Guías de laboratorio bioquímica

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GUÍAS DE LABORATORIO
PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA
Autores
Carlos Yesid Soto Ospina
Luis Ernesto Contreras Rodríguez
María Camila Vergara Rodríguez
Departamento de Química 
Facultad de Ciencias
Universidad Nacional de Colombia
Sede Bogotá
GUÍAS DE LABORATORIO
PRINCIPIOS DE BIOQUÍMICA
CONTENIDO
0. Normas de trabajo en el Laboratorio
1. tracci n c anti caci n de ácido asc rbico
2. st dio de la acti idad en imática de la catalasa
3. Determinación de proteínas mediante los métodos de Biuret y Kjeldahl
4. P ri caci n de la a ina : tracci n de Prote nas
5. P ri caci n de la a ina : romato ra a de nidad
6. P ri caci n de la a ina : lectro oresis
7. raccionamiento de tejidos : arbo idratos N 
8. raccionamiento de tejidos : idos
9. raccionamiento de tejidos : Prote nas
ANEXO 1 Preci itaci n con s l ato de amonio
ANEXO 2. ormato c as de se ridad
ANEXO 3. Uso de la micropipeta
Prácticas Página
7
11
23
41
57
67
75
89
107
119
132
133
135
7
OX = Oxidante
COR = Corrosivo
 s iantes sim les
 eacciona iolenta o e losi amente con a a 
 ies o biol ico
 adiacti o
In amabilidad
Peligro 
específico
ReactividadRiesgo para 
la salud
 n amable a menos de c
 n amable a menos de c
 n amable a menos de c
 n amable a más de c
0 No in amable
 P ede detonar
 P ede estallar or altas 
tem erat ras o or im acto
 nestable en caso de cambio 
imico iolento
 nestabe en caso de calenta-
miento
0 stable
 P ede ser mortal
 P ede ca sar da o serio o 
ermanente
 P ede ca sar inca acitaci n 
tem oral o da o resid al
 P ede ca sar irritaci n 
si ni cati a
0 No e iste eli ro
INTRODUCCIÓN
El trabajo en el Laboratorio de Bioquímica es una 
labor segura, siempre y cuando se cumplan todas 
las normas exigidas para el desarrollo del mismo. La 
seguridad de los experimentadores depende de un 
conjunto de protocolos de trabajo que contempla 
el conocimiento de los riesgos potenciales, las 
normas de prevención y las acciones a ejecutar en 
caso de ocurrir un accidente. 
El trabajo en el Laboratorio de Bioquímica no es 
peligroso, pero existe la posibilidad de accidentes 
debido al manejo inadecuado de sustancias 
micas de idos biol icos otencialmente 
in ecciosos Por tal ra n es indis ensable la 
re araci n re ia de las rácticas de laboratorio 
Normas de trabajo en el laboratorio
mediante la elaboraci n de re in ormes e 
incluyen las Fichas de Manejo de las sustancias 
a tili ar
ETIQUETADO DE REACTIVOS QUÍMICOS
as eti etas de los reacti os micos 
identi can la s stancia e incl en in ormaci n 
eneral constit ndose como la rimera 
ente de in ormaci n de se ridad ara s 
manejo nternacionalmente se tili a n 
sistema codi cado de colores e in orma 
los riesgos y la severidad de los mismos del 
si iente modo:
Práctica
0
Práctica 0: Normas de trabajo en el laboratorio
88
stancias 
t icas
stancias 
radiacti as
stancias noci as 
ara la sal d
NORMAS DE SEGURIDAD
a se ridad como re enci n se de ne or na serie de barreras como:
Primarias: ocali adas alrededor del ori en del ries o jem lo: reali ar la ráctica adec adamente
Secundarias: ocali adas alrededor del racticante jem lo: lle ar el elo reco ido las as cortas 
tili ar i eteadores etc
Terciarias: ocali adas alrededor del laboratorio jem lo: no sacar nin n material t ico del laboratorio
• eri car el rado de eli rosidad de la 
sustancia a trabajar
• eri car e se est sando la s stancia 
adecuada 
• antener los rascos cerrados en el sitio 
dis esto ara tal n
• No trans ortar los reacti os com nes al 
esto de trabajo s s com a eros tambi n 
los tili arán 
• eer c idadosamente la eti eta de 
identi caci n del reacti o 
• No mani lar los rascos de los reacti os or 
el cuello del envase
• l dil ir ácidos ertes a adir lentamente el 
ácido al agua, nunca al contrario 
• Evitar el contacto con piel, ojos, mucosas y la 
in esti n accidental de los reacti os
NORMAS SOBRE EL TRABAJO EN EL LABORATORIO
• No comer beber mar almacenar alimentos 
 a licar cosm ticos
• Portar antes a as bata blanca de labora-
torio
• sar máscara anti ás c ando sea necesario
• Lavar y secar las manos antes y después de 
reali ar la ráctica
• Realizar todos los procedimientos técnicos en 
la orma indicada
• im iar s er cies de mesones antes des-
s de reali ar la ráctica
NORMAS SOBRE EL MANEJO DE REACTIVOS QUÍMICOS
dicionalmente las eti etas de los reacti os micos contienen in ormaci n en orma de s mbolos e 
indican entre otros as ectos:
stancias 
in amables
stancias 
e losi as
stancias 
corrosivas
9
Práctica 0: Normas de trabajo en el laboratorio
MANIPULACIÓN DE MATERIAL Y EQUIPOS DE LABORATORIO
n el desarrollo de las rácticas se em leará material de idrio e debe mani larse c idadosamente ara 
evitar su quiebre, potenciales heridas y gastos económicos. Adicionalmente, los equipos como balanzas, 
centr as micro i etas a itadores es ectro ot metros destiladores entre otros se tili arán bajo la 
supervisión de los docentes siguiendo las debidas precauciones e instrucciones de operación.
PREPARACIÓN Y EVALUACIÓN DE LAS PRÁCTICAS
Quizes: e al aciones cortas orales o escritas e se reali an antes de iniciar la ráctica corres ondiente 
Pretenden e al ar el rado de re araci n del est diante ara reali ar la ráctica
Pre-Informes: escritos indi id ales elaborados siem re a mano e resentan los si ientes tems:
Introducción: com onente te rico relacionado con el tema de la ráctica
Objetivo general y específicos: metas e se alcan arán desarrollando la ráctica
Metodología: dia rama de jo e indica el rocedimiento e erimental a ejec tar
Tablas y gráficas: tili adas ara consi nar los datos ad iridos en la ráctica
Fichas de seguridad: in ormaci n de los reacti os micos a tili ar en la ráctica
Bibliografía: so orta de la in ormaci n resentada en el re in orme
l re in orme será re isito indispensable para ingresar al laboratorio.
Datos de la práctica: al nali ar la ráctica cada r o debe entre ar na tabla de los datos obtenidos 
d rante la misma la c al es necesaria ara oder entre ar el in orme en la si iente sesi n
a no entre a de la tabla de datos indica la no obtenci n de res ltados necesarios ara reali ar el in orme 
Informe de la práctica: escritos por grupo de trabajo elaborados siempre a mano que presentan datos, 
res ltados análisis disc si n concl siones de la ráctica e entre an a la semana si iente de la 
reali aci n de las rácticas dicionalmente incl irá el desarrollo del c estionario corres ondiente a cada 
ráctica 
l in orme será re isito indis ensable ara in resar a las e al aciones arciales del laboratorio
Evaluaciones parciales de las prácticas: sesiones que se realizarán en el mismo horario de laboratorio, en 
las c ales se e al arán los contenidos desarrollados en las rácticas e reali arán dos e al aciones 
d rante el semestre stas eden ser orales escritas o rácticas se reali arán de orma indi id al o 
por grupos de trabajo. 
• No pipetear con la boca, usar pipeteadores o 
i etas a tomáticas
• No pipetear varias sustancias con el mismo 
instrumento
• No mezclar sustancias sin conocimiento de su 
comportamiento
• No trabajar con equipos eléctricos si se pre-
sentan derrames sobre ellos
• Usar campanas de extracción cuando se gene-
ren gases tóxicos o irritantes
• m lear escobilla c rr sco ara el la ado 
de material 
• im iar secar el esto de trabajo al nali ar 
la ráctica
Práctica 0: Normas de trabajo en el laboratorio
1010
CUESTIONARIO
 son las cla es internacionales li e s ncionamiento mencione tres ejem los
áles son los ries os biol icos más rec entes e se eden resentar en n laboratorio de io mica
 son las ci ras si ni cati as c áles son las re las básicas ara s manejo encione al nos 
ejemplos.
¿Dónde se localizan los siguientes elementos del Laboratorio de Bioquímica 330? Realice un esquema 
lano indicando la bicaci n de:
• lmac n de reacti os
• Máquina de hielo
• Balanzas
• Nevera
• oti n
• Potenciómetro
• Cabinas de extracción
• Recipientesde desechos
• Casilleros
• Salidas de emergencia
• entr as
• Puesto de trabajo
• tintores
• Termostatos
• Lava ojos 
n c ál reci iente de desec os se deben descartar los si ientes reacti os Para ello describa 
s stancias se eden desec ar en cada no de los reci ientes ndi e la com osici n de los reacti os 
marcados con asterisco *
• Acetona
• Ácido nítrico
• Ácido molíbdico
• loro ormo
• Cloruro de sodio
• Hidróxido de amonio
• Permanganato de potasio
• Ninhidrina
• Nitroanilina
• eacti o de enedict*
• eacti o de i ret*
• eacti o de ol*
• eacti o de illon*
• eacti o de olisc *
Objetivos:
1. Aplicar el concepto de Seguridad en el Laboratorio.
2. econocer se ales s mbolos relacionados con la e ridad en el aboratorio
3. Conocer las normas generales de Seguridad en el Laboratorio.
11
l nos si los atrás acia el a o 00 d rante 
extensos viajes en altamar, se registraban 
n merosas m ertes en las tri laciones mar timas 
a ca sa n d cit itam nico a itaminosis o 
i o itaminosis de ácido asc rbico o itamina 
C, que conllevaba al desarrollo de una condición 
patológica denominada escorbuto. 
sta en ermedad se caracteri a or na 
de eneraci n del tejido conecti o el c al está 
constit ido rinci almente or bras de colá eno 
Debido a que la vitamina C es requerida para la 
hidroxilación de residuos de prolina y lisina del 
colá eno s d cit enera bras inestables 
cuyos síntomas principales incluyen hemorragias, 
rdida de dientes cicatri aci n ins ciente 
ati a e in ecciones res iratorias
En términos químicos, la vitamina C o ácido 
ascórbico, es una cetolactona de seis carbonos 
 e se o ida con acilidad al ambiente 
a ma or a de animales sinteti an itamina 
a artir de l cosa en na r ta bio mica de 
c atro reacciones catali adas en imáticamente 
in embar o al nos mam eros como los orilas 
los m rci la os de la r ta los manos an 
erdido la ltima en ima de la r ta de s ntesis 
de ácido ascórbico, que cataliza la conversión de 
L-gluconolactona en ácido L-ascórbico, razón por 
la cual debe obtenerse de la dieta. 
