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Tema 35: Inseminación artificial La reproducción en équidos lo más normal es que sea mediante monta natural, aunque cada vez se usa más la inseminación artificial, bien con semen fresco, refrigerado o congelado. De estas 3 las más exitosas son las dos primeras; con el uso de semen congelado existe un importante descenso de la fertilidad además de producirse variaciones muy marcadas entre distintos animales. De hecho a veces un tipo de diluyente muy exitoso en un semental puede ser nefasto para otro. Lo mismo ocurre con la técnica de inseminación y hay que buscar la más apropiada. Además, existe un problema de restricciones raciales: existen razas en que potros nacidos por inseminación artificial no pueden ser inscritos en el libro de la raza. Los criterios de inseminación varían de una raza a otra; en algunas sólo se permite la inseminación con semen fresco, en otras con fresco y congelado, … VENTAJAS DE LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Acelerar la mejora genética : Podemos conseguir muchas dosis de un semental muy bueno y repartirlas por distintos lugares del mundo. Examinación rutinaria del semen : Aunque tan sólo se analice la motilidad y el porcentaje de espermatozoides vivos y muertos, se logra así un mayor control de calidad y se pueden detectar problemas. Mejora el potencial reproductivo de los animales subfértiles : En el procesado se realiza una centrifugación que separa el eyaculado en 2 fases: en el sobrenadante aparecen los espermatozoides débiles y de peor calidad, mientras que en el fondo se seleccionan los espermatozoides de mayor calidad. Con esto se consigue Obstetricia495 seleccionar la mejor fracción del eyaculado de un animal subfértil para aprovechar mejor su potencial. Cubrición de yeguas con problemas . Yeguas con anticuerpos frente al semen : Se trata de hembras que se cubren de forma repetida con el mismo macho. Cuando usamos inseminación artificial la cantidad de espermatozoides es mucho menor y el plasma seminal se cambia por un diluyente que provocará menos reacciones. Endometritis postcoital : Se produce después de la monta o de la inseminación artificial. Es una endometritis casi “fisiológica”. Una yegua normal en pocos días se recupera eliminando esa contaminación para que se mantenga la gestación. Otras hembras no se recuperan y pierden el embrión, por lo que existe un problema de infertilidad. El diluyente del semen en inseminación artificial lleva antibióticos por lo que estimula que la hembra recupere su actividad tras la inseminación. Transporte del semen: Nos permite recogerlo, envasarlo y transportarlo a lugares alejados. Conservación del semen . Aumento del número de hembras cubiertas por un semental . Al diluir el semen se incrementa el número de dosis. Conservación de razas . Obstetricia496 Tiene el mismo objetivo que la transferencia de embriones. El semen de determinadas razas puede mantenerse congelado e ir cubriendo a las pocas hembras que quedan de esa raza. Permite la inseminación a tiempo fijo . Cubrición de animales aislados . Control de enfermedades . Se trata sobre todo del control de ETS (enfermedades de transmisión sexual) que no se transmiten por el semen sino por el contacto macho-hembra, que evidentemente no existe en la inseminación artificial. Con la inseminación artificial conseguiremos eliminar enfermedades bacterianas porque añadimos antibióticos al medio, pero no enfermedades víricas. Reducción del riesgo de lesiones . Sobre todo es beneficioso para el semental, porque existen hembras cuyo comportamiento de celo puede ser agresivo. Uso de sementales lesionados . Mayor control de la hembra . Esto es porque tenemos que aproximarnos al momento de la ovulación explorando el ovario y haciendo un seguimiento de los folículos. Así pueden detectarse tumores y otras alteraciones. Extensión de la estación reproductiva . Con la monta natural, si el macho tiene muchas hembras para cubrir en un tiempo determinado, puede ocurrir que no