La replicación del DNA en bacterias

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Rev. Med. Univ. Navarra, XVII: 223, 1973 
UNIVERSIDAD DE NAVARRA. FACULTAD DE MEDICINA 
DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA 
La replicación del DNA en bacterias 
']. Eugui 
La replicación del DNA es un tema de 
difícil acceso. Aunque ha sido objeto de 
amplias revisiones (1, 2, 3, 4), el trata-
miento que recibe este proceso consiste 
frecuentemente en una recopilación de 
experiencias, hipótesis y modelos, sin una 
crítica ponderada de los mismos, faltando 
un ejercicio de síntesis y una visión cohe-
rente de los numerosísimos -y a veces 
contradictorios- datos experimentales 
En líneas generales, puede decirse que 
es abundante la información existente 
sobre la síntesis de DNA en procariotes 
in vitro. Sin embargo, quedan oscuros al-
gunos puntos muy importantes, como son 
la relevancia de los datos encontrados in 
vitro con respecto a la situación in vivo, 
y los mecanismos de control de la repli-
cación del DNA. 
ASPECTOS BÁSICOS 
El cromosoma bacteriano está constituido 
por una sola molécula de DNA circular, 
formada por dos cadenas antiparalelas 
arrolladas alrededor del mismo eje, ori-
ginando una doble hélice. 
La estructura del DNA, tal como fue pro-
puesta por Watson y Crick 5, proveía el 
mecanismo para explicar la exactitud del 
proceso de replicación. Se romperían los 
puentes de hidrógeno entre las bases de 
las dos cadenas, separándose éstas y cada 
una serviría de modelo para el alineamien-
to de bases complementarias que forma-
rían las cadenas hijas. Este mecanismo 
hipotético predecía una síntesis semicon-
servativa, por la que las moléculas hijas 
tendrían una cadena de origen paterno y 
otra recién sintetizada. 
Este primer aspecto, fundamental para 
acometer posteriores investigaciones sobre 
la síntesis del DNA, fue demostrado por 
Meselson y Stahl,6 quienes partiendo de 
DNA paterno marcado con 15N estudia-
ron la distribución isotópica en las molé-
culas hijas de la primera generación, mos-
trando que poseen una cadena marcada 
con 15N y otra desprovista del isótopo. 
Los datos obtenidos en la segunda gene-
ración estaban también de acuerdo con el 
mecanismo semiconservativo. 
224 J. EUGUI Vol. XVII 
SISTEMA ENZIMÁTICO IMPLICADO 
EN LA SÍNTESIS DEL DNA 
Son muchos los enzimas -DNA polime-
rasas, ligasa, nucleasas, proteínas desen-
rollantes, factores de iniciación, etc.- que 
probablemente participan en este proce-
so, y ello nos da una idea de su comple-
jidad. La función in vivo de la mayoría 
de dichos enzimas no es bien conocida. 
ndATP 
+ 
ndGTP 
DNA polimerasas.-La DNA polimerasa 
I. de E. coli, fue el primer enzima des-
cubierto capaz de realizar síntesis de 
DNA in vitro. Requiere DNA modelo y 
DNA cebador, deoxinucleósidos trifosfato 
como precursores, y una adecuada concen-
tración de iones Mg+ +. 
La reacción que cataliza puede ser repre 
sentada esquemáticamente: 
+ 
ndCTP 
+ DNA preformado ---l>- DNA-
dAMP 
dGMr 
dCMP 
dTMP 
+ 4(n) PP; -<---
+ 
ndTTP 
Añade nucleótidos al extremo del ceba-
dor que tiene un hidróxilo libre en el 
carbono 3'. La dirección de polimeriza-
ción es, por tanto, 5'-+ 3'. El mecanismo 
de la reacción consiste en un ataque nu-
cleofílico del oxígen del grupo 3' - OH 
terminal del cebador al fosfato del nu-
cleósido trifosfato adecuado. 
La DNA polimerasa I tiene otras activi-
dades enzimáticas, las cuales están esque-
matizadas en el modelo del enzima que 
presentamos en la figura 1. No se conoce 
el significado de la actividad exonucleasa, 
aunque probablemente no tiene mucha 
relevancia, puesto que su pH óptimo es 
de 9,2 -frente a un pH óptimo de 7,4 
para la actividad polimerasa- y no in-
terfiere con la reacción de polimerización. 