Como su nombre lo indica, el ácido ascórbico, al 
ser n ácido libera rotones dismin endo 
el de na sol ci n sta ro iedad a orece 
e el ácido asc rbico artici e en reacciones 
 como a ente red ctor cede electrones 
a otras moléculas reduciéndolas a expensas 
de s o idaci n lo c al es rele ante desde el 
punto de vista bioquímico. Al reaccionar con 
es ecies reacti as de o eno la itamina e ita 
la oxidación de otras moléculas esenciales para 
la c l la como los os ol idos de las membranas 
biol icas el ácido ribon cleico N Por lo 
tanto la itamina es n anti o idante ital ara 
los seres vivos.
La oxidación del ácido ascórbico genera ácido 
dehidroascórbico, como se ilustra en la siguiente 
ra:
FUNDAMENTO TEÓRICO
El oxígeno, los iones metálicos, el pH, la luz 
 la tem erat ra son al nos de los actores 
que conducen a la oxidación de la vitamina C. 
dicionalmente di ersas en imas tili an dic a 
vitamina como agente reductor en las reacciones 
que catalizan. 
as r tas c tricas a abas tomates resas 
anti caci n de itamina 
Práctica
1
Práctica : anti caci n de itamina 
1212
erd ras erdes a as son entes ricas de 
vitamina C. Los jugos de naranja y limón presentan 
una concentración de ácido ascórbico aproximada 
de 0 m m m n e etales ede 
resentarse en orma libre ácido asc rbico o en 
orma combinada ascorb eno sta orma no es 
detectada por los métodos corrientes de análisis a 
menos que se hidrolice a ácido ascórbico, hirviendo 
el material con solución de ácido oxálico. 
l ndamento del m todo e se a licará en la 
resente ráctica de laboratorio se basa en la 
c anti caci n es ectro otom trica del com lejo 
de color rojo ioleta e res lta al nal de las 
reacciones ermitiendo la determinaci n del 
ácido ascórbico. 
Espectrofotometría
s ectro otometr a es el sistema de análisis 
basado en las medidas de la intensidad de la 
l e asa a tra s de na sol ci n tili ando 
di erentes lon it des de onda la c al se de ne 
como la distancia entre dos picos cuando la luz 
recorre n camino en orma ond latoria
Numerosas sustancias químicas absorben luz 
de la región visible o ultravioleta del espectro 
electroma n tico sta ro iedad es a ro ec ada 
para determinar la concentración de dichas 
sustancias. Para esto, se hace pasar un rayo de luz 
de lon it d de onda es ec ca a tra s de na 
sol ci n de la s stancia a c anti car
a cantidad de l absorbida or dic a sol ci n 
de ende de tres actores: el ti o de s stancia s 
concentración y la distancia que debe recorrer el 
haz luminoso dentro de la solución. En los análisis 
es ectro otom tricos se tili an como ente de 
luz, lámparas de tungsteno y de deuterio, para la 
re i n isible ltra ioleta res ecti amente 
La longitud de onda de máxima absorbancia, 
la cual depende de la sustancia a analizar, se 
selecciona con un monocromador. 
a l de intensidad inicial o se asa a tra s 
de na celda o c eta e contiene la sol ci n 
de interés, la cual absorbe una parte de la luz 
incidente a intensidad de la l transmitida 
se denomina I y es menor a Io. La absorbancia 
 de la sol ci n se de ne como o 0 o s 
relaci n con el ti o de s stancia s concentraci n 
y la distancia que debe recorrer el haz de luz, se 
e lican con las si ientes le es:
Ley de Lambert: relaciona la intensidad de la l trasmitida el es esor de la celda o camino recorrido or 
la radiaci n l minosa a e resi n matemática es:
I = Ioe-K1.L 
e = Base de logaritmos naturales
 istancia e debe recorrer el a l minoso dentro de la celda cm
 onstante caracter stica de la s stancia coloreada
I = Io e-K2.CL
 oncentraci n de la sol ci n coloreada 
K2 = Constante de la sustancia coloreada
Ley de Beer: relaciona e de eer: relaciona la intensidad de la l trasmitida con la concentraci n de la 
s stancia coloreada dentro de la sol ci n a e resi n matemática es: 
Las dos leyes pueden combinarse en una, conocida como Ley de Lambert-Beer c a e resi n matemática 
es: I = Io e-K.C.L. es ejando con irtiendo a lo aritmo decimal: Log10 Io/I = 0.4343 K.C.L
Como se mencionó anteriormente, Log10 Io es i al a la absorbancia mientras e el alor 0 
corres onde al coe ciente de e tinci n tica es ec co de la s stancia anali ada c as nidades son 
[M-1 . cm-1 eem la ando en la ec aci n:
Práctica : anti caci n de itamina 
13
A 0.200
Luz 
blanca
Registrador
Fuente de luz Monocromador Solución 
de muestra
Absorción
d
Luz monocromática 
de intensidad I0 
Luz monocromática 
de intensidad I 
Detector
ncionamiento básico de n es ectro ot metro
Por s arte la transmitancia de la l no absorbida se de ne como: o
 men do la transmitancia se e resa como orcentaje: o 00
es ejando ordenando la ec aci n: o 00 
licando lo aritmo decimal: lo 0 o lo 0 00 lo 0 
ado e lo 0 o entonces la relaci n matemática entre transmitancia absorbancia es:
A = 2 – log10 %T 
El oxígeno, los iones metálicos, el pH, la luz 
 la tem erat ra son al nos de los actores 
que conducen a la oxidación de la vitamina C. 
dicionalmente di ersas en imas tili an dic a 
vitamina como agente reductor en las reacciones 
que catalizan. 
as r tas c tricas a abas tomates resas 
erd ras erdes a as son entes ricas de 
vitamina C. Los jugos de naranja y limón presentan 
una concentración de ácido ascórbico aproximada 
de 0 m m m n e etales ede 
resentarse en orma libre ácido asc rbico o en 
orma combinada ascorb eno sta orma no es 
detectada por los métodos corrientes de análisis a 
menos que se hidrolice a ácido ascórbico, hirviendo 
el material con solución de ácido oxálico. 
l ndamento del m todo e se a licará en la 
resente ráctica de laboratorio se basa en la 
c anti caci n es ectro otom trica del com lejo 
de color rojo ioleta e res lta al nal de las 
reacciones ermitiendo la determinaci n del 
ácido ascórbico. El oxígeno, los iones metálicos, 
el pH, la luz y la temperatura son algunos de los 
actorese cond cen a la o idaci n de la itamina 
 dicionalmente di ersas en imas tili an dic a 
vitamina como agente reductor en las reacciones 
que catalizan.
as r tas c tricas a abas tomates resas 
erd ras erdes a as son entes ricas de 
vitamina C. Los jugos de naranja y limón presentan 
una concentración de ácido ascórbico aproximada 
de 0 m m m n e etales ede 
resentarse en orma libre ácido asc rbico o en 
orma combinada ascorb eno sta orma no es 
detectada por los métodos corrientes de análisis a 
menos que se hidrolice a ácido ascórbico, hirviendo 
el material con solución de ácido oxálico.
l ndamento del m todo e se a licará en la 
resente ráctica de laboratorio se basa en la 
c anti caci n es ectro otom trica del com lejo 
de color rojo ioleta e res lta al nal de las 
reacciones ermitiendo la determinaci n del 
ácido ascórbico.
Práctica : anti caci n de itamina 
1414
bjeti o: licar n m todo sim le ara e traer c anti car el contenido de ácido asc rbico 
o itamina en r tas o erd ras
REACTIVOS ili enciar la c a de se ridad de todos los reacti os s bra ados
Nota: e itar la e osici n del atr n de itamina a la atm s era debido a e es n com esto ácilmente 
oxidable.
PROCEDIMIENTO
1. Registrar el peso de las muestras, exprimirlas y medir el volumen total del zumo.
 omar m de mo a re ar m de ácido o álico 0 P me clar ltrar si es necesario 
em lear ca as de asa n emb do ara tal n ando trabaja con r tas no e rimibles o 
erd ras esar de las mismas macerar con m de ácido o álico 0 P stas re araciones 
constit en las m estras 
Nota: c ando las m estras de las r tas o erd ras resentan coloraci n debe re arar n t bo 
lanco Problema con todos los reacti os incl endo la m estra e ce to Na l reali ar los cálc los 
el valor de absorbancia de este Blanco Problema se debe descontar del valor de absorbancia de las 
muestras.
• cido o álico 0 P
• a destilada
• Etanol absoluto
• r tas c tricas o erd ras eben traerlas los est diantes
• Na 0 P
• nitro anilina 0 P en ácido ac tico lacial: l 0 :
• Nitrito de sodio 0 0 P reci n re arado
• Patrón de vitamina C 0.2 mg/mL, recién preparado
 n t bos de ensa o N marcados a re ar los si ientes reacti os:
Reactivos [mL] Blanco Blanco problema
Patrones Fruta 1 Fruta 2 o verdura
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2 M3 M4
2- Nitroanilina 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
Nitrito de sodio 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
4. Agitar y observar decoloración. Si no se produce decoloración, agregar 0.1 mL adicionales de nitrito 
de sodio restar del ol men de a a e o adicionar:
Reactivos [mL] Blanco Blanco problema
Patrones Fruta 1 Fruta 2 o verdura
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2 M3 M4
Etanol absoluto 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
Patrón vit. C 0,2 mg/mL - - 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - - - -
cido o álico 0 P 0,6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 - 0,3 - 0,3 -
Muestra - 0,3 - - - - - - 0,3 0,6 0,3 0,6
Práctica : anti caci n de itamina 
15
 e clar dejar en re oso min tos a tem erat ra ambiente e o adicionar:
 e clar bien el contenido de cada t bo leer en el es ectro ot metro a 0nm
RESULTADOS
m rimir dili enciar entre ar el ormato de n orme de aboratorio corres ondiente
CUESTIONARIO e debe res onder en el ormato de n orme de aboratorio
 ál es la nci n del ácido o álico en la ráctica
 Por se reali a el análisis en el es ectro ot metro a 0 nm
 nci n reali an las m estras N en la ráctica
 s ceder a al c anti car el ácido asc rbico inmediatamente 0 oras des s de obtenerlo 
Por se resenta este en meno
5. ¿Qué sucedería si la extracción de la vitamina C se realiza desde vegetales cocidos? 