sea capaz de cubrirlas a todas o se centre sólo Obstetricia497 en algunas. Sin embargo, si recogemos semen del macho cuando las hembras están en transición, estaremos almacenando semen para después cubrirlas a todas. INCONVENIENTES DE LA INSEMINACIÓN ARTIFICIAL Reducción de la variabilidad genética . Dilemas éticos . Titularidad del semen . Cuando se vende un animal, el antiguo propietario puede seguir vendiendo dosis de ese semental a pesar de no ser el dueño actual. Existen leyes en algunos países que especifican que además del semental también se vende la titularidad de las dosis seminales de éste. Fraude . Realmente, no sabemos quién cubre a la hembra. Variaciones en la calidad del semen . Transferencia de enfermedades . Alteraciones congénitas (cromosómicas) que se transmitirán salvo que antes de marcar a un animal como reproductor se le haga un cariotipo. Reducción de la fertilidad . A medida que aumenta el tiempo de conservación del semen, disminuye la fertilidad. Obstetricia498 Necesidad de mayores conocimientos . La técnica necesita personal cualificado. Riesgo para el personal en la recogida del semen . RECOGIDA DEL SEMEN EN EL GARAÑÓN PREPARACIÓN DEL MACHO Se necesita una hembra en celo o estrogenizada. Aprovechando la erección, se realiza un lavado del pene con agua tibia, ya que con el tiempo en él se van acumulando restos de semen y orina, lo que se conoce con el nombre de “smerma”. PREPARACIÓN DE LA VAGINA ARTIFICIAL La recogida con vagina artificial en équidos da buen resultado pues se obtiene un eyaculado muy similar al fisiológico tanto en cantidad como en calidad, y además los caballos responden muy bien a ella. No responden bien sin embargo ante la electroeyaculación. Obstetricia499 Se usan poco los maniquís porque los rechazan, por lo que se les estimula con una hembra. La vagina presenta 2 posibilidades de uso: Abierta : se les quita el recipiente y el protector que lo cubre; queda una especie de embudo que conecta con otro embudo de recogida. Cerrada : estructura toda cerrada, dentro existe un tubo donde se recoge el semen. El eyaculado de los équidos es polifásico, con fracciones pobres en espermatozoides y fracciones ricas en espermatozoides; con la vagina abierta podemos seleccionar la fracción que nos interesa. La temperatura de preparación de la vagina artificial debe ser de unos 50 ºC (se prepara alta para que vaya enfriando). La temperatura durante la recogida deberá ser de unos 40-42 ºC. A veces interesa mantenerla elevada (50 ºC) para estimular al macho si se encuentra fuera de estación reproductiva. 1. MODELO “MISSOURI” Recipiente. Protector del recipiente. Parte rígida con asa. Parte de dentro muy similar a la del toro, con una cámara que ya viene unida y con una válvula que abre y deja salir agua cuando existe exceso de presión. Obstetricia500 2. MODELO “CAMBRIDGE” Cuerpo rígido y válvula. Camisa flexible en el interior. Por dentro de la camisa existe un plástico transparente que se sujeta con bridas metálicas y acaba en un embudo. 3. MODELO “NISHIKAWA” Tiene un “tope” al final con el que contacta el pene estimulando la eyaculación. 4. MODELO “HANNOVER” Muy similar al Cambridge. También posee una bolsa de plástico que acaba en un embudo. Es más simple de usar porque en lugar de bridas metálicas llevan gomas que sujetan el plástico. Obstetricia501 RECOGIDA CON POTRO 1. MANIQUÍ . Es un potro como los de gimnasia. También se usa una hembra, se acerca el macho al potro, se excita por la presencia de la hembra y monta sobre el potro. El encargado acerca el pene a la vagina y recoge el semen. La persona que sujeta al caballo debe situarse en el lado contrario a donde está la personaque recoge el semen, porque si el caballo quiere bajarse del potro y ambos están por el mismo lado, lo hará por el lado del que lo agarra y por tanto caerá sobre el que recoge el semen. Otro método es tener el potro delante de un muro y detrás del muro una hembra; así cuando el caballo monta el potro ve a la hembra de frente. 