seminario_nBIO000530_Mazzobre

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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. 
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Tesis de Licenciatura
Estabilidad de la enzima lactasa enEstabilidad de la enzima lactasa en
sistemas de baja humedad : Efectosistemas de baja humedad : Efecto
de transición vitrea y de la presenciade transición vitrea y de la presencia
de Trehalosade Trehalosa
Mazzobre, María Florencia
1996
Tesis presentada para obtener el grado de Licenciado en
Ciencias Biológicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis de licenciatura de la Biblioteca Central
Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe ser
acompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the Six-Year Bachelor's Theses Collection of the Central Library Dr.
Luis Federico Leloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the
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Cita tipo APA:
Mazzobre, María Florencia. (1996). Estabilidad de la enzima lactasa en sistemas de baja
humedad : Efecto de transición vitrea y de la presencia de Trehalosa. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000530_Mazzobre
Cita tipo Chicago:
Mazzobre, María Florencia. "Estabilidad de la enzima lactasa en sistemas de baja humedad :
Efecto de transición vitrea y de la presencia de Trehalosa". Tesis de Licenciado. Facultad de
Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1996.
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000530_Mazzobre
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://digital.bl.fcen.uba.ar
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000530_Mazzobre
http://hdl.handle.net/20.500.12110/seminario_nBIO000530_Mazzobre
mailto:digital@bl.fcen.uba.ar
550
Universidad de Buenos Aires
Facultad de Cs. Exactas y Naturales
Departamento de Ciencias Biológicas
“Estabilidad de la enzima lactasa en sistemas de baja
humedad. Efecto de la transición vítrea y de la
presencia de trehalosa”.
Tesispara optar al títulode Licenciada en Ciencias Biológicas
Alumna: María Florencia Mazzobre
Directores: Dra. María del Pilar Buera y Dr.Jorge Chirífe.
Laboratorio de Tecnología de Alimentos.
Departamento de Industrias
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (U.B.A)
Abrílde i996
¡”95 30 ¡35;
Agradecimientos
>l<A Ia Dra. Pilar Buera y al Dr. Jorge Chirife, directores de este trabajo, por su
dedicación y conocimientos brindados.
>l<A las Lic. Carolina Shebor y Leila Burin, por su colaboración y asesoramientos
prestados en Ia realización del trabajo y en la edición del texto.
>l<A Ia Dra. Beatriz Elizalde por su apoyo y por su amistad.
>l<AI Departamento de industrias de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de Ia
Universidad de Buenos Aires por facilitarel uso de sus instalaciones.
Resúmen
1.Obietivo
2. Introducción
2.1. Desnaturalización emimátim
2.2. Estabilización en7imátim
2.3. Parámetros que afectan la estabilidad emimátirn
2.3.a. pH
2.3.b. Concentración de sólidos
2.3.e. Temperatura
2.3.d. Actividadde agua y contenido acuosa
2.3.e. Cambios físicos
2.3.f. Presencia de estabilizantes específicos
2.3.g. Interrelación de factores con respecto a la estabilidad: Tg,
contenido de humedad y aw
3. Higótesis
4. Materiales y métodos
4.1. Preparación de los sistemas modelo
4.1.a. Sistemas Iíguidos
4.1.b. Sistemas semihúmedos
4.2. Determinación del contenido de humedad
4.3. Tratamiento térmico
1.­4.4. Determinación de actividad e.
4.5. Temperatura de transición vitrea
5. Resultados y discu sión
5.1. Resistencia térmica en medio líquido
5.2. Resistencia térmica en sistemas semihúmedns
5.2.a. Análisis de la Tg como parámetro de estabilidad térmica en
matrices polímericas
página
5
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29
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31
31
31
5.2.b. Efecto protector de trehalosa en relación a su estado físico:
transición vitrea y cristalización 41
6. Conclusión 52
7. Bibliografía 54
Resúmen
Se estudió la estabilidad térmica de un preparado comercial de Iactasa (r3
galactosidasa) en matrices amorfas de humedad reducida (maltodextrina (MD),
poli(vinil)pirroliodona(PVP), trehalosa (l') y mezclas MDzT)luego de almacenar a distintas
temperaturas.
El objetivo principal fue analizar la utilidad de la temperatura de transición vítrea
(Tg)como parámetro para predecir la estabilidad térmica de Iactasa en sistemas amorfos.
No se observaron cambios drásticos en la velocidad de inactivación de la enzima
a temperaturas cercanas a Ia Tg lo cual indicaría que este proceso no sería totalmente
dependiente del cambio fisico vítreo/gomoso de Ia matriz. Los resultados mostraron que
hubo pérdida de actividad enzimática durante el almacenamiento en estado vítreo, Io cual
implicaque si bien la movilidadestaria disminuida, sería suficiente para que se produzca
la desnaturalización de la enzima. Se observó también que Ia matriz tiene un efecto
específico sobre la estabilidad, ya que para el mismo valor de (T-Tg), la enzima fue mas
estable en MDque en PVP.
La inactivaciónde lactasa en matrices polimén'casen estado vítreo almacenadas a
70°C se relacionó con la Tg de los polímeros deshidratados. pero en la matn'z vítrea de
trehalosa, la actividad enzimática fue mayor que la esperada por su Tg. En los sistemas
de trehalosa cuyas condiciones de humedad (44 y 75 %H.R) permitieron una alta
proporción de cristalización, la enzima se inactivó rápidamente luego del calentamiento.
La adición de MDa la matn'z de trehalosa permitió una mayor protección de lactasa.
1. Obietivo
lnvestigar Ia estabilidad de la enzima lactasa en sistemas secos o semihúmedos
incorporando nuevos aspectos en tecnología de alimentos (como transición vitrea, efecto
de trehalosa y otros estabilizantes específicos), y análisis de la influencia relativa de los
distintos factores.
2. Introducción
La estabilidad enzimática es uno de los factores claves que determinan en
gran medida la aplicación de las enzimas en muchos procesos biotecnológicos
(Colaco et al, 1992). Se usan en industrias como la de almidón, detergentes,
fermentación, cervecería, medicamentos, alimentos. (O'Fágáin, 1988).
El conocimiento de los mecanismos de las reacciones enzimáticas, como asi
también del comportamiento térmico y estabilidad de enzimas en sistemas secos,
tiene gran importancia práctica en el procesado y almacenamiento de alimentos
(Palumbo et al., 1995).
Como modelo para estudiar la estabilización, se empleó la enzima Iactasa. Los
resultados derivados del estudio de sistemas modelo, podrán ser utilizados en la
comprensión y prevención de los procesos que conducen al deterioro de los
alimentos (p.ej. desnaturalización proteica).
2.1. Desnaturalización enzimática
Muchas enzimas y proteínas son inestables y pierden su actividad después de su
Muchas enzimas y proteinas son inestables y pierden su actividad después de su
aislamiento o almacenamiento, por Io cual el problema de la desnaturalización ha
adquirido relevancia.
