Presentación 5 molecular

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Genética y Biotecnología
Marcador molecular 
Definición
Los marcadores moleculares están situados en lugares
específicos del genoma. Se usan para “marcar” la posición de un
gen en concreto o la herencia de una característica particular. En
un cruzamiento genético, las características de interés seguirán
generalmente unidas a los marcadores moleculares. Por lo tanto,
se pueden seleccionar individuos en los que el marcador
molecular esté presente, ya que el marcador indica la presencia
de la característica deseada
Segregación de marcadores moleculares en retrocruzamientos, con 
recombinación en la región II
A
C
B
A
C
B
Prolificidad
a
c
b
a
c
b
Prolificidad
A
C
B
a
c
b
b
c
b
a
c
b
Región I
Región II
Retrocruzamiento
a
c
B
a
c
b
A
C
b
a
c
b
b
c
b
a
c
b
A
C
B
a
c
b
Introducción al análisis de marcadores moleculares
Técnicas de análisis de DNA
Polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción
(RFLP)
Microsatélites (SSR)
Polimorfismo de longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP)
Etapas
digestión del ADN con enzimas de restricción
separación por electroforesis de los fragmentos resultantes de
la digestión
transferencia de los fragmentos separados a membranas de
nitrocelulosa (Southern Blotting) e hibridación con sondas
moleculares radiactivas y exposición de la membrana a un filme
de rayos X
Se muestra la dotación genética (azul) de un individuo homocigoto (A)
y uno heterocigoto (B) para un marcador; tras hibridarse con una
sonda específica (rosa) se observa el resultado del Southern a la
derecha
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a5/RFLP_mapping.svg
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/a/a5/RFLP_mapping.svg
Representación de DNA de hebra simple en locus específico
L1 L2 L3 L4 L5 L6
L1
L2
L3
L4
L5
L6
Sonda (segmento de
DNA clonado marcado)Secuencia de DNA
homóloga a la sonda
Sitio de restricción
Mutación generando sitio de restricción en
la secuencia homóloga
Mutación generando sitio de restricción
fuera de la secuencia homóloga
Inserción de secuencia de DNA entre los
sitios de restricción
Mutación/deleción de sitio de restricción
que flanquea secuencia homóloga
Deleción de secuencia de DNA entre los
sitio de restricción
Detección autoradiográ-
fica de diferencias entre
los segmentos de DNA
de las linajes después
de la hibridización
Ventajas
no estar influenciados por el ambiente
no depender del estado ontogénico del animal
permitir un análisis de todo el genoma
puede ser detectados en estadios muy tempranos del
desarrollo independientemente de la expresión del gen, una vez
heredados
poseen la característica de ser codominantes en la expresión
fenotípica, es decir, permiten discernir entre el individuo
homocigótico dominante y el heterocigótico
Desventajas
son muy costosos
necesitan de un personal calificado y entrenado para trabajarlo
precisa el uso de radioactividad y además,
consumen mucho tiempo
Microsatélites
Características
Se los conoce como secuencias simples repetidas (SSR) consiste de
pequeñas secuencias de 1 a 4 nucleótidos de longitud repetidas en
tándem
En el genoma de eucariota estas secuencias simples son mas
frecuentes, distribuidas al azar y forma locus genéticos muy polimórficas,
estos locus amplificados vía PCR fueron también denominados sitios de
microsatélites marcados por secuencia (STMS), además se los conoce
como polimorfismo de secuencia simple repetidas (SSRP)
Las repeticiones mas frecuentes en mamíferos son extensiones de di-
nucleótidos CA y TG
Locus SSR parecen ser somáticamente estables, poseen expresión
codominante o sea, ambos alelos de un individuo heterocigoto son
visualizados y son altamente multialélicos, en una población donde
potencialmente todos los alelos de aquel locus puede ser detectado y
discriminado
Microsatélites
Etapas
amplificación a través de PCR utilizándose un par de primers
específicos complementares a secuencias únicas que flanquea el
microsatélite
la detección de las secuencias SSR vía PCR es hecha en gel
de electroforesis utilizándose poliacrilamida o agarosa de alta
resolución, una vez que es necesario un gel adecuado para la
separación de segmentos que difieren en pocos pares de bases
la visualización de las bandas en el gel puede ser hecha
directamente por coloración con bromuro de etidio, nitrato de
plata o a través de autoradiografía o se utiliza primers marcados
con radioisótopos en la reacción de PCR
CACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
5’
5’
ALELO (CA)10
Cromosoma 12
CACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
5’
5’
ALELO (CA)10
Cromosoma 12
CACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
5’
5’
ALELO (CA)10
Cromosoma 12
CACACACACACACACACACACACACA
GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT
5’
5’
ALELO (CA)13
Cromosoma 12
A B C
INDIVIDUO HOMOCIGOTO 
(CA)10/(CA)10
INDIVIDUO HETEROCIGOTO 
(CA)10/(CA)13
ELECTROFORESIS
CA10/CA10 CA10/CA13 CA13/CA13
Ventajas
teniendo en cuenta la expresión codominante y el
multialelismo, los marcadores SSR son los que poseen el más
elevado contenido de información de polimorfismo
los SSR son muy frecuentes y distribuidos al azar, permitiendo
la mas completa cobertura de cualquier genoma eucariótico
los segmentos polimórficos generados son pequeños o
suficientes para ser detectados utilizándose la reacción de PCR
Desventajas
la gran cantidad de trabajo necesario para el desenvolvimiento
previo a los marcadores
necesitan de un personal calificado y entrenado para trabajarlo
equipamiento sofisticado y elevado costo
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa, habitualmente conocida
como PCR por sus siglas en inglés, es una técnica de biología
molecular, cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de
