GUIA N 10 Examen Microscopico del semen

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 Fisiopatología de la Reproducción y Obstetricia
 Facultad de Ciencias Veterinarias – UNNE Guia Nº10 
GUIA N° 10
EXAMEN MICROSCOPICO DEL SEMEN
INTRODUCCION:
 Un factor esencial para el éxito de la IA., es la calidad del semen. Esto se inicia en 1780, cuando
en Italia el científico Lázaro SPALLANZARI, realiza por primera vez inseminación artificial en una
perra, la que concibió tres cachorros. A partir de ese momento y hasta la actualidad los métodos y
mecanismos para evaluar el semen han mejorado sensiblemente hasta alcanzar niveles de alta
predicción de la fertilidad por medio de diversos exámenes.
 La calidad del semen va a depender de varios factores como ser: genéticos, neurohormonales y
ambientales. Los métodos que se utilizan en la actualidad permiten evaluar las características de
motilidad, metabolismo, morfología de los espermatozoides (epz) y la composición bioquímica del
mismo.
 El y tipo y calidad de semen de un toro, se puede valorar con exámenes seriados en un mínimo
de tres con un lapso de 15 a 20 días entre cada uno de ellos, como para poder descartar o aprobar un
reproductor.
 El examen se debe realizar rápidamente una vez extraído el semen, en condiciones de medio
ambiente constante, a una temperatura de 36° C aproximadamente, pues cualquier variación por
mínima, que sea puede provocar una disminución en la capacidad fecundante del semen.
 Algunos factores a tener en cuenta para el adecuado manejo del semen son:
1. La vagina artificial o el recipiente empleado para recoger el semen por electroeyaculación
debe estar limpio y libre de contaminantes que pueden dañar a los espermatozoides, tales
como, alcohol, excesiva vaselina, polvo o talco en las camisas nuevas y antisépticos o
sustancias irritantes.
2. En el momento de la recolección hay que evitar que la vagina se contamine con excesiva
suciedad o desechos, incluidos esmegma prepucial y secreciones, el agua y la orina dañan a
los espermatozoides por modificación del ph.
3. El sobreenfriamiento y el calentamiento demasiado rápido dañan a los espermatozoides.
4. La excesiva agitación y movimiento del semen afecta a los espermatozoides.
5. Debe evitarse la exposición directa a los rayos solares.
 En condiciones de campo, las pruebas que puedan realizarse son pocas, pero con buen
adiestramiento, éstas pueden llegar a ser en algunos casos, válidas, que junto a otros datos o la historia
reproductiva del toro nos permitirá tener una historia mas completa sobre la fertilidad del mismo.
 Considerar que luego de un reposo sexual prolongado, la calidad del semen puede disminuir
en términos de motilidad y un aumento en el número de epz muertos. 
MOTILIDAD:
 La muestra de semen recién recogida, inmediatamente se valora la motilidad del mismo, a los
efectos de evitar este pierda algún grado de movimiento por la demora en observarlo. La motilidad se
divide para su observación, en Motilidad propiamente dicha (movimiento en masa de los epz) y en
Vigor (carácter y tipo de movimiento individual), con el fin de establecer el porcentaje de epz mótiles,
lo que es de fundamental importancia para la dilución final (en caso de conservación) y la fertilidad.
MOTILIDAD PROPIAMENTE DICHA:
 El movimiento en masa de los epz en el eyaculado no diluido se examina en Gota Gruesa o
Colgante sobre platina térmica con un aumento que no debe pasar los 100 x. El movimiento esta
caracterizado por la formación de los remolinos (olas espermáticas) que se forman y desaparecen
rápidamente. Según la intensidad del movimiento de los remolinos se valoran tanto la densidad como el
porcentaje de epz vivos y el grado de su actividad. Cuanto mas grande es la intensidad de la formación
de los remolinos tanto más grande es la motilidad y el número de epz móviles.
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 Todas las observaciones de motilidad deben hacerse a una temperatura determinada, con
preferencia similar a la del organismo, ya que la motilidad varia en relación inversa a la T °, entre los 
5° C aproximadamente, a la que las células son esencialmente inmóviles, hasta aproximadamente los
50 º C a la que los epz mueren rápidamente.
Clasificación de la Motilidad: la misma se evalúa en porcentaje (%), variando desde 0 al 100. 