A medida que una proteína es sintetizada, sus aminoácidos hidrofóbicos tienden a
agruparse en el interior de la molécula para evitar el contacto con el entorno acuoso,
los residuos polares se disponen cerca de la parte externa de la molécula, donde
pueden interactuar con el agua y con otros grupos polares. Estudios terrnodinámicos,
revelaron que esta conformación se encuentra estabilizada por uniones
intramoleculares no covalentes (enlaces de hidrógeno, interacciones de Van der
Waals entre residuos de aminoácidos no polares e interacciones electrostáticas).
Estas uniones pueden ser afectadas por una serie de factores como temperatura,
proteasas, oxígeno, pH, agentes desnaturalizantes, etc., produciéndose en
consecuencia la inactivación de la dela enzima.
La desnaturalización ha sido definida simplemente como un cambio mayor de la
estructura nativa sin alteración de la secuencia de aminoácidos. La cinética de este
proceso se ajusta generalmente a la de una reacción de primer orden, ya que por
definición, es una sola molécula, la proteína, la que sufre un cambio de conformación:
N <—> D —-> l
N, D e l representan la estructura nativa, desnaturalizada en forma reversible e
inactivación irreversible de la enzima, respectivamente (Janecek, 1992).
El cambio en el ordenamiento espacial de Ia molécula proteica, por el cual esta
pasa de un estado nativo (relativamente ordenado) a una estructura desnaturalizada
(estado de mayor desorden) (Figura 1), es una transición endotérrnica y con un calor
latente involucrado, como Io es, por ejemplo la fusión de cristales (Roos, 1992). En la
Figura 2 se muestra un termograma obtenido por calorimetria diferencial de barrido
(DSC), en el cual la desnaturalización de distintas proteínas se manifiesta como un
pico endotérrnico (Figura 2).
Prot. nativa estado de mayor desorden
-—>
Figura 1: Transición de pn'mer orden: desnaturalízación.
Músculo
ActinaMiosina Colágeno
‘Flujodecalorendotérmico
l l l l
o 7o
TEMPERATURA (°C)
Figura 2: Tennograma de desnaturalización obtenido para distintas proteínas de
múscqu (míosina,proteínas samoplasmáticas, colágeno y actina).
Se dice que la inactivación térmica es reversible, cuando la enzima recupera su
actividad luego del enfriamiento, en caso contrario la inactivación será irreversible.
La desnaturalización térmica reversible puede producirse por dos tipos de
transformaciones no covalentes: agregación y formación de estructuras incorrectas.
Durante el desdoblamiento, regiones hidrofóbicas de la molécula proteica que
estaban localizadas en el interior, son expuestas a la solución. Ésto es
termodinámicamente desfavorable. El modo más eficiente de reducir la energia libre
del sistema es que las moléculas interactúen unas con otras a través de las regiones
hidrofóbicas expuestas (agregación).
Si la solución enzimática es muy diluida, el fenómeno de agregación raramente se
produce, pero la inactivación tiene lugar debido a que las moléculas pueden
replegarse formando nuevas estructuras que son catalíticamente inactivas. Si
además esta nueva conformación es estabilizada por uniones covalentes entonces el
proceso es irreversible (Klibanov, 1984).
2.2. Estabilización enzimática
El estudio detallado del fenómeno de desnaturalización y renaturalización ha
contribuido en gran medida al entendimiento de los eventos o factores responsables.
Estos conocimientos pueden ser de gran utilidad para prevenir la inactivación
enzimática mediante distintas técnicas de estabilización. Para obtener enzimas
termoestables se pueden seguir fundamentalmente las siguientes estrategias:
—Obtención de la enzima a partir de microorganismos termófilos, los cuales
producen enzimas termorresistentes.
- Modificarla secuencia de aminoácidos por ingeniería genética.
—Estabilizar enzimas ya conocidas, por inmovilización, modificación quimica o
modificación del medio de reacción por inclusión de aditivos (Klibanov, 1984).
Una enzima inmovilizada es aquella cuyos movimientos han sido restringidos, ya
sea completamente o limitados a una pequeña región, con lo cual se previene
significativamente el desdoblamiento de la molécula por impedimento físico. Es un
hecho conocido que la inmovilización produce un aumento de Ia estabilidad térmica
(Pomeranz,1985). Una enzima deshidratada en una matriz, bajo ciertas condiciones
controladas puede considerarse inmovilizada en dicho medio. La remoción de agua
conduce a la obtención de sistemas de alta viscosidad donde la movilidad molecular
está muy reducida.
A pesar de que es bien conocido el uso de alimentos deshidratados como
sistemas de encapsulación y preservación, las bases fisicoquímicas aún no están
bien establecidas (Noel et a|., 1995). Se requiere mayor información sobre la
movilidad en matrices de alta viscosidad, para lograr un mejor entendimiento de los
procesos cinéticos que ocurren en estos sistemas (Noel et al., 1994; Whitaker, 1995).
Los estudios tendientes a conocer los factores que influyen sobre Ia estabilidad
enzimática en sistemas de baja humedad ofrecen desde el punto de vista académico,
la posibilidad de analizar y discriminar mecanismos que tienen que ver con la
estructura de los materiales y sus interacciones. Su importancia práctica radica en su
contribución a la formulación de preparados enzimáticos estables, en condiciones
que no requieran cuidados especificos (temperatura, humedad por ej.) favoreciendo
su manipulación y utilización en el procesado de alimentos. Además, estos estudios
permiten conocer aspectos funcionales y estructurales de las moléculas proteicas
asegurando un mejor mantenimiento y calidad del alimento.
2.3. Parámetros que afectan la estabilidad enzimática.
Los distintos factores que afectan la estabilidad enzimática (y reacciones
químicas), conducen finalmente al deterioro del alimento. Los parámetros extrinsecos
que afectan Ia estabilidad de un alimento son tiempo y temperatura . En cuanto a los
factores propios del alimento, tradicionalmente se ha considerado a la actividad de
agua (aw) o humedad relativa de equilibrio como el factor crucial en la estabilidad de
un alimento. Además, el pH, potencial de óxido-reducción, fuerza iónica, etc. afectan
la cinética de deterioro. En la última década se propuso a la llamada temperatura de
transición vítrea (Tg) como el criterio para predecir la estabilidad de alimentos
amorfos.
2.3.a. pH
El pH afecta reacciones como pardeamiento no enzimático, reacciones de
deshidratación de azúcares o de hidrólisis (Sawnders y Jewis, 1966; Vukov, 1965) y
reacciones enzimáticas modificando así la calidad del alimento.
Las proteinas presentan grupos ionizables, por lo cual cambios en el pH del medio
afectan el sitio catalítico y la conformación de la enzima. En general las enzimas son
estables y activas sólo en un rango limitadode pH y se observa en muchos casos un
pH óptimo que varía con la temperatura. Por otro lado la temperatura de
desnaturalización puede variar al variar el pH del medio, según se observa en el
termograma obtenido por DSC de la Figura 3 ( Roos, 1992).
—-—pH 7.o
__.pH 8.9
‘ EXO
eo 80 A 100
TEMPERATURA Pc)
¿o
Figura 3: Termograma de desnaturalización de proteínas de clara de huevo a dos
valores de pH diferentes (adaptado de Wright, 1982)
2.3.b. Concentración de sólidos
Leiras (1993) observó que la estabilidad térmica de la enzima Iactasa aumentaba
al aumentar la concentración de sólidos en suero de queso concentrado. Tanto Ia
concentración como el tipo de soluto utilizado influyen en la estabilidad térmica de la
enzima, cuando se trabaja a la misma aw. Asimismo a menor aw el efecto
estabilizador del soluto es mayor.
