Anna_Lobell_1_Ke_Hedhammar_4_Ir_corriend

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La falta de evidencia de un papel de Islet autoinmunidad en la etiología de 
la diabetes mellitus canina
Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,Kerstin M. Ahlgren 1., Tove otoño 2 *., Nils Landegren 1, Lars Grimelius 3, Henrik von Euler 4,
Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,Katarina Sundberg 5, Kerstin Lindblad-Toh 6,7, Anna Lobell 1, Ke Hedhammar 4, Ir corriendo Andersson 5,
Helene Hansson-Hamlin 4, Ke Lernmark 8, Olle Kampe 1Helene Hansson-Hamlin 4, Ke Lernmark 8, Olle Kampe 1Helene Hansson-Hamlin 4, Ke Lernmark 8, Olle Kampe 1Helene Hansson-Hamlin 4, Ke Lernmark 8, Olle Kampe 1Helene Hansson-Hamlin 4, Ke Lernmark 8, Olle Kampe 1Helene Hansson-Hamlin 4, Ke Lernmark 8, Olle Kampe 1
1 Departamento de Ciencias Médicas, Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia, 2 Departamento de Ciencias Médicas, Epidemiología Molecular y Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de 1 Departamento de Ciencias Médicas, Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia, 2 Departamento de Ciencias Médicas, Epidemiología Molecular y Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de 1 Departamento de Ciencias Médicas, Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia, 2 Departamento de Ciencias Médicas, Epidemiología Molecular y Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de 1 Departamento de Ciencias Médicas, Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia, 2 Departamento de Ciencias Médicas, Epidemiología Molecular y Ciencias de Laboratorio de la Vida, Universidad de 
Uppsala, Uppsala, Suecia, 3 Departamento de Inmunología, Genética y Patología de la Universidad de Uppsala, Suecia, 4 Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 5 Departamento Uppsala, Uppsala, Suecia, 3 Departamento de Inmunología, Genética y Patología de la Universidad de Uppsala, Suecia, 4 Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 5 Departamento Uppsala, Uppsala, Suecia, 3 Departamento de Inmunología, Genética y Patología de la Universidad de Uppsala, Suecia, 4 Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 5 Departamento Uppsala, Uppsala, Suecia, 3 Departamento de Inmunología, Genética y Patología de la Universidad de Uppsala, Suecia, 4 Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 5 Departamento Uppsala, Uppsala, Suecia, 3 Departamento de Inmunología, Genética y Patología de la Universidad de Uppsala, Suecia, 4 Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 5 Departamento Uppsala, Uppsala, Suecia, 3 Departamento de Inmunología, Genética y Patología de la Universidad de Uppsala, Suecia, 4 Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 5 Departamento Uppsala, Uppsala, Suecia, 3 Departamento de Inmunología, Genética y Patología de la Universidad de Uppsala, Suecia, 4 Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 5 Departamento 
de Genética y Mejora Animal, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 6 Instituto Broad de Harvard y el MIT, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos de América, 7 Ciencia para la vida en el laboratorio del de Genética y Mejora Animal, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 6 Instituto Broad de Harvard y el MIT, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos de América, 7 Ciencia para la vida en el laboratorio del de Genética y Mejora Animal, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 6 Instituto Broad de Harvard y el MIT, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos de América, 7 Ciencia para la vida en el laboratorio del de Genética y Mejora Animal, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 6 Instituto Broad de Harvard y el MIT, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos de América, 7 Ciencia para la vida en el laboratorio del de Genética y Mejora Animal, Universidad Sueca de Ciencias Agrícolas, Uppsala, Suecia, 6 Instituto Broad de Harvard y el MIT, Cambridge, Massachusetts, Estados Unidos de América, 7 Ciencia para la vida en el laboratorio del 
Departamento de Bioquímica y Microbiología Médica, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia, 8 La diabetes y la enfermedad celíaca Unidad, Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad de Lund, Malmö, SueciaDepartamento de Bioquímica y Microbiología Médica, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia, 8 La diabetes y la enfermedad celíaca Unidad, Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad de Lund, Malmö, SueciaDepartamento de Bioquímica y Microbiología Médica, Universidad de Uppsala, Uppsala, Suecia, 8 La diabetes y la enfermedad celíaca Unidad, Departamento de Ciencias Clínicas, Universidad de Lund, Malmö, Suecia
Resumen
Objetivos / Hipótesis: La diabetes mellitus es uno de los trastornos endocrinos más comunes en los perros y se propone comúnmente para ser de origen autoinmune. Objetivos / Hipótesis: La diabetes mellitus es uno de los trastornos endocrinos más comunes en los perros y se propone comúnmente para ser de origen autoinmune. 