Frankenburg FR. Vitamin discoveries and disasters. History, science and controversies. ABC-CLIO. 2009. 
anta arbara ali ornia a t lo 
oolman oe m olor tlas o ioc emistr nd edition eor ieme erla 00 t art 
erman Pá ina 0
sao Pac er c s n o er ie o ascorbic acid c emistr and bioc emistr ac P arm 00 
: 
REFERENCIAS
Reactivos [mL] Blanco Blanco problema
Patrones Fruta 1 Fruta 2 o verdura
P1 P2 P3 P4 P5 P6 M1 M2 M3 M4
Na 0 P 0,6 - 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
a destilada 2,6 2,9 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6
1616
PROCEDIMIENTO anti caci n de itamina 
1 Registrar el peso de las muestras, exprimirlas y medir el volumen total del zumo. 
3 Mezclar: 1 mL de zumo + 4 mL de ácido oxálico 0,15% (P/V) Agitar y MARCAR: “Muestra Problema (M) 1, 2, 3, etc…”
4 Agregar en el siguiente orden la cantidad en mL de los reactivos indicados
A
E
F
G
B
C
D
H
Blancos Patrones Muestras
 Naranja Limón
Agitar hasta observar decoloración
0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
Mezclar e incubar 5 minutos a temperatura ambiente
Agitar y medir absorbancia a 540 nm
 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1
 - - 0,1 0,2 0,3 0,4
0,6 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2
 1 0,3 1 1 1 1
0,5 0,6 - - - -
0,1 - 0,3 - 0,3 -
 1 1 1 1 1 1
2,6 2,9 2,6 2,6 2,6 2,6
 1 1 1 1 1 1
2,6 2,6 2,6 2,6 2,6 2,6
 1 1 0,3 0,6 0,3 0,6
2-nitro anilina 0,16% (P/V);
HCl 10% (V/V) 9:1
Nitrito de sodio 0,08% (P/V)
Etanol Absoluto
Solución de vitamina C 0.2 mg/mL
Solución de ácido oxálico 0.15% (P/V)
H2O
NaOH 20% (P/V)
Muestra problema
2 Filtrar el zumo a través de 2 capas de gasa utilizando un embudo.
EXTRACCIÓN DEL ÁCIDO ASCÓRBICO
CUANTIFICACIÓN DEL ÁCIDO ASCÓRBICO
B1 B2 1 2 3 4 5 6 M1 M2 M3 M4
B1 B2 1 2 3 4 5 6 M1 M2 M3 M4
M1 M2
23
Los organismos que viven bajo condiciones 
aeróbicas dependen del oxígeno molecular 
ara obtener ener a mica en orma de 
ATP, mediante procesos bioquímicos como la 
os orilaci n o idati a no de los s b rod ctos 
de dicho proceso es el peróxido de hidrógeno 
 n a ente o idante erte e a ecta 
estructuras celulares y biomoléculas esenciales 
para la célula.
a catalasa c di o en imático es na 
en ima e rote e a las c l las de los e ectos 
tóxicos del H2O2, siendo una de las enzimas más 
e cientes de la nat rale a e a calc lado e 
na nica mol c la de esta rote na catali a la 
con ersi n de asta 0 0 millones mol c las 
de H2O2 por segundo. La catalasa se encuentra 
en organismos procariotas y eucariotas, en éstos 
ltimos se locali a ma oritariamente en or anelos 
denominados peroxisomas. Sin embargo, también 
se ha reportado en mitocondrias y citoplasma. 
e ac erdo con la base de datos N s:
brenda en mes or de endiendo del 
organismo, la catalasa exhibe rangos amplios 
de peso molecular y punto isoeléctrico. 
Estructuralmente, la catalasa presenta un 
r o rost tico mol c la or ánica nida de 
manera co alente e contrib e con la nci n 
en imática denominado r o emo a catalasa 
los citocromos, la hemoglobina, la mioglobina y 
las ero idasas constit en el r o de las emo
proteínas.
a catalasa es altamente es ec ca catali a la 
si iente reacci n:
FUNDAMENTO TEÓRICO
2H O 2H catalasa
n la descom osici n en imática del 0 , éste se 
une al grupo hemo de la catalasa y se descompone 
en agua y oxígeno atómico. El átomo de oxígeno 
se enlaza con el átomo de hierro presente en 
el r o emo desde all es trans erido acia 
una segunda molécula de H O ormando na 
nueva molécula de agua y oxígeno molecular. La 
ener a de acti aci n de la reacci n catali ada 
por la catalasa es tan solo de 23 kJ/mol, lo cual, 
en comparación con la reacción no catalizada, 
conlle a a n actor de aceleraci n de 0 
veces.
En términos de estructura cuaternaria, se han 
reportado oligómeros de dos, cuatro y seis 
s b nidades d meros tetrámeros e ámeros 
res ecti amente ara la ma or a de catalasas in 
embargo, la catalasa del hongo Neurospora crassa 
nciona en estado monom rico n todos los 
casos cada s b nidad contiene n r o emo 
como se indica para la catalasa humana de la 
si iente ra:
cti idad en imática de la catalasa
Práctica
2
Práctica : cti idad en imática de la catalasa
2424
n c anto alos arámetros cin ticos de la catalasa 
y dependiendo del organismo, la constante de 
ic aelis enten ar a entre 0 0 m 
mientras e s tem erat ra tima de 
reacci n com renden ran os entre 0 
0 res ecti amente
Diversos compuestos químicos han sido reportados 
como inhibidores de las catalasas, como óxido 
n trico N metanol ditiotreitol 
 el ion cian ro N entre otros n el caso 
artic lar del Na N s mecanismo de in ibici n 
es irreversible, uniéndose y bloqueando el grupo 
hemo. Adicionalmente, inhibe el complejo 
en imático citocromo c o idasa de la cadena 
trans ortadora de electrones a ectando la s ntesis 
de ATP. Por tal razón, el NaCN es un compuesto 
tóxico que debe ser manipulado con precaución. 
a acti idad en imática de la catalasa tanto 
en extractos proteicos como en preparaciones 
ras se mide de di ersas ormas n la resente 
ráctica se eri cará mediante la tit laci n del 
 no catali ado resid al con erman anato 
de otasio n des s de detener la 
reacci n con ácido s l rico 
a reacci n de tit laci n es la si iente:
atalasa mana c di o en el anco de 
atos de Prote nas P
r o emo
2KMnO O 3H SO 2MnSO SO
Práctica : cti idad en imática de la catalasa
25
Objetivo: idenciar la acti idad en imática de la catalasa e al ar el e ecto del la concen-
tración de enzima, la concentración de sustrato y la temperatura.
REACTIVOS ili enciar la c a de se ridad de todos los reacti os s bra ados
PROCEDIMIENTO
Nota: ara el desarrollo de la ráctica se debe tener en c enta el si iente as ecto: los e erimentos se 
reali arán a ba o de ielo or lo tanto los reacti os los t bos e se tili arán deben encontrarse 
a esta temperatura. Esta condición es necesaria debido a la alta velocidad de reacción de la enzima.
Pre araci n del e tracto en imático de catalasa:
 n n mortero colocar de abic ela bien la ada icada en tro os e e os dicionar 0 m de 
a a destilada r a macerar asta obtener n e tracto coloreado ni orme 
 rans erir el e tracto a n t bo alcon centri ar a 000 r m or min tos btener el sobrenadante 
 com letar con a a destilada r a a 0 m itar s a emente conser ar a 
sta m estra constit e el Extracto Enzimático e contiene la catalasa a est diar
A. Estudio del efecto del pH sobre la actividad enzimática:
 n el ba o de ielo colocar t bos de ensa o rot lados e o adicionar: 
• morti ador os atos 0 m 
• abic elas rescas eben traerlas los est diantes
• H SO 6 N
• KMnO 5 mM
• Solución de H O 50 mM reci n re arada en amorti ador os atos 
eacti os m
Tubos
T1
pH 4
T2
pH 5
T3
pH6
T4
pH7
T5
pH8
CONTROL
pH 7
H SO 6 N 2 2 2 2 2 2,5
Reactivos [mL]
TUBOS
T1 
pH 4
T2 
pH 5
T3 
pH 6
T4 
pH 7
T5 
pH 8 CONTROL pH 7
morti ador del corres ondiente 10 10 10 10 10 10
H 0 50 mM 2 2 2 2 2 2
Extracto Enzimático 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
 itar los t bos e inc bar or min tos en el ba o de ielo e o adicionar:
 rans erir el contenido de cada t bo a n erlenme er tilice no ara cada t bo tit lar el 0 
remanente con n l nto nal de la tit laci n se alcan a c ando a arece n color rosado claro 
permanente.
Práctica : cti idad en imática de la catalasa
2626
B. Estudio del efecto de la concentración de enzima:
 n el ba o de ielo colocar t bos de ensa o rot lados e o adicionar:
eacti os m
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
morti ador de 10 9,5 9 8,5 8 10,5
H 0 50 mM 2 2 2 2 2 2
Extracto Enzimático 0,5 1 1,5 2 2,5 -
 itar los t bos e inc bar or min tos en el ba o de ielo e o adicionar:
eacti os m
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
H SO 6 N 2 2 2 2 2 2
 rans erir el contenido de cada t bo a n erlenme er tilice no ara cada t bo tit lar el 0 
remanente con n l nto nal de la tit laci n se alcan a c ando a arece n color rosado claro 
permanente.
C. Estudio del efecto de la concentración de sustrato:
 n el ba o de ielo colocar t bos de ensa o rot lados e o adicionar:
eacti os m
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
morti ador de 11,5 11 10,5 10 9,5 10
H 0 50 mM 0,5 1 1,5 2 2,5 2,5
Extracto Enzimático 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
 itar los t bos e inc bar or min tos en el ba o de ielo e o adicionar:
eacti os m
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
H SO 6 N 2 2 2 2 2 2
 rans erir el contenido de cada t bo a n erlenme er tilice no ara cada t bo tit lar el 0 
remanente con n l nto nal de la tit laci n se alcan a c ando a arece n color rosado claro 
permanente.
Práctica : cti idad en imática de la catalasa
27
D. Estudio del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática:
 n el ba o de ielo colocar t bos de ensa o rot lados e o adicionar:
eacti os m
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
morti ador de 9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 10,5
H 0 50 mM 2 2 2 2 2 2
Extracto Enzimático 1 1 1 1 1 -
itar los t bos e inc bar el tiem o indicado en baño con agua en ebullición.
P N 0 2 5 10 15 15
 e o adicionar:
eacti os m
Tubos
T1 T2 T3 T4 T5 CONTROL
H SO 6 N 2 2 2 2 2 2
 rans erir el contenido de cada t bo a n erlenme er tilice no ara cada t bo tit lar el 0 
remanente con n l nto nal de la tit laci n se alcan a c ando a arece n color rosado claro 
permanente.
RESULTADOS
m rimir dili enciar entre ar el ormato de n orme de aboratorio corres ondiente
CUESTIONARIO e debe res onder en el ormato de n orme de aboratorio
 indica cada no de los n meros del c di o en imático de la catalasa
 n la ráctica se est diaron al nos actores e a ectan la acti idad en imática de la catalasa 
otros actores tendr an e e al ar ara com letar el est dio cin tico de la en ima li e
 áles di erencias e isten entre la acci n de la catalasa la ero idasa onstr ir n c adro 
com arati o
 ál es la nci n del d rante la ráctica Por no se a lica sim ltáneamente con los 
demás reacti os e odr a s stit ir el or idr ido de sodio Na sti e s res esta 
REFERENCIAS
oolman oe m olor tlas o ioc emistr nd edition eor ieme erla 00 t art 
erman Pá ina 
Nelson o e nin er Princi les o ioc emistr t edition reeman om an 0 
New York, USA. Capítulo 6
P tnam r ai o rne ainer cti e and n ibited man atalase tr ct res: i and and 
N P indin and atal tic ec anism ol iol 000 : 0 
2828
PROCEDIMIENTO cti idad en imática de la catalasa
[mL]
1 Pesar 5 g de habichuela fresca. 
3
 
EXTRACCIÓN DE LA CATALASA
Sobrenadante
tracto en imático
Precipitado
2
En un mortero colocar la habichuela bien 
lavada y picada en trozos pequeños. Adicionar 
0 m de a a destilada r a macerar asta 
obtener un extracto coloreado uniforme. 
