ............................................................................................................. 25 II.1.3. Objetivos específicos .......................................................................................... 25 II.2. Materiales y métodos ................................................................................................. 27 II.2.1. Materiales ........................................................................................................... 27 II.2.1.1. Obtención del BWPC ................................................................................... 27 II.2.1.2. Vitaminas y otros reactivos .......................................................................... 30 II.2.2. Métodos .............................................................................................................. 30 II.2.2.1. Análisis proximal ......................................................................................... 30 II.2.2.2. Perfil proteico ............................................................................................... 31 II.2.2.3. Análisis proteómico ...................................................................................... 33 II.2.2.4. Evaluación del efecto de la congelación ...................................................... 33 II.2.2.5. Obtención de los complejos BWPC - Vitaminas ......................................... 35 II.2.2.6. Fluorescencia ................................................................................................ 36 II.2.2.7. Espectroscopía UV ....................................................................................... 37 II.2.2.8. Desnaturalización del BWPC ....................................................................... 38 II.2.2.9. Docking molecular ....................................................................................... 38 II.2.2.10. Espectrometría Infrarroja ........................................................................... 39 II.2.2.11. Capacidad antioxidante .............................................................................. 40 II.2.2.12. Distribución de tamaño de partícula y potencial-ζ ..................................... 43 II.2.2.13. Eficiencia de encapsulación y capacidad de carga ..................................... 45 II.2.2.14. Estabilidad de los complejos BWPC - AF frente a la luz UV .................... 50 II.2.2.15. Estabilidad de los complejos BWPC - TOC .............................................. 50 II.2.2.16. Análisis estadístico ..................................................................................... 51 II.3. Resultados ................................................................................................................. 52 II.3.1. Obtención del BWPC ......................................................................................... 52 II.3.2. Composición proximal ....................................................................................... 52 II.3.3. Perfil proteico ..................................................................................................... 53 II.3.3.1. SDS-PAGE ................................................................................................... 53 II.3.3.2. EC ................................................................................................................. 55 II.3.3.3. FPLC ............................................................................................................ 56 II.3.4. Proteómica .......................................................................................................... 58 II.3.5. Efecto de la congelación ..................................................................................... 60 II.3.6. Interacciones moleculares BWPC – vitaminas: complejamiento ....................... 65 II.3.6.1. Espectroscopías de fluorescencia y UV ....................................................... 65 II.3.6.2. Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) ......................... 77 II.3.6.3. Desnaturalización química ........................................................................... 81 II.3.6.4. Docking molecular para el sistema BWPC - TOC ....................................... 91 II.3.6.5. Docking molecular para el sistema BWPC - AF .......................................... 94 II.3.6.6. Cambios en la estructura secundaria ............................................................ 97 II.3.6.7. Capacidad antioxidante .............................................................................. 100 II.3.6.8. Agregación proteica: análisis de la distribución de tamaño de partícula y potencial-ζ ................................................................................................................... 103 II.3.9. Estudios de los nanocomplejos como sistemas de encapsulación .................... 111 II.3.9.1 Eficiencia de la encapsulación (EE) y capacidad de carga (CC)................. 111 II.3.9.2. Efecto protector de las proteínas constituyentes de BWPC sobre AF ....... 120 II.3.9.3. Efecto protector de las proteínas constituyentes de BWPC sobre TOC ..... 122 II.4. Conclusiones ...........................................................................................................125 Capítulo III. Desempeño de los complejos en sistemas dispersos aire/agua ...................... 129 III.1. Introducción ........................................................................................................... 130 III.1.1 Hipótesis ........................................................................................................... 139 III.1.2. Objetivos ......................................................................................................... 139 III.2. Materiales y métodos ............................................................................................. 140 II.2.1. Materiales ......................................................................................................... 140 III.2.2. Métodos ........................................................................................................... 141 III.2.2.1. Dispersión dinámica de luz. Determinación de tamaño de partícula y potencial-ζ ................................................................................................................... 141 III.2.2.2. Hidrofobicidad superficial ........................................................................ 142 III.2.2.3. Tensiometría .............................................................................................. 142 III.2.2.4. Tensiómetro de gota .................................................................................. 147 III.2.2.5. Propiedades espumantes ........................................................................... 152 III.2.2.6. Análisis estadístico .................................................................................... 153 III.3. Resultados .............................................................................................................. 154 III.3.1. Isotermas de adsorción superficial de los concentrados proteicos .................. 154 III.3.2. ¿Cuán agregado se encontraba el material proteico de partida? ..................... 157 III.3.3. Cinética de adsorción superficial .................................................................... 163 III.3.4. Características dilatacionales superficiales ..................................................... 172 III.3.5. Impacto de la agregación proteica sobre las propiedades superficiales de los sistemas mixtos BWPC - Vitaminas .............................................................................. 176 III.3.6. Hidrofobicidad superficial de los sistemas mixtos BWPC - Vitaminas ......... 181 III.3.7. Isotermas de adsorción superficial de las mezclas BWPC – Vitaminas ......... 183 III.3.8. Cinética de adsorción superficial .................................................................... 185 III.3.9. Características dilatacionales superficiales ..................................................... 188 III.3.10. Espumas de concentrados proteicos .............................................................. 193 III.3.11. Espumas de las mezclas BWPC - Vitaminas ................................................ 204 III.4. Conclusiones .......................................................................................................... 