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Regulación de la replicación en respuesta al daño en el ADN Trabajo Fin de Máster Máster Universitario en Biología Celular y Molecular Curso 2019/2020 Nombre: Saray Aragón García Tutora: Mónica Segurado Carrascal ÍNDICE 1. Resumen 1 1.1. Castellano 1 1.2. Inglés 1 2. Introducción 2 2.1. Ciclo celular 2 2.2. Replicación 3 2.3. Checkpoint de fase S 5 2.4. Exo1 6 2.5. Control de la expresión de proteínas 8 2.6. Pu-seq 9 3. Objetivos 10 4. Materiales y métodos 10 4.1. Cepas del estudio 10 4.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento 11 4.3. Construcción de cepas 11 4.3.1. Transformación de cepas en Sccharomyces cerevisiae 11 4.3.1.1. Plásmidos 11 4.3.2. Cruces genéticos 12 4.3.3. Esporulación de cepas de S.cerevisae diploides 12 4.3.4. Disección de tétradas S.cerevisiae 13 4.3.4.1. Selección de marcadores 13 4.3.5. Conservación de cepas S.cerevisiae 13 4.4. Técnicas de manipulación del ADN 14 4.4.1. PCR 14 4.4.1.1. Oligonucleótidos 14 4.4.1.2. PCR 14 4.4.1.3. PCR de colonia 14 4.4.1.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa 15 4.4.2. Purificación de muestras de PCR 15 4.4.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción 15 4.5. Test de gotas 15 5. Resultados y discusión 16 5.1. Papel de Exo1 en la inestabilidad de cadenas nacientes en presencia de estrés replicativo 16 5.1.1. Construcción de cepas para analizar las diferencias de cadenas en ausencia de Exo1 16 5.1.1.1. Deleción de EXO1 16 5.1.1.2. Combinación de la deleción de EXO1 con mutantes de la ADN polimerasa δ 18 5.1.1.3. Combinación de la deleción de EXO1 con mutantes de la ADN polimerasa ε 23 5.1.2. Análisis de sensibilidad de agentes genotóxicos: ensayo de gotas 26 5.2. Efecto de la fosforilación de Exo1 en la estabilidad de cadenas nacientes en presencia de estrés replicativo 31 5.2.1. Construcción de cepas para el análisis diferencial de cadenas encientes en mutantes de fosforilación de Exo1 32 5.2.1.1. Mutantes catalíticamente inactivos exo1-D173A 32 5.2.1.2. Mutantes catalíticamente inactivos exo1-E150D 34 5.2.1.3. Mutantes fosfonulos exo1-23A 36 5.2.1.4. Mutantes fosfonulos exo1-23D 37 6. Conclusiones38 7. Perspectivas futuras 39 8. Referencias bibliográficas 39 9. Material suplementario 41 1 | P á g i n a 1. Resumen 1.1. Castellano La fase S del ciclo celular, es la fase donde el ADN se replica. Los errores en esta fase alteran la viabilidad celular y producen inestabilidad genómica. Además, en esta fase existe un punto de control: el checkpoint de fase S, regulado en Saccharomyces cerevisiae por las quinasas Mec1 y Rad53 desencadenando la respuesta del checkpoint. La replicación del ADN se realiza por tres ADN polimerasas: Polα inicia la síntesis y es sustituida por Polε en la replicación de la cadena continua y Polδ en la cadena discontinua. Las polimerasas pueden introducir ribonucleótidos (rNTPs) por error siendo eliminados por la subunidad catalítica de la ribonucleasa RNasa H2. En situaciones de estrés en la replicación, se activa el Checkpoint de fase S llevando a cabo una respuesta coordinada. Cuando el Checkpoint no funciona correctamente Exo1 es responsable del colapso de las horquillas de replicación. El objetivo de este estudio era ver si Exo1 afectaba de manera diferencial a la estabilidad de las cadenas continua o discontinua cuando hay estrés replicativo. También se quiso estudiar el papel de la fosforilación de Exo1, realizada por Rad53, en las cadenas de nueva síntesis. Para ello, existen técnicas como Pu-seq que permiten analizar la síntesis de las cadenas nacientes por las distintas polimerasas. Por ello, es necesario construir cepas que tengan mutaciones en las DNA polimerasas Polδ y Polε, para promover la introducción de mayores niveles de ribonucleótidos durante la replicación del DNA, así como mutaciones en Rnh201 que eliminen la ruta RER, y por tanto las células no puedan eliminar el exceso de rNTPs. La técnica Pu-seq se basa en las roturas del DNA a nivel de rNTPs por hidrolisis alcalina, y el posterior análisis por secuenciación de los fragmentos generados a nivel genómico. 1.2. Inglés The S phase of the cell cycle is the phase where the DNA replicates. Errors in this phase alter cell viability and produce genomic instability. In addition, there is a checkpoint in this phase: the S-phase checkpoint, regulated in Saccharomyces cerevisiae by the Mec1 and Rad53 kinases, triggering the checkpoint response. DNA replication is performed by three DNA polymerases: Polα initiates the synthesis and is replaced by Polε in the continuous chain replication and Polδ in the discontinuous chain. Polymerases can introduce ribonucleotides (rNTPs) by mistake and are removed by the catalytic subunit of ribonuclease RNase H2. In situations of replication stress, the S-phase Checkpoint is activated, carrying out a coordinated response. When the 2 | P á g i n a Checkpoint doesn't function properly Exo1 is responsible for the collapse of the replication forks. The objective of this study was to see if Exo1 differentially affects the stability of the continuous or discontinuous chains when there is replicative stress. We also wanted to study the role of Exo1 phosphorylation, performed by Rad53, in the new synthesis chains. For this purpose, there are techniques such as Pu-seq that allow to analyze the synthesis of the nascent chains by the different polymerases. Therefore, it is necessary to build strains that have mutations in the DNA polymerases Polδ and Polε, to promote the introduction of higher levels of ribonucleotides during DNA replication, as well as mutations in Rnh201 that eliminate the RER pathway, and therefore the cells cannot eliminate the excess rNTPs. The Pu-seq technique is based on DNA breaks at the rNTP level by alkaline hydrolysis, and the subsequent analysis by sequencing of the fragments generated at the genomic level. 2. Introducción En este estudio se usó la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae, organismo que está muy estudiado y cuya manipulación en el laboratorio es muy simple. Además, la corta duración de su ciclo celular, junto con la descripción completa de su genoma haploide en la literatura científica, hace que sea un organismo modelo de fácil manejo. Al ser esta levadura un organismo eucariota, mucho de los procesos estudiados en dicho organismo pueden servir de base en estudios en eucariotas superiores. 2.1. Ciclo celular El ciclo celular está compuesto por una serie de eventos ordenados en el tiempo donde los objetivos son el crecimiento, la proliferación y la división de las células para generar células hijas capaces de realizar el mismo proceso. Estos eventos están divididos en 4 etapas: la primera es la fase G1, donde las células aumentan de tamaño; la segunda, la fase S, donde el ADN se replica a partir de las cadenas ya existentes; la tercera fase, es la fase G2 donde las células siguen creciendo y continúa la síntesis de proteínas; la última fase, la fase M, corresponde a la fase de mitosis dónde se produce la segregación cromosómica seguida de la división del núcleo y posteriormente la citocinesis. El paso de una fase a otra está mediado por los complejos CDK-ciclina. Las CDK, son proteínas quinasas que dependen de las ciclinas, proteínas que varían a lo largo del ciclo, mientras que las CDK se mantienen constantes. El complejo que forman fosforila proteínas y 3 | P á g i n a la especificidad de dicha fosforilación viene dada por la ciclina. Cuando las fases del ciclo no transcurren de manera correcta, se producen fallos, como pueden ser mutaciones o aneuploidías, siendo estos fallos la base de la inestabilidad genómica que puede dar lugar al cáncer en organismos pluricelulares (Kastan & Bartek, 2004). Para controlar las diferentes fases del ciclo, existen unos mecanismos que regulan el funcionamiento del mismo, además de detectar fallos y solucionarlos. Estos mecanismos se conocen como Checkpoints, que son rutas de transmisión de las señales. Cuando se detecta un fallo, el checkpoint bloquea los eventos más tardíos del ciclo hasta que soluciona el fallo y después el ciclo prosigue. Dentro del ciclo celular existen varios Checkpoints y cada uno de ellos actúa en una fase del ciclo celular. En la fase G1, se encuentra el checkpoint G1/S controlando la transición correcta entre fase de crecimiento a la fase de replicación (fase S del ciclo celular). En la fase S del ciclo celular actúa el checkpoint de fase S que controla la correcta realización de la replicación del ADN. Durante la fase G2, actúa el checkpoint G2/M que no deja entrar a la célula en la fase de mitosis hasta que el ADN esté completamente replicado. Dentro de la mitosis también hay checkpoint, como es el checkpoint de ensamblaje del huso mitótico, que detecta la correcta asociación de los cromosomas al huso mitótico para proseguir la mitosis hacia anafase. 