Aunque la presentación clínica de la diabetes humana de tipo 1 (T1D) y la diabetes canina son similares, las etiologías pueden ser diferentes. El objetivo de este estudio fue 
investigar si la etiología autoinmune se asemeja a la DM1 humana es tan frecuente en perros como se informó anteriormente.
métodos: Los sueros de 121 perros diabéticos que representan 40 razas diferentes se ensayaron para anticuerpos de células de islotes (ICA) y autoanticuerpos métodos: Los sueros de 121 perros diabéticos que representan 40 razas diferentes se ensayaron para anticuerpos de células de islotes (ICA) y autoanticuerpos 
GAD65 (GADA) y se compara con sueros de 133 perros sanos. ICA se detectó mediante inmunofluorescencia indirecta utilizando tanto canina y secciones congeladas 
humanos. GADA fue detectado por in vitro la transcripción y traducción (ITT) de GAD65 humana y canina, seguido por precipitación inmune. Las secciones de humanos. GADA fue detectado por in vitro la transcripción y traducción (ITT) de GAD65 humana y canina, seguido por precipitación inmune. Las seccionesde humanos. GADA fue detectado por in vitro la transcripción y traducción (ITT) de GAD65 humana y canina, seguido por precipitación inmune. Las secciones de 
páncreas de cinco perros diabéticos y dos perros de control se examinaron histopatológicamente incluyendo la inmunotinción para la insulina, glucagón, somatostatina 
y polipéptido páncreas.
resultados: Ninguno de los sueros caninos analizados dio positivo para ICA en secciones de canino congelado o páncreas ICA humano. Sin embargo, el suero de un resultados: Ninguno de los sueros caninos analizados dio positivo para ICA en secciones de canino congelado o páncreas ICA humano. Sin embargo, el suero de un 
perro diabético fue débilmente positivo en el ensayo GADA canina y suero de un perro sano fue débilmente positivo en el ensayo GADA humano. Histopatología 
mostraron un marcado cambios degenerativos en islotes endocrinos, incluida la vacuolización y la pérdida de la variable de inmuno-tinción para insulina. No se observó 
ningún signo de inflamación.
Conclusiones / interpretaciones: Contrariamente a las observaciones anteriores, con base en los resultados de las pruebas para la auto-reactividad humoral contra las proteínas de Conclusiones / interpretaciones: Contrariamente a las observaciones anteriores, con base en los resultados de las pruebas para la auto-reactividad humoral contra las proteínas de 
los islotes utilizando la captación de radicales y los exámenes histopatológicos, no encontramos ningún apoyo de una etiología autoinmune islote en la diabetes mellitus canina.
Citación: Ahlgren KM, Fall T, Landegren N, Grimelius L, von Euler H, et al. (2014) La falta de evidencia de un papel de Islet autoinmunidad en la etiología de la diabetes canina Mellitus. PLoS ONE 9 (8): e105473. doi: Citación: Ahlgren KM, Fall T, Landegren N, Grimelius L, von Euler H, et al. (2014) La falta de evidencia de un papel de Islet autoinmunidad en la etiología de la diabetes canina Mellitus. PLoS ONE 9 (8): e105473. doi: 
10.1371 / journal.pone.0105473
Editor: Thomas WH Kay, Instituto de San Vicente, AustraliaEditor: Thomas WH Kay, Instituto de San Vicente, Australia
Recibido 08 de abril 2014; Aceptado 21 de julio 2014; Publicado 25 de de agosto de, 2014Recibido 08 de abril 2014; Aceptado 21 de julio 2014; Publicado 25 de de agosto de, 2014Recibido 08 de abril 2014; Aceptado 21 de julio 2014; Publicado 25 de de agosto de, 2014Recibido 08 de abril 2014; Aceptado 21 de julio 2014; Publicado 25 de de agosto de, 2014Recibido 08 de abril 2014; Aceptado 21 de julio 2014; Publicado 25 de de agosto de, 2014Recibido 08 de abril 2014; Aceptado 21 de julio 2014; Publicado 25 de de agosto de, 2014
Derechos de autor: 2014 Ahlgren et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite
uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan.
Disponibilidad de datos: Los autores confirman que todos los datos que se basan las conclusiones son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información de papel y.Disponibilidad de datos: Los autores confirman que todos los datos que se basan las conclusiones son totalmente disponible sin restricciones. Todos los datos relevantes se encuentran dentro del apoyo de sus archivos de información de papel y.
Fondos: Este trabajo fue apoyado por la Comisión Europea (FP7-Lupa, GA-201 370), el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Torsten y Ragnar Söderberg, la Fundación Novo Nordisk y Agria Djurfo¨ rsa¨kringar Fondos: Este trabajo fue apoyado por la Comisión Europea (FP7-Lupa, GA-201 370), el Consejo Sueco de Investigación, la Fundación Torsten y Ragnar Söderberg, la Fundación Novo Nordisk y Agria Djurfo¨ rsa¨kringar 
Fundación de Investigación. KLT es el destinatario del premio EURYI del FSE. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.