4 arcar como tracto en imático itarsuavemente y conservar a 4°C. 
Transferir el extracto a un tubo Falcon y 
centrifugar a 6000 rpm por 5 minutos. Obtener 
el sobrenadante y completar con agua 
destilada r a a 0 m
29
PROCEDIMIENTOcti idad en imática de la catalasa
A. EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA CATALASA
morti ador de os atos 
H O 0m en amorti ador de 
tracto en imático
H SO N
n m
Reactivos
n el ba o de ielo colocar t bos de ensa o rot lados e o adicionar los si ientes 
ol menes en ml:
pH
4
pH
5
pH
6
pH
7
pH
8
pH
7
iii
 i
ii
10 10 10 10 10 10
 2 2 2 2 2 2
 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
 2 2 2 2 2 2,5
morti ador de corres ondiente
H O 0m
tracto en imático
H SO N
itar e inc bar or min tos en el ba o de ielo 
ControlT5T4T3T2T1
A.1
iv
Transferir el contenido de cada tubo a un
 erlenmeyer (utilice uno para cada tubo) 
y titular el H202 remanente con KMnO4. 
El punto final de la titulación se alcanza
cuando aparece un color rosado claro 
permanente.
 Transferir Titular Punto final
Medir volumen de 
KMnO4 gastadoKMnO4
A.2
3030
PROCEDIMIENTO
Transferir el contenido de cada tubo a un
 erlenmeyer (utilice uno para cada tubo) 
y titular el H202 remanente con KMnO4. 
El punto final de la titulación se alcanza
cuando aparece un color rosado claro 
permanente.
 Transferir Titular Punto final
Medir volumen de 
KMnO4 gastadoKMnO4
B.2
B. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓNDE LA ENZIMA
Amortiguador de fosfatos pH 7
H2O2 50mM en amortiguador de pH 7
Extracto enzimático
H2SO4 6 N
KMnO4 5mM
Reactivos
B.1 En el baño de hielo colocar 6 tubos de ensayo rotulados. Luego, adicionar los siguientes volumenes en ml:
Control
10
ml
9,5
ml
9
ml
8,5
ml
8
ml
10,5
ml
10 9,5 9 8,5 8 10,5
 2 2 2 2 2 2
 0,5 1 1,5 2 2,5 -
 2 2 2 2 2 2
Amortiguador de pH 7
H2O2 
Extracto enzimático
H2SO4 6 N
Agitar e incubar por 5 minutos en el baño de hielo 
T5T4T3T2T1
iii
 i
ii
iv
cti idad en imática de la catalasa
31
PROCEDIMIENTO
morti ador de os atos 
H O 0m en amorti ador de 
tracto en imático
H SO N
n m
Reactivos
n el ba o de ielo colocar t bos de ensa o rot lados e o adicionar los si ientes 
ol menes en ml:
iii
 i
ii
11,5 11 10,5 10 9,5 10
 0,5 1 1,5 2 2,5 2,5
 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 -
 2 2 2 2 2 2
morti ador de 
H O 0m
tracto en imático
H SO N
itar e inc bar or min tos en el ba o de ielo 
ControlT5T4T3T2T1
C.1
iv
Transferir el contenido de cada tubo a un
 erlenmeyer (utilice uno para cada tubo) 
y titular el H202 remanente con KMnO4. 
El punto final de la titulación se alcanza
cuando aparece un color rosado claro 
permanente.
 Transferir Titular Punto final
Medir volumen de 
KMnO4 gastadoKMnO4
C.2
C. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 
DE LA CATALASA
cti idad en imática de la catalasa
3232
PROCEDIMIENTO
 P N :
morti ador de os atos 0
H O 0m en amorti ador de 0
tracto en imático
H SO N
n m
Reactivos
n el ba o de ielo colocar t bos de ensa o rot lados e o adicionar los si ientes 
ol menes en ml:
iii
 i
ii
9,5 9,5 9,5 9,5 9,5 10,5
 2 2 2 2 2 2
 1 1 1 1 1 -
 0 2 5 10 15 15
morti ador de 
H O 0m
Extracto nzimático
TIEMPO (MIN)
itar los t bos e inc bar el tiem o indicado en ba o con a a en eb llici n
ControlT5T4T3T2T1
D.1
Transferir el contenido de cada tubo a un
 erlenmeyer (utilice uno para cada tubo) 
y titular el H202 remanente con KMnO4. 
El punto final de la titulación se alcanza
cuando aparece un color rosado claro 
permanente.
 Transferir Titular Punto final
Medir volumen de 
KMnO4 gastadoKMnO4
D.2
 2 2 2 2 2 2H SO Niv
itar e inc bar or min tos en el ba o de ielo 
cti idad en imática de la catalasa
41
Determinación de proteínas mediante los 
métodos de Biuret y Kjeldahl
Las proteínas son las biomoléculas más abundantes 
y estructuralmente diversas del mundo natural. 
odas se com onen de aminoácidos tienen 
di erentes nciones incl endo: catálisis control 
metab lico de ensa inm nol ica sost n 
trans orte entre m c os otros n di erentes 
especies, una misma proteína presenta variaciones 
estr ct rales a esar de desem e ar na nci n 
semejante. 
Los aminoácidos de las proteínas se caracterizan 
or la resencia de c atro r os micos distintos 
e ce to la licina nidos co alentemente a 
un mismo átomo de carbono, conocido como 
carbono al a os c atro r os son: r o 
amino r o carbo ilo átomo de idr eno 
 cadena lateral denominada r o la c al 
se n s s caracter sticas micas es tili ada 
ara la clasi caci n de los aminoácidos
 tra s de s s r os amino N carbo ilo 
 los aminoácidos reaccionan entre si 
estableciendo un enlace covalente denominado 
enlace e dico a ni n de arios aminoácidos 
cond ce a la ormaci n de oli o tidos 
0 oli tidos 00 rote nas más 
de 00 aminoácidos os e tremos de la 
mol c la res ltante e contienen los r os 
amino y carboxilo intactos, correspondientes 
al rimer ltimo resid o de aminoácido de la 
cadena, se denominan extremos N y C terminal, 
res ecti amente 
as rote nas eden le arse de di erente 
manera, estableciendo los siguientes niveles de 
or ani aci n:
Estructura primaria: secuencia de aminoácidos 
nidos mediante enlaces e dicos enerando 
na cadena oli e dica 
Estructura secundaria: con ormaci n local e 
as me la cadena oli e dica lo rando s 
estr ct ra más estable P ede ser en orma de 
lices ojas iros 
Estructura terciaria: se de ne como la dis osici n 
de todos los átomos de una proteína en el 
espacio. Surge cuando las estructuras secundarias 
se pliegan entre si, generando una estructura 
tridimensional compleja de orden superior. 
En la estructura resultante, los aminoácidos 
idro bicos se bican acia el interior de la 
proteína, alejándose del agua del medio, mientras 
e los aminoácidos idro licos se bican acia la 
eri eria de la rote na 
Estructura cuaternaria: asociación de dos o más 
cadenas oli e dicas cada na con s ro ia 
estr ct ra terciaria de nida e establecen 
homo-oligómeros y hetero-oligómeros, cuando 
las cadenas son i ales o di erentes entre s 
res ecti amente
La mayoría de interacciones que estabilizan las 
proteínas son no covalentes, por lo tanto, el 
calentamiento de las mismas conduce a su ruptura 
y a la pérdida de las estructuras secundaria, 
terciaria y cuaternaria de las proteínas. En este 
caso las rote nas e erimentan el en meno 
de desnat rali aci n tros actores e eden 
desnat rali ar rote nas incl en: alores 
extremos de pH, solventes orgánicos y detergentes.
Por otra arte el estado nati o de na rote na 
a el en el c al stas son ncionalmente 
acti as se mantiene c ando las interacciones e 
estabilizan sus estructuras se conservan.
FUNDAMENTO TEÓRICO
Práctica
3
Práctica : eterminaci n de rote nas mediante los m todos de i ret jelda l 
4242
Interacciones estabilizadoras de las estructuras protéicas
Estructura primaria Estructura secundaria Estructura terciaria Estructura cuaternaria
nlace e dico P entes dis l ro
P entes de idr eno P entes salinos nteracciones idro bicas
lice 
oja 
Poli tido 
Poli tido 
Poli tido 
minoácidos
La solubilidad de las proteínas depende de 
actores intr nsecos e e tr nsecos l rinci al 
actor intr nseco e in e en la sol bilidad de 
las rote nas corres onde al ti o de aminoácidos 
resentes en la s er cie de las mismas Por s 
arte los actores e tr nsecos incl en el la 
temperatura, la presencia de solventes orgánicos 
 la er a i nica de la sol ci n
as rote nas son electrolitos m lti alentes 
se comportan de manera similar a los iones 
simples, cumpliendo la teoría de Debye-Hückel. 
n este sentido bajas concentraciones de sal en 
el solvente estabilizan los grupos cargados de las 
rote nas a mentando s sol bilidad sol bilidad 
or salado o altin in l en meno contrario 
reci itaci n or salado o altin o t se 
obser a a altas er as i nicas como res ltado de 
la competencia entre la proteína y los iones de la 
sal por las moléculas de agua de solvatación. 