2.2. Replicación La replicación es un proceso complejo (Karim Labib, 2010) mediante el cual se duplica el genoma, hecho fundamental para la vida. La replicación del ADN es semiconservativa, es decir, cada molécula de ADN está compuesta por una hebra de ADN original, a partir de la cual se realiza la replicación, y una hebra de nueva síntesis complementaria a la anterior. El proceso de la replicación se encuentra regulado, participando en dicha regulación muchas proteínas (Leman & Noguchi, 2013), pero también puede sufrir fallos generando inestabilidadgenómica, hecho clave para el desarrollo de enfermedades como el cáncer (Bartkova et al., 2005; Gorgoulis et al., 2005). La replicación en organismos eucariotas no se inicia desde un punto concreto, sino que se inicia desde varios puntos a la vez. Estos puntos se denominan orígenes de replicación y están separados entre ellos. En los orígenes de replicación de S.cerevisiae hay unas secuencias de ADN consenso que son reconocidas por el complejo de reconocimiento de origen (ORC) y se unen a ella. La replicación tiene tres fases: la primera de ellas es la iniciación, fase en la que se requieren dos quinasas: Cdc7 y la quinasa dependiente de ciclinas (CDK) (Karim Labib, 2010). A continuación, la fase de iniciación es seguida por una fase de elongación y finalmente una 4 | P á g i n a fase de terminación. Dentro de la fase de iniciación existe un modelo de dos pasos, donde el primero de ellos es el licencing. Este paso se produce en G1 con una actividad CDK baja y lo que ocurre es que se promueve la unión de dos factores: Cdc6 (ciclina ATPasa) y Cdt1 (Karim Labib, 2010). Posteriormente, se atrae al complejo MCM2-7 (figura 1). Con este primer paso,el origen está licenciado, pero no está activo. Esta activación se produce cuando las células entran en fase S y hay altos niveles de Cdc7 y CDK. En el caso de Cdc7, necesita la unión con su subunidad reguladora para ejercer su función. Su subunidad reguladora es Dbf4 y tras su unión se conoce como quinasa dependiente de Dbf4 o DDK, que fosforila las colas de MCM2-7 activándolas. Este complejo se recluta en los orígenes de replicación por la interacción con MCM 2-7 (Jares & Blow, 2000; Lei et al., 1997; Walter, 2000). Durante la fase S es necesario CDK, ya que fosforila a Sld2 y Sld3, que estando fosforiladas se unen a Dpb11, que interviene en el reclutamiento de otros factores de replicación. Para la progresión de las horquillas en la replicación además de MCM2-7, es necesario Cdc45 (Aparicio et al., 1997; K. Labib et al., 2000; J. A. Tercero et al., 2000). Además, recluta a GINS (Araki, 2010) con la ADN polimerasa ε. Todas estas proteínas, permiten la activación de la helicasa MCM2-7, gracias al desenrollamiento del origen y permitiendo la replicación de ambas cadenas del ADN (Figura 1b). Figura 1. Representación de la formación y activación del complejo pre-replicativo y del inicio de la replicación. En esta imagen aparece el licenciamiento del origen de replicación (a) y la formación del completo de preiniciación y del inicio de la replicación (b) (Karim Labib, 2010). La segunda fase de la replicación es la elongación. Esta fase se realiza por PCNA (proliferating Cell nuclear antigen) y por tres ADN polimerasas que existen en eucariotas: α, δ y ε. La replicación de ADN se da en dirección 5’ a 3’. Las dos hebras iniciales, se disponen de forma antiparalela, de tal manera, que durante la replicación la hebra que tiene sentido 5’ a 3’ se sintetiza de manera continuada por la ADN polimerasa ε. Esta hebra se conoce como la hebra continua o leading. La otra hebra, la que tiene un sentido de 3’ a 5’, se sintetiza de manera 5 | P á g i n a discontinua en pequeños fragmentos denominados fragmentos de Okazaki. La síntesis de esta cadena es llevada a cabo por la ADN polimerasa δ (Daigaku et al., 2015) y se conoce como la hebra discontinua o lagging. Ambas polimerasas se encargan de la elongación de las cadenas siguiendo esta división del trabajo. La división del trabajo entre las polimerasas se encuentra en estudio ya que no se conoce si se mantiene a lo largo de todo el genoma. La polimerasa que inicia la síntesis de nuevas hebras es la ADN polimerasa α que forma un fragmento de ARN que actúa como un cebador del ADN naciente durante la elongación (Bell & Dutta, 2002). Estos fragmentos de ARN son eliminados posteriormente por unas proteínas con función exonucleasa (Sun et al., 2003) y los fragmentos generados se unen después por la acción de una ligasa. En concreto, los rNTPs incorporados por las polimerasas, se eliminan mediante el sistema de escisión de nucleótidos (RER). La RNasa H2, en concreto su subunidad catalítica Rnh201, corta en el extremo 5’ al ribonucleótido y la polimerasa correspondiente inicia la síntesis. La nucleasa Fen1 elimina el fragmento resultante antes de que por la acción de una ligasa se repare por completo la escisión (Sparks et al., 2012).La última fase de la replicación es la terminación en la que las horquillas de replicación desaparecen. 2.3. Checkpoint de Fase S El checkpoint de fase S es un mecanismo de vigilancia basado en la transducción de la señal (Melo & Toczyski, 2002) que actúa durante la replicación del ADN, operando frente a errores sucedidos durante la replicación manteniendo así la estabilidad del genoma. Este mecanismo, está muy conservado a lo largo de la evolución (Paulovich & Hartwell, 1995; B. B. Zhou & Elledge, 2000). Las proteínas centrales de este proceso en S. cerevisiae son las quinasas Mec1 y Rad53, Rad3 y Cds1 en S.pombe y ATR y Chk2 en células de mamíferos (Segurado & Tercero, 2009). Cuando el proceso de replicación se encuentra en peligro, como puede ser el daño en el ADN o el agotamiento de nucleótidos, el Checkpoint de fase S se activa (Paulsen & Cimprich, 2007) generando una respuesta que incluye la parada del ciclo celular, la reparación de errores, la reanudación de la replicación y por lo tanto del ciclo celular. Este checkpoint necesita el establecimiento de las horquillas de replicación (Lupardus et al., 2002; Stokes et al., 2002; José Antonio Tercero et al., 2003) y la formación de ADN monocatenario (ADNss), que se acumula ya que la helicasa MCM2-7 sigue desenrollando ADN. Este hecho no se encuentra asociado a la síntesis de ADN en la replicación (Byun et al., 2005; Nedelcheva et al., 2005; Sogo et al., 2002). El ADNss se une a la proteína RPA (proteína de replicación A) que presenta afinidad 6 | P á g i n a alta por el ADN monocatenario, siendo la unión del ADNss a RPA lo que el Checkpoint de fase S detecta (You et al., 2002; Zou & Elledge, 2003). Dcd2, subunidad reguladora asociada a la quinasa sensora Mec1, recluta la unión RPA-ADNss. Mec1 fosforila al mediador de la ruta Mrc1, transduciendo la señal hasta la quinasa efectora Rad53, que se activa por fosforilación (Alcasabas et al., 2001) (figura 2) y es capaz de fosforilar a otras proteínas para desencadenar la respuesta del checkpoint: reparación, activación del orígenes de replicación, estabilización de las horquillas de replicación en respuesta a daño o a estrés replicativo (Karim Labib & De Piccoli, 2011) Figura 2. Funcionamiento del Checkpoint de fase S. En los mutantes de las proteínas del Checkpoint, se degradan las horquillas de replicación de forma irreversible. Este suceso se denomina colapso de horquillas, situación patológica para la célula que termina siendo letal. La nucleasa Exo1 interviene en la respuesta del checkpoint, ya que cuando este punto de control se activa, Rad53 mantiene la integridad de la horquilla inhibiendo la actividad nucleasa de Exo1 (Morafraile et al., 2020) y las horquillas de replicación no se degradan. Este hecho correlaciona con una viabilidad celular alta en condiciones de estrés replicativo. 2.4. Exo1 EXO1 codifica una proteína que presenta actividad nucleasa y que tiene un tamaño de 702 aminoácidos. Esta proteína pertenece a la familia de nucleasas de Rad2 y presenta dos actividades: actividad exonucleasa en sentido 5’→3’ y actividad flap-endonucleasa (Tran et al., 2004) (Figura 3a). Figura 3. Proteína Exo1. Actividades de Exo1 (a). Las flechas rojas señalan la dirección de la acción de Exo1 en su actividad exonucleasa en sentido 5’ a 3’ (arriba) y en su actividad flap-endonucleasa (debajo). Representación de la proteína Exo1 y sus dominios (b). 