Conflicto de intereses: Tove otoño ha recibido honorarios como conferenciante de MSD (Merck). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.Conflicto de intereses: Tove otoño ha recibido honorarios como conferenciante de MSD (Merck). Esto no altera la adhesión de los autores a PLoS ONE políticas sobre los datos y compartir materiales.
* E-mail: tove.fall@medsci.uu.se
. Estos autores contribuyeron igualmente a este trabajo.
Introducción
La diabetes mellitus se produce en perros en Suecia, con una incidencia de 13 casos por cada 
10.000 años en situación de riesgo y una edad media de inicio en 8,6 años [1]. El perro doméstico 
comparte su entorno y estilo de vida con su dueño y tiene una estructura raza que es muy 
adecuado para el análisis genético [2]. Un requisito previo para los estudios genéticos 
comparativos es, sin embargo, una etiología común de la enfermedad.
No hay sistema de clasificación internacionalmente aceptada para la diabetes mellitus 
canina, pero la etiología ha sido ampliamente dividido en resistencia primaria a la insulina o 
diabetes deficiencia de insulina primarios. De acuerdo con esta clasificación, resistencia a 
la insulina canina no está representando una resistencia periférica a la insulina celular 
primaria, pero puede ocurrir como consecuencia de diversos trastornos hormonales. Por 
otra parte, la diabetes deficiencia de insulina canina, afirmó universalmente para parecerse 
a la diabetes autoinmune latente en el adulto, ha sugerido a ser el resultado de la 
autoinmunidad o, en algunos casos,
PLOS ONE | www.plosone.org 1 De agosto de 2014 | Volumen 9 | Número 8 | e105473
http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
http://crossmark.crossref.org/dialog/?doi=10.1371/journal.pone.0105473&domain=pdf
Tabla 1. estado de la raza y la enfermedad de los perros analizados en el estudio.Tabla 1. estado de la raza y la enfermedad de los perros analizados en el estudio.
Raza Diabético Sano La tiroiditis linfocítica La insuficiencia suprarrenal
galgo afgano 1
terrier de Airedale 1
perro australiano del ganado 1
Terrier australiano 6
Basenji 1
Basset Normand artesiano 2
Beagle 17
collie barbudo 1
Border collie 9 2
border terrier 2 1
Borzoi 1
Boxer 6 1
Bullmastiff 1 1
terrier de mojón 3
Cavalier King Charles Spaniel 1
Cocker 1 1
Collie 2
Perro tejonero 9
perro de granja danés / sueco 1
doberman 1
Drever (dachsbracke sueco) 2
Spaniel Inglés Springer 1 3
perro finlandés 2
lapphound finlandesa 1
de Pomerania finlandés 1
Labrador Retriever 2
foxterrier 2
perro pastor alemán 1 5
Schnauzer gigante 1 9 13
golden retriever 8
pastor hollandse (Bouvier) 1
Hovawart 1
setter irlandés 1 1
lobo irlandés 3
Jack Russell Terrier 4
Labrador retriever 5 2
Laika 1
perro Lapp 2
caniche mediano 2
caniche miniatura 2
Raza mixta 9 4
elkhound 7
Tocante del perro perdiguero 3 3
Papillion 1
Petit brabancon 1
Polski owczarek Nizinny 6 2
Caniche 2
waterdog portugués 1
rhodesian 1
rottweiler 5 2
Autoinmunidad y la diabetes en los perros
PLOS ONE | www.plosone.org 2 De agosto de 2014 | Volumen 9 | Número 8 | e105473
El tejido exocrino secundaria a enfermedad pancreática [3,4]. Las diferentes razas podrían 
estar predispuestos a diferente forma de diabetes mellitus como se muestra para los 
elkhounds sueco y noruego, que se desarrollan una forma reversible de diabetes durante el 
embarazo o pseudoembarazo, se asemeja a la diabetes mellitus gestacional humano [5].
Los hallazgos en muestras de biopsias de páncreas de perros diabéticos han sido 
contradictorios. Dos bastante grandes estudios de perros diabéticos [6,7] (n = 33, n = 
30) han mostrado un número reducido o la ausencia total de islotes, junto con la 
degeneración, hialinización o vacuolización. muestras de biopsias de páncreas de 
perros con diabetes mellitus secundaria a trastornos hormonalestambién mostraron 
degeneración y vacuolización de las células beta [8] No infiltración linfocítica se 
observó en cualquiera de estos tres estudios. Por otro lado, Alejandro et al informaron 
de que 6/13 perros diabéticos en su estudio tenían infiltración linfocítica asociada con 
islotes (insulitis) y que 5/18 perros muestran extensa daño pancreático exocrino [9]. 
No hubo grupos de control en cualquiera de estos estudios.