La solubilidad de la mayoría de las proteínas, a una 
er a i nica constante resenta n m nimo en s 
punto isoeléctrico, dado que a este valor de pH las 
re lsiones electrostáticas entre las mol c las de 
soluto son mínimas. Los solventes orgánicos como 
la acetona el iso ro anol el cloro ormo son 
buenos precipitantes, debido a que presentan una 
baja constante dieléctrica. 
e n s sol bilidad las rote nas se clasi can en 
los si ientes r os:
Solubilidad y precipitación de las proteínas
GRUPO SOLUBLES EN INSOLUBLES EN EJEMPLOS
lb minas
Agua
Soluciones diluidas de 
sales como el NaCl
Soluciones ácidas y básicas 
diluidas
ol ciones de s l ato de 
amonio N sat ra-
das al 0 P
Coagulan por calor
actalb mina
oalb mina 
eroalb mina
lob linas
Soluciones diluidas de 
sales como el NaCl
Soluciones ácidas y básicas 
diluidas
Agua y soluciones de 
N sat radas al 0 
 P
Coagulan por calor
Ovoglobulina
Seroglobulina 
e mina lob lina de 
semilla
Práctica : eterminaci n de rote nas mediante los m todos de i ret jelda l
43
Prolaminas
lco ol 0 0 
Soluciones ácidas y básicas 
diluidas 
Agua y etanol absoluto
No coagulan por calor
liadina del tri o
Hordeína de la avena
Zeína del maíz
l telinas Soluciones ácidas y básicas diluidas
Solventes neutros, solucio-
nes salinas y alcohólicasCoagulan por calor
l telina del tri o ri e na 
del arroz
Escleroproteínas -
Agua y soluciones ácidas y 
básicas diluidas, salinas y 
alcohólicas, resistentes a 
las en imas roteol ticas
Colágeno
lastina
Fibroina
eratina
Existen diversos métodos para determinar 
el contenido proteico de una muestra. Entre 
stos se incl en: análisis or densitometr a 
es ectro otometr a isible de com lejos 
coloreados es ectro otometr a ara detecci n 
de aminoácidos aromáticos o determinaci n del 
contenido total de nitrógeno en la muestra. La 
elecci n de n m todo en artic lar de ende 
de actores como la nat rale a l ida o s lida 
 cantidad de m estra la ra ide la e actit d 
sensibilidad deseados.
n la resente ráctica se c anti cará el contenido 
proteico de una muestra, mediante los métodos 
de Biuret y Kjeldahl.
Método de Biuret: técnica apropiada para la 
c anti caci n de m estras en sol ci n e basa 
en el tratamiento de stas con s l ato de cobre en 
sol ci n alcalina reacti o de i ret enerando 
n color lila caracter stico c ando los com estos 
analizados presentan más de dos enlaces 
e dicos 
El color generado se debe al complejo de 
coordinación que se establece entre el átomo 
de cobre de la solución con cuatro átomos de 
nitr eno ro enientes de los enlaces e dicos 
como se indica en la si iente ra:
Cuantificación de proteínas
R R
Cu
O OO
R R RO OO
H
HH
R
C
H
C CCCC
N
H
N
H
N
H
N
H
N
H
N
2+
CC
H
CC
H
CC
H
Los espectros de absorción de los complejos 
de cobre ormados or di erentes rote nas 
son similares or esta ra n es osible tili ar 
cualquier proteína como patrón de coloración. 
La concentración mínima requerida de muestra 
es 1-20 mg/mL. Compuestos como glicerol, 
amoniaco ca san inter erencia
todo de jelda l: t cnica til ara la 
c anti caci n de m estras en sol ci n o s lidas 
Práctica : eterminaci n de rote nas mediante los m todos de i ret jelda l 
4444
catalizador
calorN or ánico N 
i esti n
N Na N Na
estilaci n or arrastre de a orestilaci n or arrastre de a or
N N 
Absorción
N l N l 
Titulación
Indicador tashiro
Indicador tashiro
os orcentajes de nitr eno total Nt de rote na br ta se calc lan a artir del ol men de ácido 
clor drico de concentraci n conocida astado en la tit laci n de ac erdo con las si ientes rm las:
Nt = Nitrógeno total
m ol men de l astado en la tit laci n de la m estra
b ol men de l astado en la tit laci n del blanco
NHCl = Normalidad del HCl
a m lti licaci n del Nt or 00 se basa en el ec o de e el contenido romedio de nitr -
eno en las rote nas es 
Nt m
-Vb NHClx14x100
eso de m estra di erida m 
Prote na br ta Nt 00
16 
l m todo se dise ara determinar el contenido 
de nitr eno total nitr eno roteico nitr eno 
no roteico en na m estra roteica siendo el 
método de análisis de proteínas más usado en la 
actualidad. 
El contenido de proteína verdadera puede 
determinarse mediante una extracción de ésta, 
reci itándola con ácido tricloroac tico 0 
 c anti cando el nitr eno no roteico 
e ermanece en el sobrenadante a di erencia 
entre el nitrógeno total y el nitrógeno no proteico, 
corresponde a la proteína verdadera.
Las reacciones que ocurren durante el proceso 
son:
El método es reproducible y requiere el 
tratamiento de muestras con una concentración 
de proteína mayor a 3 mg/mL ó 3 mg/g, para 
m estras l idas s lidas res ecti amente No 
se aconseja la implementación de éste método 
para la determinación de numerosas muestras, 
debido a que es dispendioso y demorado.
Práctica : eterminaci n de rote nas mediante los m todos de i ret jelda l
45
Objetivo: om arar dos m todos de c anti caci n de rote nas i ret jelda l desde el 
punto de vista de sensibilidad y rapidez.
REACTIVOS ili enciar la c a de se ridad de todos los reacti os s bra ados
PROCEDIMIENTO
1. Preparación de la muestra
Pesar ramos de arina e etal dis onerla en n t bo alcon de m dicionar 0 ml de Na l 
P a itar d rante 0 min tos em leando orte centri ar a 00 r m or min tos trans erir 
el sobrenadante en n matra a orado de m com letar ol men con Na l P escartar el 
residuo. 
sta m estra constit e el tracto Proteico e contiene las alb minas lob linas a c anti car
2. Cuantificación mediante el método de Kjeldahl 
a. Digestión: tomar dos matraces jelda l ara di esti n adicionar en no de ellos m del tracto 
Proteico en el otro m de a a destilada ste será el blanco del rocedimiento lo reali ará n nico 
r o cada matra adicionar en el si iente orden: 
• 100 mg de mezcla catalizadora
• 30 gotas de H2SO4 concentrado
Colocar los matraces en el digestor, aumentado la temperatura gradualmente hasta que la solución 
tome na coloraci n erde esmeralda n riar los balones d rante min tos
b. Destilación y absorción: bajo la s er isi n del ro esor reali ar el si iente rocedimiento en el 
destilador:
rans erir los rod ctos de la di esti n al emb do del destilador la ar el matra de di esti n dos eces 
con m de a a destilada rec erando el remanente de m estra trans erir estos la ados al emb do 
Dejar pasar la muestra suavemente hacia el dedal de reacción.
dicionar 0 m de ácido b rico P otas de indicador as iro en n erlenme er de m la 
sol ci n se torna roji a obre esta sol ci n se reco erá el destilado
• cido b rico P
• H2SO4 concentrado
• Harina vegetal
• HCl 0.01N valorado
• Indicador de Tashiro
• e cla catali adora n 0 selenio
• Na l P
• Na 0 P
• Patr n de rote na alb mina de e o o case na m m
• eacti o de i ret
Práctica : eterminaci n de rote nas mediante los m todos de i ret jelda l 
4646
re ar ota a ota m de Na 0 P desde el emb do del destilador acia el dedal de reacci n 
dejando un remanente de la solución en el embudo, la cual actuará como sello que evitará la pérdida 
de vapores.
bser ar el cambio de coloraci n de la sol ci n tili ada ara recibir el destilado a medida e transc rre 
el roceso la sol ci n se tornará a l contin ar la destilaci n or min tos adicionales
c. Titulación: tili ar l 0 0 N ara tit lar la sol ci n contenida en el erlenme er asta obtener la 
coloraci n inicial sol ci n roji a
3. Cuantificación mediante el método de Biuret
a n t bos de ensa o N marcados a re ar los si ientes reacti os: 
eacti os m Blanco
Patrones Muestras
P1 P2 P3 P4 P5 M1 M2
Patrón de proteína 5mg/mL - 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 - -
Extracto Proteico - - - - - - 0,5 1
Na l P 2 1,7 1,4 1,1 0,8 0,5 1,5 1
eacti o de i ret 3 3 3 3 3 3 3 3
b e clar el contenido de cada t bo inc bar or 0 min tos a leer en el es ectro ot metro a 
540nm.
RESULTADOS
m rimir dili enciar entre ar el ormato de n orme de aboratorio corres ondiente
N e debe res onder en el ormato de n orme de aboratorio
 l re arar el tracto Proteico or error se tili a a en l ar de Na l P se obt o en 
el sobrenadante? ¿Qué proteínas quedaron en el precipitado? 
 l leer la absorbancia a 0 nm de los t bos e contienen el tracto Proteico se obt ieron alores 
e sobre asan a ellos tili ados ara constr ir la c r a de calibraci n en el m todo de i ret 
estrategias aplicaría en esta situación? Mencione y explique al menos dos estrategias.
 ál es la di erencia entre rote na br ta rote na erdadera li e
 ál es la nci n de la me cla catali adora sada en el m todo de jelda l 
 es c mo nciona el indicador de as iro
 áles son los m todos o ciales de análisis de rote nas en alimentos
REFERENCIAS 
arret ris am ioc emistr t edition roo s ole en a e earnin 0 0 oston 
USA. Capítulos 4-6
Práctica : eterminaci n de rote nas mediante los m todos de i ret jelda l
47
e ico n ola elasco as de aboratorio de io mica ara la arrera de mica 
edici n olecci n Notas de lase ni ersidad Nacional de olombia 0 o otá olombia Práctica 
 Pá ina 
Pase N et al Protein tr ct re tabilit and ol bilit in ater and t er ol entsP il rans oc 
ond 0 : 
4848
PROCEDIMIENTO
1 
2
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS DEL FRIJOL
Pesar 2 g de harina de frijol y adicionar 10 mL de 
NaCl 1% (P/V)
Agitar en Vortex por 10 minutos y centrifugar a 
3500 rpm por 5 minutos
3 Tomar el sobrenadante y completar el volumen de 25 mL con NacCl 1% (P/V)
4 Marcar como “Extracto Proteico”
Método de Biuret
Método de Kjeldahl
[mL]
! " # $ % &
'()* '+,*
"-
Determinación de proteínas mediante los métodos de Biuret y Kjeldahl
49
PROCEDIMIENTO
anti caci n de rote nas or el m todo de jelda l
 N
tracto roteico 
e cla catali adora
cido b rico P
H concentrado
eacti os
Na 0 P
l 0 0 N
ndicador as iro
re ar en n matra de di esti n en 
el si iente orden: 
 m de Extracto Proteico 
00 m de me cla catali adora 
0 otas de concentrado
Balón de 
digestión
 Incubar sobre
 hornilla ~ 45 min 
 Incubar hasta 
decolorar y enfriar
Realizar en cabina de extracción debido a la emisión de gases tóxicos
2.1
 N N
rans erir al 
destilador 2.2
dicionar Na 
0 P
2.3 estilar absorber el destilado 2.4
etener destilaci n min 
des s de iraje a a l
10 mL ácido 
bórico + 2 
gotas indicador 
de Tashiro
 N
HCl 0,01 N Punto final
Medir volumen de 
HCl gastado
Determinación de proteínas mediante los métodos de Biuret y Kjeldahl
5050
PROCEDIMIENTO
1 Agregar en el siguiente orden la cantidad en mL de los reactivos indicados
C
D
A
B 
Blanco Patrones Muestras
Agitar e incubar durante 10 minutos a 37° C
Medir absorbancia a 540 nm
 - 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 - -
 - 1,0
 1,0
 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0 3,0
 1,5 0,5 0,8 1,1 1,4 1,7 2,0
 - - - - -
Patrón de proteína 5 mg/mL
Extracto Proteico 
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS MEDIANTES EL MÉTODO DE BIURET
Extracto proteico 
NaCl 1% (P/V)
eacti o de i ret
Patr n de alb mina o case na m m
eacti os
NaCl 1% (P/V) 
Reactivo de Biuret
0,5
B 1 2 3 4 5 M1 M2
B1 1 2 3 4 5 M1 M2
Determinación de proteínas mediante los métodos de Biuret y Kjeldahl
57
as in esti aciones bio micas eneralmente 
re ieren la ri caci n arcial o com leta de las 
biomol c las bajo est dio ado e las entes 
biol icas c l las tejidos contienen n merosos 
com onentes ácidos n cleicos carbo idratos 
l idos rote nas el roceso de ri caci n 
resulta complejo y requiere de gran trabajo. Por 
otra parte, la biomolécula de interés puede ser 
inestable de radarse ácilmente o encontrarse 
en bajas concentraciones di c ltando s 
aislamiento.
