E4a_clase-1_-2018

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Ingeniería Genética
Mercedes Goin
Laboratorios Denver Farma S.A.
La ingeniería genética es una ciencia que manipula 
directamente el genoma de un ser vivo, por medio 
de un conjunto de técnicas que aíslan, multiplican y 
modifican los genes del individuo con el fin de su 
estudio y beneficio. 
Área de la biológica molecular que trabaja sobre la 
manipulación de los genes
Posibilita transferir genes de un organismo a otro y 
expresarlos (producir las proteínas para las cuales 
estos genes codifican) en organismos diferentes al 
de origen. 
¿Qué es la Ingeniería Genética?
1973: Herbert Boyer y 
Stanley Cohen
1977: Genentech produce 
somatostatina humana en 
bacterias
1976: H. Boyer y R. Swanson fundan Genentech
DNA cloning: A personal view after 40 years Stanley N. CohenPNAS | September 24, 2013 | vol. 110
1978: Genentech produce Insulina humana. Sale al 
mercado en 1983 (Eli Lilly)
La insulina humana es el primer producto recombinante producido 
industrialmente autorizado por la FDA (1982) para uso clínico en seres 
humanos
1- Obtención del gen de interés
2- Clonación del gen
3- Obtención de la cepa productora
4- Producción de la proteína de interés (POI)
5- Purificación / procesamiento de la POI
6- Formulación
PRODUCTO SISTEMA DE PRODUCCIÓN INDICACIÓN TERAPÉUTICA
Factores de coagulación
Factor VIII Cultivo de células de 
mamífero
Hemofilia A
Factor IX Cultivo de células de 
mamífero
Hemofilia B
Factor VIIa Cultivo de células de 
mamífero
Ciertas formas de hemofilia
Anticoagulantes
Activador del plasminógeno 
tisular
Cultivo de células de 
mamífero
Infarto de miocardio
Activador del plasminógeno 
tisular
E. coli Infarto de miocardio
Hirudina Levaduras Trombocitopenia y prevención de 
trombosis
Productos farmacéuticos aplicados a la salud 
humana y que provienen de organismos 
genéticamente modificados 
Hormonas 
Insulina Levaduras Diabetes mellitus
E. coli
Hormona de crecimiento E. coli Deficiencia de la hormona en niños, acromegalia, 
síndrome de Turner
Folículo-estimulante Cultivo de células de mamífero Infertilidad, anovulación y superovulación
Paratiróidea E. coli Osteoporosis
Gonadotrofina coriónica Cultivo de células de mamífero Reproducción asistida
Tirotrofina Cultivo de células de mamífero Detección /tratamiento de cáncer de tiroides
Luteinizante Cultivo de células de mamífero Ciertas formas de infertilidad
Calcitonina E. coli Enfermedad de Paget
Glucagon Levaduras Hipoglucemia
Factores hematopoyéticos
Eritropoyetina (EPO) Cultivo de células de mamífero Anemia
Factor estimulante de colonias de 
granulocitos/macrófagos (GM-CSF)
E. coli Netropenia, transplante autólogo de médula
Interferón e interleuquinas
Interferón alfa (IFN alfa) E. coli Hepatitis B y C, distintos tipos de cáncer
Interferón beta (IFN beta) Cultivo de células de mamífero Esclerosis múltiple
Interferón gamma (IFN gamma 1b) E. coli Enfermedad granulomatosa crónica
Interleuquina 2 (IL-2) E. coli Cáncer de riñón
Anti-hepatitis A Levaduras Inmunización contra la hepatitis A
Anti-enfermedad de Lyme E. coli Inmunización contra la enfermedad de Lyme
Anticuerpos monoclonales 
recombinantes
Anti-IgE (recombinante) Cultivo de células de mamífero Asma
Anti-TNF (recombinante) Cultivo de células de mamífero Arthritis reumatoidea
Anti-IL2 Cultivo de células de mamífero Prevención del rechazo agudo de transplante 
de riñón
Otros productos 
recombinantes
Proteína morfogénica del 
hueso-2
Cultivo de células de mamífero Fractura de tibia
Galactosidasa Cultivo de células de mamífero Enfermedad de Fabry (deficiencia en alfa-
galactosidasa)
Iaronidasa Cultivo de células de mamífero Mucopolisacaridosis
Proteína C Cultivo de células de mamífero Sepsis severa
Beta-glucocerebrosidasa E. coli Enfermedad de Gaucher
DNAsa Cultivo de células de mamífero Fibrosis quística
Fuente: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21 Nº8- Cuadernillo 49
de PorqueBiotecnología
Vacunas
Anti-hepatitis B Levaduras Inmunización contra la hepatitis B
Obtención del material genético
ADN
ARN
ADN
¿Por qué ARN y no ADN?