MOTILIDAD INDIVIDUAL O VIGOR:
 La evaluación del vigor en el microscopio necesita como la anterior cierto grado de experiencia
y se hace con el fin de diferenciar los distintos tipos de movimientos de los epz y especialmente para
poder establecer el grado de movimiento progresivo del epz. La comprobación del movimiento
individual es posible realizarla con semen diluido, para ello utilizamos solución fisiológica o citrato
diluido al 2,9 % en una dilución aproximada de 1:20.en el campo del microscopio se aprecia el número
de epz con movimiento rectilíneo. Este representa la característica típica vital de los epz y tiene una
relación muy estrecha con la fertilidad .Sin embargo, la motilidad progresiva no significa lo mismo que
fertilidad, porque esta desaparece mucho antes que la motilidad rectilínea. Todos los otros tipos de
movimiento confirman una mala calidad del semen y los epz afectados con estos movimientos
prácticamente han perdido el poder de fecundar. 
En el semen extraído y mantenido a la temperatura de 37 ° C pueden encontrarse los siguientes
grados de vigor: 
5 - Movimiento progresivo rectilíneo muy rápido.
4 – Movimiento progresivo rectilíneo rápido.
3 –Movimiento progresivo lento.
2 –Movimiento oscilante y/o circular.
1 –Movimiento retroactivo.
0 –Sin movimiento.
Para poder utilizar el semen en IA., el eyaculado debe tener por lo menos el 65%-70% de motilidad
o más y un vigor mínimo de 3, los niveles mas bajos influyen negativamente en la fertilidad y no se
recomienda utilizarlo.
Es importante destacar el concepto de cada item y diferenciar los mismos: tomemos el ejemplo, de
dos muestras de semen con un 70 % de motilidad, es decir que son iguales para esta característica,
pero con un vigor de 4 en una y 2 en la otra, la primera puede ser utilizada, mientras que la segunda
debe ser descartada. 
Durante el examen microscópico del semen hay que tener en cuenta también la aglutinación de los
epz que se presentan en algunos eyaculados y puede disminuir la posibilidad de fecundación del
semen. La aglutinación se presenta en tres grados:
1° GRADO: se representa por la aglutinación de 2-8 epz que se acercan con las cabezas hacia el
centro forman una estrella.
2° GRADO: se caracteriza por la acumulación de un número más grande de epz en forma de
glóbulos irregulares. El movimiento se encuentra disminuido.
3° GRADO: concentra grandes agrupaciones de epz aglutinados desapareciendo prácticamente
todo el movimiento progresivo.
La teoría de la aglutinación de los epz es muy variable y hace falta tener en cuenta, tanto los
cambios del potencial eléctrico como los factores nutritivos, infecciosos o inmunológicos.
 MORFOLOGIA ESPERMATICA
El examen de la morfología de los epz tiene valor definido en el estudio de la gravedad de la
degeneración testicular y de los defectos congénitos o hereditarios de los mismos. El epz puede realizar
y cumplir sus funciones biológicas solo cuando está morfológicamente bien constituido, es decir,
cuando posee las estructuras intactas en sus diversas partes.
 La posibilidad de fertilización del óvulo y la formación del nuevo individuo sano, dependen
básicamente de la composición y constitución de la cabeza, que conduce la información genética y el
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sistema acrosomal, sin embargo la cabeza puede realizar esa tarea solamente en dependencia de la
función y la constitución del sistema locomotor, como son el cuello, parte intermedia y cola.
 Las alteraciones del desarrollo de los epz que acompaña por ejemplo a la hipoplasia testicular, o
varios grados de degeneración, procesos fibróticos, orquitis y otras anomalías del parénquima testicular
se forman en cualquier fase del desarrollo espermiogénico, siendo muy sensibles los espermatocitos.
 Estas anormalidades testiculares primarias, es necesario diferenciarlas de las primarias, las que se
producen solo después de la formación del epz o como resultado de la manipulación del semen durante
su procesamiento.
Las anormalidades morfológicas primarias o testiculares están relacionadas con los cambios cuali o
cuantitativos del material nuclear y con los órganos de origen citoplasmáticos, expresan el grado y
amplitud del proceso histológico que reduce tanto en calidad como en cantidad el potencial
espermiogenético del testículo.
 Las anormalidades secundarias se encuentran sobre todo en los casos de alteraciones bioquímicas
del plasma seminal, pero más frecuentemente como consecuencia de procesos inflamatorios del
testículo y de las glándulas sexuales accesorias y también como resultado de algunos factores físicos
como lo son, el aumento y la disminución de la temperatura testicular.
 En la actualidad esta clasificación fue suplantada por otra, en la cual los defectos se clasifican en
mayores o menores, según que los mismos sean o no fagocitados en su pasaje a través del epidídimo.
(Blom, 1973).