Aunque se ha demostrado que es capaz 
de sintetizar DNA funcional in vitro con 
la ayuda de nucleasa y ligasa,8 el papel 
de este enzima in vivo no es bien cono-
cido. Posiblemente actúa en mecanismos 
de reparación del DNA, según se deduce 
de datos procedentes del campo genético. 
Los mutantes en el gen estructural del 
enzima (pol A), deficientes en DNA poli-
merasa I, suelen ser más sensibles a la 
irradiación por rayos X 9 y presentan una 
reparación más lenta de las roturas del 
DNA que las cepas silvestres 10 lo que 
indica que la polimerasa actúa en este 
proceso. 
Fig. l. Actividades enzimáticas de la DNA 
polimerasa I de E. coli. Adaptado de Korn-
berg (7). (1) Polimerización; (2) Hidrólisis 
exonucleolítica 3' -+ 5'; (3) Pirofosforólisis 
exonucleolítica 3' -+ 5'; (4) Hidrólisis exonu-
cleolítica 5' -+ 3'; (5) Recambio de nucleósi-
dos trifosfato que parece ser una combinación 
de polimerización y pirofosforólisis; (a) Lo-
cus del modelo; (b) Locus del cebador; (c) 
Locus del nucleósido trifosfato. 
Septiembre 197 3 REPLICAC!ON DEL DNA 225 
Sin embargo, no se puede excluir que 
participe en la síntesis del DNA in vivo. 
Si ésta fuera el resultado de la formación 
de pequeños fragmentos de DNA por la 
acción de otra DNA polimerasa, la DNA 
polimerasa I podría alargar estos frag-
mentos, y finalmente serían unidos por 
una ligasa. Efectivamente, en células de-
ficientes en DNA polimerasa I el DNA 
recién sintetizado tiene un peso molecu-
lar menor que en las células normales n. 
La DNA polimerasa II es la única po-
limerasa que resulta estimulada por una 
proteína desenrollante. Su función es des-
conocida, en mutantes deficientes en este 
enzima no se encuentran alteraciones de 
la síntesis o reparación del DNA (12, 13). 
Sin embargo, algunas experiencias recien-
tes indican que posiblemente participe 
en la reparación del DNA al menos sus-
tituyendo a las otras polimerasas en mu-
tantes deficientes en DNA polimerasas I 
y III 11 • 
La DNA polimerasa III es el producto 
del gen dnaE, y los datos genéticos in-
clinan a pensar que es el enzima que efec-
túa la síntesis del DNA in vivo, puesto 
que al cultivar mutantes termosensibles 
dnaE a temperatura restrictiva cesa la 
síntesis de DNA.15 
Proteínas desenrol/antes.-Desestabilizan 
la estructura doble helicoidal del DNA 
de dos cadenas por su gran afinidad por 
el DNA de una sola cadena. La proteína 
aislada de E. coli tiene un peso molecu-
lar de 22.000, y se encuentran unas 800 
copias por célula en la fase logarítmica 
de crecimiento.16 
Otro tipo distinto de proteínas que posi-
blemente tengan una función en la repli-
cación del DNA es la proteína w, que 
relaja el DNA superenrollado. 
Endo y exonucleasas.-Aunque no se co-
noce su función in vivo en la síntesis del 
DNA, podrían actuar efectuando los cor-
tes necesarios para la iniciación, repara-
ción, o para eliminar nucleótidos mal 
colocados durante la polimerización. 