2. USO DE YEGUAS . Obstetricia502 a. Preparación de las hembras i. Lavar bien el periné para evitar contaminación del eyaculado. ii. Vendar la cola de la hembra para que los pelos no produzcan cortes en el pene del macho. iii. Sujetar las extremidades posteriores fijándolas con cuerdas pro ejemplo al cuello de la hembra. iv. Proteger el cuello de la hembra porque el macho en ocasiones al montar la muerde. Generalmente se usa cuero. La eyaculación en équidos es más lenta que en rumiantes: dura unos 60 segundos porque es polifásica en cerdos y perros. En el minuto que dura se puede apreciar que existen unas 8 o 9 contracciones del pene cuando cesan las contracciones, cesa la eyaculación y el macho desciende de la hembra o el potro: se retira la vagina y se coloca ésta verticalmente para que vaya cayendo lo recogido. FRACCIONES DEL EYACULADO PREESPERMÁTICA GLÁNDULAS URETRALES ACUOSA (POCOS ESPERMATOZOIDES) ClNa, ÁC. CÍTRICO Y GPCC* ESPERMÁTICA EPIDÍDIMO Y AMPOLLA LECHOSA NO VISCOSA ESPERMATOZOIDES ERGOTIONEÍNA, Obstetricia503 GPC* POSTESPERMÁTICA VESÍCULAS SEMINALES MUY VISCOSA POCOS ESPERMATOZOIDES ÁCIDO CÍTRICO GOTEO PENEANO COLA DEL EPIDÍDIMO ACUOSA (NO CONTIENE ESPERMATOZOIDES) SIN ESPERMATOZOIDES GPC = DIESTERASA DE GLICERILFOSFORILCOLINA La fracción postespermática tiene pocos espermatozoides, y además se cree que la secreción de las vesículas seminales puede llegar a tener un efecto tóxico sobre los espermatozoides si contacta mucho tiempo con ellos. Para seleccionar el semen se hace un filtrado; existen dos posibilidades: Si se usa una vagina abierta, al final de la fracción espermática retiramos la vagina para que se pierda el resto del eyaculado. Si se usa vagina cerrada, se recoge el semen se filtra por ejemplo con una gasa estéril: la fracción postespermática queda retenida en la gasa. Existen también filtros que se adaptan al recipiente de la vagina artificial, de modo que se hace el filtrado al mismo tiempo que se recoge. - 20 – 100 ml. libres de gel. Caballos (mucho volumen, - 50 x 106 – 200 x 106 esperm./ml. poca concentración) VALORACIÓN DEL SEMEN A) MACROSCÓPICA Obstetricia504 Se mira el volumen (sin gel) olor (si huele a orina, para ver si están mezclados), color, densidad, etc. B) MICROSCÓPICA Motilidad individual: en équidos no existe motilidad masal porque existen muy pocos espermatozoides en todo el volumen de eyaculado. Concentración. % de espermatozoides vivos y muertos. % de formas anormales. SEMEN FRESCO A pesar de que lo vamos a usar directamente, requiere una preparación, ya que lo ideal es aumentar el número de dosis, por lo que habrá que diluirlo. Mantener a 37 ºC. Recogida. Valoración. Dilución, con leche desnatada (“diluyente 1”): 1:2 (duplicando el volumen) o 1:3 (triplicando el volumen). Inseminación: o Máximo 48 horas antes de la ovulación: el tiempo de diferencia entre la inseminación y la ovulación puede ser más largo cuanto Obstetricia505 menor sea el tiempo que lleve conservado el semen. Por ello, con semen fresco podemos inseminar incluso 48 horas antes de que ovule. o Dosis de 15-20 ml: importa poco la concentración, porque la dosis es alta y está poco diluida. Esto nos permite no usar en exceso los sementales, porque si se hacen muchas montas seguidas, las últimas hembras que sean cubiertas sólo llevarán una dosis de plasma seminal en el eyaculado. SEMEN REFRIGERADO Recogida. Valoración. Dilución: o Leche desnatada (“diluyente 1”) y yema de huevo. Refrigeración a 4 ºC, temperatura de una nevera convencional. Inseminación: o Máximo 24 horas antes de la ovulación. El semen refrigerado aguanta unas 24-48 horas. o Ligero descenso de la fertilidad, por ello hay que aproximarse más a la ovulación. SEMEN CONGELADO Recogida: La congelación es ilimitada siempre y cuando tengamos la precaución de llevar suficiente nitrógeno líquido en el tanque. Valoración: Obstetricia506 Es necesaria para conocer la concentración de espermatozoides para luego hacer las dosis. Primera dilución (sin crioprotector): Diluir el plasma seminal y eliminar la secreción de