 Al evaluar morfológicamente un eyaculado es necesario tener en cuenta que este contiene un
número extraordinario de epz y que también entre estos, algunos son anormales y cuando no pasa del 5
al 10 %, se puede considerar como desperdicio fisiológico; sin embargo, cuando los defectos superan el
15%, debemos prestar mucha atención para tratar de determinar que esta ocurriendo. Además de los
defectos propios de los epz se encuentran en el eyaculado en forma aisladas células espermiogénicas
(espermatocitos, espermátides), especialmente en los procesos degenerativos avanzados o en algunas
casos de defectos hereditarios (hipoplasia). Los procesos inflamatorios en la esfera genital están
acompañados en el eyaculado por leucocitos y otras células extrañas.
 Desde el punto de vista del diagnóstico correcto, es recomendable tener en cuenta el hecho de que
las alteraciones de los procesos espermiogénicos en forma de defectos comienzan a aparecer en el
eyaculado en forma retrazada, es decir, que no se encuentran hasta después de cierto tiempo de
comenzado el problema (30 a 45 días), lo que se ajusta a la duración de la espermatogénesis, siendo
similar el proceso en cuanto a su recuperación en términos de tiempo.
 El examen morfológico del semen exige cierto proceso y trabajo sistemático, cierta experiencia y
objetividad, como así también un microscopio (común) en buen estado y seleccionados métodos de
tinción. La microscopia electrónica solo esta reservada para centros de investigación en el cual se
necesita personal sumamente capacitado para manejar dicho aparato.
 Blom (1972), clasifico a los defectos en mayores: cualquier anormalidad que haya sido
relacionada con infertilidad o condición patológica, ya sea en el testículo o en el epidídimo, y, llamo
defectos menores: cualquier forma de anormalidad reconocida como de menor importancia.
 La lista completa de los defectos es la siguiente:
 
 DEFECTOS MAYORES
Subdesarrollado Contorno anormal 
Formas dobles Dag defect (fractura P.Int.)
Knobbed sperm (crater acrosoma) Pseudo gota
Decapitado Cabeza pequeña anormal
Pouch formation (vesículas zona ecuatorial) Cabeza suelta anormal
Cabeza piriforme Cola tirabuzón
Estrecho en la base Gota proximal
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 DEFECTO DE PIEZA INTERMEDIA
 DEFECTOS MENORES 
Cabeza estrecha Cabeza pequeña normal 
Cabeza gigante, corta. Cabeza larga 
Cabeza suelta Gota distal
Cola doblada Cola enroscada o con un dobles simple
 Cola con enrollamiento terminal Implantación Abaxial (normal en equino)
Capuchón acrosómico suelto
*Se adjunta en última hoja, anexo defectos del espermatozoide. 
 TECNICA DE BURRI O DE LA TINTA CHINA:
 Es quizás la más sencilla de realizar por el veterinario:
Equipo:
 Tinta china de buena calidad 
 Vidrio reloj de 5 cm. de diámetro
 Portaobjetos
 Pipeta Pasteur, pajuela vacia o ansa
 Técnica: 
1. Colocar tres o cuatro gotas de tinta china.
2. Agregar una gota de semen.
3. Homogeneizar con cuidado.
4. Tomar una gota con pipeta Pasteur, pajuela o ANSA y colocar en el
portaobjeto.
5. Realizar el extendido 
6. Secar al aire o sobre el aire caliente de una llama.
7. Observar con 400x o inmersión 
 Se mezcla suavemente la tinta china con el semen, se coloca una gota de esta mezcla en el
portaobjeto y se la extiende por extensión tirando, y no empujando, con un portaobjeto como se hace
con un frotis sanguíneo .El frotis se seca luego al aire o lentamente sobre el aire caliente de una llama.
Se observa con gran aumento o inmersión sobre un fondo oscuro se pueden observar células claras
(epz). 
TÉCNICA DE WATSON (Giemsa modificado):
 Esta técnica se utiliza no solo para morfología sino que además es útil para el estudio del
capuchón cefálico, segmento ecuatorial y gránulos basales.
Equipo: 
 Solución de Giemsa (GURR)...........................3ml.
 Buffer de fosfato Sorensen................................2ml.
 Agua destilada en cristal ...................................35ml.
 Portaobjetos.
Técnica:
1. Hacer suspensión.
2. Secar al aire o al sol.
3. Teñir con el colorante de Giemsa 1 – 1,5 horas.
4. Lavar con agua destilada. 
 Sobre un fondo levemente violáceo se distingue el acrosoma de azul violeta (la parte trasera de la
cabeza solo se tiñe ligeramente).