Ligasas.-Parecen jugar un papel impor-
tantísimo en la replicación. 17 Restauran 
roturas producidas en una cadena del 
DNA, si los nucleótidos vecinos presen-
tan un grupo 3' - OH y 5' -fosfato li-
bres. También son esenciales para la cé-
lula, ya que mutantes termosensibles de-
ficientes en esta actividad enzimática 
mueren al elevar la temperatura 18 • 
SISTEMAS DE ESTUDIO IN VITRO 
DE LA SÍNTESIS DEL DNA 
Se emplean dos tipos principales de sis-
temas. En los sistemas de células permea-
bles se intenta perturbar las células lo 
menos posible, permitiendo la síntesis in 
vitro, es decir, la incorporación de pre-
cursores. No se purifican los componen-
tes macromoleculares. Los sistemas de cé-
lulas lisadas tratan de conseguir un apa-
rato enzimático con menos componentes, 
más purificado. Entre estos últimos me-
rece destacarse el de Schaller y col.,19 en 
el que se realiza una lisis suave de las 
células bacterianas sobre un disco de ce-
lofán de 12 mm de diámetro. El medio 
de incubación para la rotura de la pared 
bacteriana contiene Brij 58, lisozima y 
una elevada concentración de células ; se 
añade sobre el disco de celofán que está 
colocado en una placa de agar con saca-
rosa 0,33 M y actúa durante 20 minutos 
a 0° C. Se traslada el disco a otra placa 
de agar que no contiene sacarosa y que 
resulta hipotónica para las células bac-
terianas desprovistas de pared, ocurriendolisis por choque osmótico. Se deja secar 
para que se concentre el material sobre el 
disco, y se deposita éste sobre 50 p. 1 de 
la solución que contiene los nucleósidos 
trifosfato precursores difusibles. Este sis-
tema, aunque no purifica los componen-
tes, tiene las ventajas de ocasionar una 
lisis suave y de conseguir una concentra-
ción alta de macromoléculas en el li-
sado. 
REPLICACIÓN DEL DNA IN VIVO. MODELOS 
Los intentos de descifrar cómo se realiza 
este proceso in vivo tropezaban con una 
226 J. EUGUI Vol. XVll 
11111111111111111111 
3 
Fig. 2. Representación esquemática del modelo de cuchillo y horquilla. 
dificultad. Todos los datos sugerían que 
la replicación tiene lugar en las dos ca-
denas del DNA simultáneamente y en la 
misma dirección. Esto planteaba -dado 
que las cadenas son antiparalelas- el si-
guiente dilema: o bien la síntesis de una 
de las cadenas es discontinua, o existe 
una polimerasa que funciona en la direc-
ción 3'-+ 5'. Esta última no se ha des-
cubierto, pero muchos de los resultados 
in vivo y prácticamente todos los in vitro 
prueban, al aislarse el DNA recién sinte-
tizado en forma de pequeños fragmentos, 
que la síntesis del DNA es discontinua en 
una de las cadenas por lo menos. 
Se han propuesto un gran número de 
modelos que intentan explicar la replica-
ción del DNA in vivo tratando de con-
ciliar los abundantes datos experimenta-
les, pero ninguno es totalmente satisfac-
torio. Nos limitaremos a describir algunos 
de ellos. 
El modelo de cuchillo y horquilla fue pro-
puesto por Mitra y Kornberg.20 Al sepa-
rarse en el punto de iniciación las dos 
cadenas, la DNA polimerasa comienza la 
síntesis en la dirección 5'-+ 3' utilizando 
como modelo la cadena adecuada y con-
tinuando después sobre la otra cadena 
(figura 2). Una endonucleasa realiza un 
corte en el centro de la horquilla de re-
plicación, y permite el sucesivo desplega-
miento de las cadenas paternas, conti-
nuando la polimerización a partir del ex-
tremo 3' - OH libre y prolongándose 
también sobre la otra cadena. La endo-
nucleasa produce un corte en el vértice 
de la horquilla y el proceso se va repi-
tiendo. La ligasa une los fragmentos re-
sultantes de la polimerización que ha uti-
lizado como modelo la cadena paterna 
terminada en 5'. 
Existen otros tipos de modelos disconti-
nuos, como el de Okazaki 21 que predice 
crecimiento discontinuo a lo largo de las 
dos cadenas. Algunos autores incluyen 
discontinuidades en las cadenas paternas 
(figura 3). 
1 
Fig. 3. Modelos de síntesis discontinua de 
DNA. 1.-Síntesis discontinua en ambas ca-
denas hijas. 2.-Síntesis discontinuas en am-
bas cadenas hijas, con roturas en las cadenas 
paternas. 
Septiembre 197 3 REPLICACION DEL DNA 227 
~--~~;;;;;;;;;;;;:;... ..... ~€:../ --~·--··-+ 
1 
= 
+ + 
1 
! 
1 
. 
Fig. 4. Representación esquemática del modelo de síntesis pre-
horquilla. 
• Sitio del cebador. 
_,.. Dirección de crecimiento de la cadena. 
n Lugar de unión por acción de la ligasa. 
--+ Lugar de corte endonucleolítico. 