2.3.c. Temperatura
La temperatura es uno de los factores más importantes por su gran influencia en
todo tipo de reacciones químicas.
La expresión matemática mas utilizada para exponer el efecto de la temperatura
sobre la velocidad de un proceso químico, reacciones de desnaturalización o
enzimáticas, es la ecuación de Arrhenius:
k = A e-E/RT
En particular para la desnaturalización térmica de proteínas, k sería la constante
de desnaturalización enzimática, A la constante de Arrhenius, E la energía de
activación, R la constante de los gases ideales y T la temperatura absoluta. La forma
Iogarítmica de la reacción anterior es:
ln k = ln A - E/RT
por Io tanto al representar Inkversus 1fl', se obtendrá una línea recta cuya pendiente
es -E/R. La magnitud de E, expresa el grado de dependencia respecto a la
temperatura del proceso en cuestión.
La inactivación térmica de las enzimas generalmente es debida a la
desnaturalización de la proteína y la energía de activación para la desnaturalización
es alta (40-130 kcal/g.mol) (Wang et al., 1979).
Las curvas tipoArrhenius se observan principalmente en sistemas con alto
contenido de humedad. En alimentos con baja humedad pueden presentarse
desviaciones de esta cinética, generalmente causadas por cambios físicos (transición
vítrea, cristalización), o cambios en los mecanismos de reacción. Por ejemplo, si una
enzima se encuentra inmovilizada en una matriz amorfa, una disminución en la
viscosidad del sistema podría favorecer el proceso de desnaturalización,
obteniéndose un gráfico como el mostrado en la Figura 4.
l omoso
log kfi g
vítreo
log kg - ¡
‘l
iffg
1/T(K)
Figura 4: Efecto hipotético de cambios físicos en sistemas amonós sobre la
desnaturalización térmica de proteínas, demostrado por un quiebre enla curva de
Anhenius (adaptado de Karely Saguy, 1991).
2.3.d.Actividadde agua y contenido acuoso
Se ha observado que diversos alimentos con el mismo contenido de agua difieren
significativamente en su suceptibilidad a la alteración. En consecuencia el contenido
de agua por si solo no es un indicador fiable del deterioro. Ésto puede atribuirse, en
parte, a diferencias en la intensidad con que las moléculas de agua se asocian con
los constituyentes no acuosos, ya que el agua que interviene en asociaciones fuertes
es menos capaz de participar en actividades degradativas (Fenema, 1985). Para
tener este factor en consideración se desarrolló el término “actividad de agua” (aw), el
cual se correlaciona suficientemente bien con las velocidades de muchas reacciones
degradativas. Se define aw como:
aw = (Pl po) T
donde p es la presión de vapor sobre el alimento a la temperatura T
po es la presión de vapor del agua pura a la temperatura T
El valor de aw aumenta al aumentar la temperatura. En el equilibrio, a una
temperatura constante, las actividades de agua de los componentes de una mezcla
son iguales, lo cual no es cierto para el contenido de humedad.
La aw da cuenta de la reactividad del agua en el sistema. Un mapa típico de
estabilidad que muestra la reactividad como función de aWse muestra en la figura 5 y
fue presentada por Labuza y col. (1970) como una representación esquemática de
las velocidades relativas de procesos químicos, enzimáticos y biológicos en alimentos
conservados a temperatura constante a diferentes humedades relativas.
La actividad de agua está relacionada con la humedad a través de la isoterrna de
sorción de agua. Las isoterrnas para sistemas cristalinas o amorfos son
significativamente diferentes, tal como se observa en la figura 6. Un sólido cristalino
absorbe muy poca humedad hasta una aW dada donde el sólido comienza a
disolverse. Por debajo de este punto los potenciales sitios de unión con el agua están
ocupados por las interacciones con otras moléculas del cristal. Sólo en la superficie
del cristal, los grupos reactivos, por ejemplo los hidroxilos de un azúcar, están
disponibles para Ia uniones por puente de hidrógeno con el agua. En cambio en un
sistema amorfo hay una mayor exposición de los grupos reactivos. Esto es por que
las moléculas no están tan empaquetadas sino que están en un ordenamiento al
azar, lo que les da mayor espacio entre ellas y por Io tanto permite la existencia de
moléculas con hidroxilos relativamente más libres para interactuar con el agua. Por
eso, la absorción de agua a bajas aWes mayor.
Velocidcdreictivcdereaccion
C3
Figura 5: Mapa de actividad de agua (adaptado de Labuza y col., 1970).
0 U 0 U
U Ü g m ristalino
EDU amorio (¡DU C
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o E 0 C
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aw aw
Figura 6: lsotenna para sistemas amorfos y cristalinas (adaptado de Saltmarch y col.,
1980).
2.3.e. Cambios físicos
La estructura fisica de un alimento está definida por la de sus principales
constituyentes: lípidos, carbohidratos, proteinas y agua, así como también por el tipo
de procesamiento y almacenamiento sufridos. Los cambios en las propiedades físicas
están relacionados con cambios de estado de los mencionados componentes. Son
ejemplos de transiciones de fase en alimentos la evaporación del agua,
congelamiento y fusión de agua y hielo, fusión y solidificación de grasas y aceites,
gelatinización del almidón, desnaturalización de proteinas y cristalización y fusión de
azúcares (Roos, 1992).
Un cambio de estado particularmente importante en alimentos deshidratados, es
la transición vitrea de proteinas y carbohidratos en estado amorfo.
La figura 7, muestra la formación de un sólido cristalino o amorfo a partir de una
solución.
solución
\ o oo
. | o o 5
h../. <\.., o o
evaporacrnn' ;“ o | o. secado spray
lenta/ \ o Yiofilización/
á f Q/í í
/o? ° 93/í í / ., .
á ¡á solucronvrscosa Tg \
¡á //<——_ concentrada
á “estado gomoso”
. vidriocristales
Figura 7: Formación de un vidrioy un sólido cristalino a partir de una solución. Los
círculos negros representan el solvente que en alimentos genera/mente es agua. Las
líneas representan las moléculas de soluto que pueden ser carbohidratos (adaptado
de Karel, 1985).
En la solución las moléculas del solvente (agua) y las del soluto (un azúcar, por
ejemplo) coexisten en un estado desordenado o al azar. Dependiendo cómo se
extraiga el agua puede formarse un sólido amorfo o cristalino. La remoción lenta
durante el proceso de deshidratación le da a las moléculas de azúcar la posibilidad
de arreglarse ordenadamente en una estructura cristalina. El cristal resultante se
encuentra en un estado termodinámico estable con relativamente poca movilidad
molecular y muy poco espacio entre moléculas.