209 Capítulo IV. Bioaccesibilidad de las vitaminas vehiculizadas en complejos ..................... 212 IV.1. Introducción ........................................................................................................... 213 IV.1.2. Hipótesis ......................................................................................................... 218 IV.1.3. Objetivos ......................................................................................................... 218 IV.2. Materiales y métodos ............................................................................................. 219 IV.2.1. Materiales ........................................................................................................ 219 IV.2.2. Métodos .......................................................................................................... 219 IV.2.2.1. Evaluación de la Bioaccesibilidad de las Vitaminas ................................ 219 IV.2.2.2. Determinación de la concentración de vitamina bioaccesible .................. 222 IV.2.2.3. Análisis estadístico ................................................................................... 222 IV.3. Resultados .............................................................................................................. 223 IV.3.1. Bioaccesibilidad de las vitaminas ................................................................... 223 IV.4. Conclusiones .......................................................................................................... 232 CONCLUSIONES GENERALES ...................................................................................... 233 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................ 243 Nomenclaturas y abreviaturas Abreviatura Significado BWPC Concentrado proteico de lactosuero bubalino AF Ácido fólico TOC Aetato de α-tocoferol [AF] Concentración de ácido fólico [TOC] Concentración de TOC WPC Concentrado proteico de lactosuero vacuno WPI Aislado proteico de lactosuero vacuno ABTS•+ Radical catión [2,2´-azinobis (3-etilbenzotiazolina-6- ácidosulfónico] IF Intensidad de fluorescencia λ Longitud de onda λex Longitud de onda de excitación λmax Longitud de onda de emisión máxima BWPC – Vitaminas Sistema mixto formado por proteínas del lactosuero y las vitaminas aquí consideradas. BWPC – AF Sistema mixto formado por proteínas del lactosuero y ácido fólico. BWPC - TOC Sistema mixto formado por proteínas del lactosuero y acetato de tocoferol β-lg β-lactoglobulina α-lac α-lactoalbúmina BSA Albúmina de suero bovino 1 Capítulo I. Introducción General Capítulo I Introducción General 2 I.1. La leche búfala y lactosuero bubalino La cría de búfalos (Bubalus bubalis) constituye una actividad agropecuaria emergente en nuestro país. Desde 1992, la producción de ganado bubalino ha experimentado un marcado crecimiento (actualmente 150.000 cabezas) (Collado y col., 2021), concentrándose principalmente en la región nordeste. La provincia de Corrientes reúne el 41 % de la población bubalina nacional mientras que Formosa el 29 % y Chaco el 13% (Szopko y col., 2020). Los búfalos del NEA se han destinado principalmente a la producción de carne y en menor medida a la obtención de leche (Crudeli y col., 2021). En la Figura I.1 se muestra el aspecto del ganado bubalino criado en Argentina desde inicios de la década de los ‘70s. A nivel mundial, la leche de búfala representa el 15,5 % de la producción mundial, posicionándose entre la leche vacuna (81 %) y la de cabra (2 %), oveja (1 %) y camella (0,5 %), entre otras (FAO, 2022). Es un alimento rico en proteínas de alto valor biológico y grasas, con una proporción de sólidos totales mayor que la leche vacuna, lo cual hace de este una opción nutritiva con buenos rendimientos en la obtención de derivados lácteos (Sales y col., 2017). A pesar de los beneficios nutricionales y tecnológicos reportados en la literatura (Brijesha y col., 2017), y a la disponibilidad de animales con potencial capacidad productora en nuestro país (SENASA, 2022), la producción de leche bubalina es aún incipiente, alcanzándose valores medios entre 5 y 7 litros diarios, con lactancias aproximadas de 240 días (Collado y col., 2021). Así mismo, la oferta de productos lácteos bubalinos en el mercado argentino es aún limitada, lo cual advierte un escenario promisorio en relación a las posibilidades de crecimiento de este sector industrial (Crudeli y col., 2021). Capítulo I Introducción General 3 Figura I.1. Aspecto del ganado bubalino de Argentina. En Argentina, la leche de búfala se ha utilizado tradicionalmente para la preparaciónde quesos, principalmente mozzarella. En la elaboración de quesos, la filtración de la cuajada Capítulo I Introducción General 4 conduce a la separación del suero, el cual se compone principalmente de agua, proteínas, lactosa, ácido láctico y minerales (Abella y col., 2022). Al igual que el suero de leche vacuna, el suero de leche de búfalas es mínimamente aprovechado en la obtención de ricota (Sameer y col., 2020), destinado a la alimentación animal, o bien descartado, constituyendo el principal efluente en los establecimientos elaboradores de quesos. La composición del suero lácteo bubalino hace de éste una materia prima excepcional, no solo en la obtención de productos lácteos con gran potencial (ricota, bebidas lácteas de suero, suero en polvo), sino también como fuente de ingredientes funcionales y tecnológicamente atractivos (principalmente proteínas y lactosa), menos estudiados y menos explotados comercialmente que los de origen vacuno (Mahadev y col., 2020; Nishanthi y col., 2017; Thienel y col., 2018). En todos los casos, el aprovechamiento del suero lácteo en aplicaciones novedosas plantea un escenario promisorio en relación al agregado de valor de este subproducto (Allahdad y col., 2019). Los estudios realizados sobre suero lácteo vacuno, señalan a las proteínas como los componentes más importantes desde el punto de vista tecnológico y económico. La fracción proteica del suero se compone principalmente de proteínas globulares y solubles tales como β- lactoglobulina, α-lactoalbumina, inmunoglobulina, albúmina de suero bovino (BSA), lactoferrina y lactoperoxidasa (Malcata y col., 2016). Numerosas propiedades nutricionales como el alto valor biológico, correcta digestibilidad, etc., funcionales (gelificantes, espumantes, térmicas, emulsionantes, etc.) y biológicas (actividad antimicrobiana, anticarcinogénica e inmunomoduladora, entre otras), han promovido la utilización de las proteínas de suero lácteo vacuno en diversos sectores industriales. Ya sea en forma de concentrados (WPC) o aislados (WPI), se ha reportado en los últimos 40 años un notable incremento en las aplicaciones tecnológicas y comerciales de este subproducto (Papadaki y col., 2022; Rossi Marquez y col., 2017) y como carriers de Capítulo I Introducción General 5 compuestos bioactivos en sistemas de nano-microencapsulación (Falsafi y col., 2022; Pérez y col., 2014). A diferencia de las proteínas de suero de leche vacuno, las proteínas del suero de leche de búfalas han sido remarcablemente menos estudiadas en relación a su comportamiento funcional en aplicaciones tecnológicas. En este sentido, el conocimiento de las propiedades fisicoquímicas, moleculares y funcionales de la fracción proteica del suero de leche bubalina constituye un prerrequisito clave en el aprovechamiento de este recurso actualmente desaprovechado. En este contexto, la presente Tesis, pretende evaluar el comportamiento de las proteínas de suero lácteo bubalino, con vistas a ser aplicadas en el desarrollo de nano- microestructuras para la estabilización de compuestos bioactivos. I.2. Nano-microestructuras y alimentos funcionales Ante el aumento en la demanda de productos alimenticios “saludables”, las industrias han direccionado la producción hacia la obtención de alimentos funcionales, esto es, alimentos capaces de impartir beneficios adicionales para la salud, más allá de cubrir las necesidades nutricionales básicas (Dhakal y col., 2020). Esta aptitud se les ha atribuido a ciertos compuestos fisiológicamente activos o bioactivos, capaces de modular positivamente el metabolismo, contribuyendo así al correcto funcionamiento del organismo (Rosales y col., 2023). Entre los compuestos bioactivos de interés se encuentran: antioxidantes y compuestos fenólicos, minerales, esteroles