las vesículas seminales porque se cree que es incluso tóxica, y el contacto del semen con esta secreción durante la congelación aún es mayor. En el semen fresco y congelado no importa tanto el efecto tóxico porque las dosis que se usan son mucho mayores. En la congelación, la fertilidad ya de por sí se reduce mucho, y además se utilizan concentraciones mucho más pequeñas. Se deja que transcurran entre 10 minutos y una hora y se pasa a la siguiente fase del procesado. Centrifugación: o Eliminación del plasma seminal. o 500-2000 g. durante 5-15 minutos. o Pérdida del 25 % de espermatozoides. Los mejores tubos son los de 50; los tubos más pequeños (por ejemplo de 10) ocasionarán más pérdidas. Queda un gel de espermatozoides en el fondo del tubo; el sobrenadante no es transparente porque existen espermatozoides que se pierden, y que suelen ser los espermatozoides anómalos (a no ser que usemos velocidades de centrifugación muy bajas, entonces también aparecen espermatozoides buenos). o Eliminación del sobrenadante quedando el pellet. El diluyente usado para la primera centrifugación se tira todo, por ello no hace falta que lleve crioprotector no que sea un medio especial. Segunda dilución (con crioprotector): Obstetricia507 o Resuspender el pellet con el diluyente de congelación, pues sino la concentración de espermatozoides en el pellet es muy alta y no tienen medio para sobrevivir. o Llevar a la concentración deseada, unos 200 millones/ml. o Diluyentes empleados : existen multitud de ellos y casi todos tienen una preparación para fresco, refrigerado y congelado. Palmer (1984). Martin y Coll (1979). Como ya se ha dicho, el diluyente de centrifugación nunca lleva glicerol; es un diluyente simple porque se desecha. El diluyente de congelación siempre lleva crioprotector (glicerol). Además, lleva: Azúcares (lactosa). Tampones. Antibióticos. Protectores de membrana (leche desnatada y yema de huevo). EquexSTM. Equilibrado: Media hora - 1 hora a 4 ºC. Se introduce el semen en una cámara a 4 ºC; una variante es realizar la segunda centrifugación en una cámara a 4 ºC. Sea cual sea la forma de hacerlo, siempre tendrá que ser a 4 ºC. Envasado: 0.5, 4, 15 – 20 ml. sobre 100 millones/ml. Puede hacerse con una máquina o simplemente rellenando el tubo. Obstetricia508 Congelación: o Vapores de nitrógeno : se ponen las pajuelas sobre un nivel de nitrógeno un tiempo determinado. Este tiempo varía en función del envase que utilicemos. o Congelador programable : se programa desde la temperatura de inicio hasta la del final, y a que velocidad queremos que se congele la pajuela. Lo normal es: 4 ºC -140 ºC 30 ºC/minuto Se trata de una congelación rápida. El descenso de temperatura en el congelador programable es más controlado que en el método de los vapores de nitrógeno. Descongelación: Cuanto más rápida sea la congelación, más rápida tendrá que ser la descongelación. El método habitual es la inmersión en agua, que puede estar a distintas temperaturas: o 37 ºC (unos minutos). o 50 ºC. o 75 ºC (dejar sólo unos segundos o se quemará). Obstetricia509 Inseminación: Dosis de 400 millones de espermatozoides vivos. Si una pajuela de 0.5 tiene 100 millones de espermatozoides, para llegar a 400x106 espermatozoidesse necesitarán 4 pajuelas. Además, si los espermatozoides de esa pajuela tienen un 50% de movilidad, se necesitarán 8 pajuelas. De ahí que se comercialicen envases de 4 y más. o Máximo 24 horas de la ovulación. Cuanto más nos acerquemos a la ovulación mejor, si puede ser 12 horas mejor. o Aparato genital de la yegua: Cuerpo del útero. Ovario. Oviducto. Vagina. Vulva. Cuernos uterinos. Cuello del útero: en la vaca existen pliegues perpendiculares al sentido del cuello y el catéter Obstetricia510 “tropieza” con ellos al inseminar. En la yegua estos pliegues del cuello son longitudinales (siguen el sentido del cuello), por lo que al introducir el catéter no tropieza. Vejiga orina. Recto. Ano. o La inseminación en la yegua es vaginal y manual. Localizamos el cuello e introducimos el