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TECNICA DE NOMARSKI:
Esta técnica utiliza un elemento mas sofisticado pero de gran ayuda, que es el microscopio de
contraste de fase, con el cual se puede realizar un perfecto análisis morfológico, según la técnica de
Nomarski, que no requiere colorantes ni fijadores.
Equipo: 
 Solución Salina formolada 40 %.............................1 ml.
 Tubos de hemólisis
 Portaobjetos
 Cubreobjetos
Técnica:
1. Hacer suspensión.
2. Colocar una gota en portaobjeto.
3. Cubrir y sellar.
Se observa en microscopio de contraste defase, 1000 X en aceite de inmersión. 
PORCENTAJE DE VIVOS Y MUERTOS
COLORACION VITAL 
 Se ha determinado que la cabeza de los epz muertos o en fase letal, tienen la propiedad de dejar
pasar los colorantes, gracias a la alteración de la permeabilidad de la membrana cefálica, mientras que
los vivos y activos no permiten el paso de los colorantes, por lo que permanecen sin coloración. Con el
método de Blom, se puede diferenciar específicamente los epz vivos y los muertos, según la eosinofilia
de la cabeza de los muertos que se tiñen de rosado y de los moribundos que se tiñen solo la parte
caudal. Para efectuar la coloración se usa la solución acuosa de eosina al 5% y de nigrosina al 10%,
pudiéndose utilizar también en una solución de citrato de sodio al 3%, siendo el porcentaje de eosina
1% y de nigrosina el 5%.
 
 TÉCNICA DE BLOM (eosina-nigrosina)
Equipo: 
 Eosina B al 1%-5%.
 Nigrosina al 55-10%.
 Vidrio reloj.
 Portaobjetos.
Técnica:
1. Colocar una gota de semen sobre el vidrio reloj o porta (en una esquina).
2. Mezclar suavemente con varilla de vidrio, pipeta o pajuela.
3. Agregar cuatro gotas de nigrosina, volver a mezclar.
4. Tomar una gota de la muestra y llevar a portaobjeto.
5. Realizar el extendido (por arrastre).
6. Secar a la llama o aire, observar con 800-900 x no menos de cien epz.
 Sobre fondo oscuro (nigrosina) se distinguen epz blancos (vivos) que rechazan el colorante y
rosados (muertos) que toman el colorante. Es muy importante que la prueba se realice lo mas rápido
posible (mejor 30 – 45”)
 El tiempo determinado para la coloración es muy importante porque cuando se prolonga se tiñe
un numero mayor de epz muchos de los cuales estaban vivos al inicio, y la prueba entonces pierde su
valor.
 Después de un periodo prolongado de reposo sexual el numero de epz muertos puede aumentar.
Con un colorante de mala calidad o una técnica deficiente se puede alterar mucho el resultado.
CONCENTRACIÓN 
La concentración o densidad de los epz en eyaculados de toros fértiles varia entre 500.000 a
2.000.000 por mm3, con un promedio de 800.000 a 1.000.000. los eyaculados obtenidos con
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electroeyaculador tienen con frecuencia una concentración menor y un volumen mayor que los
recogidos con vagina artificial, debido a un exceso de secreción de las glándulas accesorias.
La concentración del semen expresa el contenido de epz en una unidad de volumen (mm3 o
cm3) y su apreciación tiene gran significancia no solo para la clasificación sino para la posible
dilución .
Los eyaculados de buena calidad deben tener por lo menos, una concentración de 800.000 a
1.000.000. de epz por mm3 o mas ; los eyaculados con concentraciones inferiores a 500.000 por
mm3 tienen generalmente baja fertilidad y deben ser eliminados del uso de la IA, porque en la
mayoría de los casos son productos de anormalidades congénitas de los testículos o consecuencias
de enfermedades adquiridas de varios tipos (inflamación, degeneración , orquitis, fibrosis,).
A los fines prácticos a la concentración se la valora microscópicamente según los métodos
siguientes:
1. Comprobación de la concentración de los epz vivos por determinación microscópica
subjetiva con semen puro o diluido.
2. Comprobación de la concentración del semen por determinación microscópica objetiva en
la cámara cuenta glóbulos (hemocitómetro).
Existen otros métodos de laboratorio para determinar la concentración pero son muy pocos usados
(fotómetro electrónico, fotocelómetro, espermatocrito, etc.).