P ri caci n de la a ina: 
Extracción de proteína
El primer paso para aislar una proteína consiste 
en la ruptura o lisis celular, para posteriormente 
e traerla con n amorti ador adec ado os 
m todos de r t ra cel lar se clasi can de 
ac erdo a rinci ios sico micos s a licaci n 
de ende de las caracter sticas estr ct rales de las 
m estras de artida 
stos m todos incl en:
FUNDAMENTO TEÓRICO
Práctica
4
MÉTODOS FÍSICOS
Choque osmótico: consiste en suspender las células en una solución hipotónica con respecto al interior celular. Debido 
a la di erencia osm tica el a a di nde al interior de la c l la ca sando s inc amiento r t ra todo til ara 
lisar células sin pared celular como las células animales. 
Maceración, molienda y presión: m todos mecánicos de lisis cel lar e em lean morteros molinos rensas rancesas 
instr mentos e asan las c l las a ran elocidad a tra s de n e e o ori cio res ecti amente es ltan tiles 
para lisar células vegetales, bacterias y levaduras.
Termólisis: se ndamenta en someter las c l las a cambios abr tos de tem erat ra a licando ciclos de con elamiento 
con nitr eno l ido descon elamiento a tem erat ra entre a ormaci n de cristales de a a al 
interior cel lar e lica el en meno de crio r t ra e se resenta en este m todo
Ultrasonido o sonicación: las c l las se res s enden en na sol ci n amorti adora en la c al se s mer e na nta de 
metal conectada a n dis ositi o e enera ondas de ltrasonido estableciendo el en meno de ca itaci n ormaci n 
de e e as b rb jas e estallan iolentamente lisando las c l las
MÉTODOS QUÍMICOS
Álcalis: las aredes cel lares de bacterias lantas eden ser de radadas or com estos alcalinos 0 
desestabili ando la inte ridad cel lar de este ti o de m estras Posteriormente es necesario ne trali ar el de las 
muestras con el propósito de estabilizar las biomoléculas extraídas. 
Detergentes: se tili an am liamente ara e traer rote nas l idos de las membranas cel lares liberando el contenido 
cito lasmático os deter entes más com nes son el dodecil s l ato de sodio el rit n 00
Solventes orgánicos: el tratamiento con acetona dimetil s l ido tol eno ciertos alco oles ermiten e traer los 
lípidos de las membranas celulares, contribuyendo a la extracción de componentes intracelulares. Sin embargo, la 
desnaturalización de proteínas es la principal desventaja del método.
Práctica : P ri caci n de la a ina tracci n de rote nas 
5858
MÉTODOS ENZIMÁTICOS
Lisozimas: a orecen la r t ra de las aredes cel lares bacterianas al catali ar la idr lisis de los enlaces l cos dicos 
entre el ácido N acetilm rámico la N acetil l cosamina del e tido licano com onente rinci al de la ared 
cel lar de bacterias ram ositi as
Glucanasas: idrolasas em leadas ara debilitar las aredes cel lares de on os al de radar el l cano olisacáridos 
de l cosa resente en las mismas
Otras enzimas empleadas en los protocolos de lisis celular incluyen celulasas, manasas, quitinasas y xilanasas.
Es importante mencionar que en los protocolos 
de ruptura celular se pueden combinar varios 
de los métodos recién expuestos para mejorar la 
extracción de los componentes de interés. Para 
el caso de las proteínas, una vez que ésta se ha 
extraído de su entorno natural, queda expuesta 
a actores e eden de radarla como cambios 
bruscos de pH, temperaturas extremas y la 
acci n de las roteasas en imas e idroli an 
los enlaces e dicos Para e itar o minimi ar 
la degradación de las proteínas, durante los 
rocesos de e tracci n ri caci n se tili an 
amorti adores e in ibidores de roteasas 
conservando las muestras a bajas temperaturas 
 rocediendo de manera rá ida 
El resultado de los métodos de lisis celular es 
n e tracto cr do e contiene na me cla de 
biomoléculas, membranas y restos celulares. El 
e tracto cr do se somete a centri aci n ara 
eliminar los restos celulares y demás componentes 
insol bles l ro sito de la centri aci n 
es obtener un sobrenadante que contenga la 
biomolécula de interés. No obstante, en algunas 
ocasiones la molécula bajo estudio permanece en 
la racci n insol ble re iriendo la tili aci n de 
detergentes o agentes caotrópicos que permitan 
su resuspensión.
LECTINAS
i ersas amilias e etales es ecialmente 
las le minosas abaceae contienen en s s 
semillas rote nas denominadas lectinas las 
cuales se organizan como dímeros o tetrámeros, 
dependiendo del pH. El peso molecular de 
estas rote nas ar a entre 0 00 a 
caracterizándose por su propiedad de unirse 
a carbo idratos artici ando en rocesos de 
reconocimiento celular. Las bacterias, algunos 
eces e in ertebrados tambi n resentan lectinas 
iertas lectinas como la ri ro imina aislada desde 
la lanta imenia americana ejercen acti idad 
anti roli erati a en l neas cel lares de le cemia 
cáncer de próstata.
n la resente ráctica se re arará n e tracto 
de rote nas artiendo de arina obtenida de 
semillas de aba Vicia faba ara tili arlo en la 
ri caci n de la a ina lectina es ec ca de esta 
planta.
Práctica : P ri caci n de la a ina tracci n de rote nas
59
bjeti o: btener n e tracto de rote nas a artir de arina de aba icia aba
PROCEDIMIENTO
Extracción de proteínas:
olocar 0 de arina de aba en n erlenme er o aso de reci itados adicionar 0 m de Na l P 
a itar i orosamente or lo menos ora con a itador ma n tico entri ar a 000 r m or 0 min tos 
y separar el sobrenadante del precipitado. Ajustar el pH del extracto a 4,65 y medir el volumen total 
obtenido. Marcar como Extracto Crudo,mantener sobre hielo y guardar 1 mL para pruebas posteriores 
c anti caci n de rote nas electro oresis ste e tracto cr do contiene alb minas lob linas
Separación de albúminas y globulinas: 
Colocar 5 mL del Extracto Crudo en un tubo Falcon, adicionar LENTAMENTE Y CON AGITACIÓN SUAVE, 
s l ato de amonio macerado re iamente asta na orcentaje de sat raci n del 0 tilice el Anexo 
1 de la a ara calc lar la cantidad de sal a adicionar isol er com letamente el s l ato de amonio e 
inc bar en ba o de ielo or min tos entri ar a 000 r m or min tos se arar el sobrenadante 
del reci itado l sobrenadante el reci itado contienen alb minas lob linas res ecti amente
Medir el volumen del sobrenadante, marcar como ALBÚMINAS y guardar para pruebas posteriores 
c anti caci n de rote nas electro oresis
es s ender el reci itado en Na l P com letar en bal n ol m trico a m arcar como 
GLOBULINAS ardar ara r ebas osteriores c anti caci n de rote nas ri caci n de a ina 
electro oresis
Cuantificación de proteínas por absorción en el ultravioleta:
a onstr ir na c r a de calibraci n tili ando como atr n na sol ci n de case na de m m 
medir s absorbancia a 0 nm:
eacti os m Blanco
Patrones
P1 P2 P3 P4 P5 P6
Patrón de proteína 5mg/mL - 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
Na l P 2,5 2,3 2,1 1,9 1,7 1,5 1,3
b ra car: Absorbancia 280 nm VS Concentración de proteína (mg/mL). Determinar la ecuación de la 
recta res ltante el alor del coe ciente de re resi n 
c alc lar la concentraci n de rote na en las m estras tracto r do lb minas lob linas 
interpolando en la curva de calibración su absorbancia corregida y usando la ecuación de la recta. Se 
deben dil ir las alb minas lob linas : 0 : 0 en Na l P res ecti amente
Práctica : P ri caci n de la a ina tracci n de rote nas 
6060
RESULTADOS
m rimir dili enciar entre ar el ormato de n orme de aboratorio corres ondiente
CUESTIONARIO e debe res onder en el ormato de n orme de aboratorio
 es c mo nciona n metro ealice n es ema
 ál es la nci n de aj star el del tracto r do a 
 nciones biol icas desem e a la a ina
REFERENCIAS
de artine n ola de me ecto de idr lisis en imática sobre la acti idad 
to emoa l tinante de la a ina e ista olombiana de mica 0 : 
arrison ell disr tion n: oo o n ditor in ie om re ensi e iotec nolo nd 
dition ord lse ier 0 Pá inas 
oc e ab s ind a ic ol tion t dition oc e ia nostics mb 0 ann eim erman 
a t lo Pá ina 
61
PROCEDIMIENTOP ri caci n de la a ina tracci n de rote nas
1 Pesar 10 g de harina de haba.
EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS
2 Adicionar 30 mL de NaCl 1% (P/V) 
3 Agitar 1 hora y centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos
4 Tomar sobrenadante y ajustar pH a 4,65
5 Medir volumen y marcar como M1: “Extracto Crudo”
6 Guardar 1 mL para pruebas posteriores
[mL]
Sobrenadante
tracto en imático
Precipitado
M11 mL
6262
PROCEDIMIENTO P ri caci n de la a ina tracci n de rote nas
SEPARACIÓN DE ALBÚMINAS Y GLOBULINAS
1 Tomar 5 mL del “Extracto Crudo”
2 Adicionar LENTAMENTE Y CON AGITACIÓN SUAVE sulfato de amonio hasta 50% de 
saturación.
3 Disolver COMPLETAMENTE el sulfato de amonio e incubar sobre hielo por 15 minutos
4 Centrifugar a 4000 rpm por 15 minutos
Sobrenadante Precipitado
Medir volumen, marcar como 
“Albúminas” y guardar para 
osteriores r ebas c anti caci n
 y electroforesis).
Resuspender en NaCl 1% (P/V)
hasta completar 25 mL y
marcar como “Globulinas”.
Guardar para pruebas posteriores
c anti ci n ri caci n 
electroforesis).