Se puede obtener un sólido amorfo cuando las moléculas del soluto son
inmovilizadas mediante un rápido congelamiento y deshidratación a baja presión,
como en los procesos de secado por spray o liofilización.Como la deshidratación se
lleva a cabo rápidamente, el sistema experimenta un rápido incremento de Ia
viscosidad y subsecuentemente una disminución de la movilidad molecular. Las
moléculas de soluto no pueden alcanzar configuraciones de equilibrioy permanecen
en forma no ordenada en un estado amorfo. Muchos alimentos deshidratados
contienen matrices amorfas. Los biopolímeros (proteínas, almidón) y también los
azúcares son capaces de generar matrices amorfas. Ejemplos de alimentos con
sólidos en estado amorfo son los vegetales deshidratados y la leche en polvo (White
and Cakebread, 1966: Levine and Slade, 1992: Roos 1992).
Un alimento en estado amorfo puede ser vítreo (glassy) o gomoso (rubbery)
según la temperatura y el contenido de agua. El cambio du fase entre esos dos
estados se conoce como transición vitrea, es una transición de segundo orden propia
de materiales amorfos, en la que no hay calor latente involucrado pero la movilidad y
flexibilidad molecular cambian a una temperatura crítica llamada temperatura de
transición vitrea (Tg). Por debajo de la Tg, que es característica de cada sistema, el
alimento se comporta como un vidrio (tiene muy alta viscosidad). Como la movilidad
está restringida, el sistema puede considerarse estable con respecto a cambios
físicos y químicos. Cuando la temperatura es mayor que Tg (p.ej. durante el
procesamiento o almacenamiento), el sistema adquiere movilidad y es suceptible a
cambios. En la Figura 8, se muestra la diferencia en el aspecto fisico de una matriz
amorfa de maltosa en estado vítreo o gomoso.
Figura 8: Aspecto físico de una matn'z de maltosa Iiofilizadade humedad "cero",
Tg= 88°C, antes y después de cuatro horas de almacenamiento a 88°C (Shebor,
comunicación personal).
Propiedades del sistema como viscosidad, entalpía, constante dieiéctrica, calor
específico, cambian a ia temperatura de transición vítrea y por io tanto pueden ser
utilizadas para determinar la Tg de un sistema. En particular el análisis por DSC,
permite determinar la Tg detectando los cambios en el calor específico del sistema ai
ser calentado a distintas temperaturas. La Figura 9, muestra un DSC típico para un
azúcar Iiofilizado,con sus correspondientes transiciones de fase (Roos, 1992), en él
se representa el flujocalórico en función de la temperatura. El cambio en ei calor
específico a la temperatura de transición vitra se observa por un cambio en ia linea
20
de base a medida que la muestra es calentada a una velocidad constante desde una
temperatura menor que Tg hasta altas temperaturas. A (T>Tg),el azúcar pasa a un
estado de mayor movilidad (estado gomoso). A medida que la temperatura y la
movilidad aumentan, las moléculas de azúcar se reorientan alcanzando una forma
cristalina termodinámicamente favorable, la cual se manifiesta en el tennograma por
un pico exotérmico. Finalmente a temperaturas mayores, se produce la fusión del
azúcar (observada por un pico.endotérmico en el termograma).
transición , . H
vnrea cnstahzacuon
estado
h l "vítreo" l ¡333o líquidoo ¿22“
Tv l l 9‘" \
o 0‘
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'U
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LL estado
"gomoso" fusión
l l l l l I l I l l
Temperatura l tiempo
Figura 9: DSC típico para un azúcar Iiofllizado mostrando sus conespondientes
transiciones de fase: transición vítrea, cristalización y fusión (Kannas, 1994).
21
2.3.f. Presencia de estabilizantes específicos
Muchos estudios han demostrado que una variedad de compuestos orgánicos
(como polioles, distintos azúcares, metilaminas y aminoácidos) pueden prevenir la
desnaturalización de proteínas, estabilizándolas durante el calentamiento en
soluciones acuosas. Si bien el glicerol, prolina y metilaminas, pueden actuar como
cn'protectores para varias enzimas, no protegen durante la deshidratación. El secado
por Iiofilizaciónes una técnica muy usada para preservar y almacenar materiales
biológicos, sin embargo tiene algunos efectos indeseables (desnaturalización de
proteínas sensibles y disminución de la viabilidad celular) (Leslie,1995). Se observó
que sólo ciertos disacáridos como maltosa, sacarosa y principalmente trehalosa, son
capaces de estabilizar enzimas de restricción durante el liofilizado,pero solamente la
trehalosa protege durante el posterior almacenamiento (Uritaniy col, 1994). El azúcar
trehalosa demostró tener también importantes efectos preservantes durante el
secado por ej. de microorganismos, células, vitaminas, anticuerpos y factores de
coagulación de la sangre. Además algunas plantas e insectos que habitan en los
desiertos tienen la notable propiedad de secarse completamente en verano y luego
rehidratarse recuperando la viabilidad sin sufrir daño. Es precisamente su alto
contenido de trehalosa que les permite la supervivencia (Roser,1991).
Existen diferentes propuestas para explicar el fundamento del efecto protector de
la trehalosa:
a) Carpenter y Crowe (1990), propusieron un posible mecanismo según el cual los
azúcares establecerían uniones con grupos superficiales de la proteína, sustituyendo
de este modo al agua durante el secado. Sólo ciertos disacáridos, entre ellos
sacarosa, maltosa y trehalosa cumplirían con los requerimientos estéricos que les
permiten reemplazar a las moléculas de agua de la superficie de la proteína y
estabilizar Ia estructura nativa en sistemas secos.
b) Otros autores (Colaco y col, 1992) postulan que la protección es debida a la
22
tendencia de la trehalosa a formar una estructura vítrea en la cual las reacciones
degradativas estarán cinéticamente impedidas. La alta viscosidad característica del
estado vítreo es un factor importante que controla la movilidad y la estabilidad de
muchos biomateriales deshidratados. Si bien la temperatura de transición vítrea de la
trehalosa es elevada (alrededor de 85-90°C en estado anhidro), comparada con la de
sacarosa o los monosacáridos, la acción protectora no se ha observado en otros di y
trisacáridos de Tg similar a la de trehalosa. Es de interés entonces, dilucidar los
mecanismos involucrados en el efecto protector de este azúcar en relación con el
estado fisico del medio.
c) Se ha propuesto que la preservación oe microorganismos o células
deshidratadas por agregado de trehalosa antes del liofilizadose debe tanto a su
capacidad para aumentar Ia estabilidad de proteinas en sistemas secos, como
también a su capacidad de inhibir cambios en el estado físico de lípidos de
membrana (Leslie et al, 1995).
2.3.g. Interrelación de factores con respecto a la estabilidad: Tg,
contenido de humedad y aw.