Líneas gruesas: material paterno. 
Líneas delgadas: material nuevo. 
Un modelo particularmente interesante en 
el de síntesis pre-horquilla,22 según el cual 
la elongación de la cadena tiene lugar por 
delante de la horquilla de replicación (fi-
gura 4). Van ocurriendo roturas en las 
cadenas paternas, originadas por endonu-
cleasas, y la DNA polimerasa, tomando 
como cebador el extremo 3' - OH, co-
mienza la síntesis del DNA, que se rea-
liza en sentido opuesto en ambas cade-
nas. Existen intermediarios en los que se 
encuentra el DNA recién sintetizado uni-
do covalentemente a las cadenas pater-
nas. Más tarde son separados y la ligasa 
une las mellas de las cadenas paternas. 
Los cortes en dichas cadenas van ocu-
rriendo sucesivamente, y son, como he-
mos señalado, transitorios. Esto elimina 
la necesidad de un desenrrollamiento rá-
pido de las cadenas. La ligasa une los 
fragmentos recién sintetizados. 
Según el modelo del círculo sin fin de Gil-
bert y Dressler 23 una endonucleasa pro-
duce una rotura en la cadena +. El ex-
tremo que presenta el grupo 5' - OH li-
bre comienza a desenrollarse y se une a 
la membrana celular. La síntesis se inicia 
actuando como cebador el extremo 3' 
- OH de la cadena + y utilizándose 
como modelo la cadena - (figura 5). Se-
gún la versión de "cuchillo y horquilla" 
la síntesis continúa a lo largo de la ca-
dena + con extremo 5' - OH libre. La 
endonucleasa origina un corte en el vérti-
ce de la horquilla, el círculo "rueda" 
exponiendo otra zona de la cadena - y 
la síntesis prosigue como se ha descrito. 
Ningún modelo satisface plenamente los 
numerosos requerimientos del complejo 
proceso de replicación ni está apoyado 
por todos los hechos experimentales, por 
lo que en el momento actual se desco-
noce como ocurre la síntesis del DNA 
in vivo. 
CONTROL DE LA REPLICACIÓN DEL DNA 
Este es uno de los aspectos de mayor 
interés, y muy poco conocido. Más que 
la regulación del movimiento de la hor-
quilla de crecimiento, el punto central es 
la regulación de la iniciación. la teoría del 
replicón 24 -un elemento genético que 
contiene toda la información necesaria 
para su replicación- indica que existe 
228 J. EUGUI Vol. XVII 
3' 5' 3°-0H 
o 
5' 
Fig. 5. Modelo del círculo sin fin. 
un gen estructural cuyo producto es el 
iniciador, el cual, al reconocer a otro gen 
del cromosoma, el replicador, inicia la 
síntesis del DNA. El replicón está unido 
a una estructura intracelular, posiblemen-
te la membrana. 
Hay datos genéticos que apoyan esta teo-
ría. Si ocurriera una mutación en cual-
quiera de los dos genes controladores del 
replicón se perdería la capacidad de re-
plicación. Se han aislado mutantes termo-
sensibles de E. coli que no inician la re-
plicación, creyéndose que es por altera-
ción de la proteína iniciadora. Sería posi-
ble integrar un nuevo replicón en el 
cromosoma de estos mutantes que induci-
ría la síntesis de todo el cromosoma, lla-
mándose a ese fenómeno "supresión inte-
grativa". Su existencia se ha demostrado 
insertando un episoma en el cromosma 
de este mutante de E. coli y comprobando 
que tiene lugar la replicación.25 Pero ésta 
no ocurre si el episoma no se integra, ya 
que la proteína iniciadora no reconoce el 
gen replicador del cromosoma de E. coli. 
Se ha localizado el origen de la replica-
ción en B. subtilis y en varios fagos. En 
E. coli algunos autores lo sitúan en las 
cercanías de los minutos 65 ó 71,26• 27 pero 
no hay acuerdo general sobre este punto. 
Otro apoyo de la teoría del replicón es 
la demostración de la existencia de proteí-
nas necesarias para la iniciación, La sín-
tesis de algunas de ellas es sensible al 
cloranfenicol a concentraciones bajas, y 
hay otras cuya síntesis es resistente al 
cloranfenicol a estas concentraciones. 