7 | P á g i n a Exo1interviene en muchos procesos biológicos como la recombinación homóloga (Zakharyevich et al., 2010), mantenimiento de los telómeros, reparación del ADN, reparación de apareamientos erróneos en el ADN o en la replicación, ya que se encarga de procesar los cebadores que intervienen en los fragmentos de Okazaki (Tishkoff et al., 1997). Estructuralmente, Exo1 presenta su actividad catalítica en el extremo N-terminal de la proteína y el extremo C-terminal presenta un dominio de unión a proteínas (figura 3b). Además, Exo1 está implicado en la activación del checkpoint de fase S, ya que gracias a su actividad nucleasa genera ADNss en procesos de reparación, provocando la activación del checkpoint de fase S (Giannattasio et al., 2010). En condiciones de checkpoint no funcional, Exo1 es responsable del colapso de las horquillas de replicación (Cotta-Ramusino et al., 2005). En condiciones de un checkpoint funcional, Rad53 evita el colapso de las horquillas dependiente de Exo1, mediante un mecanismo de regulación por fosforilación, que inhibe su actividad (Doerfler & Schmidt, 2014; Morin et al., 2008; Morafraile et al., 2020). Esto se ha comprobado mediante la deleción de EXO1 en mutantes rad53, lo que suprime el colapso de horquillas de replicación en presencia de estrés replicativo (Cotta-Ramusino et al., 2005). Aparte de los mutantes de deleción de EXO1, existen otros mutantes de fosforilación de Exo1 generados en nuestro laboratorio. Uno de ellos presenta modificados 23 residuos de fosforilación no esenciales, siendo un mutante fosfonulo como es el caso del mutante exo1-23A, que presenta los residuos modificados por alanina. El otro es exo1-23D mutante fosfomimético, donde los residuos fosforilables son sustituidos por aspárticos que, debido a su estructura, simulan las cargas que tendría Exo1 si estuviera fosforilado. Además, han sido descritos mutantes de actividad nucleasa de Exo1. Uno de los mutantes que existe es exo1-E150D, donde Exo1 es catalíticamente inactivo porque el glutámico de la posición 150, que es donde se encuentra la actividad nucleasa, ha sido sustituido por ácido aspártico. Como consecuencia del cambio en la zona catalítica, pierde su actividad exonucleasa. El mutante exo1-D173A, tiene una situación parecida, ya que el ácido aspártico de la posición 173 ha sido sustituido por alanina perdiendo por completo la actividad catalítica, es decir, la actividad exo-nucleasa y la actividad flap-endonucleasa (Tran et al., 2002). 8 | P á g i n a 2.5. Control de la expresión de proteínas Las cepas usadas en este estudio pertenecientes al cepario del laboratorio tienen varios sistemas para controlar la expresión de proteínas. Uno de estos sistemas es el sistema del promotor inducible por tetraciclina. Este sistema regula la transcripción de un gen y se encuentra descrito en el estudio de G.Bellí y colaboradores (Bellí et al., 1998). Este sistema consiste en la introducción en el genoma mediante transformación del promotor tetO2, que contiene el activador tTA. Siguiendo el mismo protocolo, se introduce también un inhibidor del sistema, tetR’-SNN6. Ambas partes del sistema se encuentran asociadas a un marcador de selección diferente: el promotor tetO2 se encuentra asociado al marcador de selección TRP y el inhibidor a LEU. En condiciones normales (figura 4a), el promotor con el activador está activo permitiendo la transcripción del gen. Al suministrar tetraciclina o algún derivado, como la doxiciclina, se activa el inhibidor evitando la transcripción del gen (figura 4b). Figura 4. Funcionamiento del sistema del promotor inducible. Esquema con la construcción del sistema (a) y funcionamiento del sistema al añadir tetraciclina (b). Otro de los sistemas utilizados en el laboratorio, es el degrón de auxina, que es un sistema propio de plantas. La auxina pertenece a una familia de hormonas vegetales encargadas de controlar la expresión génica en el crecimiento y desarrollo. Aunque algunos eucariotas carecen de la respuesta a auxina, sí que comparten la vía de degradación, permitiendo usar el sistema degrón inducible por auxina (AID) (Nishimura et al., 2009). Este sistema permite una degradación rápida y reversible de proteínas diana en respuesta a auxina. Para que se dé el agotamiento de la proteína, se necesita la expresión del gen TIR1, que codifica un receptor de unión a auxina que va a interactuar con el complejo E3 ubiquitina ligasa SCF que está conservado (figura 5a). Cuando se añade auxina, la proteína TIR1 se une a ella e interactúa con el dominio AID (figura 5b), permitiendo que el complejo E3 ubiquitina ligasa SCF ubiquitinice a la proteína a la que está unida el dominio AID dirigiendo así la degradación de la proteína por el proteasoma (figura 5c) (Mendoza‐Ochoa et al., 2019). 9 | P á g i n a Figura 5. Esquema del funcionamiento del degrón de auxina. (a) la proteína de interés se encuentra unida a AID. Al añadir auxina este complejo es reconocido por TIR desencadenando la ubiquitinación por la enzima E2 (b) que produce la degradación de la proteína por el proteasoma (c). Este sistema de degrón aparece controlando a las proteínas Rnh201 (subunidad catalítica de RNasa H2) y Rad53. Este sistema en Rad53, es ventajoso, porque RAD53 es un gen esencial, es decir, su deleción es letal para la célula. Esto se debe a la regulación sobre el gen SML1 que regula negativamente la síntesis de dNTPs. La única solución posible es delecionar el gen SML1, aunque esta deleción no restaura la funcionalidad de Rad53 (X. Zhao et al., 1998). Todas las cepas usadas en este estudio presentan en su genotipo la deleción de SML1, de tal manera que al eliminar la proteína Rad53, por el degrón, no afectará a la viabilidad de la célula. 2.6. Pu-seq Esta técnica permite el análisis de la replicación, determinando la ubicación de los orígenes de replicación y el trabajo llevado a cabo por cada polimerasa (Daigaku et al., 2015). Como se ha comentado ya, las ADN polimerasas pueden incorporar por error rNTPs en las cadenas de nueva síntesis, aunque con una baja frecuencia. La incorporación de ribonucleótidos en el ADN aumenta la frecuencia de rotura, y por ello, son eliminados mediante un sistema de escisión de ribonucleótidos (RER) previamente explicado, en el cual interviene la RNAsa H2 (Daigaku et al., 2015). En los últimos años, la incorporación de ribonucleótidos por parte de polimerasas alteradas ha sido usada como herramienta para analizar de forma diferencial las cadenas sintetizadas de novo (Daigaku et al., 2015), siendo esta la base de la técnica de la Secuenciación del uso de la polimerasa (Polymerase usage sequencing o Pu-seq). Mediante esta técnica se puede analizar la actividad de las polimerasas Polδ y Polε durante la replicación, mediante la identificación y mapeo de los ribonucleótidos introducidos en el DNA utilizando polimerasas Polδ y Polε mutantes capaces de introducir mayores niveles de ribonucleótidos (Daigaku et al., 2015). 10 | P á g i n a Esta técnica se basa por tanto en el empleo de cepas que contienen polimerasas mutantes con mayores tasas de incorporación de rNTPs, y en la eliminación del sistema RER por medio de la eliminación de Rnh201, evitando así que los ribonucleótidos desaparezcan del genoma. Además, el ADN aislado de estas cepas sufre un tratamiento alcalino que rompe el ADN por donde está el ribonucleótido, generado ADNss a partir del cual se generan librerías. A partir de la secuenciación de estas librerías de ADN, y su alineamiento con el genoma de referencia, se hace una relación relativa de lecturas de los datos tanto para Polε y Polδ tanto en la cadena sentido 5’→ 3’ como en la 3’→ 5’, y se calcula la ratio de ribonucleótidos introducidos por cada polimerasa (Daigaku et al., 2015). Estas técnicas de mapeo de ribonucleótidos permitieron demostrarque la replicación de la cadena continua se lleva a cabo por la ADN polimerasa ε, mientras que la ADN polimerasa δ realiza la síntesis de la cadena discontinua (Daigaku et al., 2015). En este estudio, el mutante de la POL2 utilizado fue pol2-M644G. En este mutante el aminoácido metionina de la posición 644 ha sido sustituido por glicina. El mutante POL3 utilizado es pol3-L612M, donde la leucina de la posición 612 fue sustituida por el aminoácido metionina. Además, las cepas van a presentar la proteína Rnh201 controlada por un degrón de auxina explicado previamente, de tal manera que el sistema RER no podrá eliminar los rNTPs incorporados. Con estas cepas generadas, se podrá explorar el funcionamiento de la replicación a nivel de cadena continua o discontinua. 3. Objetivos • Estudiar la acción de Exo1 en la replicación, tanto en la estabilidad de la cadena continua como de la cadena discontinua. • Averiguar el papel de la fosforilación de Exo1 en la estabilidad de las cadenas nacientes 4. Materiales y métodos 4.1. Cepas del estudio Las cepas usadas en este trabajo presentaban un fondo genético W303 que presentaba el siguiente genotipo: MAT-a/α ade2-1 ura3-1 his3-11,15 trp1-1 leu 2-3,112 can1-100 rad5-535. En la tabla suplementaria 1 (tabla suplementaria 1) aparecen todas las cepas usadas en el estudio con su genotipo completo y su procedencia. 