¿Cuál es la fuente del ARN?
¿Cuándo ADN?
¿Fuente?
aislamiento
Opciones 
síntesis 
• Ruptura celular: ruptura mecánica o 
enzimática
• Remoción de lípidos: detergente
• Remoción de proteínas: proteasas, fenol 
cloroformo
• Precipitación del ADN: sal + etanol
• Agentes quelantes (EDTA): remoción de 
Ca 2+, Mg 2+, para inhibir DNasas
Elección de la sal
Acetato de Na+ (0,3 M)
NaCl (0.2 M): muestras con SDS 
LiCl (0,8 M): para ARN (inhibe síntesis proteica y ADN polimerasa)
Acetato de NH4+: para remoción de dNTPs (inhibe T4 PNK)
Separación de fragmentos de ácidos nucleicos: 
Electroforesis de ADN y ARN
La carga neta de los ácidos nucleicos es 
negativa
Migración : de cátodo a ánodo
Separación de fragmentos de ácidos nucleicos: 
Electroforesis de ADN y ARN
Electroforesis en gel de agarosa
Fabricación del gel Siembra de las muestras Transcurso de la electroforesis
(30-60 min)
Electroforesis en gel de poliacrilamida
* Menor rango de separación pero mayor resolución que los geles de agarosa. 
Bromuro de etidio: agente intercalante
SYBR Gold, SYBR Green, SYBR safe
¿Cómo vemos lo que hay en el gel?
Electroforesis de ADN
Electroforesis en gel de agarosa
Efecto de la concentración 
de agarosa en la migración
< % de garosa >PM
-
+
DNA cromosómico digerido con EcoRI
1.0
1.6
2.0
3.0
4.0
5.0
kbp
DNA plasmídico digerido 
con diferentes enzimas de
restricción
Electroforesis de ARN
Resolución de muestras de 
ARN total en un gel 
de agarosa al 0,8%.
28S
18S
A partir del gel podemos aislar el 
fragmento de interés
CUANTIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
ESPECTROFOTOMETRÍA UV: λ 260 nm
TriptofanoSales
Max. Abs ADN
Insolubles
A260/A280= 1,8
A260/A280 > 1,8……ARN? (A260/A280= 2- ARN puro)
A260/A280 < 1,8……Fenol? Proteínas?
ESPECTROSCOPIA UV: λ 260 nm
ADNdc: A260= 1 50 μg/ml
Una solución de ADN tiene una A260= 0,40
¿Cuál es la concentración de ADN en μg/ml?
50 μg/ml = X μg/ml
1 OD 0.4 OD
X = 20 μg/ml
Coeficiente de extinción de ADNdc: E o ε
= constante de absorción = coeficiente de absorción
Abs. 260 nm de una sc. 1 mg/ml de ADNdc = 20 = E
(pH neutro, G+C 50%, paso de luz 1 cm)
Ley de Beer: A260= E260.l.c.
l = 1 cm A260= E260.c
C= A260/E260
E: Medida de cantidad de luz absorbida por unidad de concentración
Una solución de ADN tiene una A260=1
¿Cual es la concentración de ADN en μg/ml?
C= A260 C= 1 = 0.05 mg/ml = 50 μg/ml
E260 20 
A260 nm de una sc. 1 mM de ADNdc = 6,7 = E260
Coeficiente de extinción, E260, para una 
solución de ADNdc 1 mM
Una solución de ADN tiene una A260=0.212.
¿Cuál es la concentración expresada en milimolar?