[mL]
Albúm
inas
Globulinas
63
PROCEDIMIENTOP ri caci n de la a ina tracci n de rote nas
Blanco Patrones
B 1 2 3 4 5 6
CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS POR ABSORCIÓN EN EL ULTRAVIOLETA 
A
B
Agitar y leer absorbancia a 280 nm
 - 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2
2,5 2,3 2,1 1,9 1,7 1,5 1,3
Patrón de proteína 5 mg/mL (mL)
NaCl 1% (P/V) (mL)
Preparar diluciones de las muestras a cuantificar y leer absorbancia a 280 nm.
Se recomiendan diluciones de albúminas y globulinas 1:250 y 1:50 en 
NaCl 1% (P/V), respectivamente.
Patrón de albúmina o caseína 5 mg/mL
NaCl 1% (P/V)
Reactivos
67
P ri caci n de la a ina: 
romato ra a de a nidad
Práctica
5
os m todos de ri caci n de rote nas 
a ro ec an distintas ro iedades sico
químicas de éstas para lograr su aislamiento. Las 
ro iedades en menci n incl en tama o car a 
a nidad e idro obicidad de la rote na de inter s 
no de los m todos más tili ados ara se arar 
rote nas es la cromato ra a en col mna
as col mnas cromato rá cas contienen rellenos 
de material s lido con caracter sticas micas 
es ec cas e constit en la ase estacionaria 
 tra s de la col mna e na sol ci n 
amorti adora denominada ase m il la c al 
permite la entrada del extracto crudo a la columna. 
ada rote na mi rará a distinta elocidad a 
tra s de la ase estacionaria se n el rado de 
interacci n con dic a ase
eneralmente los rotocolos cromato rá cos se 
reali an de orma semia tomática en la c al la 
ase m il se ace asar a tra s de la col mna 
or acci n de na bomba eristáltica mientras 
e n detector n colector de racciones irán 
analizando y recogiendo las muestras que salen de 
la columna. Los detectores permiten monitorear 
las muestras en el rango ultravioleta, a 210 y/o 
0 nm ara el enlace e dico los aminoácidos 
aromáticos res ecti amente 
os ti os de cromato ra a tili ados ara la 
ri caci n de rote nas son:
1. Filtración en gel o cromatografía de exclusión 
molecular: la ase estacionaria está constit ida or 
ar c las de ol meros de di erente orosidad 
en c o tama o reside el rinci io de se araci n 
Así, las proteínas grandes no pueden penetrar los 
oros de las ar c las de la ase estacionaria 
son eluidas rápidamente de la columna. En este 
caso se dice que dichas proteínas son excluidas 
de la matri Por s arte las rote nas e e as 
penetran por los poros, recorriendo un camino más 
lar o siendo el idas osteriormente l tama o 
de los poros internos depende de la naturaleza del 
ol mero e constit e la ase estacionaria
2. Cromatografía de intercambio iónico: la 
ase estacionaria está constit ida or so ortes 
con car as ositi as o ne ati as las c ales son 
ne trali adas or los iones resentes en la ase 
móvil. Cuando el extracto de proteínas ingresa a 
la columna, aquellas proteínas con más tendencia 
a unirse al soporte reemplazan reversiblemente 
los iones de la ase m il ni ndose al so orte 
En este caso, las proteínas se han intercambiado 
por los iones que neutralizaban el soporte. Las 
rote nas más car adas se nirán ertemente al 
intercambiador or lo tanto serán más di ciles de 
el ir a a nidad con la e na rote na se ne a 
n intercambiador de ende de la er a i nica del 
medio, debido a la competencia entre los grupos 
car ados de la rote na los iones de la ase m il 
Por lo tanto, la elución de las proteínas retenidas 
se lo ra a mentando rad almente la er a 
i nica de la ase m il e esta orma el irán 
inicialmente las proteínas débilmente retenidas, 
mientras que las proteínas más cargadas eluirán 
c ando la er a i nica sea s erior 
ando el so orte resenta car as ositi as estará 
ne trali ado or iones de car a ne ati a aniones 
de la ase m il los c ales se intercambiarán or 
rote nas c a car a neta tambi n es ne ati a 
n este caso la cromato ra a se denomina 
de intercambio aniónico. Por el contrario, 
c ando el so orte resenta car as ne ati as 
ste intercambiará cationes denominándose 
cromato ra a de intercambio cati nico 
3. Cromatografía hidrofóbica: la ase estacionaria 
es a olar idro bica ra n or la c al las 
proteínas se unirán al soporte mediante sus 
FUNDAMENTO TEÓRICO
Práctica : P ri caci n de la a ina romato ra a de a nidad
6868
residuos de aminoácidos apolares. Por lo tanto, 
cuanto más residuos apolares exhiba la proteína 
en s s er cie será retenida más ertemente 
en la columna. En este caso la elución de la 
proteína se logra aumentando la apolaridad de la 
ase m il
4. Cromatografía de afinidad: numerosas proteínas 
tienenla ca acidad de nirse es ec camente 
a ciertas mol c las mediante niones ertes 
no covalentes. En esta técnica la molécula que 
se une a la proteína se denomina ligando, el 
cual se enlaza covalentemente a una matriz o 
soporte inerte. Cuando el extracto con la mezcla 
de proteínas se aplica a la columna, la proteína 
a n or el li ando se nirá a ste mientras e 
las demás proteínas saldrán de la columna con 
la ase m il a el ci n de la m estra se reali a 
estableciendo n en meno de com etencia al 
a mentar la concentraci n del li ando en la ase 
m il Por ejem lo c ando na ase estacionaria 
está constit ida or carbo idratos como la 
l cosa las rote nas a nes a los mismos serán 
retenidas y eluirán posteriormente al pasar en la 
ase m il altas concentraciones de l cosa n 
este caso la ase estacionaria la l cosa de la 
ase m il com iten or la rote na de inter s 
os sistemas cromato rá cos eden 
a tomati arse tili ando bombas de alta resi n 
00 00 bares col mnas con ma or oder de 
retención. Estos sistemas reducen notablemente 
los tiem os de o eraci n e incrementan los 
orcentajes rendimiento de las ri caciones 
l P ast Protein i id romato ra es el 
sistema act almente más em leado ara tal n
n la resente ráctica se reali ará n rotocolo 
de cromato ra a de a nidad em leando la 
ase estacionaria e ade 00 n so orte 
com esto or de trano olisacárido de l cosa 
el c al ermitirá ri car la a ina a ro ec ando 
s a nidad or los carbo idratos
Práctica : P ri caci n de la a ina romato ra a de a nidad
69
bjeti o: P ri car la a ina resente en n e tracto de lob linas de arina de aba icia 
aba mediante cromato ra a de a nidad
PROCEDIMIENTO
Cromatografía de afinidad:
 cada r o se le entre ará na col mna em acada con e ade 00 la c al se encontrará e ilibrada 
en Na l P ste so orte tradicionalmente se sa ara cromato ra a de ltraci n en el sin embar o 
en esta ocasi n se a ro ec ará s estr ct ra mica ara reali ar cromato ra a de a nidad
Aplicación del extracto de globulinas:
etirar la sol ci n de Na l P e se enc entra sobre la s er cie de la ase estacionaria de la 
columna, mediante la apertura de la llave de paso de la columna. EVITAR QUE EL SOPORTE SE SEQUE. 
Por esta ra n d rante el rotocolo debe mantener n remanente de ase m il sobre la ase 
estacionaria.
Adicionar con pipeta pasteur, LENTAMENTE Y POR LAS PAREDES DE LA COLUMNA, 7.5 mL del extracto 
de globulinas. EVITAR PERTURBAR LA SUPERFICIE DE LA FASE ESTACIONARIA. e o ermitir e la 
muestra ingrese en el soporte, mediante la apertura de la llave de paso. 
Elución de proteínas no retenidas:
na e la m estra a a in resado en s totalidad al so orte el ir la m estra al adicionar Na l P en 
la arte s erior de la col mna reco er racciones de m en t bos de ensa o ontin ar adicionando 
Na l P sobre la ase estacionaria asta obser ar la el ci n com leta de la racci n de rote nas e 
no interact con el so orte rote nas no retenidas Para esto determinar la resencia de rote nas en 
cada na de las racciones reco idas monitoreando s absorbancia a 0 nm tili ar como blanco Na l 
 P 
onser ar la racci n de ma or absorbancia ara r ebas osteriores electro oresis
RESULTADOS
m rimir dili enciar entre ar el ormato de n orme de aboratorio corres ondiente
CUESTIONARIO e debe res onder en el ormato de n orme de aboratorio
 Por se tili a Na l P como ase m il en la ráctica li e
 Para ri car la a ina n r o de trabajo tili na col mna e ade e ilibrada con l cosa 
 P Na l P ra car el er l de el ci n es erado na e nali ado el rotocolo de ri caci n
 ál es el objeti o de monitorear la absorbancia a 0 0 nm de las di erentes racciones reco idas 
d rante el rotocolo de ri caci n
Práctica : P ri caci n de la a ina romato ra a de a nidad
7070
REFERENCIAS
Asensio, E. Estudio comparativo de la actividad hemaglutinante de algunas leguminosas colombianas. 
Purificación y caracterización de la hemaglutinina del haba (Vicia faba). Tesis de grado en Química. 
Universidad Nacional de Colombia. Bogotá. 1975
López Rico E, Anzola Velasco C. Guías de Laboratorio de Bioquímica para la Carrera de Química. 
edición. Colección Notas de Clase. Universidad Nacional de Colombia. 0 o otá olombia Práctica 
 Pá ina 
71
PROCEDIMIENTOP ri caci n de la a ina romato ra a de a nidad
PURIFICACIÓN DE FAVINA POR CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Columna Sephadex G-75
NaCl 1% (P/V)
Glucosa 5% (P/V) en NaCl 1% (P/V)
Materiales y reactivos
Extracto de 
globulinas
1
Adicionar 7.5 mL 
de la muestra
Comenzar a recoger 
fracciones de 3 mL c/u
NaCl 1% (P/V)2
Lavar con 
NaCl 1% (P/V)
Continuar recogiendo
fracciones de 
3 mL c/u
Monitorear Abs 280 nm
hasta obtener línea 
base (≈ 0)
3
Blanco: NaCl 1% (P/V)
Abs
Gluosa-NaCl4
Eluir con 
glucosa 5% (P/V)-
NaCl 1% (P/V)
Recoger fracciones 
de 1.5 mL c/u
Monitorear Abs 280 nm
hasta obtener línea 
base (≈ 0)
5
Blanco: Glucosa 5% (P/V) - 
NaCl 1% (P/V)
Abs
Ab
s. 