y ácidos grasos omega-3, péptidos, vitaminas, fibra dietaria, prebióticos, probióticos y postbióticos, entre otros (Sachdeva y col., 2020; Swanson y col., 2020). Todos estos, son agentes promotores de la salud o preventivos para varias complicaciones patológicas, entre las que se incluyen trastornos gastrointestinales, Capítulo I Introducción General 6 neurológicos, oculares, cardiovasculares, metabólicos y dermatológicos, entre otros (Das y col., 2012; Sachdeva y col., 2020). En muchos casos, los compuestos con bioactividad suelen ser moléculas lábiles, sensibles a la luz, oxígeno, pH, metales, aw, fuerza iónica y/o temperatura. Son susceptibles de experimentar interacciones indeseables con otros componentes alimentarios durante el procesamiento y/o almacenamiento, e incluso ser sujetos de la degradación enzimática. También suelen presentar solubilidad limitada en entornos acuosos y en muchos casos, una reducida biodisponibilidad (Dias y col., 2015). Todo lo cual, dificulta la utilización de estos compuestos en la formulación de alimentos o suplementos dietarios, disminuyendo su eficiencia o bioactividad e incluso puede darse un impacto sensorial. Ante esto, se han propuesto distintas estrategias basadas en la encapsulación a escala nano o micrométrica, las cuales pretenden resolver los inconvenientes antes mencionados (Zhang y col., 2021a). La encapsulación consiste en el atrapamiento o entrapamiento de un compuesto que se desea proteger, en matrices formadas por sustancias de recubrimiento, agentes encapsulantes, materiales de pared o carriers (Awuchi y col., 2022). Las sustancias encapsuladas podrían ser consumidas como tales (en suplementos dietarios, por ejemplo), o bien, adicionadas como ingredientes funcionales en la formulación de alimentos saludables (Dhakal y col., 2020). La nanotecnología ha revolucionado la producción y preservación de alimentos, al proveer herramientas útiles capaces de ser aplicadas en la vehiculización de compuestos bioactivos permitiendo resolver los inconvenientes de estabilidad, solubilidad, transporte y biodisponibilidad, con posibilidad de controlar la liberación de su contenido. Actualmente constituye un área de rápida expansión en I+D+i que abarca tanto a la industria alimentaria como farmacéutica y nutracéutica (Dhakal y col., 2020; Zhang y col., 2021a). Capítulo I Introducción General 7 Las estrategias para abordar estos desafíos se basan en las propiedades de los materiales en la nanoescala (Kiss, 2020). La nanoencapsulación abarca procesos que operan a una escala ≤ 100 nm, aunque en la práctica se admite un límite superior de 500 nm (da Silva y col., 2015; Rizvi y col., 2018). Por medio de ésta, el compuesto bioactivo de interés queda atrapado en una matriz biopolimérica, la cual actúa como cobertura y/o barrera física con el entorno, capaz de controlar su interacción con el exterior, para luego liberarlo bajo condiciones específicas (Zhang y col., 2021a). El diseño de nanovehículos aprovecha las interacciones intrínsecas de materiales biocompatibles. Las nano estructuras pueden formarse por autoensamblaje y/o complejamiento a nivel molecular, esto es por unión espontánea y reversible de moléculas como respuesta a los cambios extrínsecos operando sobre las soluciones en que se encuentran disueltas como pH, fuerza iónica, temperatura, etc. (Rajagopal y col., 2004; Zhang y col., 2021a). En particular, los nanocomplejos se constituyen mediante interacciones no covalentes relativamente débiles (electrostáticas, hidrofóbicas, puentes de hidrógeno, de van der Waals, y exclusión estérica), simultáneas y reversibles (Jakobek, 2015; Yildirim-Elikoglu y col., 2018). Presentan la ventaja de suceder en condiciones moderadas (entornos acuosos, temperatura ambiente) con mínimos requerimientos de energía y de equipamiento específico posibilitando un mayor control de las características finales. Diversas proteínas alimentarias han sido propuestas como nanocarriers debido a su anfipatía, biodegradabilidad y propiedades estructurales y funcionalesespeciales, tales como su alta afinidad de unión a varios compuestos bioactivos (Tang, 2021). Presentan además numerosas ventajas entre las que se destacan la abundancia en la naturaleza, la biocompatiblidad y la inocuidad (Wei y col., 2019). En particular, las proteínas lácteas presentan las ventajas de ser fácilmente accesibles, económicas y poseen un alto valor nutricional, lo que las hace únicas para el delivery de compuestos bioactivos (Falsafi y col., 2022). Capítulo I Introducción General 8 Las proteínas de suero lácteo han permitido la obtención exitosa de nano y microestructuras útiles en la vehiculización, protección y liberación controlada de compuestos bioactivos (Jain y col., 2021; Wang y col., 2022a; Zhao y col., 2022b). Así, por ejemplo, la β-lactoglobulina demostró particular afinidad por las moléculas hidrofóbicas (vitamina D, retinol, polifenoles del té, resveratrol y DHA). Del mismo modo, la α-lactoalbumina (α-lac) y la BSA han demostrado habilidad para unirse a varios compuestos bioactivos (Yildirim-Elikoglu y col., 2018). El presente trabajo de Tesis explorará la aptitud de las proteínas de suero lácteo bubalino como carriers para vitaminas. I.3. Nanovehiculización de vitaminas Las vitaminas son compuestos bioactivos indispensables para el crecimiento, desarrollo y mantenimiento de la salud, cuyos efectos fisiológicos, requerimientos y enfermedades relacionadas por su déficit, han sido exhaustivamente reportados (Tan y col., 2021; Yaman y col., 2021). La fortificación de alimentos con vitaminas ha perseguido desde hace muchos años prevenir la aparición de enfermedades carenciales en la población (Teleki y col., 2013). Sin embargo, esto se ha llevado a cabo por adición directa de vitaminas a los alimentos, lo cual supone numerosos inconvenientes como: a) la pérdida inevitable durante el almacenamiento y procesamiento, lo cual disminuye su bioaccesibilidad, absorción y bioactividad efectiva (Yaman y col., 2021), y b) la adición de cantidades excesivas e innecesarias a los efectos de asegurar la provisión de la dosis mínima recomendada (Qiu y col., 2019), c) la alteración de las propiedades sensoriales, principalmente color y sabor. En este contexto, la nano-microencapsulación surge como una alternativa innovadora a las tradicionales formas de fortificación de alimentos con vitaminas (Tan y col., 2021; Yaman y col., 2021). El diseño de nanoestructuras para la protección y aseguramiento de la bioactividad Capítulo I Introducción General 9 de las vitaminas constituyen de hecho, una activa área de investigación (Zhang y col., 2021a). En términos generales, la encapsulación se ha descrito como un conjunto de métodos aplicados para atrapar temporalmente una sustancia activa dentro de un material formador de cubierta. El principio activo puede existir en diferentes estados, es decir, sólido, líquido o incluso estado gaseoso, y ser liberado bajo condiciones específicas o controladas, como cierto pH, actividad del agua, temperatura o tiempo (Fang y col., 2010; Marcillo-Parra y col., 2021). La nanoencapsulación es la encapsulación llevada a cabo en nanoestructuras. Si bien las tecnologías de encapsulación se pueden clasificar según el tamaño de partícula resultante y la hidrofobicidad, el proceso utilizado, así como la aplicación prevista, la clasificación más común y genérica depende de cómo se crean las micro- o nano-cápsulas. Dos enfoques principales para la encapsulación son ampliamente aceptados, a saber, los enfoques de abajo hacia arriba o botton-up y de arriba hacia abajo o top-down, como se ilustra en la Figura I.2. El enfoque bottom-up implica mecanismos de autoensamblaje de moléculas que operan a nanoescala y están controlados por la fuerza iónica, el pH y/o la temperatura, entre otros parámetros, mientras que el enfoque top-down es distinguido por la aplicación de energía para reducir el tamaño de partícula (Alu'datt y col., 2022). En este trabajo de Tesis se ha propuesto evaluar la protección de la vitamina E y vitamina B9, como modelo de compuestos bioactivos sensibles de carácter hidrofóbico e hidrofílico, respectivamente. La estrategia seguida será el complejamiento para formar nanoestructuras mediante un enfoque botton-up. Capítulo I Introducción General 10 Figura I.2. Clasificación de las tecnologías de encapsulación según los enfoques top-down y bottom-up y el tamaño de las partículas. Adaptado de