El concepto de aW ha resultado ser extremadamente útil, en particular para
describir dos tipos de cambios: aquellos debidos a crecimiento microbiano y aquellos
debidos a reacciones de pardeamiento no enzimático. Sin embargo en la década del
80, los mapas de estabilidad basados en la actividad de agua fueron criticados por
algunos autores (Levine y Slade, 1991, 1992; Francks, 1981). Éstos argumentaron
que el concepto de aW proviene de consideraciones termodinámicas, aplicables a
sistemas en equilibrio, y los alimentos son sistemas de no equilibrio. Por lo tanto
propusieron la introducción del concepto de “dinámica del agua”, y mapas de
estabilidad basados en la temperatura de transición vítrea que define un limite entre
23
una región donde la movilidad molecular es baja, y existen impedimentos cinéticos
para llegar a Ia condición de equilibrio, y otra región en Ia que la movilidad molecular
está aumentada y los cambios tisicoquimicos no tendrian obstáculos para su
realización (Figura 10).
lneslabilídad
Estabilidad
Velocidadrelativa
T9//
Temperatura
Figura 10: Mapa de estabilidad para alimentos amorfos, que describe el efecto de la
temperatura sobre la velocidad relativa de cambios controlados por la temperatura de
transición vítrea (Tg), como son la difusión, movilidad molecular, cambios mecánicos,
cristalización, etc (adaptado de Roos, 1995).
24
La movilidadde un sistema amorfo puede ser incrementada ya sea aumentando
el contenido de agua o Ia temperatura de almacenamiento. La aW y la Tg están
relacionados, ya que a medida que se incrementa el contenido de agua ocurre la
transición vitrea-gomosa a menor temperatura. En los sistemas biológicos el agua
puede actuar como agente plastificante incrementando la flexibilidaddel sistema. Si
se lo agrega en suficiente cantidad, Ia Tg puede caer por.debajo de la temperatura
del sistema. Por Io tanto para determinar si un componente de un alimento se
encuentra en estado vitreo o gomoso, es importante determinar el parámetro (T-Tg),
que expresa la diferencia entre la temperatura de almacenamiento (T) y la Tg. Como
la Tg de un sistema depende del contenido de agua y del peso molecular, el término
(T-Tg)combina efectos de temperatura, humedad y composición en la estabilidad.
Si (T - Tg) > 0 el sistema amorfo se encuentra en estado gomoso y puede sufrir
alteraciones dependientes del tiempo. Si (T - Tg) < 0 el sistema está en estado vítreo
y puede ser considerado estable con respecto a aquellos cambios físicos que
requieran movilidad molecular (como la desnaturalización enzimática) y con respecto
a reacciones limitadas por Ia difusión. Por ejemplo cuando se almacenan alimentos
como caramelos, helados y productos liofilizados por encima de la Tg pueden
apreciarse defectos de calidad como colapso, pegajosidad y apelmazamiento (White
and Cakebread, 1966). Otros cambios en alimentos relacionados con la Tg son:
colapso en vegetales liofilizados, cristalización de azúcar, liberación de compuestos
volátiles encapsulados y oxidación de lípidos (Tsourouflis, 1976; To and Flink, 1978;
Levine y Slade, 1992; Shimada y col., 1991; Roos y Karel, 1991; Labrousse y col.,
1992; Anglea y col., 1993). La figura 11, muestra las Tgs y las temperaturas de
cristalización y fusión del disacárido lactosa equilibrado a varias aw.
200
\\ fundido
r-i160 ‘-.............. -*
U _______________z­
i “*u x
n 12o
5 estado cristalino
y ...... .,o
|­080
E estado "90mm"
0 .
¡- 40 estado vrlreo
o v ' ' l I l I
o 1 2 3 4 5 6 7 8
Contenido de humedad (gl 100 g de materia seca)
T. de cristalización...,._.__,T9
Figura 11: Diagrama de estado para Ia lactosa. Las condiciones de humedad y
temperatura determinan el estado vítreo, gomoso, cristalino o fundido. Seobserva
que la temperatura de transición vítrea y la cristalización instantánea disminuyen con
el aumento del contenido de humedad (adaptado de Roos, 1992).
La humedad relativa a la cual ocurre la cristalización en un dado sistema depende
de Ia temperatura de almacenamiento; la cristalización se producirá a bajas aWa
temperaturas de almacenamiento altas y a aW altas si la temperatura es baja
(Warburton and Pixton, 1978). Por otro lado se observa que el fenómeno de
cristalización es dependiente del tiempo y su velocidad es función del parámetro
(T-Tg) (Roos and Karel, 1990); a diferencia de la fusión que ocurre a una temperatura
definida, la temperatura de cristalización depende de la velocidad de calentamiento y
26
puede ocurrir en cualquier punto por encima de Tg.
Las reacciones químicas de deterioro pueden ocurrir en los alimentos, cuando los
reactantes pueden difundir, encontrarse, chocar y reaccionar. En este sentido, los
cambios de viscosidad y movilidadque ocurren cerca de la transición vitrea, pueden
afectar la velocidad de estas reacciones (Karel and Saguy, 1991).
Sin embargo el efecto de la transición vitrea sobre las reacciones químicas no es
tan claro como Io que se ha expuesto sobre fenómenos físicos, probablemente
porque el agua juega otros roles, no sólo el de plastificante, sino también el de
reactante o producto. Algunas reacciones químicas que pueden ocurrir en alimentos
son: pardeamiento no enzimático, oxidación de lípidos e hidrólisisácida de sacarosa.
Los antecedentes de la bibliografíasobre estas reacciones ponen de manifiesto
que las velocidades de reacción no pueden ser definidas por un único factor (p.ej.
la Tg), y que existen efectos específicos de la humedad y Ia temperatura, no
contemplados únicamente en el parámetro (T-Tg).
Levine y Slade (1991, 1993) propusieron que Ia actividad enzimática estaba
regida por la transición vitrea y era dependiente de la plastificación por el agua.
Además, que sólo podía haber actividad enzimática a temperaturas mayores que la
temperatura de transición vitrea. De la misma manera se podría proponer un efecto
similar sobre la resistencia térmica enzimática. Cuando una enzima se encuentra en
una matriz amorfa de baja humedad su movilidad está reducida ya que los
fenómenos difusivos están inhibidos. Como el proceso de desnaturalización involucra
un desdoblamiento de la estructura terciaria y/o cuatemaria de la proteína, es de
esperar que dicha movilidad reducida inhiba la desnaturalización y provoque un
aumento de la estabilidad, con la consiguiente retención de su capacidad catalítica.
No existe un estudio sistemático sobre este punto, ya que la propuesta se basa en
una combinación de datos experimentales de distintos autores e involucra
extrapolaclones, sin experimentos que lo demuestren específicamente. Sin embargo
27
estas apreciaciones constituyen un punto de partida interesante para lograr un
entendimiento del efecto del agua tanto sobre la actividad enzimática como sobre la
resistencia térmica de enzimas.
3. Hipótesis:
'AI ocurrir la transición vítrea se produce un cambio bmsco en varias de las
caracteristicas físicas de un material amorfo. En particular, la viscosidad disminuye mucho
y da lugar a un aumento en la movilidadde los componentes del sistema.
*Se sabe que la desnaturalización de proteínas requiere un desdoblamiento espacial
que estaria inhibidoen medios vítreos.
‘Se investigará si el efecto de la humedad observado en distintos sistemas conteniendo
la enzima Iactasa se puede explicar en base a las propiedades plastificantes del agua, o
existen efectos directos especificos de la humedad sobre la inactivacióntérmica.
*Se estudiará el efecto del disacán'do trehalosa sobre la estabilización de Iactasa en
relación a su estado físico.
