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GENÉTICA DE LA CONSERVACIÓN APLICADA A DELFINES DE RÍO DE SURAMERICA María Catalina López Arévalo Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de los Andes Biología Director: Susana Caballero, Ph. D. ENERO 2021 Contenido RESUMEN ................................................................................................................................ 1 ABSTRACT ............................................................................................................................... 1 INTRODUCCIÓN ..................................................................................................................... 2 METODOLOGIA ...................................................................................................................... 7 GENERALIDADES .................................................................................................................. 8 Genética de la conservación ................................................................................................... 8 Conservación en delfines de río ............................................................................................. 9 ANTENCEDENTES................................................................................................................ 11 Genética de poblaciones ....................................................................................................... 11 Muestreo basado en complejo principal de histocompatibilidad (MHC) ............................ 19 Genética Forense .................................................................................................................. 21 ADN Ambiental ................................................................................................................... 22 CONCLUSIONES ................................................................................................................... 23 REFERENCIAS ....................................................................................................................... 24 1 GENÉTICA DE LA CONSERVACIÓN APLICADA A DELFINES DE RÍO DE SURAMERICA RESUMEN Los delfines de río son de interés para la conservación puesto que son predadores topes, especies sombrilla e indicadoras del estado de salud del ecosistema. Debido a lo anterior, este trabajo busca hacer una recopilación sobre los diferentes tipos de estudios de genética de la conservación de estas especies en Suramérica, ya que esta área de investigación está en constante evolución, buscando así mostrar los avances que se han tenido hasta el momento. Para esto, se hablará, en primer lugar, sobre la caracterización de la genética de la conservación y planes de preservación en delfines de río. Y, en segundo lugar, se describirán los diferentes estudios que se pueden implementar sobre estas especies mediante las distintas áreas: la genética de poblaciones, el muestreo basado en complejo principal de histocompatibilidad (MHC), genética forense y ADN ambiental (eDNA por sus siglas en ingles). ABSTRACT River dolphins are of conservation interest since they are top predators, umbrella species and indicators of the health of the ecosystem. Due to the above, this work seeks to compile the different types of genetic studies of the conservation of these species in South America, since this area of research is constantly evolving, thus seeking to show the advances that have been made up to moment. For this, it will be discussed, in the first place, about the characterization of the conservation genetics and preservation plans in river dolphins. And, secondly, the different studies that can be implemented on these species through the different areas will be described: population genetics, sampling based on main histocompatibility complex (MHC), forensic genetics and environmental DNA (eDNA). 2 INTRODUCCIÓN Los delfines de río son mamíferos acuáticos considerados un grupo polifilético perteneciente al orden de cetáceos odontocetos, los cuales se caracterizan por vivir en agua dulce. Sin embargo, hay delfines contemplados en este grupo que viven en estuarios. Estos delfines, restringidos a sistemas dulceacuícolas, pertenecen a cinco géneros de odontocetos en cinco familias. En estas familias tenemos a Iniidae con el género Inia, a Lipotidae con el género Lipotes (declarado extinto en 2006), a Pontoporidae con el género Pontoporia, a Platanistidae con el género Plantanista y a Delphinidae con los géneros Sotalia y Orcaella (Trujillo, Crespo, Van Damme, & Usma, 2011; Flores et al 2018; Hamilton et al, 2001; Caballero et al, 2007; Minton et al, 2017). El delfín Lipotes vexillifer o comúnmente conocido como baiji o río Yangtze se consideraba endémico en los tramos medio e inferior del río Yangtze en China, era una especie relicta (Zhou, 2009). Chen y Hua (1989) citados en Zhou (2009) estimaron la población de 300 individuos aproximadamente, pero cayó dramáticamente en la década de 1990, y se extinguió funcionalmente en 2006 (Turvey et al, 2007). Sin embargo, fue declarado probablemente extinto en 2007, debido a que se hizo una investigación intensiva que cubrió el rango histórico total y no se encontró evidencia de sobrevivencia de la especie (Turvey et al, 2007). Esta especie se extinguió debido a la mortalidad incidental resultante de impactos ambientales humanos a gran escala (Chen et al, 2019). El delfín Orcaella brevirostris o comúnmente conocido como delfín del Irrawaddy está en el sur y sureste de Asia. Limitado en tres sistemas fluviales (el Ayeyarwady (previamente Irrawaddy) de Myanmar, el Mahakam de Indonesia, y el Mekong de Camboya, RDP de Laos y Vietnam ) y dos lagos salobres o de agua dulce parcialmente aislados (el Chilika en India y Songkhla en Tailandia ) (Smith et al., 2007). Actualmente es una especie en peligro de extinción según la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (IUCN por sus 3 siglas en inglés). Donde las principales amenazas son la mortalidad incidental en las pesquerías (captura incidental) y la degradación del hábitat (Minton et al, 2017). Por otra parte, Platanista gangetica es el único miembro vivo de la familia Platanistidae. Esta especie tiene dos subespecies que se distinguen entre ellas por su distribución, diferenciándose en el cráneo y