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Desarrollo de OGMs: Biotecnología moderna y nuevas aplicaciones Dra. Laura Esther Tovar Castillo. Directora Técnica de Información y Fomento a la Investigación. Secretaría Ejecutiva – CIBIOGEM. CONACYT Organismo Genéticamente Modificado: Cualquier organismo vivo que ha adquirido una combinación genética novedosa, generada a través del uso específico de técnicas de la biotecnología moderna. Cultivos GM (LBOGMs Artículo 3, fracción XXI) Según el Convenio sobre Diversidad Biológica: Biotecnología puede definirse como "toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos". Industria Alimentaria Medicina y Farmacéutica Aplicaciones Diagnósticas Biotecnología Ambiental Tratamiento de aguas y biorremediación BiocombustiblesBiofertilizantes Agrobiotecnología Mejora de cultivos y selección de nuevas variedades. Ingeniería Genética Aprovechando el conocimiento en Biología Molecular. BIOTECNOLOGÍA (CBD, 1992) 19801960 1970 1990 2000 20101950 1961 Mejoramiento genético Norman Borlaug [Premio Nobel 1970] 1953 Estructura del ADN Watson-Crick Wilkinson-Franklin 1976-77 Secuencia ADN Sanger/Maxam-Gilbert 1982 Vacunas Recombinantes 1978 Interacción Agrobacterium-Planta Schell-Van Montagu 2002 Salmón de rápido crecimiento 1980 Ratones GM 1985 Cerdos GM 1988 Maíz resistente a plagas 1994 Jitomate FlavrSavr Aprobado por FDA 1999 Arroz vitaminado 1996 Algodón y Soya (Aprobación USDA y FDA) 1995 Papa contra plagas (Aprobación EPA) 2003 GlowFish 1985-86 Tabaco GM Primer vegetal transgénico Desarrollo de la Biotecnología Moderna 1972 ADN Recombinante Boyer-Cohen BIOTECNOLOGÍA MODERNA (Protocolo Cartagena, 2000; LBOGMs 3, VI) Por “biotecnología moderna” se entiende la aplicación de: a.Técnicas in vitro de ácido nucléico, incluidos el ácido desoxirribonucleico (ADN) recombinante y la inyección directa de ácido nucléico en células u orgánulos, o b.La fusión de células más allá de la familia taxonómica, que superan las barreras fisiológicas naturales de reproducción o de la recombinación y que no son técnicas utilizadas en la reproducción y la selección tradicional. Ciencias Genómicas e Información Biológica Respeto y Sustentabilidad del Medio Ambiente y la Biodiversidad Innovación Tecnológica Acceso y potenciamiento de la biodiversidad nacional Biotecnología Agroecológica en el campo mexicano Adaptación. Academia Mexicana de Ciencias (2010) http://www.amc.unam.mx/biotecnologia/comite/tendencias.htm Provisión de Alimentos Productos y/o materias primas para la industria Desarrollo de nueva industria soportada en tecnología biológica más limpia Nuevos Bioprocesos y otras aplicaciones con potencial tecnológico Metagenómica, Caracterización, Biocatálisis e Ingeniería Celular Clasificación Comparación Diagnóstico Certificación http://www.amc.unam.mx/biotecnologia/comite/tendencias.htm • El hombre ha seleccionado y modificado a las plantas. • Más de 10,000 años. • Fomento del avance de la Ciencia y Tecnología. 8 ¿Reconoces esta raíz? La influencia de la domesticación 9 A través de la selección artificial: “favoreciendo la sobrevivencia y reproducción de individuos de una especie con rasgos o atributos de interés, durante muchos años”, se han domesticado numerosas plantas y animales. La influencia de la domesticación Muchas de las variedades agrícolas comestibles más comunes se generaron inicialmente a través de procesos de selección humana favoreciendo las características deseables: Variedades Agrícolas Algunos resultados de años del trabajo de la humanidad... Selección artificial “La cruza del mejor con el mejor esperando lo mejor” Ingeniería Genética Reduce costos e incrementa rendimientos La mutagénesis inducida se utiliza desde mediados del siglo XX. • Sustancias químicas o radiaciones. • Cambios al AZAR. • Diversas mejoras. • Aprox. 3088 nuevas variedades vegetales, 70% área de cultivo. Cambios semejantes a los que ocurren naturalmente de manera espontánea. W. Murcott mandarin (left) and Tango (right). Photo credit: T. Williams, UC Riverside. No son considerados Organismos Genéticamente Modificados (OGMs) Mutaciones • Nucleasas Sitio Dirigidas (SDN) • Mutagénesis Dirigida por Oligonucleótidos (ODM) Producen alteraciones en la secuencia de nucleótidos de un gen. • Pérdidas • Inserciones • Sustituciones La edición de genomas de refiere a un tipo de ingeniería genética en el que manipulan directamente secuencias en el genoma. A diferencia de las técnicas previas, esta manipulación se dirige a sitios específicos. 