28
4. Materiales y métodos:
4.1 Preparación de los sistemas modelo.
4.1 .a. Sistemas líguidos.
Se preparó una solución conteniendo buffer fosfato 0.1M de pH 6.86 y 1% (vlv)
de un preparado enzimático de lactasa ([3galactosidasa) Maxilact5000L (Gist Brocades,
Netherlands, nv).
4.1.b. Sistemas semihúmedos.
Los sistemas amorfos fueron obtenidos por liofilizaciónde soluciones conteniendo
20% (p/v)de cada una de las siguientes sustancias, capaces de formar matrices amorfas:
Poli(vinil)pirrolidona, peso molecular 10,000 y 40,000 (PVP10, PVP40) (Sigma Chemical
Co., St. Louis, MO), trehalosa (T) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), maltodextn'na
(MD), DE. 10.9, y MD:T50:50 y 80:20, en buffer fosfato (0,1M, pH 6,9). Se incorporó 1%
(v/v)del preparado comercial de lactasa.
Alícuotas de 1 ml de cada solución se distribuyeron en viales de vidriode 3 ml, se
congelaron con aire líquido (temperatura= -170°C) y se Iiofilizaron 48 hs (liofilizador
Stokes Pensilvania, P.A. que opera a -40°C y a una presión menor que 100 mp de Hg).
Luego del Iiofilizado,las matrices se equilibraron en desecadores de vacío durante una
semana a 25°C, sobre P202para humedad “cero”o sobre soluciones salinas saturadas de
awconocida para humedades de 22, 33,.44, y 75% H.R.
4.2.Determinación del contenido de humedad.
El contenido de humedad de las matrices poliméricas (MD, PVP) una vez
equilibradas, se determinó por diferencia en el peso antes y después del secado en
estufas de vacío durante 48h a 70°C. Para la determinación de humedad en
2‘)
muestras conteniendo trehalosa cristalizada, se utilizó una temperatura de 105°C.
Estas condiciones aseguran una determinación adecuada de la cantidad de agua,
según el tipo de muestra, y fueron seleccionadas en base a estudios previos
(Cardona y col., 1996).
4.3.Tratamiento térmico.
Luego de la equilibración, los sistemas semihúmedos se cerraron herméticamente
con teflón alrededor de sus tapas y se incubaron en estufa de circulación forzada de
aire a varias temperaturas (37, 45, 51, 57, 60, 70, 80, °C) por encima y por debajo de
las Tgs de los biopolímeros. Se retiraron de la estufa muestras por duplicado a
distintos tiempos, y se determinó la actividad enzimática remanente.
En los sistemas líquidos el tratamiento térmico se realizó en un baño de agua
terrnostatizado a 45 y 55°C.
4.4.Detenninación de actividad enzimática.
Después del tratamiento térmico, se agregó 1 ml de agua a cada tubo y los
sistemas se mantuvieron a 5°C hasta la disolución completa de los sólidos. Se
incorporaron luego 2 ml de una solución al 15% de lactosa, condiciones en que la
enzima opera a sustrato saturante (el KMde la enzima lactasa, obtenido por distintos
autores en productos lácteos o en sistemas modelo con buffer y lactosa, está entre
40 y 112 mM (Leiras y col., 1992)). Los sistemas conteniendo la enzima Iactasa se
incubaron a 37°C durante 90 minutos, luego de los cuales la inactivación se realizó
exponiendo las muestras a 80°C durante 3 min. La hidrólisis de la lactosa fue
determinada midiendo la concentración de glucosa, uno de los productos de la
reacción. Se utilizó el método enzimático Trinder basado en la oxidación de la
glucosa por la enzima glucosa-oxidasa a ácido glucónico y peróxido de oxigeno
30
(Wiener lab., Rosario, Argentina). En presencia de peroxidasa, este último
compuesto produce una reacción oxidativa del fenol con la 4-aminofenazona,
produciéndose un cromógeno color rojo que se puede medir en espectrofotómetro a
una longitud de onda de 505 nm.
La determinación se realizó en base a duplicados de cada muestra, y como por
cada tiempo se extrajeron dos muestras cada valor es el promedio de 4 mediciones.
Para este número de mediciones se calculó un error relativo del 5%.
La cantidad de lactosa hidrolízada por una muestra sin tratamiento térmico (Lo),
fue considerada correspondiente al 10.0%de actividad. La lactosa hidrolízada luego
del tratamiento térmico (L), fue referida a Loy la actividad remanente (AR) calculada
como:
AR= 100 L/Lo.
4.5. Temperaturas de transición vítrea.
Las temperaturas de transición vítrea fueron obtenidas por Buera y col., 1992, para
las matrices de PVP, porRoos y Karel., 1992, para matrices de MD,y por Cardona y
col., 1996. para los sistemas conteniendo trehalosa. En todos los casos, los datos se
obtuvieron por calorimetría diferencial de barrido, a una velocidad de 5°C/min,
utilizandomuestras equilibradas en las mismas condiciones seguidas en este trabajo.
3]
5.Resultados y discusión
5.1. Resistencia térmica en medio liquido.
Se estudió en primer lugar, la estabilidad térmica de Ia enzima Iactasa (rs
galactosidasa) en medio líquido (ver sección 4.1.a.). En la Figura 12 (a,b), se observa
que la actividad remanente disminuye a medida que aumenta el tiempo de
incubación, siendo la "vida media” (tiempo para reducir Ia actividad de la enzima a un
50% de su valor inicial),aproximadamente de 60 minutos a 45°C y menos de 0.5 min.
a 55°C. Estos resultados muestran que la estabilidad de la enzima en medio líquido
se ve marcadamente afectada por la temperatura y el tiempo de incubación.
5.2. Resistencia térmica en sistemas semihúmedos.
5.2.a. Análisis de la Tg como parámetro de estabilidad térmica en matrices
poliméricas.
La Tabla 1, muestra el contenido de humedad y los valores de Tg
correspondientes, de los sistemas utilizados para estudiar la influencia de la
transición vítrea (y de los cambios físicos asociados) sobre Ia resistencia térmica de Ia
enzima Iactasa.
Tabla 1. Contenido de humedad y Tg para matrices de PVP y MD Iiofi/izadas y
equilibradas a distintas actividades de agua.
Matriz aw Humedad Tg (°C)
(% b.s.)
PVP 40,000 0.22 7.6 63
0.33 10.2 55
0.44 15.3 47
0.75 32 -1
MD 0.22 4 85
0.44 7 60
0.75 l l .1 30
32
100
bO)COOOO
Actividadremanente%
l\) O
o l l l l l l l I
O 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tiempo, min
55°C
pH= 6.9
Actividadremanente,%
o I
O 0.5 1
Tiempo, min
Figura 12: Actividad remanente de Iactasa en medio líquido (1% v/v, buffer fosfato
pH: 6.9), en función del tiempo de calentamiento a 45°C (a) y a 55°C (b).
Los sistemas fueron almacenados a temperaturas por encima y por debajo de
la temperatura de transición vítrea (en un rango de 37 a 80°C), para poder analizar la
estabilidad en el estado vítreo y gomoso. Tanto para MDcomo para PVP, se graficó
la actividad remanente en función del tiempo de almacenamiento para las distintas
humedades y temperaturas estudiadas (Figuras 13 y 14).