en las morfologías de las vértebras (Smith & Braulik, 2009). El delfín del río Ganges o Susu (Platanista gangetica gangetica), según Jones citado en Kolipakam (2020) esta restringida a partes de los sistemas fluviales Ganges- Brahmaputra-Meghana y Karnaphuli de la India, Nepal y Bangladesh. Por otro lado, el Platanista gangetica minor conocido como delfín del Indo o Bhulan, es endémico del sistema del Indo, distribuido en los territorios actuales de India y Pakistán. A principios de la década de 1990, los delfines del Indo habían sufrido una reducción del 80% en el rango, habiendo sido extirpado de los tramos superior e inferior del Indo y de cuatro de los afluentes más grandes. Esto debido a barreras como construcción de presas y remoción de agua, haciendo que se restrinjan a cinco secciones fluviales actualmente (Braulik et al,2014). Conjuntamente, la franciscana o Pontoporia blainvillei, es un pequeño cetáceo endémico del Atlántico suroeste, que se distribuye desde Itaúnas (Brasil) hasta Golfo Nuevo (Argentina) (Denuncio et al, 2011). Esta especie costera se puede encontrar en Argentina, Uruguay y sureste de Brasil (Monteiro et al 2020). Además, según Zerbini citado en Monteiro (2020) esta especie está en peligro crítico de extinción y presenta una tendencia descendente de la población, con una disminución continua de individuos maduros y según Zerbini et al citado por Monteiro (2020) clasificaesta especie como vulnerable según la IUCN. Donde se califica así bajo el criterio A3d de la lista roja, debido a la disminución proyectada en todo el rango de más del 30% durante tres generaciones (undefined, 2017). 4 En el caso específico de Suramérica se presentan dos delfines de agua dulce, el Boto o delfín rosado (Inia geoffrensis) y el Tucuxi (Sotalia fluviatilis). Dentro de las amenazas principales a los cuales se encuentran expuestos los delfines de agua dulce en Sudamérica esta la construcción de represas, creación de vías fluviales, la contaminación del agua, aumento de mercurio debido a extracción de oro, explotación y producción de petróleo, tránsito de barcos y malas prácticas turísticas. A lo anterior, se le suman los conflictos con las actividades pesqueras relacionado al uso de redes de pesca largas a lo largo de ríos, arroyos y lagos, haciendo que los delfines se enreden y se asfixien. Añadiéndole a esto, se encuentra la pesca directa, donde se hacen matanzas deliberadas de los delfines que usan como carnada para el pez mota. (Trujillo et al, 2011; Flores et al 2018). Adicionalmente, las especies de delfines de río presentan unos patrones de distribución marcados como que los machos son el medio de flujo genético entre grupos, mientras que las hembras no cambian de grupo (Hollatz et al, 2011). Por otro lado, estos delfines son testigos de la evolución y transformación de los ríos Amazonas y Orinoco convirtiéndose en los predadores tope de los ecosistemas acuáticos, siendo asi especies indicadoras del estado de salud del ecosistema (Trujillo et al, 2019). Esto ultimo debido a que conquistaron la mayor diversidad de hábitats que incluyen, no solo los canales principales y tributarios, sino algunas lagunas y bosques inundados (Trujillo & Diazgranados, 2012). Cabe aclarar que en la cuenca del Amazonas se puede encontrar tanto a Inia geoffrensis como a Sotalia fluviatilis, mientras que en el río Orinoco se encuentra la subespecie Inia geoffrensis humboldtiana y solo en la parte baja a Sotalia guianensis, especie hermana de S. fluviatilis (Caballero et al 2007 ; Caballero et al 2018; Banguera-Hinestroza et al, 2002), pero más adelante ampliaremos este tema. 5 La especie comúnmente conocida como delfín rosado del Amazonas o Boto (Inia geoffrensis), tiene un estado de conservación global en Peligro, esto según la Lista roja de las especies emitida en el año 2018 por la IUCN. Esta clasificación se realiza bajo los criterios A2acd+3cd+4acd, los cuales indican que la especie se ve amenazada por reducción del tamaño poblacional observada y proyectada (IUCN, 2012). Figura 1 Distribución de Inia geoffrensis, basado en registros disponibles en GBIF sobre observaciones humanas, muestras de salidas de campo y colecciones biológicas. En la figura anterior, se puede evidenciar un modelo de distribución de la especie Inia geoffrensis, el cual está basado en registros disponibles en GBIF, con las fuentes hidrográficas de Colombia. Al ver este modelo, se evidencia que la especie Inia geoffrensis se distribuye en los ríos Amazonas y Orinoco, pasando por los siguientes países Brasil, Perú, Venezuela, Colombia, Ecuador, Guyana y Bolivia. Siendo su hábitat canales principales, canales laterales, lagos, planicies inundadas, bosques inundados y ríos con rápidos fuertes. Es importante 6 recalcar, que esta especie, es endémica de Sur América y se encuentra específicamente en las cuencas hidrológicas al norte de este continente (Banguera-Hinestroza et al, 2002). El delfín Sotalia fluviatilis también conocido como Tucuxi, tiene una taxonomía que ha sido controvertida donde se catalogaba en dos subespecies o ecotipos siendo Sotalia fluviatilis guianensis (ecotipos marinos) y Sotalia fluviatilis fluviatilis (ecotipos fluviales). Estudios morfométricos y de ADN mitocondrial los sugirieron como especies separadas (Monteiro- Filho et al, 2002; Cunha et al, 2005). Finalmente, en un estudio del 2007 se presenta evidencia genética (diez intrones nucleares y tres genes mitocondriales), donde se concluyó que cada subespecie debía ser elevada a nivel de especie basándose en el concepto de especie GCC (de sus siglas en ingles Genealogical/ Lineage Concordance Species Concept), dejando la especie Sotalia fluviatilis como la especie ribereña, mientras que a la especie costera se le denominó Sotalia guianensis (Caballero et al, 2007; Flores et al, 2018). Cabe aclarar que según IUCN declaro en el 2020 a Sotalia fluviatilis en peligro de extinción y en el 2018 a Sotalia guianensis en estado casi amenazado. Figura 2 Distribución del género Sotalia, basado en registros disponibles en GBIF. Como se puede apreciar en la figura 2 se puede evidenciar un modelo de distribución del género Sotalia, el cual está basado en registros disponibles en GBIF, donde se puede ver en las costas https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1748-7692.2007.00110.x#b66 