28
0 
nm
Volumen (mL)
6 Almacenar 
fracción 
de mayor 
absorbancia
Almacenar 
fracciones 
de mayor 
absorbancia
Utilizar las muestras almacenadas para 
posterior análisis por electroforésis
75
P ri caci n de la a ina: 
lectro oresis
Práctica
6
Electroforesis
a electro oresis es na t cnica sim le rá ida 
sensible que permite separar moléculas cargadas, 
bajo la in encia de n cam o el ctrico l 
principio de la técnica se basa en el siguiente 
en meno: al a licar n cam o el ctrico las 
moléculas cargadas migran hacia los electrodos 
de olaridad o esta sta t cnica anal tica se 
tili a rinci almente ara el est dio de ácidos 
nucleicos y proteínas.
a elocidad de mi raci n de las mol c las 
es directamente proporcional al producto de su 
car a e ecti a or la intensidad del cam o 
el ctrico e in ersamente ro orcional al 
coe ciente de ricci n el c al es relati o al 
radio r de la mol c la a la iscosidad del medio 
de se araci n eamos:
FUNDAMENTO TEÓRICO
v = qE/F
s miendo e la mol c la es es rica 
a licando la le de to es la c al se re ere a la 
er a de ricci n e erimentada or objetos 
es ricos en n medio iscoso como los so ortes 
electro or ticos se tiene e:
 r
 artir de estas ec aciones la elocidad de la 
mol c la será:
 r 
Por consiguiente, la velocidad de migración de 
las mol c las en la electro oresis de ende de s 
car a e ecti a la intensidad del cam o el ctrico el 
tama o de la mol c la la iscosidad del medio
La carga de las moléculas depende principalmente 
de los r os ioni ables resentes en s s er cie 
cuyo signo y magnitud depende a su vez del pH 
 la er a i nica del medio n consec encia la 
se araci n tima de las mol c las mediante 
electro oresis ede e ect arse seleccionando las 
condiciones a ro iadas de er a i nica
a ma or di erencia entre m todos electro or ticos 
es el ti o de so orte el c al ede ser de a arosa 
almidón, celulosa o poliacrilamida. La celulosa 
es usada como soporte para separar moléculas 
de bajo peso molecular como aminoácidos 
y carbohidratos. Por su parte, los geles de 
poliacrilamida y agarosa son ampliamente usados 
para macromoléculas como proteínas y ácidos 
nucleicos.
lectro oresis en eles de oliacrilamida P :
Los geles de acrilamida presentan las siguientes 
caracter sticas:
1. Alto poder de resolución para proteínas y 
ácidos nucleicos.
2. Interacciones mínimas entre la matriz y las 
moléculas migrantes.
3. stabilidad sica de la matri
4. Alta sensibilidad.
a electro oresis en el de oliacrilamida 
permite mejorar la resolución de separación 
de los componentes de una muestra dado que 
la separación se basa no solo en la movilidad 
electro or tica sino tambi n en la acci n de 
tamizado molecular. El gel es comparable con un 
tamiz molecular donde las moléculas grandes no 
se mo erán ácilmente la elocidad de mi raci n 
de las mol c las e e as será ma or
Los geles de poliacrilamida son preparados por la 
polimerización de radicales libres de acrilamida 
 s entrecr amiento con N N metilen bis
Práctica :P ri caci n de la a ina lectro oresis
7676
acrilamida. La polimerización química está 
controlada or el ers l ato de amonio la 
N N N N tetraetilendiamina e act an 
como iniciador catali ador res ecti amente 
El poder de resolución y el intervalo de 
tama o molec lar a se arar de enden de la 
concentración de acrilamida y bis-acrilamida. 
ajas concentraciones de acrilamida 
producen geles de resolución con poros grandes 
que permiten el análisis de biomoléculas de 
alto peso molecular. Por el contrario, altas 
concentraciones de acrilamida rod cen 
eles con oros e e os e ermiten el análisis 
de biomol c las de menor tama o rote nas
l tama o del oro ede controlarse con 
e actit d en orma re rod cible or la 
concentraci n total de acrilamida el rado de 
entrecr amiento :
 (a+b) x 100
 V
 
 b x 100
 (a+b)
 
%C =
%T = a = masa de acrilamida en ramos
b = masa de N N metilen bis acrilamida en ramos
V = ol men en m 
Electroforesis en gel discontinuo:
n esta t cnica a dos onas di erentes en la 
placa del gel, una superior o gel de concentración 
 otra in erior o el de se araci n as di erencias 
entre ambas onas radica en el el l el 
de concentración, cuyo pH es 6,8, presenta poros 
de ran tama o Por s arte el el de 
separación, cuyo pH es 8.8, presenta poros de 
menor tama o 
stas di erencias rom e en la ormaci n de 
bandas concentradas de los componentes de la 
muestra en el gel de concentración y una mejor 
resolución en el gel de separación. Por tanto, 
la electro oresis en el discontin o ermite 
excelente resolución y es el método de elección 
para el análisis de proteínas porque las bandas 
con contenidos e e os de rote na 
eden ser detectadas ácilmente al te ir el el 
des s de la corrida electro or tica
Electroforesis en gel de poliacrilamida con 
dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE):
Técnica que permite determinar el peso molecular 
P de las rote nas anali adas al ser se aradas 
or electro oresis en resencia de n deter ente 
ani nico como el dodecil s l ato de sodio 
de n a ente red ctor como el merca toetanol 
El SDS rompe la estructura secundaria, terciaria 
y cuaternaria de las proteínas, generando 
cadenas oli e dicas lineales c biertas con 
 car ándolas ne ati amente l se ne 
de manera ro orcional al tama o de la cadena 
 mol c la resid os de aminoácidos l 
 merca toetanol desnat rali a la rote na or 
red cci n de los entes dis l ro 
En consecuencia, la movilidad del complejo 
rote na de enderá del tama o de la 
mol c la donde las de ma or tama o serán 
retardadas or el e ecto de tami molec lar del 
el mientras e las mol c las de menor tama o 
tendrán una mayor movilidad. 
Para determinar el PM de una proteína, la cual ha 
sido tratada con P merca toetanol 
0 sometida a eb llici n or min tos 
se corre simultáneamente con una mezcla de 
rote nas de P conocido marcadores de P 
na e corrida la electro oresis te ido el el 
se miden las mo ilidades electro or ticas de 
los marcadores de PM para construir una curva 
de calibraci n o P s o ilidad relati a 
tili ando la ec aci n de la recta res ltante se 
determina el PM de la proteína objeto de estudio. 
Práctica : P ri caci n de la a ina lectro oresis
77
Objetivo: nali ar las racciones reco idas en el rotocolo de ri caci n de la a ina or 
electro oresis bajo condiciones desnat rali antes
REACTIVOS ili enciar la c a de se ridad de todos los reacti os s bra ados
PROCEDIMIENTO
1. Preparación del gel
Armar el casete del gel, el cual consiste de dos vidrios separados por espaciadores adecuados, que permiten 
enerar eles de es esor ni orme entre 0 mm nsertar el casete en el dis ositi o de olimeri aci n 
 eri car e no a a a tili ando a a destilada ara tal n etirar el a a rose ir 
Pre arar la si iente me cla ara el el se arador erter entre los dos idrios del casete:
a me cla res ltante es s ciente ara re arar dos eles se aradores
• Buffer concentrador 4X: Tris 0.5 M pH 6.8/ 0 P
• Buffer de carga 6X: a l de bromo enol 0 0 P b er concentrador P 0 P
licerol 0 P merca toetanol 
• Buffer de corrida de electroforesis 5X: ris P licina P 0 P
• Buffer separador 4X: ris 0 P
• tanol absol to o 
• Marcadores de peso molecular
• Pers l ato de amonio 0 P
• Solución de monómeros: acrilamida P bisacrilamida 0 P Toxica. Evite contacto con 
la piel
• Solución de tinción: ácido ac tico P a l de oomassie 0 0 0 P iso ro anol 
P ensibilidad: 0 0 banda
• TEMED
Componente Volumen
a destilada 5 mL
er se arador 3,8 mL
Solución de monómeros 6 mL
Pers l ato de amonio 00 
*TEMED 0 
* Se agrega al final y sólo en el momento de aplicar la solución entre los vidrios.
Práctica : P ri caci n de la a ina lectro oresis
7878
s erar asta la olimeri aci n com leta de la me cla a ro 0 min tos etirar el eine la ar con 
a a destilada ara eliminar sales resid os de acrilamida no olimeri ada 
olocar el casete al interior de la cámara de electro oresis adicionar b er de corrida en los tan es 
interior e terior del sistema ase rando e los lamentos de la cámara eden s mer idos en el 
b er 
2. Preparación de la muestra
e clar en n t bo e endor 0 l de m estra Prote nas no retenidas l idos 0 l del b er de 
carga 6X, de tal manera que éste quede 1X. Hervir por 5 minutos a 92ºC. Con el extracto original, las 
lob linas las alb minas roceder del mismo modo ero dil ndolas : 00 en Na l P re io 
a la adici n del b er de car a 
3. Condiciones de corrida y tinción del gel
embrar en cada o o entre 0 de m estra onectar la cámara a la ente de oder aj star a 0 
oltios correr la electro oresis asta e el rente de corrida banda a l alcance la arte s erior del 
el de se araci n mentar el oltaje a 0 oltios asta e el rente de corrida alcance el borde in erior 
del el emo er el el e inc barlo or lo menos na ora en la sol ci n de tinci n etirar ardar la 
sol ci n de tinci n a ar el el con a a caliente eali ar al menos la ados lternati amente la ar el 
el con ácido ac tico asta s decoloraci n
 
RESULTADOS
m rimir dili enciar entre ar el ormato de n orme de aboratorio corres ondiente
CUESTIONARIO e debe res onder en el ormato de n orme de aboratorio
 es c áles son las tilidades de na electro oresis nati a de rote nas
 ál es la nci n del en los eles de concentraci n se araci n
 ál es la nci n de la licina tili ada en el b er de corrida
 na rote na i ot tica se com one de dos cadenas oli e dicas de a cada na ic as 
cadenas establecen eterod meros mediante entes dis l ro ib je el er l electro or tico de la 
rote na c ando es anali ada mediante P en resencia a sencia de merca toetanol
REFERENCIAS
arc a Pere lectro oresis en eles de oliacrilamida: ndamentos act alidad e im ortancia 
ni erso ia n stico 000 : 
e ico n ola elasco as de aboratorio de io mica ara la arrera de mica 
edici n olecci n Notas de lase ni ersidad Nacional de olombia 0 o otá olombia Práctica 
 Pá ina 
Nelson o e nin er Princi les o ioc emistr t edition reeman om an 0 
New York, USA. Capítulo 3
119
Fraccionamiento de tejidos en sus 
principales constituyentes: Proteínas
Práctica
9
La diversidad e importancia biológica de las 
proteínas, ha impulsado el desarrollo de campos 
de investigación para dilucidar su estructura 
y comprender los mecanismos moleculares 
de su funcionamiento. Generalmente, el 
estudio bioquímico de las proteínas implica su 
aislamiento y caracterización (determinación de 
su composición, estructura y función). 
El aislamiento de proteínas a partir de una fuente 
biológica, se basa en las propiedades físicas y 
químicas de dichas biomoléculas. Por ejemplo, 
la solubilidad de las proteínas en diferentes 
soluciones, es una propiedad fundamental que 
se aprovecha para lograr su separación. En este 
sentido, las globulinas presentes en una muestra 
precipitan por la adición de sulfato de amonio 
hasta el 50% de saturación