La pérdida de actividad enzimática en el rango de temperaturas estudiadas
mostró una dependencia logaritmica en función del tiempo (Figuras 13 y 14),
ajustándose a una reacción de primer orden (característica de los procesos de
desnaturalización de proteinas) según Ia ecuación:
v=k.a
daldt=k.a
Inalao=-k.t
donde t: tiempo de incubación
ao: actividad de la enzima a t=0
a: actividad de Ia enzima al tiempo t
k: constante de inactivación
La resistencia térmica se vio notablemente incrementada en los sistemas
semihúmedos (Figuras 13 y 14), respecto a Io observado en medio liquido (Figura
12.a y b); (p.ej. a 45°C Ia “vida media" en matrices de PVP deshidratadas, está en el
orden de cientos de horas, mientras que en medio liquido fue de aproximadamente
60 minutos a la misma temperatura).
Las Figuras 13 y 14, muestran que a una dada temperatura la actividad
remanente en matrices de PVP y MD,disminuye al aumentar el tiempo de incubación
y el contenido de humedad. Por otro lado se observó que aún en estado vítreo
((T-Tg)<0), la pérdida de actividad de la enzima Iactasa fue importante,
principalmente a temperaturas de almacenamiento suficientemente altas
(aproximadamente 60°C).
o 1.19 - -2e°c
. . . . . . . . . A Y . . . V . . . v , . . . 4 . . 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . , , A . . . . . . . 4 . . i ..
Actividadremanente,96
T'T9 = 7’° a) aw=o.22 Tg=63°C
o l l l I l l1
O 100 200 300 400 500 600 700
tiempo, h
"m"ÍZIÍÍÍÍÏLÍIíCIíCÍÍÉÍ:ZZÍÏTEÍQÉÍEÍPÏ‘CLZÍIÁÍZIÍZ
. . . 4. . . A“11.9.; floyd.
Actividadremanente,96
....,..4..4...
\\*¿
T-Tg= 4°C
T-Tg= 5°C
X
TJQEZW b) aw=0.33 Tg=55°C
1° l l l I
0 100 200 300 400 500
tiempo, h
100.-" . . . . A. . . . . . . A. . . . . . . . . . 4 . A. . . . . . . . . . . . . . A. . . . . . . . . . . . . , 4 . A.
.. . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . 4.T_Tg.__,_.._11,c.
¡e . . . . . A 4 . . A . _ . . . . . . . A . . . . _ . .s .
2' 50 . . . . . . . . . . ..'. , . A_. _. , 4 . . . . . . . . _. . . , . . , . . , . , ..
S \ T'Tg=-3'C5 . 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . Y . . . . . . ., . A . . . . . . . . . . . . . . A . . . A . . . . . . . . . A ..
É ................... _. “9: 3°
E _ . . . . . 4 ,7
:9. T-Tg= 12'C
.2
.6 i . . . . . . Á . . . . . . . . . . . . _ . . . . . . . , _ . Á . . . . . . . . . . 4 . _ Y . _ . . . . . . Y . k . . _.<
T-Tg=zrc
c) aw= 0.44 Tg=47°C
10 l l l I l | l Í l
D 50 100 150 200 250 300 350 400 45
tiem po, h
Figura 13: Cínétíca de primer orden para la inactivación de Iactasa en matn'ces de
PVP Iiofilízadas y equilibradas a aw= 0.22 (a), aw= 0.33 (b), aw= 0.44 (c). Los
distintos sistemas se aímacenamn a van'as temperaturas.
.37°C A45°C 3K51°C ¡60°C X70°C
35
T°Tg SÁOGC
Acllvldadremanente,96
_. o
a) aw= 0,22 Tg285°C
l l 4‘
1 l ' l I
0 300 600 900 1,200 1,500 1,800 2,100
llempo, h
Actividadremanente,%
Acuvldadremanente,96
_ . . . . . . . . . . . . . A. . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . .. c). a.wï0.75.T.g.Z30,C.
T_Tb.=.5°,c . . . . . . . . . , . . . . . A. . . . . , . . . A. . . . . . . . . . . . A . . . . . . . . ..
0.1,“ l l l I ' l I l l I
C 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
llempo, dla
Figura 14: Cínétíca de primer orden para la inactivación de Iactasa en matrices de MD
Iifilizadas y equilibradas a aw= 0.22 (a), aw= 0.44 (b), aw= 0.75 (c). Los distintos
sistemas se aImacenaron a + 45°C + 57°C 9K80°C
36
La temperatura de calentamiento, más que el parámetro (T-Tg)parece ser el principal
factor responsable de la inactivaciónde Iactasa en sistemas semihúmedos.
Si la estabilidad enzimática tuviese una dependencia importante con la
transición vítrea, se esperaría un cambio drástico en la estabilidad de la enzima
lactasa a temperaturas cercanas a la Tg. Sin embargo no se observaron dichos
cambios en los experimentos realizados (Figuras 13 y 14).
La estabilidad en matrices amorfas de PVP se estudió almacenando a 6
temperaturas distintas (en un rango de 37 a 80°C) (Figura 13) con el fin de
representar las pendientes en un gráfico de Arrhenius." Utilizando el método de
regresión lineal, se calcularon las constantes de inactivación (k) para las distintas
humedades y temperaturas de almacenamiento, y los coeficientes de correlación
correspondientes, que mostraron un buen ajuste en todos los casos (Tabla 2).
(Debido a que en las condiciones del experimento se perdió menos del 10% de
actividad a 37°C en los tres sistemas (22, 33 y 44% H.R.), la constante de
inactivación no pudo ser evaluada a esta temperatura).
Tabla 2. Constantes de inactivación (k) de la enzima Iactasa, calculadas para las
distintas condiciones analizadas en sistemas amorfas de PVP. Se muestra también el
coeficiente de cone/ación (r)conespondiente.
Terripgratura aw: 0.22 aw= 0.33o ) . _
Estudios previos (ver sección 2.3.c.) indicaron que pueden ocurrir
desviaciones de la cinética o quiebres en el gráfico de Arrhenius, debidos a cambios
fisicos. Sin embargo en los gráficos obtenidos (Figura 15) no se observan dichos
quiebres en relación con la temperatura de transición vítrea. Estas resultados
indicarían que la transición de la matriz donde se encuentra la enzima, del estado
vítreo al gomoso, no se ve reflejada en cambios drásticos en Ia velocidad de
inactivación térmica, como se esperaría si este proceso fuera predecible en base los
cambios físicos de la matriz.
Las energías de activación (Ea) halladas a partir de la pendiente (Ea/R = k) del
gráfico de Arrhenius, están en el orden de las normalmente encontradas para
desnaturalización enzimática (aproximadamente 40 Kcal/mol).
Para analizar el efecto específico de la matriz sobre Ia estabilidad de la
enzima, se graficó el tiempo para obtenerun 50% de pérdida de actividad (tm) en
función del parámetro (T-Tg) a 45°C, para los sistemas conteniendo PVP y MD
(Figura 16). Se observa que a medida que aumenta el parámetro (T-Tg), el tm
(estabilidad de Iactasa) disminuye siendo la enzima más estable en MDque en PVP.