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1748-7692.2007.00110.x#b66 https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/j.1748-7692.2007.00110.x#b28 7 de Suramérica, los ríos Amazona y Orinoco. El tucuxi se distribuye principalmente de la cuenca del río Amazonas en Brasil, hasta el interior del sudeste de Colombia, el este de Ecuador y el noreste de Perú. Además, se puede evidenciar como la especie costera se encuentra en aguas costeras del Atlántico occidental de América del sur y central, es decir desde Brasil hasta Nicaragua (Flores et al, 2018). Cabe aclara que los especímenes del río Orinoco fueron agrupados en Sotalia guianensis (Caballero et al, 2017). El presente trabajo tiene el propósito de recopilar información sobre los avances en genética de la conservación en delfines de río. Lo anterior, con el interés de contribuir en la recopilación de información, dado que existe una constante actualización de metodologías en el área de la genética de la conservación. Así mismo, se plantea como pregunta de investigación la siguiente ¿Cómo se han estudiado los delfines ribereños de las especies Inia geoffrensis y Sotalia fluviatilis en los ríos Amazonas y Orinoco bajo el área de la genética de la conservación? A la hora de responder a esta pregunta, se hace una selección de las diferentes metodologías para esta área de investigación, se define la genética de la conservación y los planes de conservación en delfines de río. METODOLOGIA Para hacer la selección de los documentos me centre en tres tipos de estudios principales genética de población, MHC, genética forense y ADN ambiental. Principalmente en estudios de delfines de río, idealmente de Sur América publicados desde el 2000 en adelante, sin embargo, se citaron unos estudios en Asia de delfines de río. Adicionalmente, como criterio de exclusión no se tiene en cuenta los estudios hechos en delfines marinos. Dentro de la base de datos consultadas esta Springer Link, Marine Mammal Science, Latin American Journal of Aquatic Mammals entre otras. Se hace una selección de los artículos más relevantes, agrupándolos por los criterios mencionados anteriormente (genética de poblaciones, MHC, 8 genética forense y ADNamb) y organizándolos cronológicamente. Finalmente se realiza un resumen de lo que era el artículo, aspectos relevantes si los tiene y sus respectivas conclusiones. GENERALIDADES Genética de la conservación La genética de la conservación es el uso de las técnicas y teorías genéticas que ayuda a la preservación de poblaciones u organismos, para reducir el riesgo de extinción de especies amenazadas. Las especies en peligro de extinción generalmente disminuyen sus poblaciones debido a la pérdida de hábitat y a la sobreexplotación de diferentes factores aleatorios adicionales como los demográficos, ambientales, genéticos y catastróficos (Frankham, 2004).Además, la genética de la conservación, según Mortiz (2002), permite estudiar el efecto de la fragmentación, la reducción del flujo genético y el efecto de la acumulación y perdida de mutaciones deletéreas. Esta también le da solución a problemas tanto taxonómicos, cómo definir unidades evolutivamente significativas y unidades de manejo. Asimismo, puede proteger los procesos evolutivos que mantienen la diversidad biológica. Se puede decir que la genética de la conservación se hizo mas relevante cuando se detectaron problemas genéticos asociados con las especies en peligro de extinción, su disminución poblacional, la consecuente pérdida de diversidad genética y fragmentación de los hábitats, haciendo necesario entender los procesos de extinción de las especies. Sin embargo, ya venían desarrollándose estudios que combinaban la genética y la conservación, como es el caso de Genetic conservation: our evolutionary responsibility donde Frankel habla de la importancia de la conservación de variedades de cultivos agrícolas tradicionales, donde el punto central es la diversidad genética y esta le puede proporcionar el mejoramiento de las plantas. Además, se desarrollaron metodologías para la conservación genética que son efectivas y económicas, 9 acotando la necesidad de una acción urgente para recolectar y preservar recursos genéticos irremplazables (Rocha y Gasca, 2007; Frankel, 1974). Entrando más a fondo en la historia de esta área interdisciplinaria llamada genética de la conservación, se necesitó de eventos principales para surgir. Empezando por los años 70, desde el desarrollo de la teoría de la biogeografía de islas, se comenzó los análisis sistemáticos genéticos de especies en cautiverio. En esta década la genética tiene avances importantes como el primer ADN recombinante in vitro en el año 1972, y en el año 1977 se publican las técnicas de secuenciación del ADN, a su vez, la secuencia completa de 5387 nucleótidos del fago f X171, y descubren que los genes eucariotas se encuentran interrumpidos (intrones) (Portugal, & Cohen,1977). En los años 80, a principio de esta década Kary Mullis presentó de la reacción en cadena de la polimerasa o PCR, además, se avanzó en los estudios de metapoblaciones enfocadas en la variación genética y los tamaños poblacionales, asimismo, de los avances en el uso de marcadores moleculares permitiendo recopilación de datos genéticos de poblaciones naturales de especies amenazadas o en peligro, revelando la importancia del factor genético en depresión por endogamia (Landi y Quiroz, 2011; Rocha y Gasca, 2007). En seguida, en los años 90, se avanzó en métodos moleculares y computacionales que permitieron mejoramiento de análisis y predicciones. Finalmente, en los años 2000, se evidencia el avance de la genética de la conservación con las publicaciones de la revista Conservation Genetics y otras publicaciones. Esto lleva a la relación que guarda la genética y la conservación, donde el objetivo clave es ayudar a minimizar las extinciones al evitar problemas relacionados con la perdida de diversidad y la habilidad para evolucionar en respuesta a los cambios ambientales (Rocha y Gasca, 2007). Conservación en delfines de río Según Trujillo & Diazgranados (2012) los delfines de río se han posicionado como especies emblemáticas en Sudamérica y alrededor de ellos se están tejiendo diversas iniciativas de 10 conservación que no sólo los incluye a ellos, sino también a toda la