La aparición de autoanticuerpos es una característica central de T1D humano, y 
los anticuerpos de células de islotes (ICA) y autoanticuerpos GAD65 son 
marcadores de diagnóstico valiosos. La presencia de autoanticuerpos en la diabetes 
mellitus canina sigue siendo controvertido, ya que se han reportado tanto en 
presencia como en ausencia de autoanticuerpos [5,9-12]. Insulitis se ha divulgado 
en las muestras de los últimos temas T1D humanos aparición [13]. En este estudio 
se investigó el suero de perros con y sin diabetes utilizando cuatro ensayos 
diferentes, además de examen histopatológico de páncreas de diabéticos y control, 
con el objetivo de investigar si etiología autoinmune asemeja T1D humano es 
frecuente en los perros.
métodos
Perros
Las muestras de suero se obtuvieron a partir diabética propiedad privada ( n = 121) Las muestras de suero se obtuvieron a partir diabética propiedad privada ( n = 121) Las muestras de suero se obtuvieron a partir diabética propiedad privada ( n = 121) 
y el control sano ( n = 133) perros de 64 razas en total (hembra 60%) [14] (Tabla 1). y el control sano ( n = 133) perros de 64 razas en total (hembra 60%) [14] (Tabla 1). y el control sano ( n = 133) perros de 64 razas en total (hembra 60%) [14] (Tabla 1). 
Además, los sueros de los perros diagnosticados con insuficiencia adrenocortical ( n = 5) Además, los sueros de los perros diagnosticados con insuficiencia adrenocortical ( n = 5) Además, los sueros de los perros diagnosticados con insuficiencia adrenocortical ( n = 5) 
y la tiroiditis linfocítica ( n = 13) fueron incluidos. El diagnóstico de la diabetes mellitus y la tiroiditis linfocítica ( n = 13) fueron incluidos. El diagnóstico de la diabetes mellitus y la tiroiditis linfocítica ( n = 13) fueron incluidos. El diagnóstico de la diabetes mellitus 
en los casos se basa en el cuadro clínico y la hiperglucemia en ayunas crónica. La 
edad media al diagnóstico de la diabetes fue de 8,2
años (DE 1,9). Las muestras para análisis de autoanticuerpos fueron tomadas a una mediana de 
88 días después del diagnóstico de DM (IQR 11-448 días).
En un subgrupo ( n = 51) de los perros, una prueba de estimulación con glucagón conEn un subgrupo ( n = 51) de los perros, una prueba de estimulación con glucagón conEn un subgrupo ( n = 51) de los perros, una prueba de estimulación con glucagón con
mediciones de C-péptido se realizaron [14], que resultó negativa para la gran mayoría de los 
perros que indican una insulina deficiencia de tipo de diabetes mellitus. Páncreas estaban 
disponibles a partir de cinco perros de diferentes razas con diagnóstico de diabetes (4 
mujeres y 1 hombre). Los perros fueron sacrificados en el momento del diagnóstico. Los 
especímenes de dos perros normoglycemic sacrificados por otras razones que la diabetes 
sirvieron como controles. El estudio fue aprobado por el comité de ética animal de Uppsala 
(C 267/5) y todos los dueños de perros dieron su consentimiento informado por escrito.
Patología
Las muestras de tejido se fijaron en 10% formalina tamponada neutral a temperatura 
ambiente, seguido de procesamiento de rutina a la cera de parafina. Aproximadamente 4- metroambiente, seguido de procesamiento de rutina a la cera de parafina. Aproximadamente 4- metro
m de espesor secciones fueron cortadas y unidas a cargado positivamente portaobjetos de 
vidrio (IHC microscópico Diapositivas, Flex (Dako, Glostrup, Dinamarca) .Las secciones se 
trataron de microondas durante 2 6 5 min a 700 W usando Tris 50 mM solución salina trataron de microondas durante 2 6 5 min a 700 W usando Tris 50 mM solución salina trataron de microondas durante 2 6 5 min a 700 W usando Tris 50 mM solución salina 
tamponada, tal como solución de recuperación y se inmunotiñeron utilizando un sistema de 
detección de polímero, Dako Cytomation, EnVision + System-HRP; K4010 para los 
anticuerpos primarios y K4006 para anticuerpos primarios de ratón. El tiempo de incubación 
fue de 30 min a temperatura ambiente. Diaminobencidina se utilizó como cromógeno. Los 
anticuerpos se diluyeron en diluyente de anticuerpo de Dako. Se utilizaron los siguientes 
anticuerpos: Insulina (monoclonal de ratón, diluido 1: 2000, K36AC10, Sigma-Aldrich), 
glucagón
(Monoclonal de ratón, 1: 10.000,
K79bB10, Abcam), somatostatina (policlonal de conejo, 1: 4000, A0566, Dako), 
polipéptido páncreas (policlonal de conejo, 1: 10.000, A0619, Dako). hematoxilina de 
Meyer de Histolab (Gotemburgo, Suecia) se utiliza para la contratinción nuclear. Los 
controles negativos, excluyendo el anticuerpo primario, se utilizaron.