Para la determinación de la concentración de los epz por medios subjetivos, existen dos métodos:
1. Determinación por medio de la Gota Gruesa o la Gota Colgante:
En la gota gruesa o gota colgante el semen se valora en pequeños aumentos (40-100x),
determinándose la concentración aproximadamente según la densidad y oscuridad de los remolinos
en el centro de la gota (motilidad en masa). En el semen muy denso que contiene mas de 1.000.000 de
epz , los remolinos son intensos , densos y oscuros , uno al lado del otro mientras que en el semen
con una concentración menor (800.000 a 1.000.000) los remolinos son mas distanciados, claros y
finos. El semen con una concentración de alrededor de 500.000 epz, forma remolinos muy pequeños,
muy claros y más finos y están separados unos del otro. En los eyaculados menos concentrados
aparecen solamente indicios de los remolinos, o se encuentran sin ellos. Hay que tener en cuenta
que los remolinos se forman solamente en los eyaculados con epz móviles y que no se pueden
encontrar en los eyaculados de epz inmóviles o sin movimiento.
2. Determinación con Semen Diluido o Puro por Extensión:
Otra alternativa de comprobación subjetiva de la concentración del semen nos la brinda (con
mayor precisión), el examen microscópico del semen puro o diluido en una fina extensión. Este tipo
de prueba necesita indudablemente cierta experiencia para poder registrar rápidamente toda la
situación en el campo del microscopio .
Inmediatamente, después de la extracción se coloca en el portaobjeto una pequeña gota de semen
(0,01ml) y se cubre con un cubreobjeto. Se observa con un aumento de 400x investigando los
espacios entre los epz, anotándose el resultado en el protocolo. 
Se puede emplear la siguiente escala:
D0-campo microscópico libre de epz (azoospermia) o con epz aislados (oligospermia).
D1-entre las cabezas de los epz se encuentran espacios de 1/3 de la longitud del epz. Concentración
menor a 200.000mm3.
D2-la distancia entre las cabezas de los epz alrededor de 1/5 de la longitud de la cabeza.
Concentración de 200.000a 500.000.
D3- la distancia entre los epz es alrededor de la longitud de la cabeza. Concentración 500.000 a
1.000.000. 
D4- Distancias menores que la longitud de la cabeza. Concentración mayor de 1.000.000.
Cuando el semen es diluido 1/50 brinda en el microscopio el cuadro siguiente:
DO-campo microscopico sin epz.
D1-campo con 1-8 epz.
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D2-campo con 9-20 epz.
D3-campo con 21-40 epz.
D4-campo con 41-80 epz.
Otra manera práctica (subjetiva) de determinar la concentración es según el aspecto:
ASPECTO:
Muy concentrado .....................cremoso..........................de 1.000.000 de epz. 
Buena concentración.................lechoso............................700.000 a 1.000.000 “
Regular ‘’ ..................opalescente......................400.000 a 700.000 “
Baja concentración....................acuoso..............................menos de 400.000 “
Para la comprobación objetiva el recuento de epz puede hacerse con un hemocitómetro , en forma
similar a como se procede para efectuar un recuento de eritrocitos , utilizándose para tal fin la cámara
cuenta glóbulos de “BURKER”, “THOMA”, “NEUBAUER”,etc.
Para realizar la prueba se necesita:
Equipo:
 Cámara cuenta glóbulos con su cubre objeto 
 Pipeta de Thoma-Zeiss (para glóbulos rojos) 
 Solución fisiológica formolada al 1% con 1-2 gotas de eosina.
 Papel de filtro. 
Técnica:
1. Homogenizar la muestra de semen extraída recientemente, 
2. Aspirar con la pipeta hasta la marca 0,5.
3. Enrasar con papel de filtro y secar su punta 
4. Aspirar sol. Fisiológica formolada hasta la marca 101, con esto tenemos una dilución 1/200. 
5. Tapar con los dedos pulgar e índice y agitar suavemente para homogenizar lamezcla.
6. Montaje de la cámara (adherir cubre sobre la cámara humedeciendo los Bordes). 
7. Desechar las primeras gotas de la pipeta.
8. Colocar el extremo de la pipeta en el borde del cubre y dejar que la cámara se cargue por
capilaridad.
9. Dejar reposar 5 minutos antes de iniciar el recuento.
10. Contar los epz de 5 de las 16 celdas mayores y multiplicar por el factor 10000. Por ejemplo,
contamos 80 epz, en las 5 celdas mayores, al multiplicar por el factor 10000. Por ejemplo, 80 x
10000= 800000 epz por mm3.
 La solución fisiológica formolada se usa para matar a los epz. siendo la eosina un colorante no
solo de los epz (se tiñen de rosado) sino también del medio dando una coloración rosada pálida que
facilita la observación y el conteo. 