estructura trófica de los ecosistemas acuáticos. Además, Bermúdez, Trujillo, Solano, Alonso & Ceballos (2010) citados de Trujillo & Diazgranados (2012) habla de programas como Fauna Acuática Amenazada en la Amazonía (FACUAM) desarrollada por Corpoamazonía, el Instituto Sinchi, la Fundación Omacha y Fundación Natura, donde se revisaron e implementaron acciones de conservación para delfines de río, manatíes, nutrias, tortugas y caimanes. También, existe un plan de acción para la conservación de delfines de río en Sudamérica que se llevó a cabo en el taller internacional en Santa Cruz de la Sierra (Bolivia 2008) donde se reunieron investigadores y representantes de los gobiernos de 9 países, y se realizaron acciones que se convertirán en herramientas de gestión a nivel regional y en los países donde se presentan las especies (Trujillo et al, 2011). Cabe resaltar que el delfín franciscana (Pontoporia blainvillei) , debido a que tiene un estado de conservación vulnerable dicho por IUCN, la Comisión Ballenera internacional (IWC de sus siglas en inglés) respaldado por la Comisión en su reunión de 2016 creando el primer Plan de Manejo de Conservación (CMP por sus siglas en inglés). Donde en los últimos años su comité científico ha estado trabajando para comprender mejor el alcance y el impacto de las capturas de pequeños cetáceos para alimentos, carnada, comercio y usos tradicionales. Esto incluye una nueva serie de talleres cuyo objetivo es crear capacidad entre los grupos locales para recopilar, compartir y analizar datos que ayudarán a establecer una imagen más clara de la situación local y global. Mas aún, las acciones prioritarias para el CMP durante el período entre sesiones 2018 incluyen: Continuar investigando la estructura de la población, monitoreo de abundancia, tendencias y captura incidental, mitigar la captura incidental, desarrollo o implementación de áreas protegidas, fomentar la implementación del Plan de Acción Nacional para reducir las interacciones de los mamíferos marinos con la pesca en Argentina, desarrollar https://iwc.int/index.php?cID=html_323 https://iwc.int/index.php?cID=html_323 https://iwc.int/index.php?cID=html_323 https://iwc.int/index.php?cID=html_605 11 una estrategia para aumentar la conciencia pública de la Franciscana e incluir la Franciscana en las discusiones bilaterales y multilaterales. (IWC, 2013; IWC, 2018) ANTENCEDENTES Genética de poblaciones El primer estudio de genética de poblaciones de delfines de río que incluía un género de Suramérica fue Evolution of river dolphins publicado en el 2001. Este estudio habla de los cetáceos, como son los menos conocidos y en más peligro de extinción. Dentro de los géneros que fueron estudiados están Inia, Pontoporia, Lipotes y Platanista. Además, este estudio clarifica la taxonomía entre estos géneros debido a que anteriormente se contemplaban en un solo grupo desafiando la biogeografía y evolución. Entre los resultados más relevantes de este trabajo sugieren una distinción entre los especímenes del género Inia recolectados en Bolivia y Amazonas (Hamilton et al, 2001). El primer estudio de genética de poblaciones solo en Suramérica en delfines de río se centró en la estructura génica del género Inia, donde se observa la variación genética de las tres subespecies de I. geoffrensis donde se usaron 96 muestras de ADN que fueron recolectadas en cuencas del Orinoco, el río Putumayo, un afluente del Amazonas Colombiano y ríos Tijamuchí e Ipurupuru del Amazonas Boliviano. En este estudio se amplifica un fragmento de 400pb con una región de control del ADN mitocondrial (ADNmt) y 36 de estas se usaron para secuenciar 600pb citocromo b (cyt b) (Banguera-Hinestroza et al, 2002). Rosel y Wang citados en Banguera-Hinestroza (2002) dicen que el ADNmt es una porción que evoluciona rápido y por esto permite la resolución a una delicada escala sobre la estructura de la población y las divisiones microevolutivas. Retomando el estudio, las estadísticas calculadas a partir de las secuencias obtenidas fueron el número medio de diferencias por pares, la diversidad de nucleótidos y la divergencia genética neta dentro y entre las diferentes poblaciones, el ϕ𝑆𝑇 y 12 𝐹𝑆𝑇 entre pares de población (Tamura y Nei (1993) genetic distances among the same pairs citado en Banguera-Hinestroza (2002)), y un análisis de varianza molecular(AMOVA), además, mediante matrices de distancia y procedimientos de parsimonia máxima hicieron las relaciones filogenéticas y los resultados respaldaron la propuesta de subdividir el género Inia en al menos dos unidades evolutivamente significativas, la confinada a la cuenca del río Boliviano y la otra distribuida en las cuencas del Amazonas y el Orinoco (Banguera-Hinestroza et al, 2002). En otro estudio, Ruiz (2007) en su artículo, Genética de Poblaciones: Teoría y aplicación a la conservación de mamíferos neotropicales (Oso andino y delfín rosado), encuentra que dentro de los organismos que estudia está el delfín Inia geoffrensis, donde recalca que el conocimiento de esos parámetros de la historia natural de la especie puede ser estimados a partir de los métodos genético poblacionales, los cuales deberían incorporarse a cualquier programa de conservación biológica de las especies referidas y potencialmente de otras. En este estudio, se muestra como la genética de poblaciones es trascendente desde la perspectiva de la conservación biológica aplicada al estudio. En el cual incluían tres aspectos: (a) Estimación de números efectivos mediante el análisis del cambio temporal de las frecuencias génicas y mediante procedimientos generados por la teoría de la coalescencia, (b) Determinación del grado de influencia de diferentes modelos de extinción y recolonización en el grado de heterogeneidad genética entre poblaciones y (c) ¿Cómo se puede cuantificar la existencia de cuellos de botella, expansiones poblacionales, eventos de deriva y flujo génico en un taxón dado mediante técnicas de coalescencia?. En el 2007 en el artículo Taxonomic status of the genus sotalia: species level ranking for “tucuxi” (sotalia fluviatilis) and “costero” (sotalia guianensis) dolphins se hace una revisión histórica y se presenta nuevas evidencias genéticas (diez genes nucleares y tres mitocondriales) que apoyan la elevación a especie a los dos tipos de delfines. El total de