un fragmento de ADN dado, partiendo de una escasa cantidad de
aquél
Para ello, se emplea:
una ADN polimerasa termoestable
una mezcla de los cuatro desoxinucleótidos
un tampón
dos oligonucleótidos (denominados cebadores)
un termociclador, que genera exponencialmente nuevos
fragmentos de ADN semejantes al original y acotados por los dos
cebadores
Termociclador para reacciones de PCR 
PASOS DE LA PCR
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los
cuales incluye tres fases o pasos:
Desnaturalización
Para que comience la reacción es necesario que el ADN molde se
encuentre en forma de cadena sencilla esto se consigue aplicando
temperaturas de 90 a 95°C que produce la ruptura de los puentes de
hidrógeno intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas
cadenas. Para conseguir la completa separación de las hebras de
toda la muestra esta temperatura debe mantenerse unos minutos
Hibridación
Esta fase se denomina también fase de emparejamiento. Una vez
que el ADN esta desnaturalizado se disminuye la temperatura
hasta un rango comprendido entre los 40 a 60°C para que se
pueda producir la unión de los primers a las secuencias
flanqueantes del fragmento que se va a amplificar. La
temperatura optima de hibridación (Tm) depende de varios
factores y es relativamente especifica para cada primers
Extension
Durante este paso la taq polimerasa incorpora nucleótidos en el
extremo 3’ del primers utilizando como molde la cadena de ADN
previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a
cabo este paso suele ser 72 +/- 5°C ya que es a este rango de
temperatura en que la taq polimerasa alcanza su máxima
actividad
Tecnología del ADN recombinante
La tecnología del ADN recombinante, piedra angular de la
ingeniería genética, permite obtener grandes cantidades de un
fragmento de ADN de interés, el cual se dice que ha sido clonado.
Para ello, debe introducirse dicho fragmento en otro elemento de
ADN, generalmente un plásmido, que posee en su secuencia los
elementos necesarios para que la maquinaria celular de un
hospedador, la Escherichiacoli, lo replique. De este modo, una
vez transformada la cepa bacteriana, nuestro fragmento de ADN
clonado se reproduce cada vez que aquélla se divide.
Para clonar la secuencia de ADN de interés, se emplean enzimas
como herramientas de corte y empalme del fragmento y del
vector, el plásmido. Dichas enzimas corresponden a dos grupos:
primero, unas enzimas de restricción, que poseen la capacidad de
detectar secuencias específicas y de cortar de forma dirigida en
ellas; y después, una ADN ligasa, que permite el enlace covalente
entre extremos de ADN compatibles
Vectores de transferencia: Plásmidos
Enzimas de restricción
Tecnología del ADN recombinante
http://biotec.amgen.es/html/pak_biotec62a9.muestradoc?p_plantilla=dna6_gran.tpt&p_idmenu=38&p_titulo=Biotecnolog%EDa
http://biotec.amgen.es/html/pak_biotec62a9.muestradoc?p_plantilla=dna6_gran.tpt&p_idmenu=38&p_titulo=Biotecnolog%EDa
Clonación 
Aplicaciones
Ingeniería genética
La investigación sobre el ADN tiene un impacto significativo,
especialmente en el ámbito de la medicina, pero también en
agricultura y ganadería (donde los objetivos son los mismos que
con las técnicas tradicionales que el hombre lleva utilizando desde
hace milenios - la domesticación, la selección y los cruces dirigidos
- para obtener razas de animales y plantas más productivos). A
través de la tecnología del ADN recombinante, se desea introducir
genes de interés en organismos, con el objetivo de expresar una
proteína recombinante concreta, puede ser por ejemplo:
transformar microorganismos para convertirlos en auténticas
fábricas que producen grandes cantidades de sustancias útiles,
como insulina o vacunas, que posteriormente se aíslan y se utilizan
en terapia.
Ingeniería genética
reemplazar la expresión de un gen endógeno dañado que ha dado
lugar a una patología, lo que permitiría el restablecimiento de la
actividad de la proteína perdida y eventualmente la recuperación del
estado fisiológico normal, no patológico (terapia génica)
enriquecer un alimento: por ejemplo, la composición de la leche
(que es una importante fuente de proteínas para el consumo
humano y animal) puede modificarse, añadiendo genes exógenos e
inactivando genes endógenos para mejorar su valor nutricional,
reducir infecciones en las glándulas mamarias, proporcionar a los
consumidores proteínas antipatógenas y preparar proteínas
recombinantes para su uso farmacéutico
Medicina forense
Los médicos forenses pueden utilizar el ADN presente en la
sangre, el semen, la piel, la saliva o el pelo en la escena de un
crimen para identificar al responsable. Esta técnica se denomina
huella genética, o también ‘’perfil de ADN’’. Al realizar la huella
genética, se compara la longitud de secciones altamente
variables de ADN repetitivo, como los microsatélites, entre
personas diferentes. La huella genética también puede utilizarse
para identificar víctimas de accidentes en masa, o para realizar
pruebas de consanguinidad.
Historia y antropología
El ADN almacena mutaciones con el tiempo, que se heredan, y
por tanto contiene información histórica, de manera que
comparando secuencias de ADN, se puede inferir la historia
evolutiva de los organismos, su filogenia. El campo de la filogenia
es una herramienta potente en la biología evolutiva. Si se
comparan las secuencias de ADN dentro de una especie, los
genetistas de poblaciones pueden conocer la historia de
poblaciones particulares. Esto se puede utilizar en una amplia
variedad de estudios, desde ecología hasta antropología; por
ejemplo, evidencias basadas en el análisis de ADN se está
utilizando para identificar las Diez Tribus Perdidas de Israel. Por
otro lado, el ADN también se utiliza para estudiar relaciones
familiares recientes.