 Se cuentan las cabezas situadas dentro de los cuadrados, desechándose las que están sobre las
líneas sin tener en cuenta las colas. Es recomendable hacer dos conteos y luego obtener el promedio.
 Cámara de Neubauer
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PRUEBAS BIOQUÍMICAS:
 Durante la época actual se ha desarrollado una serie de métodos bioquímicas utilizables para
medir la actividad metabólica de los epz. Sin embargo, la intensidad del metabolismo de los epz y del
eyaculado dependen de una serie de factores conocidos y desconocidos aun, los cuales influyen
desfavorablemente en los resultados de las pruebas , las que por esta razón no son utilizadas con
regularidad por algunos profesionales , de allí que en la actualidad prevalecen en la comprobación del
semen las cuatro pruebas básicas : Morfología, Vivos y muertos , Motilidad y Concentración. Sin
embargo, hay que destacar que estas pruebas tienen su valor y es recomendable usarlas para completar
el examen de la fertilidad del eyaculado, del epz y del propio toro.
 Se cuentan con distintas pruebas tales como: Prueba de reducción del azul de metileno
 Reducción de la resazurina 
 Medición de la fructólisis.
 Prueba de la catalasa.
 PRUEBA DE LA DESHIDROGENACION O DE LA REDUCCION DEL AZUL DE
METILENO.
 El azul de metileno se conocía en la biología celular hace varios años, sin embargo no se había
aprovechado ampliamente en la producción de la calidad del semen. Durante los procesos de
respiración de los epz, gracias a la presencia de sistemas enzimáticos (deshidrogenasas) se libera al
hidrogeno que puede reducir a su aceptor, representado en este caso por el azul de metileno, a una
leucobase sin color.
 La duración del tiempo de la decoloración depende de la intensidad del metabolismo y
concentración del semen, y se encuentra influida también por varios factores internos y externos, de
estos últimos, la temperatura, ph. , situación osmótica, concentración del azul de metileno, etc.
 Teniendo en cuenta que el nivel del metabolismo de los epz es mas o menos constantes, es
posible según el tiempo de la decoloración, en condiciones ambientales constantes, no solamente
evaluar la actividad, sino también la concentración delos epz vivos, y, desde luego, la fertilidad.
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 El desarrollo de la prueba es el siguiente:
Equipo:
 Tabletas de azul de metileno.
 Diluyente de crema de huevo-citrato.
 Aceite de parafina o vaselina liquida.
 Tubos de Thumberg, Wasserman o hemolisis (3-4 ml).
 Baño Maria.
Técnica: 
1. Disolver 5 mg de azul de metileno en 10 ml de yema citrato (esta solución debe
usarse siempre fresca).Llevar el semen a 200.000 epz x mm3 (0.5 de semen y 1.5 de
diluyente yema-citrato).
2. Tomar 0.9 ml de semen estandarizado.
3. Agregar 0.1 ml de sol. De azul de metileno-yema-citrato.
4. Sellar el tubo con algunas gotas de vaselina o parafina liquida.
5. Preparar el tubo control con 0.1 ml de azul de metileno-yema-citrato y de diluyente
puro, sin epz. 
6. Llevar a baño Maria 46°C (43°C) y anotar tiempo de decoloración.
Resultado: semen con buena vitalidad decolora en menos de 10’.
 Este método se basa en la determinación del tiempo que necesita una muestra de esperma o
semen en decolorar una cierta cantidad de Azul de metileno en condiciones estándar de incubación. El
azul de metileno es reducido por la adición de dos átomos de H, perdiendo su color azul oscuro,
cambiando a una leucobase de color blanco.
PRUEBA MODIFICADA:
1. En un cristal de reloj se vierten 0,2 ml. De semen fresco y 0,2 ml de azul de metileno al
0,1%.
2. Se mezcla cuidadosamente agitando el cristal.
3. El semen coloreado se aspira inmediatamente en una pipeta capilar (pasteur), y se tapan
ambos extremos con parafinao 
4. La pipeta con la columna de semen se coloca en baño maría a 40 º C y se anota el tiempo
de decoloración.
La decoloración varía entre dos y 20’, promediando de 3 a 12’, dependiendo de la concentración
y actividad de las células espermáticas.
Al utilizar la prueba del azul de metileno hay que tener en cuenta que la actividad de la
deshidrogenación la tienen también otras células presentes en el semen, al igual que los
microorganismos. Por esta razón es imprescindible no hacer la prueba hasta después del examen
microscópico del semen. Se ha comprobado que en los eyaculados normales existe una correlación
positiva entre el tiempo de la decoloración y la fertilidad , y la prueba realizada en forma estándar es
conveniente para la evaluación del semen del toro.