11 | P á g i n a 4.2. Medios de cultivo y condiciones de crecimiento Se usó como medio de cultivo YEPD (extracto de levadura 1%, glucosa 2% y peptona 2%) tanto en líquido como en sólido, donde se añadía 2% de agar. Los cultivos sólidos se hicieron en placas Petri y la incubación se llevó a cabo en una estufa a 30ºC mientras que los cultivos líquidos se incubaron en agitación constante a 30ºC. La selección de colonias con ciertos marcadores se llevó a cabo usando medio YNB sin aminoácidos (Yeast Nitrogen Base al 0,7% y Glucosa al 2%) con agar al 2%. Las cepas del estudio presentaban auxotrofías para adenina, histidina, leucina, triptófano y uracilo. El medio anterior se complementaba con los aminoácidos a concentración 40 μg/mL de cada uno de ellos excepto de uno, generando así medios selectivos. En este estudio se usaron también placas de resistencia a antibióticos, en concreto se usaron placas de YEPD con Higromicina (Hgh) y con Kanamicina (Kan) a una concentración de 100 μg/mL. 4.3. Construcción de cepas 4.3.1. Transformación de cepas en Saccharomyces cerevisiae Para la transformación de cepas de S.cerevisiae se usó un protocolo basado en el uso del Acetato de Litio (Schiestl & Gietz, 1989) y que incluía el DMSO para aumentar la eficiencia de dicho procedimiento (Gietz et al., 1992). La concentración de los casetes usados para las transformaciones se encontraba entre los 800 ng/μL y los 1800 ng/μL. Acabado el protocolo de transformación, las células se extendieron en dos placas de medio selectivo a diferentes concentraciones, una de ellas tenía un 10% de células transformantes y la otra un 90 % de células transformantes. En este estudio se usaron placas selectivas para la histidina y la adenina, que fueron los marcadores que se usaron en la transformación. Las células se incubaron 2 días a 30º y a continuación se comprobó mediante PCR la integración correcta del casete en el genoma. 4.3.1.1. Plásmidos En este trabajo se han usado dos plásmidos. El primero de ellos, fue pRS402 que se ha usado para obtener el casete de deleción de EXO1. Este plásmido presentaba el gen ADE2 de marcador. El otro plásmido utilizado es PML9 que presentaba en su genoma tres repeticiones del epítopo HA en el gen de la histidina. 12 | P á g i n a Figura 6. Esquema del plásmido pRS402(a) y PML9 (b). 4.3.2. Cruces genéticos Para realizar los cruces necesarios para este estudio se usaron células haploides de sexo opuesto, es decir, una era MATa y otra MATα. Ambas debían de encontrarse en fase exponencial (un día después de haberse refrescado). El cruce se producía cuando las dos cepas entraban en contacto: en este estudio se realizaron de dos maneras, una de ellas poniendo las cepas en contacto directamente sobre una placa de agar y la otra juntando ambas cepas en una gota de agua. Las levaduras se incubaron durante 4 horas a una temperatura de 30ºC y pasado ese tiempo se comprobó la presencia de zigotos (figura 7a y 7b) en un microscopio de campo claro mediante una extensión. Figura 7. S. cerevisiae. Las imágenes (a y b) muestran la diversa morfología que pueden presentar los zigotos mientras que la imagen (c) muestra un asca observada en microscopio de campo claro. En el caso de que hubiera zigotos, había que aislarlos del resto de las células. Para ello, se utilizó el micromanipulador MSM 400 Singer Intruments. Los zigotos obtenidos se dejaron creciendo durante varios días en la estufa a 30º C y formaron colonias de células diploides que tuvieron el genotipo de ambas células parentales. 4.3.3. Esporulación de cepas de S. cerevisiae diploides Pasado el tiempo de incubación de las colonias diploides y para que los diploides formasen esporas, las células obtenidas en el cruce y que formaban colonia se pasaron a placas de medio RSM (0.25% de extracto de levadura, 1.5% de acetato potásico, 0.1% glucosa, 2% de agar, 6.25μg/mL de fenilalanina, 2.5 μg/mL de adenina, 2.5 μg/mL de uracilo, 1.25 μg/mL de leucina, 1.25 μg/mL de arginina, 1.25 μg/mL de lisina, 1.25 μg/mL de histidina, 1.25 μg/mL de 13 | P á g i n a triptófano, 1.25 μg/mL de metionina y 0.5 μg/mL de tirosina) y se incubaron a 30ºC en la estufa durante dos días. Estas placas contenían los aminoácidos en cantidades limitantes por lo que estimulaban la esporulación de los diploides. Cuando los diploides esporularon generan unas estructuras denominadas ascas (figura 7c). La presencia de las ascas con sus tétradas correspondientes se comprueba al microscopio mediante una extensión. 4.3.4. Disección de tétradas S. cerevisiae Para diseccionar las tétradas, la muestra se diluía en un volumen de 100 μL de H20 estéril y se añadía zimoliasa (1mg/mL) y se incubó la muestra a 37ºC durante 5 minutos permitiendo la degradación de la cubierta de las ascas para facilitar su posterior separación. A continuación, la muestra se diluyó en 1mL de agua estéril y se depositó una gota de la muestra diluida en una placa con medio YEPD que se extendió y las tétradas se diseccionaban en el micromanipulador. La cantidad de tétradas a diseccionar dependía de las combinaciones que se necesitaran para obtener los genes de interés expresados un mínimo de 4 veces. Las esporas diseccionadas se incubaron al menos 48 horas a 30ºC en una estufa y pasado ese tiempo se observaron las colonias formadas por las esporas. 4.3.4.1. Selección de marcadores Cuando se obtuvieron las colonias de las esporas, se realizaron las réplicas en los medios selectivos que fueron esenciales para distinguir la presencia de los marcadores de interés. En este estudio se usaron placas de medio selectivo para la histidina, leucina, triptófano, uracilo y placas de resistencia a antibióticos, en concreto para la Higromicina y Kanamicina. También se determinó el sexo de las colonias obtenidas, para ello las cepas obtenidas se mezclaron con cepas MATa y MATα que presentaban otras auxotrofías diferentes a las del fondo genético usado, es decir, W303. Para saber el sexo de las cepas se usaron placas YNB sin aminoácidos y sólo si habían conjugado formaban un diploide que generaba colonia capaz de crecer en medio mínimo sin ningún aminoácido. Las placas se dejaron incubando en la estufa a 30ºC durante varios días para observar la formación de colonias. 4.3.5. Conservación de cepas S. cerevisiae Las cepas generadas en este estudio se guardaron para próximos estudios. Para ello, se hizo un inóculo de la cepa obtenida en medio YEPDdentro de un criotubo y se dejó incubando durante 24 horas a 30 ºC en la estufa. Pasado ese tiempo se comprobó que el cultivo estaba bien y que 14 | P á g i n a no se había contaminado observando las células al microscopio mediante una extensión. Tras comprobar que todo estaba bien se añadieron 800 μL de glicerol al 50% y se mezcló bien y se guardó a -80º C para próximos estudios. 4.4. Técnicas de manipulación del ADN 4.4.1. PCR Para la realización de la PCR se usó el termociclador Verity (Applied biosistem). 4.4.1.1. Oligonucleótidos Los oligonucleótidos usados durante este estudio aparecen en la tabla suplementaria 2 (tabla suplementaria 2. 4.4.1.2. PCR Para la PCR se usó la DNA polimerasa de Biotools (1U/μL) a concentración final 0.02 U/μL. Esta DNA polimerasa contenía su propio buffer a una concentración 10X. Se añadía también dNTPs (10mM) y los oligonucleótidos (10 mM) (tabla suplementaria 2). La cantidad de ADN molde a añadir era variable. Las condiciones usadas aparecen en la figura 8. El tiempo de extensión variaba en función del tamaño del producto de la PCR esperado. El producto de la PCR se observó en una electroforesis en gel de agarosa que se explicará más adelante. Figura 8. Tabla con las condiciones usadas en la PCR. 4.4.1.3. PCR de colonia La PCR de colonia era una variación que difiere de la anterior en que el DNA se extraía directamente de las células tras realizar un lisado por choque térmico en el microondas durante 2 minutos a 700W. La amplificación de DNA de colonia se realizó mediante “NZYtaq 2x green master mix”. Después de añadir los oligonucleótidos y el agua estéril la mezcla se añadió directamente a las células lisadas y se realizaba la PCR en el termociclador citado anteriormente con las condiciones que aparecen en la figura 9. El tiempo de extensión se ajustaba como ya se ha explicado en el apartado anterior. El producto la PCR se visualizaba por electroforesis en gel de agarosa. Ciclos Fase Temperatura (⁰C) Tiempo x1 Desnaturalización inicial 94 2 min Desnaturalización 94 30 seg Anillamiento 55 30 seg Extensión 72 1 min/kb ∞ Enfriamiento 4 ∞ x35 15 | P á g i n a Figura 9. Tabla con las condiciones usadas en la PCR de colonia. 4.4.1.4. Electroforesis de ADN en geles de agarosa El producto de la PCR se visualizó mediante electroforesis que se había cargado en geles de agarosa al 1% en TAE (Tris 40mM, EDTA 1mM y ácido acético hasta pH 8). Para la visualización de las bandas, durante la preparación del gel se añadió Bromuro de etidio (0.5 μg/mL) que era un agente intercalante del ADN el cual cuando se encontraba en presencia de luz ultravioleta emite fluorescencia. Antes de cargar la muestra, se le añadió tampón de carga 10X (0,005-0.25% azul de bromofenol y 50% Glicerol), excepto en aquellas PCR realizadas con NZY taq 2x green master mix porque ya incluía el buffer de carga. Junto a las muestras que se cargaban cada una en un carril diferente, se cargaba en otro carril el marcador 1kb Plus DNA Ladder (Invitrogen) que presentaba diversas bandas en función del peso. Para separar bien las bandas en el gel, la carrera se realizó a 100-120 V durante un tiempo variable en función del tamaño del fragmento de ADN que se esperaba. Pasado ese tiempo, el gel se revelaba y se fotografiaba con el sistema Gel Doc TM XR+ (Bio-Rad). 