individuos estudiados 13 es n=76 recolectados en ubicaciones como Nicaragua, Caribe Colombiano, Guyana Francesa, Costa Brasilera y el Amazonas Ecuatoriano, Brasileño, Colombiano y Peruano. Dentro de los estudios se construyó un reloj molecular usando las secuencias de CR de ADNmt de Sotalia costero, Sotalia ribereño y una secuencia de marsopa común, esto con el fin de estimar el tiempo de divergencia entre Sotalia costero y Sotalia ribereño. Dentro de los resultados más relevantes esta que la divergencia neta entre los costeros y los rivereños fue de un 2,2% para el conjunto de datos de ADNmt y usando el “Genealogical/Lineage Concordance Species Concept” estas se proponen deben catalogarse como especies diferentes (Caballero et al, 2007). En el 2008 en el artículo Molecular Differentiation among Inia geoffrensis and Inia boliviensis (Iniidae, Cetacea) by means of nuclear intro sequences, buscan proporcionar nueva evidencia (mediante la secuenciación de diez intrones autosómicos y del cromosoma Y) para diferencias las especies del género Inia, además de determinar si la evolución molecular de cromosomas nucleares y Y son tan sustanciales como los genes mitocondriales reportados en Banguera et al (2002). Para el muestreo se hicieron expediciones entre el 2002 y 2005, realizando biopsia de aleta caudal para cada uno de los 220 delfines capturados. Secuenciando cuatro intrones Y cromosómicos (UBEIY7, SMY7, DBY7 y DBY8; Hellborg y Ellegren (2003) citado por Ruiz- Garcia et al. (2008) y para seis intrones autosómicos (gen de lactoalbúmina, actina, CAT, IFN, GBA y CHRNA1; Palumbi y Baker (1994), Milinkovitch et al. (1998), Lyons et al. (1997) que fueron citaron por Ruiz-Garcia et al (2008)). En la extracción de ADN se utilizó el procedimiento de Fenol-Cloroformo de Sambrock et al (1989) citado en Ruiz-Garcia et al (2008), y dependiendo del marcador molecular que se usaba se tenía un perfil de PCR diferente. En el análisis estadístico alinearon las secuencias mediante los programas ClustalX y Phredv.020425, además de inspeccionar visualmente. Obteniendo como resultados eventos de inserción-deleción (indel) en diferentes secuencias como DBY8, el cual presento los indel diferentes posiciones, el DY8S en la posición 146, UBEY7 en las posiciones 32 y 33, el CAT 14 mostro una secuencia de 12pb presente en los delfines peruanos pero inexistente en los delfines bolivianos y finalmente en el intrón nuclear Actina se presentó una secuencia (posiciones 22,23 y 24) y una gran deleción en los delfines bolivianos ausente en los peruanos. Dentro de la discusión obtuvieron que la evolución molecular extremadamente baja para los intrones autosómicos y del cromosoma Y en comparación con la diferenciación genética absoluta encontrada en la región de control y en las secuencias cyt-b del mtDNA. No obstante, este estudio sirvió como refuerzo a la afirmación de Banguera et al (2002) presentando evidencia molecular adicional que favorece la evolución independiente. En el 2010 en el estudio Population structure and phylogeography of tucuxi dolphins (Sotalia fluviatilis) se usó una muestra total de 26 especímenes recolectados en el Amazona Peruano, colombiano y brasileño. Analizaron 577 pb del gen CR y 425pb del gen Cyt b, donde en la primera fueron definidos 14 haplotipos en once sitios variables y donde en el Cty b se definieron 2 haplotipos. Como resultados se compartieron muy pocos haplotipos entre diferentes regiones geográficas, lo que indica cierto grado de filopatría femenina para esta especie. Solo dos haplotipos (S y X) fueron compartida entre las regiones geográficas de la Amazonia colombiana y la Amazonia brasileña. Concluyendo la necesidad de mantener la conectividad entre las poblaciones a lo largo del río Amazonas y sus afluentes como principal objetivo de los programas de manejo y conservación de Sotalia fluviatilis (Caballero et al, 2010b). En el 2014 en el artículo Looking to the past and the future: were the Madeira River rapids a geographical barrier to the boto (Cetacea: Iniidae)? hablaba de Inia boliviensis donde buscaban diferenciar la población de delfines del río Madeira. Siendo las mayores amenazas en la región de rápidos del río Madeira la modificación del hábitat acuática, resultado de construcciones hidroeléctricas. En el estudio hipotetizaron que los delfines río arriba serian I. boliviensis y río abajo I. geoffrensis, además de querer conocer a que especie eran perteneciente 15 los delfines que se encontraban viviendo en los rápidos. Esta hipótesis se debía que consideraban que los 18 rápidos representaban barreras efectivas para el flujo de genes. Cabe aclarar al ser dos especies morfológicamente similares usan caracteres moleculares para el análisis. Utilizaron a 125 individuos del río Madeira, tomando muestra en 19 lugares diferentes. Las muestras tomadas eran de los márgenes de los lóbulos caudales de los animales según el procedimiento Silva y Martin (2000) citado por Gravena et al (2014). Conservando las muestras en etanol al 95% depositándose en la colección oficial de tejidos (CTGA), cabe aclarar que se usar 14 donde estaba confirmado que son de la especie I. geoffrensis y otras 14 más donde se sabía que eran I. boliviensis. Usan tres marcadores mitocondriales, región control (CR), region cyt b y la región citocromo c oxidasa I (COI). Donde para amplificar para las dos primeras regiones usaron cebadores HDH6 y LTRO citados de Banguera-Hinestroza et al (2002). Para el estudio se diseñaron el cebador IniaGluF1 y IniaProR1 para las dos primeras regiones y para el caso de la región COI se diseñan COIF_Inia y COIR_Inia. Teniendo como resultado que en los ríos Guaporé, Mamoré y la mayoría del río Madeira hasta Guajará pertenecen a I. boliviensis, desde Borba (Guajará) y la desembocadura del río Madeira estaban tres I. geoffrensis y 6I. boliviensis. Además, se concluyó la serie de rápidos no actúa como una barrera completa para el flujo de genes. En el mismo 2014 fue publicado A new species of river Dolphin from Brazil or: How Little do we know our biodiversity un artículo que buscaba diferenciar la especies de I. geoffrensis de Inia araguaiaensis, debido a que la cuenca del río Araguaia-Tocantins no forman parte de la cuenca Amazonas además de estar restringidos por una serie de rápidos en la parte baja de Tocantins, creyendo