REDUCCION DE LA RESAZURINA
Un aceptor semejante al azul de metileno hay que tener en cuenta durante el proceso del
metabolismo de los epz es la resarzurina .Este colorante cambia por la actividad del hidrogeno su
color azul a rosado (resorrufina) y por fin también pierde el color rosado, formándose
hidrorresorrufina. 
Se realiza de la siguiente manera:
1. En un pequeño tubo de ensayo se mezclan 0,2ml de solución de resazurina (11mg de
resaz. en 200ml de H20 destilada.
2. La mezcla se cubre con una capa de aceite de parafina y se incuba a 45°C.
El semen de buena calidad aparece de coloración rosado en 1’ y la decoloración se realiza
después de 3-4´ o más. 
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 PRUEBA DE RESISTENCIA
Mediante esta prueba se determina el poder que tienen los epz de resistir varios factores
nocivos de carácter físico, químico o térmico. 
Se usa para la prueba de la resistencia una solución de NaCL al 1%, suponiendo que el índice de
resistencia esta dado por la capa lipídica de los epz, contra los iones de , el volumen de la solución es
un exponente de la resistencia, coincidiendo con el fenómeno, de la dilución . Es muy probable que el
factor más influyente de la prueba sea el desequilibrio en los elementos minerales esenciales
nutrientes y otros factores del semen como consecuencia de la dilución con una solución salina al
1%. 
 PRUEBA DE GOTZE: 
1. A un volumen de 0,01ml de semen puro se añaden lentamente 100ml de una solución de
NaCL al 1% a 37°C manteniéndose la temperatura.
2. Se realizan evaluaciones microscópicas cada 5’ especialmenteel movimiento rectilíneo.
Para que el semen sea usado en IA. , las muestras deben conservar el movimiento rectilíneo
por lo menos durante 45’.
PRUEBA DE MILOVANOV:
1. Se vierte 0.02 ml de semen puro en un erlenmeyer 
2. Adicionar 10 ml de solución de NACL al 1% a 25°C 
3. Agitar y recoger una gota , y observar en portaobjeto al microscopio el movimiento
rectilíneo 
4. Si se conserva el movimiento rectilíneo, añadir otros 10 ml. de sol. de CLNA al 1%.
5. Ídem al punto 3 (observar al microscopio el mov. rect.)
6. Se repite hasta que el movimiento rectilíneo desaparezca.
PRUEBA DE LA SUPERVIVENCIA:
 Una de las pruebas más convenientes de la evaluación del semen es la de la supervivencia de los
epz del semen puro o diluido. Se evalúa no solo la integridad de los procesos metabólicos sino también
el contenido de las reservas energéticas y resistencia de los epz contra los productos tóxicos internos
que se producen en el semen.
 El valor de esta prueba esta representada por el porcentaje del movimiento rectilíneo en varios
periodos de la conservación. Cuanto mayor es el porcentaje del movimiento rectilíneo que se conserva
durante un periodo de tiempo más largo, tanto más alto es el valor del eyaculado.
 El semen no diluido conserva el 50 % de la motilidad progresiva a 4 ° C durante 54 horas en
promedio; en el semen diluido se prolonga este fenómeno hasta 130 hs. El limite mínimo de la
conservación del 50 % del movimiento progresivo del semen puro es de 30 hs. y de 110 hs. en el semen
diluido. Cuando el porcentaje de supervivencia disminuye, baja también la fertilidad. La duración de la
vitalidad absoluta del semen es de alrededor de 170 hs. en caso de semen puro y de cerca de 300 hs. en
el caso del semen diluido .La supervivencia del semen y su relación con la herencia es media (r: 0.43) y
es recomendable valorar al toro también según este fenómeno.
PRUEBA DE LA TERMORESISTENCIA:
 Equipo: 
 Tubo de hemólisis
 Diluyente de buena calidad
 Estufa o heladera.
 Técnica:
1. Tomar 1 cm de diluyente y depositar en el tubo 
2. Agregar 1 o 2 gotas de semen 
3. Homogeneizar
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4. Llevar a heladera (5°C ) o estufa (37°C-45°C)
Resultado:
 5°C........................................24 hs.
 37 °C.......................................2-3-4-5 hs.
 45°C…………………………1 hora.
Mas de 20 % de epz vivos con motilidad progresiva y acrosoma intactos
MÉTODOS DE CLASIFICACIÓN 
 Dentro del examen andrológico, la Sociedad de Teriogenología de los Estados Unidos, creo una
clasificación para toros teniendo en cuenta la circunferencia escrotal (C.E.)