Immunostainings para la presencia de anticuerpos anti-islotes en sueros
Páncreas fueron disecados a partir de perros sacrificados por razones distintas de endocrinos y 
trastornos pancreáticos y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Seis metro m de espesor trastornos pancreáticos y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Seis metro m de espesor trastornos pancreáticos y se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido. Seis metro m de espesor 
secciones de criostato se colocaron en portaobjetos de vidrio (Superfrost plus, Thermo Scientific, 
Braunschweig, ger-
Tabla 1. Cont.Tabla 1. Cont.
Raza Diabético Sano La tiroiditis linfocítica La insuficiencia suprarrenal
Saluki 1
samoyedo 2
Setter Inglés 1 1
Schipperke 2 1
Staffordshire Bull Terrier 1
caniche 1
elkhound sueco 26 22
de Pomerania sueca (Stgo taspets VA) 1
elkhound sueco / noruego 1
Tervueren 3
terrier tibetano 2
Vorsteh 2
West Highland White Terrier 7 2
Suma 121 133 13 5
doi: 10.1371 / journal.pone.0105473.t001
Autoinmunidad y la diabetes en los perros
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muchos), que contiene secó con aire y se bloquearon para la unión durante 30 min a 
temperatura ambiente utilizando un 10% de suero de cabra normal (Dako, Glostrup, 
Dinamarca) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) pH 7,4 inespecífica, 14% de 
aprotinina (Trasylol, Bayer, Alemania ). Los immunostainings se llevaron a cabo durante la 
noche a 4 u C, usando 100 metro l de suero / vidrio de cada perro diabético y control -diluted noche a 4 u C, usando 100 metro l de suero / vidrio de cada perro diabético y control -diluted noche a 4 u C, usando 100 metro l de suero / vidrio de cada perro diabético y control -diluted noche a 4 u C, usando 100 metro l de suero / vidrio de cada perro diabético y control -diluted noche a 4 u C, usando 100 metro l de suero / vidrio de cada perro diabético y control -diluted 
individualmente en el rango de 1:16 1:64. Se utilizaron tres controles positivos, incluyendo el 
suero de un paciente la diabetes humana, los sueros de un paciente con síndrome de 
persona rígida y un anticuerpo de GAD de ratón monoclonal (BD Biosciences, San Jose, CA, 
EE.UU.) diluido a 1: 200. Los portaobjetos se enjuagaron tres veces en PBS y se incubaron 
con 100 metro l de cualquiera secundaria pre-adsorbido, cabra cabra conjugado con FITC con 100 metro l de cualquiera secundaria pre-adsorbido, cabra cabra conjugado con FITC con 100 metro l de cualquiera secundaria pre-adsorbido, cabra cabra conjugado con FITC 
perro anti IgG (Santa Cruz Biotechnology, CA, EE.UU.), FITC conjugado anti humano de 
cabra IgG (H + L) o Cy3 conjugado IgG anti humana y
Cy3 conjugado de cabra anti-ratón IgG (los tres de Jackson Immuno Research, West 
Grove, PA, EE.UU.) en 1: 200 diluciones. Después de una h de incubación a 
temperatura ambiente, los portaobjetos se enjuagaron cinco veces en PBS yse 
montaron con Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EE.UU.) con o sin 
tinción nuclear 4 9, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Todas las incubaciones se tinción nuclear 4 9, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Todas las incubaciones se tinción nuclear 4 9, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Todas las incubaciones se 
realizaron en una cámara húmeda cubierta. La presencia de tinción Ab se evaluó en 
un microscopio de fluorescencia Nikon Microphot-FXA. Para la documentación 
también se tomaron imágenes usando un microscopio confocal Zeiss LSM 501. El 
ensayo ICA humano se llevó a cabo por un laboratorio acreditado en el Hospital 
Malmö Academic acuerdo con procedimientos estándar.