4.4.2. Purificación de muestras de PCR Los productos de PCR se purificaron usando el kit NZYPrep y siguiendo el protocolo propuesto por la casa comercial. El ADN purificado se cuantificó en el NanoDrop 1000 (Thermo Scientific) y se visualizaba mediante electroforesis de DNA en geles de agarosa según se ha explicado anteriormente. 4.4.3. Digestión de ADN con enzimas de restricción La digestión del ADN se realizó usando dos enzimas: EcoRV y RSA1. El producto de la digestión se visualizaba mediante electroforesis en un gel de agarosa. 4.5. Test de gotas Para la realización del test de gotas se han usado placas de MMS al 0,015% o Hidroxiurea (HU) a 200 mM en medio YEPD con agar al 2% y también placas que solo contenían YEPD con agar al 2%. Además, a estas placas se les añadían otras sustancias como son la doxiciclina Ciclos Fase Temperatura (⁰C) Tiempo x1 Desnaturalización inicial 94 2 min Desnaturalización 94 1 min Anillamiento 50 1min Extensión 72 1 min/kb ∞ Enfriamiento 4 ∞ x35 16 | P á g i n a (Dx) a una concentración 1 mM y el ácido indolacético (IAA) a una concentración 2mM. Para la realización de este test de gotas se cuenta con cuatro placas de YEPD: dos de ellas tendrán además DO e IAA a las concentraciones mencionadas anteriormente y dos de ellas no llevarán nada más que YEDP; 4 placas de MMS: dos de ellas en presencia de IAA y DO y dos en ausencia de estas sustancias; 4 placas de HU: dos en presencia de IAA y DO y dos en ausencia de estas sustancias. El objetivo era tener un duplicado de cada situación para que lo ocurrido en el test de gotas sea más fiable. Las placas de MMS se preparan un día antes de su utilización porque es un compuesto muy volátil y de esta manera se evita su eliminación. El inóculo inicial se realiza en una placa de 96 pocillos en medio YEPD líquido que se deja crecer hasta que alcanza la fase estacionaria (24 horas aproximadamente). Después se realizan 5 diluciones seriadas 1/5 del inóculo inicial de cada cepa que se va a usar en el test. Las placas a usar tienen que secarse en la cabina de flujo laminar durante 5 minutos antes de usarse. Tanto las gotas del inóculo inicial y de las diluciones se depositan en las placas problemas mediante un replicador de 8x6 esterilizado con etanol y con llama. 5. Resultados y discusión 5.1. Papel de Exo1 en la inestabilidad de cadenas nacientes en presencia de estrés replicativo En un primer abordaje se quiso observar si Exo1 afectaba a la estabilidad de las cadenas nacientes (tanto en la cadena continua como en la discontinua) en presencia de estrés replicativo. Estudios previos mostraban que Exo1 interviene tanto en la estabilidad de las horquillas de replicación (Segurado & Diffley, 2008) como en la activación del Checkpoint de fase S, debido a que la actividad nucleasa de Exo1 en procesos de reparación de ADN genera regiones de ADN de cadena simple que participan en la activación del checkpoint de fase S (Giannattasio et al 2010). 5.1.1. Construcción de cepas para analizar las diferencias de cadenas en ausencia de Exo1 5.1.1.1. Deleción de EXO1 Para poder estudiar la acción de Exo1 sobre la replicación, se han generado cepas que no presentaban Exo1, es decir, se ha delecionado EXO1. Para poder llevar a cabo esta deleción, se usó el plásmido pRS402 (figura 6a) que contenía una región que codificaba un marcador de selección que era el gen ADE2. Para aislar este casete, se realizó una PCR sobre el plásmido 17 | P á g i n a pRS402 donde los oligonucleótidos utilizados fueron Exo1-D5 y Exo1-D3, diseñados según la técnica empleada por Longtine y colaboradores (Longtine et al., 1998). Los oligonucleótidos presentaban en su extremo 5’ secuencias de homología con la zona del genoma a recombinar, es decir en el locus del gen EXO1, seguido de unas 20 pb homólogas al plásmido utilizado (pRS402). El producto obtenido de la PCR se visualizó en un gel de agarosa (figura 9) y presentaba un tamaño de 2,1 Kb. El gen ADE2 tenía un tamaño de 1,7 Kb, pero esta PCR amplificaba este gen incluyendo secuencias que le flanqueaban, por lo que el tamaño del producto de la PCR obtenido era mayor. Después se purificó obteniendo una concentración de 880 ng/μL. Figura 9. Electroforesis del producto de la PCR para detectar el casete de la deleción EXO1 en el plásmido pRS402. La flecha indica el tamaño del casete. El siguiente paso fue introducir el casete de deleción de EXO1 en la cepa YAB 412 (MATα W303 Δsml1::HIS TRP::tetO2::RNH201-AID*-FLAG::HGHtetR’-SNN6::LEU OsTIR1::URA) utilizando un protocolo de transformación. El casete se integró en el genoma por recombinación homóloga entre las zonas de homología que se encontraban flanqueando el gen ADE2 y EXO1. Tras la transformación, las células fueron cultivadas en medio sin adenina, y tras dejarlas crecer varios días se seleccionaron aquellas capaces de crecer en medio sin adenina. La cepa YAB 412, usada en esta parte del estudio, era auxótrofa para adenina, es decir, no era capaz de sintetizarla. El casete usado para la transformación contenía el marcador de selección ADE2. Este gen proporcionaba a las células la capacidad para sintetizar este compuesto. Por esta razón, las células capaces de crecer en un medio sin adenina, porque podían sintetizarla, eran aquellas que habían sido transformadas y por lo tanto en las que se había delecionado el gen EXO1 que había sido sustituido por el marcador de selección ADE2. Tras la selección de las células capaces de crecer sin adenina, las células seleccionadas se analizaron para comprobar la integración del casete de deleción en el locus de interés y que la 18 | P á g i n a deleción de EXO1 se había producido. Para ello se realizó una PCR de colonia usando los oligonucleótidos Exo1-1 y ADE2-2. Como se ha comentado anteriormente, el gen ADE2 tenía un tamaño de 1,7 Kb. Pero según el anillamiento de los oligonucleótidos utilizados, no se va a amplificar el gen completo por lo que el producto de la PCR se esperaba que presentara un tamaño más pequeño. Para esta PCR se usó un control positivo, que correspondía a una PCR realizada sobre una cepa con la deleción de EXO1 comprobada previamente. El producto de la PCR se visualizó en un gel de agarosa y se detectó un fragmento de 1,2 Kb correspondiente a un fragmento de ADE2 tal y como aparece en la figura 10. Figura 10. Electroforesis del producto de la PCR para comprobar la deleción de EXO1 en la cepa YAB 412. La flecha indica la banda correspondiente a ΔEXO1. 5.1.1.2. Combinación de la deleción de EXO1 con mutantes de la ADN polimerasa δ Tras escoger aquellos clones positivos en la PCR de colonia y por lo tanto que presentaban la deleción de EXO1, se realizó un cruce genético para obtener una cepa que tuviera por un lado la deleción de EXO1 y por otro lado las mutaciones necesarias para poder realizar la técnica Pu- seq (figura 11). Las mutaciones eran en las ADN polimerasa y en la ruta RER. previamente se ha explicado que, en la replicación, la ADN polimerasa σ inicia cada evento de síntesis y es reemplazada por la ADN Polimerasa δ (Pol3) que realiza la síntesis de la cadena discontinua. En condiciones normales, Pol3 incorpora rNTPs en vez de dNTPs a una frecuencia de 1:500 (Daigaku et al., 2015) y los rNTPs incorporados son eliminados por el sistema RER, ya que la RNasa H2 (con la subunidad catalítica Rnh201) corta en 5’ al ribonucleótido y la polimerasa correspondiente, Pol2 o Pol3 inicia la síntesis y la nucleasa Fen1 elimina los errores producidos por la replicación 19 | P á g i n a antes de que la ligasa complete la reparación. La mutación pol3-L612M aumenta el número de rNTPs incorporados, que además no van a poder ser eliminados en ausencia de actividad Rnh201 y, por lo tanto, el mapeo de ribonucleótidos presentes sirve para poder monitorizar la replicación de la cadena discontinua en este caso. Con este cruce se quería conseguir una cepa que a la hora de realizar la replicación tuviera una ADN polimerasa δ que cometiera más errores de lo normal (pol3-L612M) y que además la reparación de errores no funcionara correctamente (un mutante condicional de RNH201), y que además careciese de Exo1. Uno de los parentales del cruce era la cepa que construimos en el apartado anterior, que presentaba la deleción de EXO1 además de un degrón de auxina controlando la Rnh201 con el cual se eliminaría dicha proteína en presencia de auxina (figura 11). El otro parental era una cepa que contenía la mutación pol3-L612M. Además, este parental presentaba un degrón de auxina controlando Rad53, para poder analizar el papel del checkpoint de fase S durante la replicación de la cadena discontinua. Figura 11. Tabla con las cepas del cruce genético. En