que se delimitan por una serie de cascadas y rápidos como en caso del alto de río Madeira descrito anteriormente. Para analizar la hipótesis (los individuos Inia aguas arriba o incluso todo el sistema representen una entidad biológica evolutiva independiente a I. 16 geoffrensis en las cuencas del Amazonas) utilizan una serio de ADNmt, ADN nuclear y caracteres morfológicos de las dos especies conocidas de Inia (I. geoffrensis e I. boliviensis) así como los individuos de la cuenca del río Araguaia. En la toma de datos se utilizo procedimientos de muestreo mínimamente invasivos de Da Silva & Martin (2000) citados por Hrbek et al (2014), las muestras se mantuvieron en 95% etanol depositándolo en CGTA y la colección de tejidos del Instituto Nacional de Pesquisas da Amazonia. Teniendo un n=121 (45 I. boliviensis de la subcuenca boliviana, 44 I. geoffrensis de la cuenca Amazonas-Solimões y 32 Inia sp. individuos del río Araguaia.). Debido a el tema de este trabajo no se va a profundizar en el proceso morfológico. En consecuencia, para el estudio de Hrbek et al (2014) se hablará primero de la amplificación del ADN mediante microsatélites nucleares utilizaron Kit de tejido y sangre Quiaquick (Hilsden, Alemania). Para los individuos de Inia, usaron 7 pares de microsatélites (Ig2B1, Ig11B1, Ig8H1, Ig10E, Ig11D2, Ig3A1, Ig7F2) desarrollados por Gravena et al (2009) citado por Hrbek et al (2014) para I. geoffrensis. Adicionalmente, 3 pares de microsatélites (Ttr11, Ttr48, TtruAAT40) desarrollados por Caldwell et al (2002) y Rosel et al (2005) citados en Hrbek et al (2014) para Tursiops truncatus . La genotipificación se realizó según Gravena et al (2009) citado en Hrbek et al (2014) en el secuenciador automático ABI 3130XL (Life Technologies). Gracias al uso del programa GeneMapper (Life Technologies) se extraen datos de fragmentos sin procesar e inferir tamaños de fragmentos, se caracterizan en el programa ARLEQUIN. Ahora se hablará de la segunda amplificación de ADN mitocondrial (ADN mt) se amplifica el cyt b usando condiciones de PCR estándar con los cebadores IniaGluF.1 e IniaProR.1 diseñados para el estudio, además, usan COI que se amplifico usando un coctel de cebadores C_VF1LFt1-C_VRLRt1 de Ivanova et al (2007) citado en Hrbek et al (2014). Teniendo como resultado de los microsatélites se encuentran tres grupos diferentes I. 17 geoffrensis, I. boliviensis y los individuos Inia del río Araguaia. Estos resultados fueron apoyados por el estudio de ADNmt. En el 2015 en el artículo de Gravena y colaboradores, muestrean a 18 individuos de los rápidos del río Madeira, ya que suponían que en realidad los delfines que habitaban estos rápidos después de la construcción de la represa hidroeléctrica eran de la especie I. boliviensis. Para probar esto, recolectaron ADNmt (región control, cty b y COI ) y ADN nuclear (10 loci microsatélites). Buscando probar si existe alguna conectividad entre los delfines dentro de los rápidos y los de río arriba y río debajo de los rápidos. Obteniendo como resultados, que los delfines de río arriba de la cascada Teotônio (cascada principal y más alta) tenían una señal genética de I. boliviensis, mientras que la mayoría de delfines de río abajo tenían una señal genética de I. geoffrensis. Además, como resultado de la unidad de manejo (UM) obtuvieron que los I. boliviensis recolectados de rápidos sobre la cascada presentaba UM diferente a UM I. boliviensis que ocupa el río boliviano. Finalmente encontraron que río abajo la mayoría de delfines eran híbridos I. boliviensis/ I. geoffrensis. En el 2017 en el estudio de Caballero et al Genetic identity of Sotalia dolphins from the Orinoco River, buscaba clarificar la taxonomía de los Sotalia que habitaban el río Orinoco. Siendo interesante que este delfín solo ubicaba en el Orinoco Venezolano y se ausentaba en el Amazonas Colombiano, lo que proponía que era una nueva especie o de la especie S. guianensis. Para la toma de muestras de piel fueron obtenidos de animales vivos siguiendo el protocolo de Silva y Matin (2000) citados en Caballero et al (2017). Todas las secuencias se editaron manualmente, se alinearon y concatenaron utilizando el software Geneious 3.6.1. Haplotipos (en el caso de mtDNA) o genotipos (en el caso de ADN nuclear) se definieron utilizando MacClade 4.0 de Maddison y Maddison (2000) citado en Caballero et al (2017). Teniendo en cuenta la información genética obtenida en este estudio (único mitocondrial haplotipo y genotipo compartido por todas las muestras recolectadas), plantean la hipótesis de 18 que S. guianensis que habita en el Orinoco probablemente representa una unidad de población independiente, aislado de otras poblaciones costeras y, como tal, merecedor de una conservación separada y esfuerzos de gestión. En el 2018 se publicó un artículo sobre la estructura de la población de Sotalia de Caballero y colaboradores, que buscaba patrones de diversidad nuclear y mitocondrial e implicaciones para la conservación. Investigando sobre la diversidad genética, la estructura de la población y los niveles de flujo y conectividad de S. guianensis y S. fluviatilis mediante el análisis de 8-10 loci de microsatélites descritos para en genero de Cunha y Watts (2007) citado por Caballero et al (2018), adicionando un tamaño de muestreo a estudios anteriores al secuenciar la región de control de ADNmt. El estudio cuenta con un total de 146 muestras con 36 diferentes puntos de muestreos. Se hizo la amplificación de un fragmento de 700pb de la región control de ADNmt y para las muestras que no se pudieron amplificar ya sea por degradación de ADN o inhibidores de PCR presentes se obtuvo una amplificación exitosa más pequeña (500pb). Un conjunto de muestras de referencia ( n= 8) se utilizaron para realizar una calibración cruzada de las puntuaciones entre las plataformas de análisis y los laboratorios. El mismo conjunto de muestras se utilizó tanto para la amplificación por PCR como para la llamada al tamaño del alelo como control interno para detectar posibles abandonos alélicos o diferencias en la llamada alélica. El resultado para el ADNmt fue que se definieron 27 haplotipos para S. guianensis, siendo 11 de estos nuevos; en el caso de S. fluviatilis se definieron 16 haplotipos siendo seis nuevos. En los resultados de diversidad y diferenciación