Figura 1. muestras pancreáticas teñidas con hematoxilina-eosina (A, C, E) y se inmunotiñeron para la insulina (B, D, F). Las muestras se muestran en A y B vienen de un no diabético masculino Elkhound Figura 1. muestras pancreáticas teñidas con hematoxilina-eosina (A, C, E) y se inmunotiñeron para la insulina (B, D, F). Las muestras se muestran en A y B vienen de un no diabético masculino Elkhound 
Sueco, C y D proceden de un varón diabético perro polaco Owczarek Nizinny y E y F de una mujer diabética de Setter Inglés. El islote en la figura D contiene pocas células de insulina inmunorreactiva, 
excepto las células vacuoladas, mientras que estas células de apariencia normal de insulina manchados son numerosas en la figura F. doi: 10.1371 / journal.pone.0105473.g001
Autoinmunidad y la diabetes en los perros
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In-vitro transcripción y traducción con canina y GAD65 humana In-vitro transcripción y traducción con canina y GAD65 humana 
seguido por inmunoprecipitaciones
In-vitro la transcripción y traducción (ITT) de GAD65 canino se realizó utilizando el In-vitro la transcripción y traducción (ITT) de GAD65 canino se realizó utilizando el 
TNT-SP6 rápida acoplada sistema de transcripción / traducción (Promega, Madison, WI, 
EE.UU.) con la adición de 0,5 mCi de [ 35 S] metionina (10 metro Ci / metro l, Perkin Elmer, EE.UU.) con la adición de 0,5 mCi de [ 35 S] metionina (10 metro Ci / metro l, Perkin Elmer, EE.UU.) con la adición de 0,5 mCi de [ 35 S] metionina (10 metro Ci / metro l, Perkin Elmer, EE.UU.) con la adición de 0,5 mCi de [ 35 S] metionina (10 metro Ci / metro l, Perkin Elmer, EE.UU.) con la adición de 0,5 mCi de [ 35 S] metionina (10 metro Ci / metro l, Perkin Elmer, EE.UU.) con la adición de 0,5 mCi de [ 35 S] metionina (10 metro Ci / metro l, Perkin Elmer, EE.UU.) con la adición de 0,5 mCi de [ 35 S] metionina (10 metro Ci / metro l, Perkin Elmer, 
Waltham, MA, EE.UU.) como se describe anteriormente [5]. Aproximadamente 20 000 
cpm de la [ 35 S] -radio productos de ITT marcadas se utilizaron para la cpm de la [ 35 S] -radio productos de ITT marcadas se utilizaron para la cpm de la [ 35 S] -radio productos de ITT marcadas se utilizaron para la 
inmunoprecipitación con 2,5 metro l de suero. Las inmunoprecipitaciones de la proteína inmunoprecipitación con 2,5 metro l de suero. Las inmunoprecipitaciones de la proteína inmunoprecipitación con 2,5 metro l de suero. Las inmunoprecipitaciones de la proteína 
marcada con sueros caninos se realizaron utilizando proteína A Sepharose (GE 
Healthcare Biosciences, Uppsala, Suecia) seguida por la medición de la radiactividad. 
Dos GADApositive sueros humanos se utilizaron como controles positivos. Además, un 
clon que codifica la proteína humana GAD65 se utilizó como anteriormente. Un suero 
GADA-positivo humana y BSA se utilizaron como controles positivos y negativos. La 
reactividad del anticuerpo se calculó como índices relativos a un (suero humano) 
positivo y el control negativo (4% de BSA) de acuerdo con la siguiente ecuación: índice 
de inmunorreactividad = ((cpm sujeto x-cpm estándar negativo) / (estándar positivo cpm 
cpm negativo estándar) * 100). Los sueros con un índice superior a la 
inmunorreactividad del valor medio para los perros sanos ( n = 133), además de 4 inmunorreactividad del valor medio para los perros sanos ( n = 133), además de 4 inmunorreactividad del valor medio para los perros sanos ( n = 133), además de 4 
desviaciones estándar fueron considerados como positivos.
resultados
Patología
La frecuencia y distribución de los islotes variaron en los animales diabéticos, así como en los 
no diabéticos. En general, los tamaños de los islotes en los dos grupos eran más pequeñas en 
comparación con la observada en humanos
páncreas. No hay reacción inflamatoria se observó en cualquiera de los páncreas de 
animales. No hubo signos de degeneración o atrofia en el parénquima exocrino. Los 
islotes en los dos grupos de animales contenían los cuatro tipos endocrinos celular, pero 
una gran fracción de la insulinstaining (beta) las células en el grupo diabético se 
ampliaron, vacuoladas sin o con sólo trazas de insulina-inmunoreactividad (Fig 1A-F). 
insulina de las células teñidas que aparecen normales de no vacuolado estaban presentes 
en todo el páncreas de diabéticos con una frecuencia que varía de raro frecuente. Las 
imágenes de los siete perros con HE, insulina y glucagón tinción está disponible en el 
material complementario (Fig. S1).
Immunostainings para la presencia de anticuerpos anti-islotes en sueros
El uso de anticuerpos monoclonales de ratón dirigidos a la rata GAD65, seguidos de 
anticuerpos secundarios conjugados con fluorocromo dirigidos a IgG de ratón, los islotes 
de Langerhans se visualizaron en el páncreas de un perro sano (Fig. 2a). El uso de sueros 
de un paciente humano T1D GADApositive (Fig. 2b) o un paciente con síndrome de 
persona rígida (Fig. 2c) también pudimos para teñir los islotes de Langerhans en el perro y 
páncreas humano. Los sueros de perros con diabetes mellitus y perros de control fueron 
en todos los casos incapaces de unirse específicamente (Fig. 2d). El nivel de unión 
inespecífica fue similar en las muestras de los perros diabéticos y los perros control sanos. 