1 mM = x mM x= 0.03 mM
6,7 OD 0.212 OD 
ESPECTROSCOPIA UV: λ 260 nm
ADN simple cadena
ADNsc: Abs. 1= 33 μg/ml
E260 ADNsc 1 mM = 8,5 
Cuantificación de oligonucleótidos
Unidades de densidad óptica (OD u)
1 ODu = cantidad de oligonucleótido disuelto en 1 ml con A260 = 1 en 
cuveta de 1 cm de paso de luz
OD u = A260 x vol. Oligonucleótido x factor de dilución
Abs260=1 = 1 OD u = 33 μg/ml ADN sc
Concentración de oligonucleótido expresada en pmol/μl 
A260 x 100
C= x factor de dilución
(1,54 x nA) + (0,75 x nC) + (1,17 x nG) + (0,92 x nT)
Coeficiente de extinción de cada base
Una solución 1M de dATP tiene A260= 15400 E26015400L/mol = 0,00154 μl/pmol
Medida de la concentración de ARN
A260 = 1 40 μg/ml ARN
Estimación de la concentración de ADN en geles 
teñidos con bromuro de etidio
Cuantificación de ADN por fluorometría
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=pacman&source=images&cd=&cad=rja&docid=ze0tI4QGgl7nlM&tbnid=4F2lum6cd8ZdvM:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Ffrikinux.blogspot.com%2F2011%2F12%2Foptimizar-mirrors-pacman-la-velocidad.html&ei=6XbxUfG0BqaSiQKY44CQAQ&psig=AFQjCNEsjqpyTnBM6e0TIaPiuE_ppt_DCw&ust=1374865457723183Endonucleasas de restricción.
* Enzimas producidas de manera natural por microorganismos cuya función 
es la de degradar el ADN exógeno.
* Se unen específicamente a secuencias concretas de ADN de doble cadena
y la rompen (endonucleasas).
Tipo I: poseen actividad metilasa y de restricción. ATP-dependientes. Rompen
el ADN lejos del sitio que reconocen (>1Kbp) de manera aleatoria  carecen
de interés práctico.
Tipo III: poseen actividad de restricción y modificación. Cortan fuera de la
Secuencia que reconocen. Requieren dos secuencias de reconocimiento en 
orientación opuesta en la misma cadena de DNA. Son ATP-dependientes.
Tipo II: sólo actividad de restricción. No ATP-dependientes. Reconocen
secuencias específicas de ADN (de 4 a 8 bp, muchas de ellas palindrómicas). 
Punto de rotura característico para cada una y próximo a la secuencia 
reconocida  fragmentos discretos. Hay cientos comercialmente disponibles.
Palindromo:
Palabra o frase que se lee igual de izquierda a derecha que de 
derecha a izquierda , ej. RADAR, ANILINA, DÁBALE ARROZ A LA 
ZORRA EL ABAD 
TTAGCACGTGCTAA
AATCGTGCACGATT
Corte del enlace fosfodiéster
Toman el nombre de las bacterias que las producen. Ej.
EcoRI E: género Escherichia
co: especie coli
R: cepa RV 13
I: primera endonucleasa aislada de esta cepa
Enzima Fuente Secuencia de 
reconocimiento
Corte
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC 
3'CTTAAG 
5'---G AATTC---3' 
3'---CTTAA G---5'
Pvu II Proteus vulgaris 5'CAGCTG 
3'GTCGAC 
5'---CAG CTG---3' 
3'---GTC GAC---5' 
KpnI Klebsiella pneumoniae 5'GGTACC 
3'CCATGG 
5'---GGTAC C---3' 
3'---C CATGG---5' 
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
ISOESQUISÓMEROS
Endonucleasas de restricción que reconocen la misma secuencia
SmaI CCCGGG XmaI CCCGGG Neoisoesquisómeros
GGGCCC GGGCCC
BspDI ATCGAT ClaI ATCGAT
TAGCTA TAGCTA
Ver pag. 325
Hay enzimas que reconocen secuencias 
tetranucleotídicas
En algunos casos esas secuencias están dentro 
de una secuencia de 6 nucleótidos, blanco de 
otra enzima. Ej.