Alu'datt y col. (2022). I.3.1. Vitamina E i. Nomenclatura y estructura química Con el nombre de vitamina E se conoce a un grupo de al menos ocho compuestos que exhiben actividad biológica de tocoferol, incluyendo cuatro tocoferoles y cuatro tocotrienoles (α-, β-, γ- y δ-tocotrienoles) (Ribeiro y col., 2021). Todos estos constan de un anillo cromano y una cadena lateral saturada. El anillo de cromano (de naturaleza polar) deriva del ácido homogentísico, proveniente del metabolismo de los aminoácidos aromáticos (vía del shikimato). Se encuentra sustituido por grupos metilo (−CH3), cuyo número y posición da origen a las estructuras α-, β-, γ- y δ (Figura I.3). Por otro lado, la cadena lateral de fitilo deriva de geranilgeranil difosfato, biosintetizado a partir de la ruta del fosfato de metileritritol (Saini y col., 2016). Consta de 16 carbonos, siendo completamente saturada en los tocoferoles o con Capítulo I Introducción General 11 tres insaturaciones en los tocotrienoles. Todos estos compuestos presentan una gran variedad de isómeros. La forma RRR-α-tocoferol, es la única que se presenta naturalmente en los alimentos. En la naturaleza son sintetizados sólo por los organismos fotosintéticos –plantas y cianobacterias-, en donde juegan un papel importante como eliminador de oxígeno singulete en el fotosistema II (Saini y col., 2016). Figura I.3. Estructura de tocoferoles y tocotrienoles. ii. Función biológica La vitamina E es conocida por su poderosa actividad antioxidante. A diferencia de cualquier otra molécula antioxidante; existe suficiente evidencia que sugiere que la señalización celular es la principal actividad de α-tocoferol en un sistema celular. El α-tocoferol juega un papel importante en el mantenimiento de la integridad de los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en las membranas celulares. Específicamente, interactúa con los grupos acilo de los lípidos poliinsaturados, protegiéndolos de la peroxidación mediante la eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS). Durante la reacción con ROS, el α-tocoferol actúa como chain- Capítulo I Introducción General 12 breaking liposoluble, mediante un mecanismo de donación de átomos de hidrógeno (HAT), interceptando el radicales peroxilo (ROO•) y lipoproteínas de baja densidad (LDL). Las LDL oxidadas se asocian con el desarrollo de enfermedades cardiovasculares, debido al depósito de lípidos en la pared arterial (Saini y col., 2016). La presencia de otros antioxidantes como el ácido ascórbico (vitamina C) contribuye a la regeneración de los tocoles (Jiang, 2014). iii. Distribución, fuentes y recomendaciones dietéticas El contenido y la composición de los tocoles varían enormemente entre los tejidos vegetales. Las hojas acumulan alta proporción de α-tocoferol y bajos niveles de tocoles totales, mientras que las semillas acumulan 10–20 veces mayor cantidad de tocoles totales, con una gran proporción de γ-tocoferol (Saini y col., 2016). En los alimentos, los tocoles coexisten con los ácidos grasos; curiosamente, la mayoría del γ-tocoferol se asocia principalmente con ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), especialmente con ácidos grasos Ω-6 mientras que los α- tocoferoles están asociados con ácidos grasos monoinsaturados (MUFA). Por lo tanto, colectivamente el γ-tocoferol y los ácidos grasos Ω-6 juegan un papel vital en la prevención de enfermedades (Jiang, 2014). Como se ha mencionado,la vitamina E está presente en cantidades apreciables en aceites vegetales y en alimentos elaborados a partir de ellos. También en huevos, semillas, frutos secos y cereales integrales. La vitamina E es un nutriente esencial para los humanos. La IDR (ingesta diaria recomendada) de vitamina E para adolescentes (14–18 años), hombres adultos y mujeres no lactantes (19 años y mayores) es de 15 mg (22,5 UI) por día, mientras que, para mujeres lactantes, es de 19 mg (28,5 UI) por día (NIH, 2023b). Capítulo I Introducción General 13 iv. Propiedades funcionales y fortificación Numerosos estudios han demostrado los potenciales beneficios asociados al consumo de la vitamina E en la salud. Entre estos se incluyen efectos hipolipidémico, antiaterogénico, antihipertensivo, supresor de dermatitis alérgica, nefroprotector, neuroprotector y antiinflamatorio (Saini y col., 2016). Tocoferoles y tocotrienoles también cumplen una función tecnológica al contribuir con la estabilidad oxidativa de los alimentos y aumento de la vida útil (Kamal-Eldin y col., 2015). Aunque tradicionalmente se le ha atribuido al α-tocoferol la mayor actividad vitamínica, estudios recientes sugieren que los γ-tocoferoles serían más potentes en sus efectos antioxidantes (Mathur y col., 2015). Existen suficientes motivos para considerar positiva la adición de vitamina E a los alimentos. Sin embargo, la aplicación directa de este nutriente, resulta condicionada por su naturaleza hidrofóbica y su sensibilidad inherente al oxígeno, calor y luz. Los tocoferoles se oxidan fácilmente expuestos al aire, especialmente ante la presencia de Fe. Consecuentemente, en la industria alimentaria, farmacéutica y de suplementos se ha utilizado una forma esterificada del α-tocoferol, el acetato de α-tocoferol (Figura I.4), por exhibir mayor estabilidad que la forma libre (Yang y col., 2013a). En el presente trabajo de Tesis, se utilizó el acetato de α-tocoferol como fuente dietaria de vitamina E, debido a que ésta es la forma más utilizada como suplemento en la fortificación de alimentos, disponiéndose en grandes cantidades a escala industrial. A pesar de no actuar como atrapador de radicales libres en reacciones oxidativas (Müller y col., 2010) , numerosos artículos han reportado que aún con el grupo acetato, sigue siendo susceptible a ciertos agentes ambientales y merece el estudio para aplicar distintas estrategias para su protección (Padamwar y col., 2006), debido principalmente en el plano nutricional. Capítulo I Introducción General 14 Figura I.4. Estructura del acetato de α-tocoferol. I.3.2. Vitamina B9 i. Nomenclatura y estructura química Con el nombre de vitamina B9 se conoce a una familia de compuestos con actividad biológica similar o vitámeros, también denominados “folatos” o genéricamente “folato”, entre los que se incluye al ácido fólico (AF) (NIH, 2023a). Son compuestos hidrosolubles que están presentes tanto en alimentos naturales, como fortificados y en suplementos dietarios. Los folatos consisten en una estructura básica compuesta por un anillo de pteridina unido a través de un puente metileno a una molécula de ácido p-aminobenzoico conjugada con una molécula de ácido glutámico (Figura I.5). A partir de ésta, unidades adicionales de ácido glutámico se pueden añadir mediante enlaces γ-peptídicos para dar formas poliglutámicas (Bailey y col., 2012). Los folatos naturales y sintéticos existen en distintas formas químicas: tetrahidrofolato (THF), metilfolato (MTHF), formilfolato (FTHF) y en varios estados de oxidación (5,6,7,8- tetrahidropteroilglutamato, etc.), con diferentes sustituyentes y diferente grado de conjugación con el ácido glutámico. Se estima que un 80 % de los folatos presentes de forma natural en los alimentos se encuentran en forma poliglutámica (con 5 a 8 unidades de ácido glutámico), y el resto como monoglutamatos, principalmente metiltetrahidrofolato. En el tracto intestinal, los Capítulo I Introducción General 15 folatos deben ser primeramente hidrolizados a monoglutamatos para ser absorbidos (Medicine, 1998). Esta reacción, catalizada por la γ-glutamilhidrolasa o folato conjugasa, sucede en el borde apical de las vellosidades de la mucosa en el yeyuno (Olivares y col., 2004). Antes de ingresar al torrente sanguíneo, la forma monoglutámica se reduce a THF y lo convierte ya sea en los derivados metilo o formilo. La principal forma de folato en plasma es la 5-MTHF. Figura I.5. Estructura química del ácido fólico. A diferencia de los poliglutamil folato de existencia natural, el AF presenta una estructura monoglutámica completamente oxidada, siendo más estable y presentando una absorción más facilitada (Hoffpauer y col., 1998). Esta es la razón por la cual, el AF es la forma más común en que se adiciona vitamina B9 a los alimentos fortificados y con la cual se formulan suplementos. El AF raramente existe en los alimentos naturales. ii. Función biológica En los sistemas vivos, los folatos actúan como coenzima o cosustrato en reacciones de transferencia de un único