Además, el ensayo certificado ICA humana fue negativa en todas las muestras.
inmunoprecipitaciones GAD65
Un fuerte título de autoanticuerpos GAD65 se encontró en el suero T1D humano 
utilizado como control, independientemente de si canino o
Figura 2. páncreas canino tiñeron por inmunofluorescencia. A) se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de ratón Ab a GAD65 humana, B) teñidas utilizando un suero positivo GADA humana y C) Figura 2. páncreas canino tiñeron por inmunofluorescencia. A) se tiñeron con un anticuerpo monoclonal de ratón Ab a GAD65 humana, B) teñidas utilizando un suero positivo GADA humana y C) 
teñidas utilizando un suero GADA positivas de un paciente con síndrome rígido persona y D) de suero canino de un perro con diabetes. tinción nuclear en azul (DAPI). El verde es secundario anti Ig de 
rata-FITC y anti-canino Ig-FITC usada en A) y D). El rojo es anti-Ig humana -Cy5 utilizado en B) y D).
doi: 10.1371 / journal.pone.0105473.g002
Autoinmunidad y la diabetes en los perros
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productos GAD65 ITT humanos fueron utilizados para las inmunoprecipitaciones. 
Una diabética Schnauzer gigante (0,8%) muestra la reactividad débil contra canino 
GAD65 (Fig. 2a) y un control Elkhound noruego (0,8%) era positivo contra GAD65 
humana (Fig. 2b). Ninguno de los perros con tiroiditis linfocítica o insuficiencia 
adrenal eran GADA-positivas (Fig. 2a y 2b). Los resultados se resumen en la Fig. 3. 
Las pruebas de laboratorio del perro diabético GADApositive indicaron una 
deficiencia de la hormona tiroidea, pero el nivel de TSH fue normal (17 mUI / l). No 
hay más investigaciones de este perro se realizaron como se practicó la eutanasia a 
petición del propietario.
Discusión
Previamente se ha sugerido que la mayoría de la diabetes mellitus canina se debe a la 
diabetes tipo 1 o diabetes autoinmune latente autoinmune del adulto. Nosprimero utilizó el 
ensayo de ICA, que visualiza la reactividad de los islotes, independientemente de la diana 
molecular de autoanticuerpos para evaluar esta hipótesis. Los resultados de casi todos los 
ensayos fueron negativos, lo que está en línea con un estudio previo, que informó de que en 
18 examinó perros con diabetes mellitus espontánea, no autoinmunidad humoral islote 
dirigida estaba presente [9]. Nuestros resultados también fueron apoyados por los exámenes 
histopatológicos en los páncreas
obtenido en el diagnóstico de la enfermedad y antes del inicio del tratamiento con insulina, 
donde no se observaron células inmunes en conjunto a los islotes. La vacuolización de 
algunas células beta en combinación con débil o ausente insulina inmune-tinción puede 
sugerir que el estrés en el retículo endoplasmático, denominado ER-estrés, debido a una 
gran demanda de insulina y la proteína consecutivo mal plegamiento [15]. Había una gran 
variedad en la frecuencia de células de apariencia normal insulinstaining, a pesar de que el 
tiempo desde el inicio de los síntomas hasta la eutanasia fue similar entre los perros. Los 
autores especulan que el grado de resistencia a la insulina en un perro va a determinar en 
qué pérdida de la masa de células beta el perro va a entrar en una fase diabética. Los perros 
son principalmente carnívoros, y tienen menos y más pequeños islotes que los humanos. A 
pesar de que se ha producido una cierta adaptación de las vías de degradación de 
carbohidratos desde la divergencia del lobo [16], se puede especular que una dieta rica en 
carbohidratos puede inducir una respuesta ER-estrés si la demanda de insulina reemplaza a 
la capacidad de producción y que el mal plegamiento de proteínas es parte del mecanismo 
patológico en el desarrollo de diabetes mellitus canina.