Y la motilidad y morfología de los epz. Según los investigadores que llevaron a cabo el trabajo,
estas características son importantes, debiendo ser tenidas en cuenta en el momento de realizar el
examen del reproductor. En esta clasificación los toros pueden ser considerados de acuerdo con los
parámetros antes mencionados, como sigue:
EXCELENTE - BUENO - REGULAR - MALO -
 Esta tabla otorga a la motilidad un puntaje máximo de 20 puntos del total de 100, en tanto que
para morfología espermática se le dan un máximo de 40 puntos, también del total de 100, esta
diferencia esta de acuerdo con la relación de cada característica con la fertilidad, según los autores.
 En el cuadro siguiente se puede apreciar la clasificación completa que merece el semen:
MOTILIDAD
ESPERM
EXCELENTE BUENO REGULAR MALO
Individual 
En masa microscópica
Total Puntos
5
>70 %
4-5
60-70%
4
50-60%
3 (0-3)
< 50%
20 12 10 3
MORFOLOGÍA
ESPERM
EXCELENTE BUENO REGULAR MALO
Defectos Mayores 
Total Defectos
 Total Puntos
<10 %
<25%
10-19 %
26-39%
20-29 %
40-59 %
>29 %
59 %
40 25 10 3
 Fuente: Sociedad de Teriogenología de EE.UU.
 
Es importante aclarar que la clasificación esta basada en datos obtenidos de toros de raza europea,
criados en EEUU, bajo condiciones de aquel país, no extrapolables, a nuestras condiciones.
 En conclusión el valor diagnóstico del examen morfológico es admitido como criterio de
evaluación normal, en tanto otros investigadores, estiman que no es posible establecer un límite de
anomalías, expresado porcentualmente, como predictora de fertilidad.
BIBLIOGRAFIA:
BARNABE, R, 1981. Correlaciones entre motilidad progresiva y retención del acrosoma en semen
congelado de bovinos después del descongelado y pos-prueba de termoresistencia. Rev. Fac. Med. Vet.
Zoot. Univ. San Pablo, 18 (1): 61-68.
CHINNAIYA, G; Y GANGULI, N, 1980. Acrosomal damage of Buffalo spermatozoa during
freezing in extenders, ZBL Vet. Med. Reihe A, 27: 339-342.
DERIVAUX, J, 1976. Reproducción de los animales domésticos. Edit Acribia. Evaluación del
semen, Cap IV: 148-166.
ESBENSHADE, K; CLEGG, E. 1980. Acrosome reaction of sperm incubated in the uterus of gilts.
Amer. J. Vet. Res. 41 (7): 1137-1140.
Cátedra de
 Fisiopatología de la Reproducción y Obstetricia
 Facultad de Ciencias Veterinarias – UNNE Guia Nº10 
HOLY, L. 1986. Bases biológicas de la reproducción bovina. Edit. Diana. Semen, Cap XI: 379-
429.
MIES FILHO, A Y JODET, R. 1978. Evaluación de la calidad del semen bovino congelado.
Común. Cient. Fac. Vet. Y Zoot. Univ. San Pablo 2 (3/4): 7-18.
MIES FILHO, A. 1982. Reproducción de los animales e Inseminación Artificial. Edit. Sulina, 2º
vol: 435-495.
ROBERTS, S.J. 1984. Obstetricia Veterinaria y Patología de la Reproducción (Teriogenología).
Edit. Hemisferio Sur. 936-956.
SALISBURY, G; VAN DEMARK, N. Y LODGE, J. 1984. Fisiología de la Reproducción e
Inseminación Artificial de los Bóvidos. Edit. Acribia. Cap VII: 419-440.
SAXENA, V Y TRIATHI, N. 1977. Effect of foot-and-mouth disease vaccination on ultra-structure
of head of “red dane” bull spermatozoa. Pantnagar J. Res, 2(1): 67-69.
VALE FILHO, V. 1989. Padrones del semen bovino para el Brasil- Análisis y sugerencias- VIII.
Congreso Bras. Reprod. Anim (Palestras). 10-14 de Jilio. Belo Horizonte. Brasil.
VALQUIRIA, H. 1981. Comparative study between phase contrast and diferential interference
contrast microscopies for evaluation of frozen bull semen. Rev Med y Zoot. Univ. San Pablo. 18
(1):55-59.
VILLA, C. 1983. Hallazgo de Dag Defect en semen de toro Pollet Hereford. Gaceta Veterinaria,
Tomo XLV, 385:1165-1169.
	EXAMEN MICROSCOPICO DEL SEMEN