catéter ayudados por el dedo, empujando. Introducimos el semen vaciando la jeringuilla. La sacamos, cargamos aire y volveremos a introducir, todo esto para que no quede semen en el catéter, que es muy largo. Obstetricia511 MANO El problema de la inseminación en el control de la ovulación, que suele ocurrir 24-48 horas antes del final del celo, pero determinar cuando ocurre el celo es difícil. Por ello es necesario controlar el crecimiento de los folículos durante el estro de forma exhaustiva. Este control se realiza cada 1 o 2 días. Cuando vemos que un folículo en el estro puede alcanzar los 35 mm. de diámetro inseminamos porque es muy posible que ovule. Lo ideal sería que pocas horas después de inseminar la hembra ovulase; si 2 días después de inseminar no ha ovulado (se ve en la exploración), volvemos a inseminar sin ningún problema. Compensa empezar a inseminar con 30 mm. porque si esperamos y ovula, y nuestra exploración es cada 2 días, no sabremos si nos hemos pasado mucho o poco. También puede sufrir el problema de que se prolonguen mucho tiempo las inseminaciones. Para que esto no ocurra se puede usar hCG: Día (-2); hCG + IA La hCG induce la ovulación en 48 horas. Día (-1); IA 24 horas antes de la ovulación. Día 0; constatar la ovulación. Si la ovulación se produce un poco después; todavía nos queda la IA del día (-1) que tendrá efecto un día más. Otro método es: Día (-3): IA. Día (-2): hCG. Día (-1): IA. Día 0: constatar ovulación. Para usar cualquiera de estos dos métodos hay que asegurarse previamente de que existen folículos preovulatorios. Obstetricia512 Fertilidad en función del momento de la inseminación < - 96 - 72 a 96 - 48 a 72 - 24 a 48 - 0 a 24 + 0 a 6 + 6 a 12 +12 a 18 + 8 a 24 Fresco 56 % 33 % 60 % 65 % 89 % 79 % 50 % 33 % 25 % Congelado 28 % 31 % Refrigerado 12 % 41 % Con semen fresco los mejores resultados se obtienen 24 horas antes de la ovulación, y no se consiguen malos resultados 38 horas antes e incluso 72 horas antes. Después de la ovulación la asincronía que se permite es menor porque disminuye mucho la fertilidad. Con semen congelado y refrigerado, los únicos resultados válidos son los que están 24 horas antes de la ovulación. Los otros datos son despreciables y no aparecen. TASAS DE GESTACIÓN Método de conservación Fertilidad por ciclo Monta natural 50 % IA inmediata 50 % IA refrigerado in situ 0 – 8 horas 45 % IA refrigerado a distancia 0 – 8 horas 40 % IA congelado 35 % IA refrigerado 24 horas 20 – 30 % Obstetricia513 TRANSFERENCIA DE EMBRIONES APLICACIONES Obtención de potros de yeguas en entrenamiento (porque no pueden quedar gestantes). Obtención de un número mayor de potros por yegua y año. Obtención de potros de yeguas subfértiles siempre que esa subfertilidad sea de origen uterino y no problema de origen embrionario. No vale de nada usar la transferencia de embriones en yeguas viejas porque en éstas los problemas de fertilidad son de origen uterino. Obtención de potros de yeguas con problemas de salud no reproductivos. Investigación. La transferencia de embriones en yeguas tiene una gran limitación: en équidos no se puede inducir una superovulación como en rumiantes. No se sabe exactamente porqué ni la FSH ni PMSG tienen el mismo efecto que en rumiantes. Con estos tratamientos se reduce mucho el número de potros por yegua y año, mucho más que en rumiantes. A pesar de estas limitaciones sigue en uso porque si tenemos 10 celos en la estación reproductiva y podemos convertirlos en 10 partos es rentable, se aprovechan. A finales de los 80 se descubren métodos de conservación de embriones y se difunde definitivamente la transferencia de embriones en équidos, pues hasta entonces se transfieren en fresco. MANEJO DE LA YEGUA DONANTES Nos interesa que sus ovarios sean funcionales y ovocitos normales. Obstetricia514 El útero será normal (si es posible) aunque también se extraen embriones de hembras con úteros no normales. Evaluación reproductiva: o Estudio del comportamiento reproductivo. o Palpación rectal. o Ecografía. Inducción