carbono en la síntesis de ácidos nucleicos (ADN, ARN) y en el metabolismo de los aminoácidos (Ross y col., 2012). Una de las reacciones más dependiente de folato es la conversión de homocisteína a metionina. También participan en el catabolismo Capítulo I Introducción General 16 de la Hys y Gly, en la interconversión Gly-Ser y en la síntesis de proteínas, al actuar en la reacción de formilación de la metionina. Otra reacción dependiente del folato es la metilación del desoxiuridilato a timidilato en la formación del ADN, particularmente en células de rápida multiplicación, como las células epiteliales del tracto digestivo, y glóbulos rojos (Olivares y col., 2004). De hecho, un deterioro de esta reacción a consecuencia de la deficiencia de folato, puede conducir a la anemia megaloblástica, la cual se caracteriza por un reducido número de glóbulos rojos (Ross y col., 2012). iii. Distribución, fuentes y recomendaciones dietéticas Como se ha mencionado, los folatos existen naturalmente en diversos alimentos como el jugo de naranja, frutilla, vegetales de hojas verdes, nueces, maníes, legumbres y distintos tipos de porotos (negros y aduki), germen de trigo, yema de huevo, lácteos y levadura (Arcot y col., 2005). A excepción del hígado, las carnes no son buena fuente de folatos. También están presentes en alimentos fortificados y en preparaciones farmacéuticas (complejos multivitamínicos para adultos o niños, suplementos prenatales, suplementos para adultos (Yeung y col., 2011). Los folatos son micronutrientes esenciales. Si bien, es sabido que la microbiota colónica produce folatos y estos pueden ser absorbidos a través del colon, la medida en la cual este folato satisface los requerimientos dietéticos aún no está clara (Lakoff y col., 2014). Por esta razón deben ser ingeridos con la dieta. La evidencia científica que vincula a los folatos con el mantenimiento de la salud, y como estrategia para la prevención de las enfermedades de tubo neural condujo a la propuesta de recomendaciones a nivel internacional para asegurar una correcta ingesta de folato (Samaniego-Vaesken y col., 2010). Las ingestas diarias recomendadas de folatos, según el grupo etario y sexo, se presentan en la Tabla I.1. Capítulo I Introducción General 17 Donde FDE significa “Folato Diario Equivalente” y refleja las diferentes biodisponibilidades de los folatos dependiendo de su origen. Así por ejemplo 1 µg FDE = 1 µg de folato alimentario = 0,6 µg AF (en alimentos fortificados o suplementos consumidos con alimentos) = 0,5 µg AF (en suplementos dietéticos tomados con el estómago vacío). Tabla I.1. Ingestas diarias recomendadas (RDA) para folatos. Edad Masculino, µg FDE Femenino, µg FDE Gestación, µg FDE Lactancia, µg FDE 0a 6 meses* 65 65 7 a 12 meses* 80 80 1 a 3 años 150 150 4 a 8 años 200 200 9 a 13 años 300 300 14 a 18 años 400 400 600 500 19+ años 400 400 600 500 *Ingesta adecuada (IA). iv. Propiedades funcionales y fortificación Los efectos benéficos de los folatos en la nutrición de las mujeres durante el embarazo y la lactancia son ampliamente conocidos (Madziva y col., 2006). Se ha relacionado su ingesta con la prevención de malformaciones en fetos como espina bífida, casos de acráneos y anemia megaloblástica (Girard y col., 2021). Existen además reportes del rol de los folatos en la prevención de enfermedades cardiovasculares (Adank y col., 2003; Rader, 2002), neurodegenerativas (Miller, 2003; Reynolds, 2002) y distintos tipos de cáncer (Abu Ali y col., 2021; Kim, 2004; La y col., 2002; Pérez y col., 2014), entre otras. Capítulo I Introducción General 18 Estas y otras propiedades benéficas han fundamentado la incorporación intencionada de folatos en alimentos, principalmente en forma de AF. Así, por ejemplo, en Argentina, la harina se ha enriquecido por Ley 25.630, con 2,2 mg/kg de AF. Sin embargo, el AF presenta características distintivas que dificultan su incorporación directa. Es un cristal amarillo con limitada solubilidad en agua, aunque mayormente soluble en soluciones acuosas a pH extremos, e insoluble en solventes orgánicos (Dick y col., 1948; Lund, 1994). El AF es inestable en condiciones ácidas y al calor en condiciones de pH extremo. La velocidad de destrucción está condicionada además por el tipo de buffer, la incidencia de la luz solar (ultravioleta y visible) (Cheung y col., 2009) y la matriz alimentaria (Arcot y col., 2005). Ante esto, la fortificación de alimentos y desarrollo de suplementos ha demandado implementar estrategias específicas para la protección del AF. En este trabajo se estudiarán la vehiculización mediante complejamiento del AF, por ser esta la forma comercial más disponible y ampliamente utilizada, con proteínas del lactosuero bubalino. Capítulo I Objetivos 19 I.4. Hipótesis y Objetivos I.4.1. Hipótesis El procedimiento de complejamiento entre proteínas derivadas del lactosuero bubalino y las vitaminas propuestas aumenta la estabilidad y mejora la funcionalidad de las mismas, constituyendo nanovehÍculos que incrementan su protección, y direccionamiento. De esta manera, es posible construir una plataforma reproducible y eficaz de nanoencapsulación en términos fisicoquímico, funcional y biológico. I.4.2. Objetivo general de la Tesis El objetivo general de esta Tesis fue explorar los aspectos fisicoquímicos y moleculares que gobiernan el proceso de complejamiento de las proteínas del suero de leche de búfala (Bubalus bubalis) de la región NEA con vitaminas, para su vehiculización. Tales aspectos determinan el comportamiento funcional de estos nano-microsistemas. En particular, resultó de interés estudiar las interacciones que promueven la formación nano-microestructuras para la protección y liberación en condiciones controladas de la vitamina E y vitamina B9, como modelos de compuestos bioactivos hidrofóbicos e hidrofílicos, respectivamente. Los resultados de este trabajo contribuirán al conocimiento del potencial tecnológico del lactosuero bubalino como subproducto actualmente desaprovechado, generando alternativas que posibiliten el agregado de valor y reducción de la carga contaminante, lo cual prevé inminentes beneficios económicos y sociales. Capítulo I Objetivos 20 I.4.3. En este contexto se proponen los siguientes objetivos específicos 1. Caracterizar las propiedades fisicoquímicas y moleculares de la fracción proteica presentes en un concentrado de lactosuero obtenido a escala laboratorio a partir de leche de búfala de la región NEA. 2. Describir las interacciones que ocurren entre las proteínas del suero lácteo bubalino en conformación nativa y ante la desnaturalización química, y las vitaminas E y B9. 3. Examinar el impacto del complejamiento molecular sobre la estructura, distribución de tamaño de partícula y actividad antioxidante de las sustancias intervinientes, en relación a la capacidad de atrapamiento y protección de los compuestos bioactivos. 4. Evaluar el desempeño de los complejos BWPC - Vitamina en sistemas superficiales A/W mediante la obtención de parámetros característicos que permitan evaluar la actividad y capacidad espumante y estabilización de espumas alimentarias. 5. Estudiar la liberación de las vitaminas en condiciones gastrointestinales simuladas. 