1. Endonucleasas Sitio Dirigidas (SDN) y Tecnología de Dedos de Zinc 2. Oligonucleotide Directed Mutagenesis (ODM) 3. Cisgenesis/Intragenesis 4. Metilación de DNA dirigida por RNA (RdDM) 5.Reverse breeding & other "negative segregants“ (reproducción inversa y otras segregantes negativas) 6. Agro-infiltracion 7. Injerto sobre Patrón GM • Las nucleases de dedos de Zinc son proteínas quiméricas con un domino de “dedos de Zinc” (reconoce especificamente 3 pares de bases de la secuencia de DNA). •La nucleasa corta la doble hebra de DNA • Nucleasas de dedos de zinc (ZFN) • Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN) • Nucleasas de Secuencias Palindrómicas Repetidas Inversas (CRISPR-Cas) Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN) Nucleasas tipo activadores de transcripción (TALEN) son proteínas que se unen al DNA de manera secuencia- específica y se transforman “tijeras de DNA” al unirse a una nucleasa de dominio catalítico FokI SDN. Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) and CRISPR associated system (CRISPR-Cas9) Los CRISPR han sido encontrados en el 40% de las eubacterias y 90% de las arqueas secuenciadas. Es un “sistema inmune” de las bacterias para defenderlas del ataque de bacteriófagos Especificidad del sistema CRISPR / CAS9 El sistema CRISPR se compone de dos partes 1) Un componente protéico CAS9 con actividad de nucleasa 2) Un RNA guía que brinda especificidad al sistema USO DE CRISPR / CAS9 Al igual que en los sistemas anteriores la edición con CRISPR puede emplearse para generar mutaciones puntuales, deleciones o inserciones cortas • Uso de oligonucleotidos, los cuales comparten homología con la secunecia blanco (target) con excepción de los nucleotidos que serán modificados. • Oligonucleotidos “target” con secuencia homologa en el genoma • Crea uno o más pares de base de mismatch que corresponde a los nucleotidos no complementarios. La Cisgénesis es la introducción de genes aislados con sus promotores nativos de las especies susceptibles de cruzamiento o de la propia planta de cultivo En la intragénesis, el ADN insertado puede ser una combinación nueva de fragmentos de ADN de la misma especie o de una especie sexualmente compatible sujeto a recombinación homologa. Se usa en casos en donde el ADN flanqueante o el vector no se originan de especies sexualmente compatibles (Holme et al. 2013). Cisgenesis/Intragenesis utilisa la misma base tecnológica que la transgenesis. Holme et al. 2013. Intragenesis and cisgenesis as alternative to transgenic crop development. Plant Biotechnology Journal. 1-13 • Inserción de genes que codifican RNAs los cuáles son homólogos al promotor de las regiones del gen blanco • La transcripción de los genes dirige al RNAs de doble cadena, el cual es cortado en pequeños RNAs • sRNAs inducen la metilación de la región promotora del gen blanco target lo que lleva al silenciamiento transcripcional del gen (TGS) • Los cambios en el patrón de metilación sera heredaro aún en ausencia del transgene insertado Es un mecanismo en el que las moléculas de doble cadena de ARN (dsRNA) regula la expresión de los genes.Silenciamiento siRNA Molécula de RNA de doble cadena, que tienen un tamaño de 21-25 nucleótidos Producida a partir de un precursor de RNA que puede variar de tamaño y origen miRNA Molécula de RNA de doble cadena, que tienen un tamaño de 21-25 nucleótidos Los precursores de microARN son transcritos a partir de genes celulares, tal y como se producen los RNAm piRNA Mediado por A. Cuando un virus RNA infecta la célula, el RNAi destruye el RNA viral, previniendo la formación de nuevos virus. B. La síntesis de muchas proteínas es controlada por genes que codifican microRNA. Después del procesamiento el microRNA evita la traducción del mRNA a proteína. C. En la investigación, Ias moléculas de dsRNA son diseñadas para activar el complejo RISC para degradar el mRNA para un gen específico. Muchos procesos en la célula usan RNAi Reproducción inversa (RB) es una técnica de fitomejoramiento diseñada para producir directamente líneas parentales para cualquier planta heterocigótica. El mejoramiento reverso genera líneas perfectamente complementarias de parentales homocigotos mediante ingeniería meiótica. El método se basa en la reducción de la recombinación genética en el heterocigoto seleccionado mediante la eliminación del cruzamiento meiótico. Las esporas femeninas o masculinas obtenidas de tales plantas contienen combinaciones no recombinantes de los cromosomas parentales que pueden ser cultivadas in vitro para generar plantas homocigotas doble haploides (DHS). A partir de estos DHS, los padres complementarios