MboI y Sau3AI 5´…….GATC……3´
3´…….CTAG……5´
BamHI 5´……GGATCC……3´
3´……CCTAGG……5´
SalI GTCGAC …. G
CAGCTG ……CAGCT
GTCGAG No se corta
CAGCTC con XhoI ni
con SalI !!!
XhoI CTCGAG TCGAG…..
GAGCTC C…..
Ligación de fragmentos generados por 2 
enzimas de restricción
MAPEO DE RESTRICCIÓN
Procariontes
Dam metilasa……………GmATC
Dcm metilasa……………CmCAGG y CmCTGG
EcoKI Metilasa…...………metila A en AAC(N6)GTGC o GCAC(N6)GTT
La mayoría de las cepas que se usan para clonado son Dam+ y Dcm+
METILACIÓN
S-adenosilmetionina
Ver pag. 347
http://www.google.com.ar/url?sa=i&source=images&cd=&cad=rja&docid=s7eQGxuD3LblmM&tbnid=iNfpKkkRdC9dwM:&ved=0CAgQjRwwAA&url=http%3A%2F%2Fwww.coenzima.com%2Fs-adenosil_metionina_sam&ei=IkrxUaDTOqO1iwL7roCQDg&psig=AFQjCNGrHfX7Y8i5q2y1b5WgeoFG4SiVJQ&ust=1374854051004640
METILACIÓN
Eucariontes:
Metilasas de sitios mCG.
Los patrones son tejido específicos, 
heredables y correlacionan con la 
expresión de genes.
Los patrones de metilación CpG no se 
mantienen cuando el ADN es clonado 
en bacterias
La metilación de los sitios de restricción puede 
impedir la acción de la enzima de restricción
Los sitios se pueden desmetilar usando 
cepas de E coli dam- dcm-
Dam metilasa
“overlapping site”
No corta!!!!
Corta!!!!
Ver pags. 48 y 38
Ver pag.347
M. EcoRI GAATTC inhibe el corte con EcoRI
CTTAAG
M.HaeIII
M. HaeIII GCCNNNNNGGCC inhibe el corte con HaeIII y BglI
BglI
M. TaqI TCGATCGA M.TaqI TCGATCGA
AGCTAGCT AGCTAGCT
TaqI TaqI DpnI
Modificación de sitios de restricción por 
metilación del ADN
Corta sólo si está metilado
Sistemas de restricción dependientes
de la metilación en E. coli 
EcoKI :genes hdsRMS, ataca ADN NO protegido por 
metilación en A en sitio: AA[N6]GTGC o GCAC[N6]GTT
McrA, McrBC y Mrr: genes mcrA, mcrB y mrr, atacan 
ADN metilado en ciertas posiciones
Para clonar usar preferentemente cepas defectuosas 
en loci hds, mcrA, mcrBC y mrr
Ver pag.234
FACTORES QUE INFLUENCIAN LA ACTIVIDAD DE
LAS ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Composición del buffer
Temperatura de incubación
Metilación del ADN
“Star activity”……………pH alto (>8) , baja fuerza iónica (ej. olvido de buffer)
Cc de glicerol >5%
Cc muy alta de enzima (> 100 U/ug de ADN)
Solventes orgánicos (ej. Etanol, DMSO)
Digestión con múltiples enzimas
Variabilidad en la digestión de diferentes ADNs
Ver pags. 307-315
http://www.google.com.ar/url?sa=i&rct=j&q=chemical%20reaction&source=images&cd=&cad=rja&docid=UIU1EUSbHXk9dM&tbnid=htzGm2z__ErR8M:&ved=0CAUQjRw&url=http%3A%2F%2Fanmascarin.blogspot.com%2F2010%2F09%2Fvocabulary9.html&ei=IXbxUfiLEImiiQKbkIHQCQ&psig=AFQjCNGSAkRlzHTKH9bShnxdSaFdoFnTbg&ust=1374865189275514
Digestión de un plásmido, preparado con kit Wizard 
plus midipreps Promega, con BamHI
ADN sin precipitar ADN precipitado
s/c BamHI BamHI
http://www.labtools.us/nebcutter-v2-0/
aaattgggtcccgtccacgttgcatttgtgtcaccat
gctgtcatgccctg
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