de la ovulación: hCG, deslorelina (análogo sintético de la GnRH). RECEPTORAS En ellas si nos interesa que su útero sea perfecto. Evaluación reproductiva: o Ciclos estrales normales. o Ausencia de anormalidades ováricas y uterinas. Edad entre 3 y 10 años. Prostaglandina sola o con progestágenos para sincronizarlas con las donantes. También puede usarse hCG para sincronizar más las ovulaciones. Asincronía permitida; (+1) a (-3) días sin que disminuyan las tasas de gestación (la hembra receptora puede ovular un día antes o 3 días después de la donante). RECOGIDA DE EMBRIONES Se realiza mediante lavados del útero; no se recogen embriones que se encuentran en el oviducto. Entrada en útero: 5 - 6 días postovulación. Obstetricia515 Recogida en día 7 u 8 postovualción. Se recogen por lo tanto: o Mórulas compactas. o Blastocistos jóvenes. Lavado uterino transcervical; se introduce un catéter de unos 80 cm. de longitud y unos 8 mm. de diámetro (más ancho que el de la vaca) que también posee un balón que evita el reflujo. Se sujeta la hembra en el potro, se limpia y se introduce el catéter a través del cuello empujando hasta atravesarlo. Hinchamos el balón hasta que éste choque con la salida del cuello; aquí el cateter se coloca en el cuerpo del útero (no primero en Obstetricia516 Balón Cuello uterino un cuerno y luego en el otro). Se lavan los 2 cuernos al mismo tiempo. Por ello también se usa más líquido de lavado que en la vaca. Se realizan 3 o 4 lavados utilizando 1 o 2 litros por lavado. En la yegua es también más fácil recuperar el líquido porque los cuernos están hacia arriba. Entre lavado y lavado se aplica un masaje para facilitar la salida de los embriones. Medio de lavado: o PBS. o 1% de suero fetal bovino. o Penicilina (100 UI/ml.). o Estreptomicina (100 g./ml.). Filtrado (igual que en rumiantes); se hace que pase el líquido y que se retenga un poco de líquido más los embriones (en el filtro quedarán como mucho 50 ml. de líquido). Obstetricia517 Búsqueda con una lupa en palcas de Petri. Una vez que los encontramos se cambian de medio. Clasificación según la calidad de los blastómeros, cuantos más defectos, peor calidad. Envasado en una pajuela (con dos burbujas de aire a ambos lados). El semen puede mantenerse en fresco (unas horas), congelarlo o refrigerarlo: se refrigera durante 24 horas en un medio Ham’s F10 (introducido en un tubo pequeño). Luego el tubo pequeño se introduce en un tubo más grande, de mayor volumen., Así puede mantenerse unas 24 horas en un contenedor “EQUITAINER”, que es una especie de nevera portátil específicamente usada para équidos; aquí el semen se mantiene a una temperatura de 5 ºC. Obstetricia518 TUBOS EQUITAINER TRANSFERENCIA QUIRÚRGICA 70 % - 75 % gestaciones 8 días después. Hembras en gestación. Flanco (laparotomía). Anestesia: tranquilización y anestesia local. Incisión del útero. Introducción del embrión con una pipeta y un poco de líquido. Cierre de la laparotomía. Obstetricia519 NO QUIRÚRGICA 70 % - 75 % gestaciones 8 días después (por ello no se usa el método quirúrgico). Se usan camisas sanitarias, catéteres de plástico, etc. Cuerpo o cuernos. La técnica es casi igual que inseminar y podremos depositar los embriones en el cuerpo o en los cuernos. Si se depositan en los cuernos será necesario guiarse introduciendo el otro brazo por el recto. Obstetricia520 TASAS DE RECOGIDA Dependen de: Día de recogida (7 – 8 días); si se hace la recogida antes o después de este tiempo la técnica no será tan eficaz. Estado del aparato reproductor femenino. Calidad del semen. Puede ocurrir que si falla alguno de los puntos anteriores no exista fencundación y sólo recojamos ovocitos. TASAS DE GESTACIÓN Dependen de: Hembra receptora: estado del aparato genital. Sincronía entre la ovulación de la donante y al receptora: entre (+1) y (-3). Antiguamente el método era un factor que hacia variar las tasas, pero hoy en día no existen diferencias entre los distintos métodos. Obstetricia521
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