21 Capítulo II. Obtención y Caracterización del BWPC. Estudio de las Interacciones moleculares Capítulo II Introducción 22 II.1. Introducción Las proteínas constituyen materiales atractivos para el desarrollo de sistemas de vehiculización de compuestos bioactivos, debido a sus propiedades biológicas y funcionales únicas, tales como su naturaleza anfifílica, actividad superficial, biodegradabilidad, biocompatiblidad, disponibilidad de fuentes renovables, alto valor nutricional, actividad antioxidante, y excelentes propiedades tecno-funcionales como emulsionantes, formadoras de films, espumantes y gelificantes (Mohammadian y col., 2020). La presencia de sus grupos funcionales les permite a las proteínas, incluso en estado nativo, interactuar con diversos compuestos y formar nanocomplejos. Moléculas pequeñas con actividad biológica pueden unirse a través de interacciones débiles, principalmente no- covalentes (van der Waals, puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas) (Xie y col., 2022). Tanto el tipo, como la intensidad de la interacción dependen de la naturaleza del ligando, así como de las condiciones del entorno (Tang, 2020). La formación de complejos proteína-ligando sucede en un proceso de equilibrio dinámico que tiene lugar normalmente en fase homogénea debido a las propiedades fisicoquímicas de las sustancias intervinientes (Zhang y col., 2021a). En particular, las proteínas lácteas pueden unir compuestos bioactivos hidrofílicos, hidrofóbicos, e incluso cargados, estabilizando su actividad biológica (Xie y col., 2022), en medios acuosos y condiciones moderadas de pH y temperatura. La formación de complejos puede involucrar, a su vez, asociaciones a multi-escala (Ramos y col., 2019a). Esto es, en las escalas nano y micrométricas, resultando en nano y/o microestructuras con aptitud para transportar, proteger y liberar, sustancias de interés en sitios específicos, incluido en el tracto gastrointestinal (Mohammadian y col., 2020). Entender los Capítulo II Introducción 23 mecanismos involucrados en los procesos de complejamiento, requiere de una investigación exhaustiva a distintos niveles. Por un lado, el estudio de las interacciones proteína-bioactivo puede llevarse a cabo mediante la obtención de diversos parámetros termodinámicos y cinéticos tales como afinidad de unión, mecanismos de enlazamiento, constantes estequiométricas, naturaleza y fuerzas de unión, distancias de equilibrio, etc. En este contexto, las técnicas espectroscópicas resultan de gran utilidad debido a que permiten el estudio de las interacciones a nivel molecular (Ramos y col., 2019a). Muchos autores recomiendan implementar un enfoque multi-instrumental. Esto es, un conjunto de técnicas analíticas instrumentales y complementarias que proporcionen una visión global de las interacciones carrier-ligando. A su vez, resulta de gran interés entender cómo interactúan espacialmente las moléculas intervinientes. En este sentido, las herramientas computacionales como el docking molecular, contribuyen a predecir el lugar de atrapamiento, y el modo en que el compuesto bioactivo se une a la proteína (Tang, 2020). Por otro lado, debido a que la unión de los compuestos bioactivos a las proteínas conduce inevitablemente a cambios en las estructuras secundarias y terciarias (Ferinay col., 2019), resulta de interés examinar el impacto de estos cambios en las propiedades funcionales de las entidades que resultan post-interacción. Las modificaciones en la hidrofobicidad superficial, dominios de la estructura secundaria, e incluso desplegamientos debidas a la interacción (Timilsena y col., 2016), contribuyen a explicar el hecho de que, en muchos casos, los complejos formados exhiben propiedades funcionales (solubilidad, capacidad antioxidante, actividad superficial, emulsionante, espumante y estabilidad conformacional) mejoradas (Kuan y col., 2016). Los complejos exhiben así gran potencial de ser aplicados como estrategias de nano- micro- encapsulación de compuestos bioactivos para el desarrollo de ingredientes alimentarios multi- Capítulo II Introducción 24 funcionales (Mohammadian y col., 2020). Evaluar la eficiencia, capacidad de carga y de protección constituyen prerrequisitos clave al evaluar la factibilidad del método en cuestión. Capítulo II Objetivos 25 II.1.2. Hipótesis • El BWPC forma complejos moleculares con el TOC y AF, protegiendo a las vitaminas de los agentes externos injuriantes. Como contrapartida, la estructura proteica puede verse modificada, como también las propiedades intrínsecas de las vitaminas. II.1.3. Objetivos específicos - Obtener un concentrado proteico de lactosuero bubalino (BWPC). - Conocer la composición centesimal del BWPC. - Determinar el perfil proteico del concentrado. - Analizar la fracción proteica del BWPC con un enfoque ómico. - Evaluar el impacto de la congelación sobre la distribución de masas y estructura secundaria de la fracción proteica del lactosuero bubalino. - Evaluar la capacidad de la fracción proteica del BWPC para interaccionar con el TOC y el AF, y caracterizar tales interacciones. - Analizar los cambios que podrían darse en las interacciones con el TOC y el AF como consecuencia de la desnaturalización química provocada en las proteínas constituyentes del BWPC. - Establecer los sitios más probables de unión, las interacciones moleculares y las energías implicadas en la interacción del TOC y del AF con las proteínas principales del BWPC. - Determinar la composición de los elementos de estructura secundaria de la fracción proteica del BWPC y su modificación después de la interacción con el TOC y el AF. - Verificar la existencia de agregación proteica inducida por la interacción con el TOC y el AF. Capítulo II Objetivos 26 - Reconocer el potencial-ζ como un criterio de estabilidad coloidal de los nanocomplejos BWPC - Vitamina. - Calcular la Eficiencia de Encapsulación (EE) y Capacidad de Carga (CC) para cada complejo BWPC - Vitamina. - Examinar la capacidad antioxidante del BWPC, TOC, AF y de los sistemas mixtos. - Evaluar la estabilidad de las vitaminas, en ausencia y presencia de BWPC, frente a la luz UV, calor u oxígeno. Capítulo II Materiales y métodos 27 II.2. Materiales y métodos II.2.1. Materiales II.2.1.1. Obtención del BWPC El suero lácteo bubalino se obtuvo a escala laboratorio a partir de leche cruda de búfalas de las provincias de Chaco, Corrientes y Formosa. Debido a que esta leche aún no se comercializa, contar con la cantidad suficiente para el desarrollo de la Tesis, requirió obtenerla personalmente. Para ello, se realizó la búsqueda y localización de los productores bubalinos de la provincia y alrededores, utilizándose para ello bases de datos del SENASA, notas periodísticas disponibles en la web y fuentes secundarias de información. Seguidamente, se visitó a aquellos productores que generosamente ofrecieron la provisión de materia prima. En los establecimientos se realizó el ordeño manual de búfalas de las razas Murrah, Mediterránea, Jafarabadi y mestizas en periodo de lactación. En todos los casos, la extracción de leche se llevó a cabo en condiciones de higiene, en casilla de operación o instalaciones similares, siguiendo pautas de manejo y bienestar animal. El ordeño se produjo hasta vaciar las cisternas de las glándulas mamarias, alcanzándose una producción promedio de aproximadamente 1,5 L leche/animal. La Figura II.2.1 ilustra la secuencia de operaciones que se efectuaron hasta la obtención del BWPC de acuerdo a lo reportado en Bustos y col. (2022). En los lugares de ordeño, la leche cruda se filtró con algodón y se trasvasó a botellas PET limpias y desinfectadas. Los recipientes se sumergieron en un baño de agua helada para reducir la temperatura de la leche hasta 4 ºC aproximadamente. En estas condiciones, se transportaron las muestras en el mismo día de su obtención hasta el laboratorio de Alimentos Funcionales de la Universidad Nacional del Chaco Austral en Presidencia Roque Sáenz Peña, Chaco. Capítulo II Materiales y métodos 28 Figura II.2.1. Proceso de obtención del concentrado proteico de lactosuero bubalino (BWPC). En el laboratorio, las muestras se congelaron lentamente hasta -18 ºC y se conservaron a esta temperatura hasta el momento de su procesamiento. Habiéndose recolectado un volumen de leche de 30 L, se procedió a descongelar por inmersión de los recipientes en baño de agua a temperatura ambiente. Luego, se tomó una muestra de cada botella y se midió su pH como indicador de calidad, verificándose que se encuentre en el rango correcto 6,57 – 6,84 (Park y col., 2017). Solo las muestras con valores de pH normales (evidenciando la ausencia de alteraciones microbianas) se consideraron aptas para su procesamiento. Las muestras individuales se mezclaron y se pasteurizaron en batch por calentamiento a 65 ºC por 20 min, y posterior enfriamiento a 35 ºC por inmersión en baño de agua helada. Disponiéndose así de leche de búfala pasteurizada, se prosiguió con la obtención de la cuajada y separación del suero. Para ello, se agregó CaCl2 previamente disuelto en agua potable, hasta alcanzar una concentración de 0,01 % p/v. Seguidamente se disminuyó el pH con ácido láctico Capítulo II Materiales y métodos 29 hasta un pH 6 considerado óptimo para la coagulación enzimática (Yazici y col., 2010). Luego, se procedió a la adición de cuajo comercial, previamente disperso en agua potable hasta alcanzar una relación 1 g cuajo/L leche. La leche se mantuvo en reposo por 40 min a 35 ºC permitiéndose la formación del coágulo. Transcurrido este tiempo, se procedió al corte de la cuajada y calentamiento de la mezcla para favorecer la expulsión del suero. Con esta finalidad, se utilizó un