de microsatélites obtuvieron diez loci para S. guianensis y ocho para S. fluviatilis. Conjuntamente, se reportaron que los haplotipos de ADNmt encontrado no se comparten entre las especies, además confirmando estudios posteriores como un bajo nivel de flujo de genes mediado por hembras entre estas regiones 19 hablado en Caballero et al (2010) y los haplotipos de las muestras recolectadas en el río Orinoco y el estuario del Amazonas fueron agrupados en S. guianensis hablado en Caballero et al (2017); para el caso de S. fluviatilis se encontraron haplotipos con diferenciación poblacional entre Amazonia Colombiana/Peruana y Brasileña. Finalmente, los resultados sugieren la existencia de varias poblaciones costeras y ribereñas distintas de Sotalia con distribuciones localizadas. Así se ve necesario desarrollar al menos 2 estrategias de conservación diferentes para ambas especies. Muestreo basado en complejo principal de histocompatibilidad (MHC) El complejo principalde histocompatibilidad (MHC) es una parte fundamental del sistema inmune de los vertebrados, se cree que la alta variabilidad en muchos genes MHC participa en la respuesta a antígeno, y si el complejo cambia, se relaciona a rasgos de aptitud física, como factores importantes para viabilidad de la población (resistencia a parásitos, supervivencia y éxito reproductivo) (Yang et al 2005; Ahmad et al, 2002). Además, Yuhki y O'Brien citados por Yang, Yan, Zhou y Wei (2005), afirman que los genes del MHC son los loci más polimórficos de todos los genes que codifican proteínas del sistema complemento en el genoma de los vertebrados (López-Martínez et al, 2005), también sugieren que las especies y/o poblaciones con un bajo nivel de diversidad de MHC podrían ser particularmente vulnerables a enfermedades infecciosas. Por esto se considera que el examen de la variabilidad del MHC debe ser utilizado en estudios genéticos de especies en peligro de extinción (Yang et al 2005) como lo es el caso de algunos delfines de río. Adicionalmente según Klein (1986) citado en Caballero et al (2010) se conocen dos tipos de moléculas Clase I y Clase II, donde en la primera presenta péptido proteínas de células malignas o infectadas por virus y las segundas presentan péptidos que se originan de material extraño como bacterias o parásitos. 20 En un estudio relacionado en China, caracterizaron la variación genética en el exón 2 del locus baiji MHC DQB a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la clonación y la secuenciación directa de nucleótidos. Este estudio lo hicieron con el objetivo de investigar el potencial evolutivo y adaptativo de las especies de cetáceos más amenazadas en base al análisis de una región genómica funcional (Yang et al 2005). En este caso, para la amplificación se utilizan cebadores en el exón 2 del gen MHC DQB, que describe Murray, Malik y White citados en Yang, Yan, Zhou y Wei (2005): 5′- CTGGTAGTTGTGTCTGCACAC-3 ′ (adelante) y 5′-CATGTGCTACTTCACCAACGG-3 ′ (reverso). Además, Yang, Yan, Zhou y Wei (2005) determinaron los sitios de nucleótidos variables y los alelos únicos, donde las secuencias resultantes se alinearon mediante el software informático ClustalX 1.8 (corrigiendo a mano) y finalmente se hicieron análisis filogenéticos utilizando el programa informático Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) versión 2.0 (Yang et al 2005). En el primer estudio en Suramérica, reportan la primera secuencia MHC (DQB I) para las dos especies I. geoffrensis y I. boliviensis. En este estudio se hicieron captura de dos especímenes en los afluentes del Amazonas peruano y boliviano. Se pueden sacar dos conclusiones principales de este estudio, las secuencias MHC DQB I parecen evolucionar más rápidamente que otras secuencias nucleares en cetáceos y diferencial presiones selectivas positivas que actúan sobre estos genes causan concomitantes históricas evolutivas divergentes que derivan reconstrucciones filogenéticas que podría ser inconsistente con intertaxa evolutiva ampliamente aceptada relaciones dilucidadas con otros marcadores moleculares sometidos a una neutralidad dinámica (Martinez-Aguero et al. 2006). En otro estudio del 2010 se hizo el primer estudio de MHC en el exón 2 de dos loci de clase II (DQA y DQB) en los delfines neotropicales S. fluviatilis y S. guianensis de Caballero et al (2010 a). En este estudio se usó una población de 36 muestras de piel tomadas de 12 localidades 21 diferentes más una muestra de ADN. Donde en el caso de los delfines cautivos se tomó una muestra de tejido de cola, mientras que para el caso de delfines en libertad se tomó mediante el uso de un dardo desplegado lanzado desde un rifle de captura veterinaria. Las muestras se almacenaron en 70% etanol al -20°C. Para la extracción de ADN usaron el protocolo Sambrook et al (1989) modificado para pequeñas muestras por Banker et al (1994) citado en Caballero et al (2010a). Sindo el perfil de muy simila para DQA y DQB con algunas diferencias. En el caso de que fueran exitosas 3 amplificaciones independientes pasaban a ser secuenciadas directamente en ambas direcciones usando BigDye TM en un secuenciador capilar automatizado ABI 3100 (Perkin Elmer), eliminado los productos de la PCR usando fosfatasa alcalina de camaron (SAP) y ExoI (exonucleasa I). Para el análisis de alelos utilizaron MEGA3 donde se hicieron las estimaciones entre los alelos DQA y DQB, utilizando modelos de Kimura y comparando con otras especies de cetáceos. Como resultado identificaron cuatro alelos para DQA y cuatro para DQB, obteniendo así alta diversidad nucleotídica en estos alelos. Además, de que se evidencio selección positiva dm/ds en la región de unión de péptidos del locus DQB en Sotalia. Genética Forense En el 2008 sale el articulo Amazon River Dolphin love fetishes: From folklore to molecular forensics de Gravena y colaboradores, donde investigan la procedencia de los supuestos amuletos (partes de delfines). Debido a una herencia cultural fuerte de África Occidental se considera el delfín como un ser mitológico con connotaciones sexuales. Donde en el folklor poseer ciertas partes de este como los ojos o genitales, otorga a las personas verse mas atractivas a los ojos de otro o aumentar la satisfacción sexual. Debido a lo anterior en el mercado del Amazonas se comercializa supuestamente partes