esta tabla aparece el nombre de las cepas usadas en el cruce genético y su genotipo concreto. Los diploides se obtuvieron tras poner en contacto ambas cepas durante un tiempo prolongado. Las células haploides que se fusionaron dieron lugar a zigotos (figura 7a y 7b) observándose en el microscopio. Estos zigotos se aislaron y tras incubación durante varios días, dieron lugar a colonias de células diploides observables a simple vista. Tras la obtención de diploides, éstos se esporularon en placas de RSM, cuyas características se han explicado en materiales y métodos Después se comprobó la presencia de ascas con sus correspondientes tétradas, las cuales se diseccionaron. Para la disección de las tétradas, fue necesario la degradación de la cubierta de las ascas, que se producía gracias a la zimoliasa que se añadió durante el procedimiento. Después, se separaron las esporas y se dejaron que formasen colonias durante dos días. Tras ese tiempo se realizaron las réplicas de las colonias obtenidas en los medios selectivos necesarios para distinguir la presencia de los marcadores de interés. Las células descendientes del cruce, al igual que sus parentales iban a ser protótrofas para algunos aminoácidos y/o bases nitrogenadas, es decir, podían sintetizar dichos compuestos ya Cruce Genotipo MATα W303 Δsml1::HIS TRP::tetO2::RNH201-AID*-FLAG::HGH tetR’-SNN6::LEU OsTIR1::URA ΔExo1::ADE MATa W303 Δsml1::LEU OsTIR1::URA RAD53-AID*-FLAG::KAN pol3-L612M YSA001 x YAB 271 20 | P á g i n a que, al añadir ciertas características al genoma de las células por transformación, como se hizo en el apartado 5.1.1.1 con la deleción de EXO1, se usaron genes marcadores que conferían a las células la capacidad de síntesis. Por lo que estas células para crecer no necesitan medio suplementado con dichos compuestos. Uno de los medios usados para seleccionar marcadores de interés fue medio sin histidina, porque las colonias a seleccionar eran aquellas que presentaran en su genoma la deleción de SML1 que estaba asociada al gen HIS en una de las cepas parentales (figura 11). Por lo tanto, las células capaces de crecer en este medio presentarían el gen necesario para la síntesis de histidina y por lo tanto la deleción de SML1 heredada de dicho parental. Para construir esta deleción, se realizó una transformación por la cual se introdujo en las células un casete aislado de un plásmido que tenía el gen HIS y por recombinación homóloga con regiones que flanqueaba el gen SML1 se introdujo en el genoma sustituyendo a SML1 cuya función es regular negativamente la síntesis de dNTPs, por lo que la ausencia de la proteína Sml1 producirá un aumento de dNTPs permitiendo la viabilidad celular en ausencia de Rad53, aunque no restaura los defectos del checkpoint (X. Zhao et al., 1998). Por este motivo, las dos cepas usadas en este cruce presentaban la deleción de SML1, para que la eliminación de Rad53 en los mutantes condicionales de auxina no afecte a la viabilidad celular. Otro de los medios para seleccionar células fue medio sin triptófano, ya que una de las características genéticas que se quería seleccionar era el degrón de RNH201, que consta de dos componentes. Por un lado, el promotor inducible tetO2. Este promotor junto con el gen TRP fue introducido mediante transformación y por recombinación homóloga se integró en el genoma de una de las cepas parentales (figura 11). Debido a esta construcción, las células hijas capaces de crecer en un medio sin triptófano presentaban en su genomael gen TRP (otorgaba la capacidad de sintetizar dicho aminoácido) y el promotor tetO2 heredado del parental. El otro medio usado fue medio sin leucina, ya que había que seleccionar la presencia del otro componente del degrón de RNH201, el inhibidor del promotor inducible tetO2 denominado tetR’-SNN6, que iba asociado al gen LEU. Este componente fue introducido por recombinación homóloga. Por esta razón, las células capaces de crecer en medio sin leucina fueron capaces de sintetizarla gracias a la presencia del gen LEU, por lo que las células presentaban tetR’-SNN6. Las células hijas del cruce, interesaba que presentaran tetO2 y tetR’-SNN6. Como consecuencia, las células que se seleccionaron crecían en medio sin triptófano y sin leucina. Sin embargo, una de las cepas parentales presentaba en su genoma la deleción de SML1 marcada también con 21 | P á g i n a el gen LEU, mientras que la otra presentaba en su genoma el inhibidor del sistema tetO2 tetR’- SNN6 marcado también con el gen LEU (figura 11). En este caso interesaba que las células tuvieran tetR’-SNN6. Por ello, se seleccionaron aquellas que crecían en medio sin histidina y sin leucina, ya que presentaban la deleción de SML1 procedente del otro parental (marcada con HIS) y por tanto la capacidad de crecer sin leucina sólo podía venir de la integración de tetR’- SNN6::LEU. Por otro lado, se utilizó también medio sin uracilo ya que las cepas parentales presentaban en su genoma el sistema OsTIR1 (figura 11) asociado al gen URA. Como se ha explicado en la introducción de este trabajo, OsTIR1 es un receptor de unión a auxina, que en presencia de dicha hormona vegetal señala a la proteína unida al epítopo AID para que sea degradada por el proteasoma (Mendoza‐Ochoa et al., 2019). De esta forma se seleccionaron las células con la capacidad de sintetizar uracilo y que, por tanto, portaban el sistema OsTIR1, necesario para el funcionamiento de los degrones de auxina de las cepas de interés. También se usó la resistencia a antibióticos, en este caso a Kanamicina y a Higromicina: se utilizó medio con el antibiótico Kanamicina, para seleccionar las células que eran capaces de crecer en este medio, es decir, eran resistentes a kanamicina. Estas células presentaban en su genoma un degrón de auxina que controlaba a Rad53 (RAD53-AID*-FLAG) que se había heredado de uno de los parentales (figura 11) y que estaba asociado al gen KAN, que otorgaba resistencia a kanamicina. Las células capaces de crecer en un medio con Kanamicina eran aquellas que presentaban el degrón de auxina controlando a Rad53. También se empleó medio con Higromicina, por la misma razón que en el caso del degrón de auxina que controlaba Rad53, pero en este caso para seleccionar un degrón de auxina de Rnh201(RNH201-AID*-FLAG), que estaba presente en el genoma de una de las cepas parentales (figura 11) junto con el gen que da resistencia a Higromicina, el gen HGH. Las células a seleccionar fueron aquellas capaces de crecer en este medio porque presentaban este degrón y la capacidad de resistir en un medio con dicho antibiótico y por lo tanto habían heredado dicha característica de una de las cepas parentales. Se hizo también una réplica de las colonias en medio YEPD (figura suplementaria 1). A partir de esta placa, observando las colonias capaces de crecer en los medios anteriores, se seleccionaron dos tipos de colonias: en primer lugar, aquellas colonias capaces de crecer en todos los medios utilizados y que además presentaban resistencia a Higromicina y Kanamicina, por lo que tenían los dos degrones de auxina (figura suplementaria 1). El segundo lugar, se 22 | P á g i n a seleccionaron aquellas que eran capaces de crecer todos los medios selectivos y que eran resistentes a la Higromicina, pero no a la Kanamicina, es decir, solo presentaban el degrón de auxina controlando a Rnh201. En este caso se realizaron dos rondas de réplicas donde se obtuvieron en total trece colonias, de las cuales 6 presentaban el genotipo completo y 7 todo menos el degrón de auxina que controlaba a Rad53 (figura suplementaria 1). Tras la selección de marcador quedaba saber si esas colonias tenían en su genoma la mutación en la ADN polimerasa δ (pol3-L612M). La presencia de dicha mutación no se podía seguir mediante el uso de marcadores, por ello, se realizó una PCR de colonia a 4 de las 13 colonias obtenidas previamente usando los oligonucleótidos POL3-FW y POL3-RE, que amplificaban una parte del gen POL3. El producto de la PCR presentaba un tamaño aproximado de 0,5Kb (figura 12a). Después se purificó el producto de la PCR para poder digerirlo. El objetivo de la digestión era saber si la polimerasa registraba mutaciones o no. El uso de las digestiones se debía a que las mutaciones introducidas en la polimerasa generaban cambios en las bases del ADN generando sitios nuevos de restricción. La digestión se llevó a cabo con la enzima de restricción EcoRV y el producto de la digestión se visualizó mediante electroforesis (figura 12b) y se observó que de las colonias obtenidas y analizadas ninguna presentaba mutaciones en dicho gen ya que solo aparecía una única banda de 0,5Kb correspondiente a la parte del gen POL3 amplificado. Figura 12. Electroforesis en gel de agarosa del producto de la PCR de POL3 (a) y electroforesis de la digestión de POL3 (b). La flecha amarilla señala la banda obtenida en la PCR mientras que la flecha verde señala la banda obtenida en la digestión. 