cuchillo de hoja larga, practicándose cortes perpendiculares entre sí hasta alcanzar gránulos de un tamaño similar al de un poroto (0,6 – 0,9 mm). Luego se realizó al calentamiento de la mezcla a 40 ºC por 5 min, bajo agitación constante. Finalmente, se llevó a cabo el filtrado de la cuajada con lienzo, obteniéndose el lactosuero con un rendimiento de 0,77 L lactosuero/L leche. Sobre el lactosuero obtenido, se realizó un desnatado por centrifugación a 3000 x g durante 10 min a 4 °C, en una centrífuga Rotina 380 R (Zentrifugen, Germany). El suero desnatado se sometió a diálisis, a los efectos de reducir el contenido de lactosa y minerales. Se utilizaron para ello membranas de MWCO de10 kDa (SnakeSkin, Thermo Fisher Scientific), por 24 H contra agua corriente. El lactosuero dializado se dispuso en bandejas de aluminio y se congeló lentamente hasta -18 ºC, manteniéndose a esta temperatura durante al menos 24 h. Seguidamente se procedió a liofilizar las muestras a una presión de 0,02 mmHg (Rificor, Modelo L-I-E300-CRT, Buenos Aires, Argentina) durante 48 h. El concentrado proteico de lactosuero bubalino (BWPC) así obtenido se envasó en recipientes plásticos de 50 mL, los cuales se conservaron a -18 ºC y protegidos de la luz hasta el momento de su uso. Debido a que las suspensiones acuosas delBWPC (con 1 o 2 % m/v de proteínas totales) presentaron turbidez, y algunas técnicas requieren de soluciones límpidas, se procedió a un proceso de clarificación adicional a los efectos de minimizar la opacidad. Para esto, se prepararon suspensiones acuosas del BWPC (17 a 33 mg/mL de BWPC en agua destilada) dejándose hidratar durante la noche anterior a 4 °C. Luego, se llevó a cabo una centrifugación Capítulo II Materiales y métodos 30 (3000 x g durante 10 min, 25 °C) y posterior filtración del sobrenadante con membranas de nylon de 0,45 y 0,22 µm (Gamafil, Buenos Aires, Argentina). II.2.1.2. Vitaminas y otros reactivos El acetato de α-tocoferol fue donado por Laboratorios Raymos (CABA, Argentina). El ácido fólico (AF) con 99,0 % de pureza fue amablemente proporcionado por Laboratorios Bagó (La Plata, Argentina). Las sales Na2HPO4.7H2O, NaH2PO4.H2O, CuSO4.5H2O, K2SO4, persulfato de amonio, de potasio y acetato de sodio trihidratado, junto con ácido bórico, L-Tirosina, L- Triptófano, tween 20, hexano, diclorometano y los solventes grado HPLC, acetonitrilo, metanol y etanol fueron adquiridos de Biopack (Buenos Aires, Argentina). Los ácidos clorhídrico y sulfúrico concentrados, ácido acético glacial, etanol absoluto, junto con los sólidos NaOH, FeCl3x6H2O y urea se adquirieron de Reactivos Cicarelli S.A. (Santa Fe, Argentina). El Tris base, fenol, 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ), 2,2’-azino-bis(3- etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) (ABTS), tetrametiletilendiamina (TEMED) y la solución de acrilamida/bis-acrilamida al 40 % se adquirieron de Sigma-Aldrich Corporation (St Louis, MO, EE. UU.). Todos los demás productos químicos utilizados fueron de grado analítico y se utilizó agua ultrapura en todos los experimentos. II.2.2. Métodos II.2.2.1. Análisis proximal El BWPC y el BWPC clarificado se sometieron a diferentes análisis para determinar su composición centesimal. En particular se determinó su contenido de proteínas por el método de Kjeldahl utilizando un factor de conversión de 6,23, lactosa (método fenol-sulfúrico) (Chen Capítulo II Materiales y métodos 31 y col., 2016), materia grasa (AOAC 932.06), humedad (AOAC 927.05) y cenizas (mufla a 550 ºC). II.2.2.2. Perfil proteico La composición de la fracción proteica del BWPC clarificado, de ahora en adelante simplemente lo llamaremos BWPC (en caso que se aclare lo contrario) se determinó mediante diferentes técnicas. II.2.2.2.1. Electroforesis en gel de poliacrilamida Las fracciones proteicas constituyentes del BWPC se identificaron inicialmente mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) empleando una cuba Mini-Protean Tetra Cell (Bio-Rad Laboratories). Para ello, una solución de BWPC se mezcló con el buffer de muestra 5X (250 mM Tris, 10% SDS, 30% glicerol and bromofenol blue, pH 6,8) y se calentó a 70 °C por 10 min. 10 μL de esta solución, conteniendo 40 μg proteína, se sembró en cada pocillo del gel superior (4 % m/v acrilamida). La sección correspondiente al gel separador contuvo 15 % m/v de acrilamida. El sistema se corrió a 200 V. La composición del buffer de corrida fue 25 mM Tris, 200 mM glicina y 0,1 % m/v SDS, pH 8,3. Finalizada la corrida, los geles se tiñeron con una solución de azul brillante coomassie R250 (0,1 % m/v) y posteriormente se decoloraron con una mezcla metanol:ácido acético 2.5:1 (35 % v/v). Después, los geles se escanearon (HP 4640, Hewlett Packard, USA) y las bandas proteicas digitalizadas se analizaron usando el software Image J. Capítulo II Materiales y métodos 32 II.2.2.2.2. Electroforesis Capilar Complementariamente, el perfil proteico del BWPC se determinó mediante electroforesis capilar (EC) en un sistema Beckman Coulter P/ACE MDQ equipado con un detector de arreglo de diodos (DAD) y un capilar de sílice fundida de 40 cm de largo x 50 μm de d.i. (30 cm de longitud efectiva). Antes de la primera medida, el capilar se lavó con NaOH 0,1 M por 20 min, agua por 15 min y el buffer de corrida (buffer borato 150 mM pH 8,5, tween 20 0,05 %) por 10 min. El BWPC se disolvió en un buffer fosfato 10 mM pH 7,4 y las corridas se llevaron a cabo a 25 °C y entre las mismas, el capilar se acondicionó con NaOH 0,1 M por 2 min y buffer de corrida por 4 min. La detección se realizó a 280 nm y la inyección de las muestras fue hidrodinámica por 7 s. Las separaciones se llevaron a cabo a 20 kV, originándose una corriente de 37 µA. Las inyecciones se realizaron por duplicado y los electroferogramas se extendieron hasta los 5 min. II.2.2.2.3. FPLC Las proteínas presentes en el BWPC se separaron mediante cromatografía líquida rápida para proteínas (FPLC) utilizando un cromatógrafo AKTA purifier equipado con dos columnas, una de exclusión por tamaño (Superdex 200 10/300 GL) y otra de intercambio aniónico (Mono Q 4.6/100 PE). Se siguió el protocolo propuesto por (Andrews y col., 1985) con modificaciones. Para ambas columnas, el BWPC se disolvió en el buffer 20 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 200 mM, se inyectaron 50 µL y la detección se realizó por absorbancia a 280 nm. La elución se realizó a un flujo de 0,5 mL/min y con el mismo buffer de muestra para el caso de la columna Superdex, mientras que cuando se usó la columna Mono Q, la elución fue en gradiente de NaCl, desde 0 a 350 mM. Capítulo II Materiales y métodos 33 II.2.2.3. Análisis proteómico Con la finalidad de obtener un resultado global en términos de las identidades de proteínas y péptidos presentes en el BWPC, se llevó a cabo un análisis proteómico. Para ello, se llevó a cabo inicialmente una electroforesis SDS-PAGE del BWPC con la particularidad de que la corrida se detuvo cuando la totalidad de la muestra ingresó al gel separador. El protocolo empleado fue el de Domínguez Rubio y col. (2017) con modificaciones. Luego, esa porción de gel se recortó y se redujo con Dithiothreitol (DTT) 20 mM durante 45 min a 56 ºC. A continuación, la muestra se alquiló con Iodoacetamida 50 mM durante 45 min en oscuridad. Posteriormente, se digirió overnight con tripsina (corta a la derecha de Lys y Arg). Se realizó la extracción de los péptidos con acetonitrilo. Después, la muestra se deshidrató por Speed Vac y se volvió a resuspender con 10 µL de ácido fórmico 0,1%. Se realizó un desalado pasando por zip Tip C18 (Merck) y se analizó por nanoHPLC acoplado a un espectrómetro de masa con tecnología Orbitrap. La ionización de las muestras se realizó por electrospray. El análisis de los espectros de masas se llevó a cabo con el programa ProteomeDiscoverer, usando la base de datos para Bubalus bubalis de UniProt. II.2.2.4. Evaluación del efecto de la congelación Debido a la estacionalidad de la producción de leche bubalina y a la imposibilidad de adquirir cantidades suficientes en el mercado, reunir un volumen suficiente para las instancias experimentales, requirió el almacenamiento de la de leche de búfala a temperatura de congelación (-18 °C). Por ser esta una práctica de conservación habitual en el procesamiento artesanal y semiindustrial, se decidió evaluar los efectos del congelamiento en las propiedades moleculares de las proteínas de suero, en