de estos animales, donde este estudio busco saber el verdadero origen. Para esto recolectaron un total de 43 muestras de fetiches boto vendidos en diferentes mercados. Extrajeron tejido no expuesto al ambiente de 22 los globos oculares salados y se aplicó una amplificación de región control mitocondrial, estos fueron comparados con secuencias de Inia geoffrensis, Sotalia fluviatilis y Sotalia guianensis. Donde se obtuvo como resultado que las muestras de los mercados de Belém y Manaus probablemente pertenecían a Sotalia spp, mientras que en Porto Velho solo se identificio una muestra de Sotalia spp, otros cuatro eran muestra de cerdo y una de oveja; especificando la ausencia de Inia en la muestras (Gravena et al, 2008). Para el 2015 se publica el artículo When you get what you haven’t paid for: Molecular identification of “Douradinha” fish fillets can help end the illegal use of river dolphins as bait in Brazil donde el principal objetivo era identificar la especie procedente de 62 filetes de “dourdinha” (un pez) y otros peces con nombres dudosos de los mercados de Manaus. Esto debido a que la investigación genética forense de la pesca y la vida silvestre, aporta dando sustento científico para los planes de control de la explotación de este caso delfines y caimanes de rio. Lo que sucede en este caso es que se ven evidenciados etiquetados incorrectos y fraudulentos de los filetes que se venden, debido a que es un delito contra los consumidores la venta de Calophysus macropterus que es pescado con carnada de delfines y caimanes de río ( ley brasileña : artículo 66 de la Ley Federal N ° 8.078 / 90). Los resultados fueron que un 60% de los filetes etiquetados con otros nombres eran C. macropterus y para el contenido del estómago se ve la presencia Inia geoffrensis. ADN Ambiental El ADN ambiental (sus siglas en ingles eDNA) es una técnica que analiza el material genético liberado por individuos que han transitado, o habitan, en el medio muestreado con el objetivo de identificar las especies a las que pertenece dicho material. Esta técnica tiene como ventajas el ser un muestreo no invasivo y permite analizar varios taxones simultáneamente de una 23 misma muestra (Huerta, 2020). Además, el ADN ambiental es una herramienta que se pude aplicar en el seguimiento de calidad de aguas fluviales (Fernández, 2019). Hasta el momento no se han encontrado estudios publicados ADN Ambiental en delfines de río, sin embargo, WWFPerú (por sus siglas en ingles World Wildlife Fund For Nature) reportó que, en una expedición realizada en el 2017, se buscó censar delfines de río mediante la técnica de ADN ambiental, siendo esta metodología usada por primera vez en ecosistemas acuáticos que permitirá identificar con exactitud las especies de vertebrados que cohabitan con los bufeos amazónicos. En un estudio no publicado de Martinelli y Caballero sobre la Biodiversidad acuática de vertebrados en la Amazonia y Orinoquia Colombiana por medio de ADN ambiental, encontraron datos de secuencias de alta calidad de vertebrados acuáticos de 30 filtros usados. Con un total de 728 Unidades Taxonomicas Operativas, donde se hicieron analisis de diversidad tanto beta como alfa. Se compararon entre las diferentes localidades. Dentro de estos resultados de ADN ambiental reportaron especies riesgo como la nutria gigante y Inia geoffrensis, entre otros. Este estudio demuestra lo eficaz que es la implementación de estudios con ADN ambiental, ya que dentro de los resultados que se dieron se podían comprobar con reportes de otros métodos tradicionales exhaustivos (Matinelli y Caballero, 2021). CONCLUSIONES Se encontró que los delfines de río son importantes en los ecosistemas acuáticos, convirtiéndose en organismos de interés para la conservación y los estudios planteados están dirigidas al área de genética de poblaciones. Es decir, que el tipo de estudios que más se emplean en genética de la conservación aplicada a los delfines de río en Suramérica es la genética de poblaciones con la metodología de ADNmt, seguidos por estudios de MHC en ambos géneros y genética forense. 24 Al obtener una categoría muy grande como lo fue genética de poblaciones es necesario desglosarla. Donde se puede evidenciar que hay más estudios enfocados en el género de Inia que en el género Sotalia, adicional a que se ven más estudios en el río Amazonas que en el río Orinoco. Adicionalmente hablare sobre un área que se hizo evidente e importante: la biogeografía ya que esta estaba ligada a los estudios, ayudo a replantear hipótesis y confirma/rechazar nuevos especímenes o su evolución. Esto se ve ejemplificado en diferentes estudios como: en el estudio de Evolution of river dolphins del 2001 donde la evolución que se creía inicialmente desafiaba la biogeografía, o en el 2014 con el estudio Looking to the past and the future: were the Madeira River rapids a geographical barrier to the boto (Cetacea: Iniidae)? de barreras geográficas, en la aparición de un nuevo espécimen del género Inia en el estudio A new species of river dolphin from Brazil or: how little do we know our biodiversity también en el 2014 y en Genetic identity of Sotalia dolphins from the Orinoco River donde la ausencia de este género en paso del Amazonas al Orinoco generan la duda de si estos son S. fluviatilis teniendo como respuesta que estos delfines del río Orinoco pertenecen a S. guianensis. Esto trae una amplia posibilidad de aplicación de los estudios en los delfines de los genero Inia y Sotalia, como lo serian hacer una actualización de los estudios de MHC, el aplicar estrategias para la regulación de la pesca con la herramienta de genética forense, la implementación de la nueva tecnología como lo sería hacer estudios de eDNA y seguir conociendo más sobre la genética de las poblaciones para determinar el estado es estos delfines. Esto ya que se deben implementar que actualmente se encuentran catalogados como especies en riesgo. REFERENCIAS Ahmad, T., Marshall, SE, Mulcahy-Hawes, K., Orchard, T., Crawshaw, J. , Armuzzi, A. , ... Bruce, M. (2002). Genotipado MIC de alta resolución: diseño y aplicación para la investigación de la susceptibilidad a la enfermedad inflamatoria 25 intestinal. Tissue Antigens, 60, 164-179. https://doi.org/10.1034/j.1399- 0039.2002.600207.x. 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