También se ha implicado al RNA en la 
iniciación de la síntesis del DNA.28 • 29 
La iniciación ocurre cuando se alcanza 
una determinada relación DNA/masa ce-
lular, por lo que se propone un control 
positivo de la replicación, que tendría lu-
gar cuando se produce una acumulación 
suficiente de iniciadores (proteínas o 
RNA). 
En organismos superiores hay datos so-
bre la importancia de factores positivos 
en la iniciación de la síntesis del DNA, 
como son los experimentos con heteroca-
Septiembre 1973 REPLICACION DEL DNA 229 
riones. Citaremos como ejemplo los obte-
nidos por fusión de neuronas de ratón y 
fibroblastos de riñón de mono 30 • Una de 
las células es inactiva, y la otra no lo es, 
no se replica -en el caso mencionado, 
la neurona-. Las células activas inducen 
o replicarse a las inactivas. Y estos fac-
tores inductores son citoplásmicos como 
se comprobó en experiencias en que nú-
cleos de neuronas, células que no se di-
viden, son transplantados a huevos enu-
cleados, produciéndose una estimulación 
de la replicación 31 • 
Terminación de la síntesis del DNA.-Es 
poco conocida. Ocurriría al llegar la hor-
quilla de replicación al origen, o quizás 
aun sitio de terminación, que en E. coli 
es situado por algunos cerca del his ope-
rón.27 No está confirmada la existencia 
de factores de determinación. 
Otros investigadores proponen que el 
sitio de origen y el de terminación esta-
rían unidos a la membrana plasmática, 
y que el crecimiento de la membrana 
en esta zona facilitaría la segregación de 
los cromosomas hijos una vez que se ha 
completado la síntesis del DNA. 
REPLICACIÓN BIDIRECCIONAL 
La mayoría de los datos actuales están 
a favor de una replicación del DNA en 
las dos direcciones a partir del origen. 
Además de las experiencias en el campo 
152µm 
---"'---.. ~ - -
genético 32 y bioquímico 33 existen datos 
morfológicos, de microscopia electróni-
ca.31 Estos autores sincronizan el cultivo 
por deprivación de aminoácidos, e inician 
la síntesis del DNA añadiendo precurso-
res, entre ellos timina marcada de baja 
actividad específica, durante un tiempo 
corto. A continuación adicionan timina de 
gran actividad específica. Se interrumpe 
la síntesis del DNA y se aislan los cromo-
somas, obteniéndose posteriormente una 
autorradiografía de los mismos, que sólo 
revelará el DNA recién sintetizado con-
teniendo timina marcada. Los resultados 
obtenidos indican que la síntesis es bi-
direccional, ya que los granos más grue-
sos, correspondientes a la timina de gran 
actividad específica, aparecen en ambos 
extremos (figura 6), mientras que si la 
síntesis fuera unidireccional los granos 
gruesos aparecerían en uno solo de los 
extremos. 
Todos los modelos de la replicación del 
DNA son adaptables a una síntesis bidi-
reccional, inclusive el del círculo sin fin 
para el que se ha propuesto la modifica-
ción denominada de los círculos sin fin 
opuestos. 
CONSIDERACIONES FINALES 
A nivel molecular, en procariotes es mu-
cho menos lo que se sabe sobre la re-
plicación del DNA que sobre la síntesis 
·_.re¡.·-.. -~ ~- _ 1 _81 µ m _ 
- -
Fig. 6. Representación esquemática de los resultados obteni-
dos marcando cromosomas de E. coli con [3H] timina durante 
16 minutos, seguido de marcaje con PHJ timina y [3H] timi-
dina durante 2,5 minutos. Modificado de Prescott y Kuem-
pel (31). 
l. 
230 J. EUGUI Vol. XVII 
de proteínas. Se ha progresado notable-
mente en lo que se refiere a los estudios 
in vitro -se conocen la mayoría de los 
enzimas implicados aunque no su función 
real in vivo, con excepción de la DNA 
polimerasa III y la ligasa-; sin embar-
go, la síntesis del DNA in vivo es un tema 
oscuro y no existe un modelo totalmente 
aceptable. Menos conocido es el control 
de la síntesis del DNA, proceso cuya 
comprensión facilitaría el entendimiento 
de la disfunción del control de la replica-
ción y de la división celular que tiene 
Jugar en los fenómenos neoplásicos. 
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