distintas instancias del proceso de obtención de lactosuero bubalino. En particular, se comparó el lactosuero preparado a partir de leche fresca Capítulo II Materiales y métodos 34 (LLF) respecto del lactosuero obtenido a partir de leche previamente congelada (LLC). Del mismo modo, se evaluó el lactosuero congelado de leche fresca (LCLF) y el lactosuero congelado de leche congelada (LCLC), según se indican en el diagrama de la Figura II.2.2. Figura II.2.2. Diagrama de obtención de las muestras para analizar el efecto de la congelación. Sobre las muestras en estudio se estudió el cambio en la distribución de pesos moleculares mediantemediante SDS-PAGE en las condiciones descritas en Sección II.2.2.2.1 y los cambios en la estructura secundaria de la proteína por espectrometría de infrarrojo. Para ello, empleó un espectrómetro FT-IR NICOLET iS5 en la modalidad Reflectancia Total Atenuada ATR (ATR). La recolección de los espectros se llevó a cabo con una resolución de 4 cm-1 y 16 scans. A los espectros de las muestras se les sustrajo el del agua y se corrigió la línea base. Al resultado se le aplicó la segunda derivada (algoritmo de Savitzky-Golay) y se acotó la región de trabajo a la banda amida I (1.700 - 1.600 cm-1). El espectro derivado se invirtió verticalmente y los picos Capítulo II Materiales y métodos 35 resueltos se ajustaron con funciones Gaussianas. Los picos se asociaron a diferentes estructuras secundarias de las proteínas según Grewal y col. (2018). II.2.2.5. Obtención de los complejos BWPC - Vitaminas El estudio de las interacciones entre la fracción proteica del BWPC y las vitaminas (AF o TOC) se formularon sistemas mixtos conteniendo una cantidad fija de BWPC y concentraciones variables de las vitaminas. Para ello, se prepararon soluciones stock, de BWPC (400 μM de proteínas en buffer fosfato 10 mM pH 7), de AF (200 μM en buffer fosfato 10 mM pH 7) y de TOC (200 mM en etanol 96°). Este último se usó para preparar un sub-stock a 110 μM en buffer fosfato 10 mM pH 7, todas estas soluciones se protegieron de la exposición a la luz, cubriéndolas con papel aluminio. Las soluciones stock de BWPC y AF se mezclaron y diluyeron apropiadamente con el buffer fosfato para lograr sistemas mixtos con 5 μM de proteínas y 0, 0,5, 1, 2, 5, 10 y 20 μM de AF. Se usó esta concentración máxima como límite para independizarnos del fenómeno de autoagregación con el consiguiente autoquenching como lo indican Liang y col. (2010). En otro conjunto de sistemas mixtos, la solución stock de BWPC se mezcló adecuadamente con el sub-stock de TOC para obtener sistemas mixtos con 5 μM de proteínas y 0, 5, 10, 20, 50 y 100 μM de TOC. Antes de las mediciones, se permitió que los sistemas mixtos de BWPC - Vitamina interactúen durante 15 minutos, habiéndose demostrado en ensayos previos que este tiempo fue suficiente para lograr el equilibrio (datos no mostrados). Capítulo II Materiales y métodos 36 II.2.2.6. Fluorescencia El análisis de los espectros de emisión constituye un enfoque útil para dilucidar posibles interacciones. Se basa en el estudio de los cambios espectrales que experimenta la fluorescencia intrínseca de las proteínas debidos a las alteraciones en la conformación terciaria, como consecuencia de la presencia de ligandos (Katouzian y col., 2020; van de Weert y col., 2011). En estado nativo, las proteínas deben su fluorescencia intrínseca a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr y Phe). La interacción de las proteínas con otras moléculas puede llevar a una disminución en la intensidad de la fluorescencia, fenómeno conocido como “quenching”. El estudio de los diversos factores que pueden producir este efecto (efecto de filtro interno, quenching colicional, formación de complejos en estado basal, o excitado, y cambios estructurales de la proteína debidos al ligando), así como el modelado de los datos experimentales para la obtención de parámetros característicos, pueden resultar en valiosa información (van de Weert y col., 2011). Los espectros de emisión de fluorescencia de los sistemas mixtos se registraron utilizando un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse (Agilent Technologies, EE. UU.) de 290 a 500 nm a una longitud de onda de excitación (λex) de 280 nm. Los anchos de las rendijas de excitación y emisión se fijaron en 5 nm. Las muestras se colocaron en cubetas de cuarzo de 10 mm y se usó el buffer correspondiente como blanco. Aunque el AF y el TOC tienen una intensidad de fluorescencia muy baja por sí mismos a pH 7, se prepararon muestras control a las mismas concentraciones que en los sistemas mixtos, pero en ausencia de proteína. Las intensidades de fluorescencia de estas muestras se restaron de la intensidad de fluorescencia de los sistemas mixtos BWPC – Vitamina (Abdollahi y col., 2020). Además, dado que las vitaminas pueden adsorber cierta cantidad de luz en las longitudes de onda de excitación y emisión, es decir también presentar autoabsorción o efecto de filtro interno, los datos de Capítulo II Materiales y métodos 37 fluorescencia deben corregirse antes del análisis (Bakar y col., 2019) para disminuirlo, por lo que se aplicó la siguiente ecuación (Śliwińska-Hill, 2021): Fcor = Fobs ∗ e �(Aex∗dex)+(Aem∗dem)2 � (𝑒𝑒𝑒𝑒. 𝐼𝐼𝐼𝐼. 1) donde Fcor es la intensidad de fluorescencia corregida después de la eliminación del efecto del filtro interno, Fobs es la intensidad de fluorescencia medida y sin corregir; dem y dex son las longitudes del camino óptico (cm) en las direcciones de emisión y excitación respectivamente, Aex y Aem son los cambios de absorción de los sistemas mixtos tras la adición de la vitamina en la longitud de onda de excitación y emisión, respectivamente. II.2.2.7. Espectroscopía UV En forma complementaria, la espectroscopía UV también ha sido utilizada como una herramienta simple, que permite examinar con precisión transiciones electrónicas del estado basal al excitado, obteniendo información sobre la naturaleza de las interacciones entre las proteínas y ligandos (Abdollahi y col., 2020). En este caso, las interacciones entre moléculas pueden producir disminuciones en la absorbancia de señales principales y secundarias, el desplazamiento hacia mayores o menores longitudes de onda, así como la aparición de nuevas bandas (Baibarac y col., 2019). El estudio del cambio en los espectros de absorbancia permite la confirmación de cambios estructurales en las proteínas, el cambio en la polaridad del entorno de los residuos aromáticos y por tanto en la hidrofobicidad (Shahraki y col., 2018), e incluso la formación de nuevos enlaces covalentes si los hubiera (Abdollahi y col., 2020). Los espectros de absorbancia de los sistemas mixtos se registraron utilizando un espectrofotómetro Evolution 600 UV-VIS (Thermo Scientific, Waltham, EE. UU.) usando una Capítulo II Materiales y métodos 38 cubeta de cuarzo de 10 mm. Los espectros se obtuvieron en el rango de longitud de onda de 250 a 420 nm con una resolución de 2 nm. Para evitar valores elevados de absorbancia debido a la superposición entre los espectros de las vitaminas y los sistemas mixtos BWPC - Vitamina, el espectro de las soluciones de vitaminas (sin proteína) se restó de los espectros de absorción de los sistemas mixtos a la concentración correspondiente. II.2.2.8. Desnaturalización del BWPC En el marco de esta Tesis, resultó de especial interés evaluar la variación de la intensidad de las interacciones moleculares ante cambios conformacionales de la proteína. Con esta finalidad, el BWPC se sometió a una injuria química. Para ello, las soluciones de BWPC (5 μM) se trataron con urea a concentraciones variables (0 - 8 M). El BWPC desnaturalizado (D-BWPC) se mezcló con las vitaminas en las mismas concentraciones que se usaron con el BWPC nativo. El impacto del desnaturalizante químico en la estructura de la proteína se evaluó mediante espectroscopia de fluorescencia según Zhang y col. (2013). Las muestras se excitaron a (λex) 280 nm y los espectros de fluorescencia se registraron en el rango de 290 a 500 nm (Sección II.2.2.6). II.2.2.9. Docking molecular Diversas herramientas bioinformáticas como el docking o dinámica molecular, han contribuido a la interpretación de los resultados experimentales (Shahraki y col., 2018). Los estudios de docking molecular ilustran el modo en que pequeñas moléculas presentes en el entorno de las proteínas, se unen principalmente a ésta de forma no-covalente (Maity y col., 2016).
Compartir