23 | P á g i n a Como se comentó al principio del apartado, el objetivo del cruce era conseguir una cepa que presentara el degrón de Rnh201 y/o el degrón de Rad53, además de mutaciones en la ADN polimerasa δ, pero debido a la falta de tiempo no se pudieron analizar más clones para saber si alguna presentaba las características necesarias para analizar el papel de EXO1 en la estabilidad de la cadena discontinua. 5.1.1.3. Combinación de la deleción de EXO1 con mutantes de la ADN polimerasa ε Para poder analizar el papel de Exo1 en la estabilidad de la cadena continua, se necesitaba una cepa con todos los requisitos genéticos descritos en el apartado anterior (degrón de Rnh201 y/o degrón de Rad53) más mutaciones en la ADN polimerasa ε (POL2), que se encargará de la replicación de la cadena continua (Daigaku et al., 2015). La mutación pol2-M644G va a dar lugar a un exceso de ribonucleótidos en la cadena continua de nueva síntesis, que en condiciones de degradación de Rnh201 no serán reparados y podrán mapearse para analizar la síntesis de esa cadena y su estabilidad en condiciones de estrés replicativo. Por tanto, el objetivo era obtener una cepa que en la replicación de la cadena continua introdujera más ribonucleótidos de lo normal, mediante la mutación pol2-M644G y además un mutante condicional de RNH201, y que contase además con la deleción de EXO1. Para ello, se realizó un cruce genético con las cepas que aparecen en la siguiente figura: Figura 13. Tabla con las cepas del cruce genético. En esta tabla aparece el nombre de las cepas usadas en el cruce genético y su genotipo concreto. El procedimiento de obtención de diploides, la esporulación de los mismos, la disección de tétradas se llevó a cabo igual que en apartado 5.1.1.2. A continuación, se realizaron las réplicas de las colonias obtenidas en los medios necesarios para distinguir la presencia de los marcadores de interés. Al igual que en el cruce explicado anteriormente, tanto las células parentales como las esperadas del cruce, eran protótrofas para algunas bases y/o aminoácidos, por lo que, las células podían crecer en medio mínimo sin su presencia. Cruce Genotipo MATα W303 Δsml1::HIS TRP::tetO2::RNH201-AID*-FLAG::HGH tetR’-SNN6::LEU OsTIR1::URA ΔExo1::ADE MATa W303 Δsml1::LEU OSTIR1::URA RAD53-AID*-FLAG::KANpol2-M644G YSA001 x YAB 295 24 | P á g i n a Como en el cruce anterior, el primer medio que se utilizó contenía todos los aminoácidos menos la histidina ya que la característica a seleccionar era la deleción de SML1 asociada al gen HIS en uno de los parentales (figura 13). Las células producto del cruce a seleccionar fueron aquellas que eran capaces de crecer en el medio sin histidina, ya que podían sintetizarlo por lo que presentaban la deleción del gen SML1. El segundo medio donde se realizaron las réplicas de las colonias obtenidas fue en medio sin triptófano, ya que se quería seleccionar el promotor inducible tetO2 asociado al gen TRP y que era parte esencial del sistema degrón tetO2 de Rnh201. Debido a esto, las células producto del cruce que tuvieran esta característica, procedente del parental (figura 16), eran capaces de crecer en un medio sin triptófano y por lo tanto presentaban el promotor inducible tetO2. El tercer medio usado para hacer las réplicas fue medio sin leucina, para seleccionar la presencia de tetR’-SNN6::LEU. Por la misma razón explicada en el apartado anterior, la doble selección sin histidina y leucina, descarta que el marcador LEU venga asociado a la deleción de SML1 de uno de los parentales, y no a tetR’-SNN6::LEU. Otro de los medios utilizados para seleccionar fue medio sin uracilo. El uso de este medio se debió a que las cepas de interés necesitaban el sistema OsTIR1 que se introdujo junto el gen URA mediante transformación en ambas cepas parentales (figura 13). Por lo que las células seleccionadas en este caso fueron aquellas capaces de crecer en ausencia de uracilo, y por lo tanto presentaba el sistema OsTIR1. Por otro lado, se usó también la resistencia a antibióticos: se utilizaron Kanamicina e Higromicina. El uso de medio con Kanamicina fue para seleccionar el degrón de auxina de Rad53 con el gen KAN y que les proporcionaba resistencia a dicho antibiótico y el uso del antibiótico Higromicina, permitió seleccionar aquellas que tenían un degrón de auxina controlando Rnh201 y que proporcionaba resistencia a Higromicina. Junto con todos los medios anteriores, también se realizó una réplica de las colonias producto del cruce en medio YEPD sólido (figura suplementaria 2). Comparando esta placa con las anteriores se seleccionaron en esta placa las colonias necesarias para obtener todas las herramientas genéticas de interés. Se seleccionaron dos tipos de colonias: aquellas que eran capaces de crecer en todos los medios sin aminoácidos, es decir, que eran capaces de sintetizarlos y que además presentaban resistencia a Kanamicina y Higromicina; y aquellas colonias que eran capaces de crecer en todos los medios sin aminoácidos y que solo presentaban resistencia a Higromicina. 25 | P á g i n a Se obtuvieron tres colonias: dos de ellas mostraban todos los marcadores y resistencia a los dos antibióticos y la otra exhibía todos los marcadores y la resistencia a Higromicina por lo que solo presentaba el degrón de auxina controlando Rnh201. Tras la selección de marcadores, había que comprobar que las colonias que habían sido seleccionadas tuvieran mutaciones en el gen POL2. Para ello, primero se realizó una PCR de colonia de las colonias obtenidas previamente. En esta PCR se usaron dos oligonucleótidos: Pol2-FW y Pol2-RE, que amplificaban una parte del gen POL2. La visualización del producto de la PCR se hizo en un gel de agarosa (figura 14a) y se observó que el producto de la PCR presentaba un tamaño aproximado de 1,5 Kb. Tras purificar el producto de la PCR, se realizó la digestión para saber cuáles presentaban la mutación pol2-M644G. Para esta digestión se usó la enzima de restricción RSA1. La mutación en el gen POL2, producía cambios en las bases de la secuencia del ADN provocando nuevos sitios donde podían cortar las enzimas de restricción. En este caso, Rsa1 realizó cortes cuando el gen POL2 estaba mutado. Al visualizar el producto de la digestión en un gel de agarosa (figura 14b) se observó que de las colonias obtenidas y analizadas 2 de ellas presentaban claramente una banda de aproximadamente 0,5Kb que serían aquellas que presentaban la mutación en el gen POL2 y por ello había sudo digeridas. En caso contrario, aparecería una banda de 1,5 Kb correspondiente al tamaño de dicho gen. Figura 14. Electroforesis en gel de agarosa del producto de la PCR de POL2 (a) y electroforesis de la digestión con Rsa1 (b). La flecha amarilla señala la banda obtenida en la PCR y la flecha verde señala la banda obtenida en la digestión. 26 | P á g i n a 5.1.2. Análisis de sensibilidad de agentes genotóxicos: ensayo de gotas. Con este ensayo de gotas, el objetivo fue comprobar el fenotipo de las cepas generadas que presentaban la deleción de EXO1 y mutaciones en el gen POL2 descritas en el apartado 5.1.1.3, en presencia o ausencia de Rnh201 y/o Rad53. Para comprobar el funcionamiento de las diversas cepas, se usaron diferentes drogas. Una de ellas, fue el metilmetanosulfanato o MMS, agente alquilante del ADN. Se usó también Hidroxiurea o HU que provocaba estrés replicativo. Además, en este ensayo de gotas, se usó la doxiciclina (Dx), sustancia que bloqueaba la transcripción del gen RNH201 dependiente del promotor tetO2. También se utilizó ácido indolacético (IAA), que activaba los degrones de auxina integrados en el genoma y degradaba la/s proteína/s que estaban reguladas por este sistema (Rnh201 y/o Rad53). Para este ensayo de gotas se usaron diferentes cepas. La primera de ellas fue YAB 192 (MATa W303 RAD53-AID*-FLAG::KAN OsTIR1::LEU), que presentaba en su genotipo el degrón de auxina controlando a Rad53 y su uso determinaba el papel del checkpoint de fase S en las distintas condiciones ensayadas. La siguiente cepa a usar fue YAB 362 (MATa W303 Δsml1::LEU OsTIR1::URA pol2-M644G). Previamente se había comprobado que no presentaba sensibilidad a agentes genotóxicos. Por tanto, se usó como control positivo de crecimiento. La presencia de OsTIR1 y la deleción de SML1 estaban presentes en todas las cepas analizadas, por tanto, compartían este mismo fondo genético para que los resultados entre ellas fueran comparables. La siguiente cepa que se usó fue YMF 158 (MATa W303 TRP::tetO2::RNH201-AID*- FLAG::HGH TetR´-SSN6::LEU Δsml1::HIS OsTIR1::URA pol2-M644G). Esta cepa tenía una mutación en el gen POL2 que producía una incorporación de más rNTPs de lo normal. Además, presentaba el doble degrón de auxina controlando a la Rnh201. A continuación, se usaron dos clones de la cepa del cruce que se realizó y que aparece detallado en el apartado 5.1.1.3. Esta cepa se caracterizaba por tener todos los marcadores genéticos de interés (MATα W303 Δsml1::HIS