pueden ser seleccionados y utilizados para reconstituir el heterocigoto a perpetuidad. Dirks et al. 2009 • El transgene que codifíca para una secuencia de RNAi es liberado en el explante del material • La planta transgenica se regenera en cultivo de tejido • El silenciamiento de genes dirige a la supresión meiotica • Las microsporas haploides son producidas de de flores de plantas transgenicas. • Las Microsporas son desarrolladas en plantas diploides homocigas (tecnología de dobles haploides) Reproducción con línea inductora transgénica (“segregantes negativas") • El transgene codificador de un constructo de RNAi o una proteína dominante-negativa es insertado en el genoma de la línea inductora. • La expresión del transgene permite la inhibición de la expresión genica o la función de la proteína. • El efecto del transgene es usado durante uno o varios ciclos de reproducción. • El transgene inductor finalmente es segregado o eliminado. REVERSE BREEDING • El injerto en sí es un método de cultivo clásico en el que dos plantas con diferentes fenotipos se combinan físicamente adjuntándose. • Cuando se toma la parte inferior, el patrón, de una planta transgénica y la parte superior, el vástago, de una planta convencional, las hojas resultantes, tallos, semillas y frutos no llevan el ADN transgénico. • Como un ejemplo, este método puede ser utilizado para la expresión de ARN de interferencia (o RdDM) en el patrón; estos son sistémicamente transportados y puede llevar al silenciamiento transitorio o heredable de los genes en el vástago. • Las semillas resultantes, frutas o descendencia de un vástago no contienen ADN de origen transgénico, mientras que la regeneración de brotes adventicios a partir de callos o portainjerto puede llevar ADN transgénico. Stegemann y Bock, 2009; Nagel et al, 2010;. Lusser et al., 2011 ADN ARN ARNmi Proteína Una planta quimérica se produce mediante el injerto de un vástago no genéticamente modificado en un patrón modificado genéticamente. En consecuencia, los frutos de la planta no contienen la secuencia de ADN insertada. El patrón puede ser modificado para mejorar su capacidad de enraizamiento o resistencia a las enfermedades transmitidas por el suelo, resultando en un aumento sustancial en el rendimiento de los componentes cosechables. El patrón también puede ser modificado para obtener el silenciamiento de genes a través de la técnica de ARN interferencia (ARNi). En las plantas injertadas, los ARN pequeños pueden moverse a través del injerto de modo que la señal de silenciamiento puede afectar a la expresión génica en el vástago. Raíz GM Injerto No GM Fuente: Lusser et al 2012 • La expresión transitoria de genes en plantas implica la expresión de proteínas recombinantes sin necesidad de transformación del material genético de la planta. • El ADN recombinante no se inserta en el genoma, sino que mediante distintos métodos se consigue producir grandes cantidades de ARN mensajero, que se traduce a proteínas en el citoplasma de parte de las células de la planta. • Una vez que el mensajero es traducido a proteínas la planta lo degrada, no se transmite a la descendencia. http://icono.fecyt.es/informesypublicaciones/Documents/2005- Plantas%20biofactor%C3%ADa_d.pdf http://icono.fecyt.es/informesypublicaciones/Documents/2005-Plantas biofactor%C3%ADa_d.pdf La expresión transitoria de genes generalmente se utiliza para evaluar la funcionalidad de las construcciones que se usan para transformar plantas de manera estable, y para evaluar la calidad del producto que se obtiene. También es posible la expresión transitoria en plastos. Ventajas de la expresión transitoria • Expresión rápida y flexible • No está influida por efectos de posición • Puede producirse en plantas adultas, previniendo cualquier efecto negativo que la proteína recombinante pudiese tener en el desarrollo de la planta • No es una modificación genética permanente, lo que desde el punto de vista de la seguridad es una ventaja • Ideal para obtener pequeñas cantidades de proteínas “a medida” en pocas semanas Agroinfeccion • Infiltración con suspención de Agrobacterium sp. Conteniendo el gen de interés insertado en un vector viral de tamano completo • Facilita la diseminación y expresión del gen blanco en la planta Floral dip • Transformación de gametocitos femeninos • Se obtienen semillas GM (Lusser M, 2012) (Lusser M, 2012) (Lusser M, 2012) Dra. Laura Esther Tovar Castillo Secretaría Ejecutiva-CIBIOGEM Tel. 55756878 e-mail: ltovar@conacyt.mx mailto:ltovar@conacyt.mx
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