Una variedad de autoantígenos de la diabetes se ha descrito en los seres 
humanos, sin embargo GAD65 es el autoantígeno más frecuente y específico en 
T1D humano. Por lo tanto se empleó un análisis de GAD65 ITT seguido de 
inmunoprecipitación para investigar
Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia Figura 3. La inmunorreactividad a A) Canine GAD65 y B) GAD65 humana. Dm de la diabetes mellitus, n = 121, Ctrl = control sano, n = 133, LT = linfocítica tiroiditis, n = 13 y AI = insuficiencia 
suprarrenal n = 5, corte índice para positivo vs. negativo a GADA indicado por la línea de puntos. doi: 10.1371 / journal.pone.0105473.g003suprarrenal n = 5, corte índice para positivo vs. negativo a GADA indicado por la línea de puntos. doi: 10.1371 / journal.pone.0105473.g003suprarrenal n = 5, corte índice para positivo vs. negativo a GADA indicado por la línea de puntos. doi: 10.1371 / journal.pone.0105473.g003
Autoinmunidad y la diabetes en los perros
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si también los perros diabéticos producen dichos autoanticuerpos. Debido a la falta de suero 
de control positivo canino una muestra humana fue probado y demostró ser útil. Como medida 
de precaución que probamos tanto un nuevo ensayo GADA canino, así como un ensayo 
GADA establecido humano. Nuestros resultados están en oposición a un estudio previo donde 
4 de 30 perros fueron GADA-positivos y 3 de 30 perros IA-2A positivo [11]. Los perros 
GADA-positivos eran mestizos y perros de aguas de saltador, una raza también se incluye en 
el presente estudio. Además, más tarde, el mismo grupo también informó de la presencia de 
anticuerpos para la proinsulina en perros diabéticos y de control utilizando una técnica de 
transferencia de Western. Las implicaciones de autoanticuerpos proinsulina son, sin embargo, 
no está claro ya que tres de cada 15 (20%) de los perros de control incluidos en este estudio 
fueron positivos en comparación con 8/15 (53%) de 6/15 perros tratados con insulina recién 
diagnosticada y ( 40%) [10]. La población de perros sueco es un tanto diferentes de los de 
otros países occidentales, donde las perras son esterilizados temprano en la vida. La alta 
proporción de hembras intactas en Suecia se asocia con una predisposición hembra a la 
diabetes mellitus [1], que se muestra que es causada por la diabetes mellitus relacionados con 
la progesterona [5]. Por lo tanto, el material de estudio no es totalmente comparable a la de la 
estudio del Reino Unido [11], lo que podría explicar algunas de las diferencias en los 
resultados, aunque razas fueron superposición.
modelos de roedores como el ratón NOD han demostrado que el autoantígeno primario 
puede variar entre las especies [17] .En el presente estudio, se utilizó la ICA para la 
detección de otros autoanticuerpos contra páncreas canino de GAD-65, pero todos los 
hallazgos fueron negativos. No podemos descartar la autoinmunidad mediada por células, a 
pesar de que el aspecto histológico está a favor de otras etiologías. Los estudios futuros 
deberían investigar preferentemente posibles respuestas de células T a autoantígenos de 
los islotes de células.
La evaluación de la variación genética en el complejo mayor de histocompatibilidad podría haber sido 
valioso para probar similitudes con el riesgo humano HLA-DQ2 como se ha hecho para los perros en 
[18], pero estos enfoques de genes candidatos en los perros se encuentran en alto riesgo de resultados 
falsos positivos a menos
sesgo de estratificación de la población se descarta. Los estudios futuros deberían investigar 
preferentemente posibles respuestas de células T a autoantígenos de los islotes de células. Otro 
aspecto importante de la investigación etiología de la diabetes en los perros es que los perros parecen 
sensibles a la toxicidad de la glucosa, hiperglucemia y los perros no tratados inmediatamente después 
del diagnóstico están en riesgo grave de la diabetes permanente, independientemente de la causa de 
la hiperglucemia [5,19].
En conclusión, en esta cohorte sueca de 121 perros diabéticos que representan 40 razas 
diferentes, no encontramos ninguna sueros caninos ICA-positivas, sin insulitis y no hubo 
diferencias entre los casos y controles en el ensayo GADA.
información de soporte
Figura S1 pancreático especímenes teñidas con hematoxilina-eosina (columna 
izquierda) y se inmunotiñeron para la insulina (columna del medio) o de glucagón 
(derecha). AO imágenes muestran los perros diabéticos y PU perros control sanos. (derecha). AO imágenes muestran los perros diabéticos y PU perros control sanos. 
(TIF)
Expresiones de gratitud
Los autores agradecen a los propietarios de perros para la participación en este estudio. Agradecemos al 
Dr. Anna-Stina Høglund de experiencia profesional en la microscopía confocal.Agradecemos también a sa 
Hallgren y Ulrika M Gustavsson por su excelente asistencia técnica y Sara Westberg para la colección de 
sueros de perro.
Contribuciones de autor
Concebido y diseñado los experimentos: KMA TF LG HVE A. Lobell A H GA HHH a. Lernmark 
KLT OK. Realizado los experimentos: KMA NL TF LG Hve KS HHH a. Lernmark. Analizados los 
datos: KMA TF LG OK. Contribuido reactivos / materiales / herramientas de análisis: LG OK NL. 
Contribuido a la redacción del manuscrito: KMA TF NL LG Hve KS KLT
A. Lobell A H GA HHH a. Lernmark OK.
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