TRP::tetO2::RNH201-AID*-FLAG::HGH tetR’-SNN6::LEU OsTIR1::URA ΔExo1::ADE pol2-M644G) excepto el degrón de auxina controlando a Rad53. El primero de los clones utilizados fue el clon 8 que presentaba sexo MATa y el siguiente el 9 cuyo sexo era MATα. A continuación, se usó la cepa YAB 331 (MATa W303 Δsml1::LEU OsTIR1::URA RAD53- AID*-MYC::KAN Δrnh201::HGH pol2-M644G) que se caracterizaba por presentar el degrón 27 | P á g i n a de auxina de Rad53, pero en un fondo de deleción de RNH201. En este caso se pretendía comparar la sensibilidad de una cepa con un mutante constitutivo de RNH201, con la del mutante doble condicional TetO2 y degrón de auxina de RNH201. Después, la cepa que se usó fue YMF 159 (MATa W303 TRP::tetO2::RNH201-AID*- FLAG:HGH RAD53-AID*-MYC::KAN TetR´-SSN6:LEU Δsml1::HIS OsTIR1:URA pol2- M644G) esta cepa contenía ambos degrones de auxina (Rnh201 y Rad53) junto con el gen POL2 mutado. Por último, se usó la cepa generada en este trabajo y que tenía todos los marcadores genéticos de interés y cuyo genotipo era: MATα W303 Δsml1::HIS TRP::tetO2::RNH201-AID*-FLAG::HGH tetR’-SNN6::LEU OsTIR1::URA RAD53-AID*FLAG::KAN ΔExo1::ADE pol2- M644G. Figura 15. Test de gotas. La imagen muestra el comportamiento de las cepas en YEPD (a), MMS (b), HU (c) donde cada número indica el genotipo de las cepas que aparecen en la figura (d). La cepa 1 (YAB 192), que exhibía el degrón de auxina controlando Rad53, creció bien en condiciones normales, es decir, en YEPD (figura 15a). Al añadir IAA (placa YEPD +IA+DX), se activó el degrón de auxina que degradaba Rad53, por lo que la quinasa efectora del checkpoint de fase S se eliminaba. Como eran condiciones de ausencia de daño o estrés replicativo, las células presentaban alta viabilidad y solamente se detectó un crecimiento ligeramente más lento debido a la presencia de IAA y DX. Lo mismo podía observarse con la 28 | P á g i n a cepa 2, que era el control positivo de crecimiento, por lo que este ligero retraso se debía a la presencia de IAA y Dx y no al degrón de Rad53. Sin embargo, la cepa 1 era altamente sensible a la presencia de daño en el ADN, en concreto causado por MMS, y su crecimiento disminuía enormemente en presencia de MMS + IAA (figura 15b), pero no en presencia de MMS, ya que en este último caso Rad53 era funcional. En presencia de MMS + IAA (figura 15b) no había crecimiento ya que con IAA se activaba el degrón de Rad53 y se eliminaba dicha proteína, de tal manera que el checkpoint de fase S no era funcional y la replicación en presencia de lesiones sería letal. Este hecho se extendía a lo sucedido en HU (figura 15c). Se podía concluir respecto a esta cepa, que la eliminación de la proteína Rad53, efectora del Checkpoint de fase S, no afectaba a la viabilidad celular en condiciones normales, pero sí en presencia de daño en el ADN o estrés replicativo como cabría esperar. Además, estos resultados demostraban que el degrón de Rad53 era funcional y se activaba correctamente en presencia de auxina. Por otro lado, en la cepa 2 en presencia de daño al ADN, tanto en MMS como en MMS+IAA+Dx (figura 15b) no disminuía la viabilidad, ya que la proteína efectora del checkpoint (Rad53) estaba presente. Esta situación se extendía también a HU y HU+IAA+Dx (figura 15c). Esta cepa contenía una mutación en el gen POL2 por lo que iba a incluir más rNTPs de la cuenta. Estos resultados mostraban que la presencia del checkpoint de fase S activo y del sistema RER (en presencia de Rnh201) en cepas con el gen POL2 mutado, era funcional tanto en condiciones normales como en presencia de daño. Estos resultados indicaban que cuando el sistema RER funcionaba, la incorporación de exceso de ribonucleótidos no suponía un problema durante la replicación, incluso en presencia de agentes genotóxicos. En el caso de la cepa 3 (YMF 158) tenía el gen POL2 mutado (pol2-M644G). Esto generaba en la replicación, al igual que en el caso anterior, una introducción de rNTPs por parte de la Pol2 a una mayor frecuencia, como se ha explicado en el apartado 5.1.1.3. En condiciones normales (figura 15a), es decir, en YEPD, los rNTPs eran eliminados correctamente gracias al funcionamiento de Rnh201 y la viabilidad se mantenía alta. Al añadir IAA y Dx (figura 15a), que activaban el degrón de auxina degradando la proteína Rnh201, junto con la doxiciclina que inhibía la transcripción del gen RNH201, se observó que el crecimiento disminuía ligeramente, al igual que sucedía en presencia de HU, HU+IAA+Dx (figura 15c) MMS y MMS+IAA+Dx (figura 15b). Estos resultados mostraban que mantener un exceso de rNTPs introducidos por la 29 | P á g i n a polimerasa, en ausencia de actividad Rnh201, afectaba ligeramente a la viabilidad celular, aunque este hecho no parecía acentuarse en presencia de agentes genotóxicos. Al comparar la viabilidad de esta cepa con la de las cepas 4 y 5, obtenidas en el apartado 5.1.1.3 y que diferían de la anterior en la deleción de EXO1, se observó que estas cepas presentaban mayor viabilidad en YEPD (figura 19a), pero al añadir IAA y Dx, eliminando Rnh201, se observaba que la cepa 4 tenía más viabilidad que la 5. En presencia de HU y MMS (figura 15b y 15c) ocurría lo mismo, que al degradar Rnh201 en presencia de IAA y Dx la viabilidad en la cepa 4 se mantenía mientras que en la 5 disminuía aún más. Esto indicaba que los dos clones que tenían el mismo genotipo no compartían el mismo fenotipo. El funcionamiento esperado era que en una cepa POL2 mutada al degradar la proteína Rnh201, el sistema de reparación por escisión de nucleótidos (RER) no funcionara y esto afectase a la viabilidad tal y como ocurre en la cepa 3. Además, en este caso la proteína Exo1 estaba ausente y, por lo tanto, no podía llevar a cabo su función de reparación de lesiones en el ADN, lo que confería sensibilidad a MMS (Morafraile et al., 2020). Por todo esto, al activar el degrón y eliminar Rnh201 en ausencia de Exo1 y presencia de agentes genotóxicos, la viabilidad disminuiría considerablemente, como sucedía en la cepa 5 y no en la cuatro. Esto hacía pensar, que en la cepa 4, alguno de los componentes de eliminación de Rnh201 no funcionaba correctamente, ya fuera el degrón de auxina o el sistema de promotor inducible. Teniendo en cuenta el comportamiento de la cepa 5, los resultados obtenidos mostraban que Exo1 era importante para la viabilidad celular en ausencia de RER cuando la ADN polimerasa ε estaba mutada en condiciones de daño en el ADN o estrés replicativo. La cepa 6 (YAB 331) tenía una mutación en el gen POL2, además de la deleción de RNH201 y el degrón de Rad53. En YEPD era viable, pero al añadir IAA y Dx (figura 15a), que degradaba Rad53 porque dicha proteína estaba controlada por un degrón de auxina, la viabilidad disminuía. Esto indicaba que la ausencia combinada de Rad53 y Rnh201 en combinación con la mutación en POL2 afecta la viabilidad celular incluso en ausencia de tratamiento con agentes genotóxicos. Probablemente altos niveles de rNTPs en ausencia constitutiva de Rnh201 genera problemas replicativos, que hacen necesaria la función del checkpoint de fase S. En presencia de daño, en concreto de MMS (figura 15b), las células presentaban defectos de viabilidad, incluso en presencia de Rad53, lo que indica que altos niveles de rNTPs de forma constitutiva es deletéreo para las células en presencia de agentes genotóxicos. Lo mismo se observaba en presencia de HU (figura 15c). Al activar el degrón, las células eran sensibles a MMS o HU en ausencia de Rad53 como cabría esperar. 30 | P á g i n a Lo ocurrido en esta cepa se extendía a la cepa 7 (YMF159) en MMS y en HU al añadir IAA y Dx (figura 15b y figura 15c) que eliminaba por completo Rnh201 y Rad53, aunque en este caso la pérdida de viabilidad en YEPD+IAA y Dx (figura 15a) es muy leve, y muy comparable a lo que le ocurre a la cepa 3 en las mismas condiciones. Esto indica de nuevo que la ausencia constitutiva de Rnh201 es más dañina para las células que la deleción de Rnh201 durante un tiempo limitado mediante el uso de un mutante condicional de Rnh201. También se puede concluir que un mutante doble condicional de Rhn201 que permite controlar la eliminación de la proteína Rnh201 y la transcripción del gen RNH201 por un sistema de promotor inducible, es una buena herramienta genética para el estudio de la replicación en condiciones de estrés genotóxico. Los resultados indicaban, que el uso de un sistema de degradación de proteínas como el degrón de auxina y el sistema del promotor inducible, generaban mutantes condicionales cuyo fenotipo confirmaba el correcto funcionamiento del sistema. Investigaciones previas habían mostrado que las células que carecían del sistema RER podían progresar en el ciclo celular, aunque de una manera más lenta, en presencia de estrés replicativo (Nick McElhinny et al., 2010), como sucede con la cepa 3 al añadir IAA y Dx. En ausencia de Rnh201 eran capaces de activar
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