Como se mencionó anteriormente , hay pérdida de actividad en el estado vítreo (p.ej.
a (T-Tg)= -15°C para ambas matrices), sugiriendo que aunque la movilidad molecular
se encuentra significativamente disminuida en el estado vítreo, la movilidad de la
enzima es suficiente para que se produzca la desnaturalización.
La temperatura de almacenamiento también tiene un rol especifico en la
estabilidad térmica, según se muestra en la Figura 17 para MD (a) y PVP (b). A un
mismo valor del parámetro (T-Tg) se observa claramente que tanto en MD como en
PVP el tm es menor al aumentar la temperatura de almacenamiento.
El efecto de la humedad sobre las reacciones de deterioro físico y químico en
el rango de bajas humedades, fue atribuido a disminución de la viscosidad del medio
y pérdida de limitaciones difusionales al aumentar la humedad del medio. Es por eso
que algunos autores propusieron que la dependencia de la constante de velocidad de
las reacciones de deterioro con el contenido de humedad podria explicarse
1
l\ a) aw=0.22
A
0.1 — 1°
33
.34
A
0.01 —
Á\
\
l l I l 1 I | L 1
2.70 2.75 2.80 2.85 2.90 2.95 3.00 3.05 3.10 3.15 3.20
1/T(1/K).10‘
1
b) aw=0,33
\0\\
0.1F \\
k(h‘)
/
0.01 * \O
l l ' l l l l l l '
2.70 2.75 2.80 2.85 2.90 2.95 3.00 3.05 3.10 3.15 3.20
1/T(1/K).10’
C) aw =O 44
l l l l l J l l
2.70 2.75 2.80 2.85 2.90 2.95 3.00 3.05 3.10 3.15 3.20
1/T(1/K).10’
Figura 15: Gráfico de Anheníus mostrando la inactivación de lactasa en matrices de
PVP Iiofi/¡zadas y equilibradas a aw= 0.22 (a), aw= 0.44 (b), aw= 0.75 (c).
39
50
40
l
­
l
o l J l J l l
-50 -40 -30 -20 -10 O
45°C
l v .
"M.D.
v pvp
(T-Tg), °C
10 20 30 40 50 60
Figura 16: Efecto del parámetro (T-Tg) sobre la estabilidad térmica (tiempo de vida
media) de lactasa en matrices de PVP y MDalmacenadas a 45°C.
50
Maltodextrina
40 ­
m 30 - '
¡s
1:
a: _ 45°C
10­
o l l l
-50 -40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50 60
(T-Tg),°C
20
o PVP
15 b
{3’
o 46°C
51°C
5 _
60°C
._—_————o—————4v
o l l l I l l
-15 -10 -5 0 5 10
(T-Tg), °C
Figura 17: Efecto específico de la temperatura de almacenamiento en la estabilidad
térmica (tiempo de vida media) de lactasa en MD(a) y PVP (b), a distintos valores de
(T-Tg).
41
unicamente en base al cambio de la temperatura de transición vítrea con Ia humedad,
ya que el agua es un agente plastificante cuyo efecto es reducir dicha temperatura. El
parámetro (T-Tg), que involucra aspectos de temperatura y humedad, podria
entonces utilizarse como única variable en la predicción de velocidades de deterioro.
Si esto fuera así, al graficar el tiempo de vida media versus (T-Tg)debería obtenerse
una única curva, independientemente de la temperatura o humedad del sistema. Sin
embargo en la Figura 18 se observa que para un mismo valor del parámetro (T-Tg) la
vida media es menor en los sistemas más secos, lo cual estaría mostrando el
importante efecto que tiene la temperatura sobre la estabilidad de la enzima en
matrices amorfas deshidratadas.
5.2.b. Efecto protector de trehalosa en relación a su estado físico: transición
vítrea z cristalización.
En la Tabla 3, se muestra la composición, contenido de humedad y Tg
correspondientes para los sistemas estudiados.
Tabla 3. Composición de los sistemas modelo.
Matriz aw Humedad Tg (°C)
(% b.s.)
PVP 10,000 “0" “0” 90
PVP 40,000 “o” “0” l37
T “0” “0”
0.22 4.5 45
0.44 8.4 l4
0.75 9 -lO
MD:T (80:20) 0.22 4.8 no det
0.44 8.3 no det
0.75 9.7 no det
42
MD
m=7%
'\ m=11%
' 1
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
(T-Tg), °C
25
4 PVP
20 ­
m=7.6%
m 15 ­
tu
:5 m=10.2%
J 10F
5 ._..
o l l J l I l
-15 -10 -5 0 5 10 15
aOC
Figura 18: Efecto específico de la humedad en la estabilidad térmica (tiempo de vida
medía) de lactasa en MD(a) y PVP (b), a distintos valores del parámetro (T-Tg)
43
Se analizó el efecto específico del disacárido trehalosa (en comparación con
MD, PVP y MD-T)sobre la estabilidad de lactasa en sistemas liofilizados. Se estudió
la influencia del contenido de humedad (O, 22, y 44% H.R.) de la matriz a distintas
temperaturas de almacenamiento (45, 57 y 70°C), sobre la capacidad protectora de Ia
trehalosa.
La Figura 19, muestra la actividad remanente de la enzima en función del
parámetro (T-Tg), en matrices de humedad “cero” (PVPm, PVP40, MD y T), luego de
10 y 15 h de tratamiento térmico a 70°C. Existe una correlación inversa entre Ia
actividad enzimática remanente y el parámetro (T-Tg) para MD y PVP’s de distinto
peso molecular, lo cual se corresponde con la teoría de la transición vítrea (Levine
and Slade, 1992). Sin embargo la trehalosa cae fuera de esta correlación, indicando
que la estabilización de la enzima en esta matriz, es mayor que la esperada por su
valor de (T—Tg)y por lo tanto el estado vitreo no sería el único modo de estabilización,
habria un mecanismo de protección específico relacionado con la mantención de la
estructura terciaria.
Se estudió luego la influencia de la temperatura y del contenido de humedad
sobre el efecto protector de trehalosa. Los resultados obtenidos se muestran en Ia
Figura 20 donde se graficó la actividad remanente de lactasa en matrices de
trehalosa equilibradas a 22, 44 y 75% de H.R., en función del tiempo de
calentamiento a distintas temperaturas (45, 57 y 80°C). Se observa que la matriz de
trehalosa proteje a la enzima a humedades bajas (22% H.R.)y cuando la temperatura
de calentamiento fue de 45 y 57°C. Almacenando a 80°C (Figura 20 c.), la enzima es
poco estable y pierde su actividad aún a humedad baja (22% H.R.). AI aumentar el
contenido de agua del sistema (44 y 75% H.R.), la actividad de la enzima se pierde
rápidamente comparada con la pérdida observada en la matriz de menor humedad
(22% H.R.).
44
100 h I T A I­
n
o l T :\ ' I
o“ 80mA ¿:2 ——————
3' MD ‘> . \\
1; \ \
o 60 _ \\ \\
N \ \
\ \
8’ s \
-- 4o — \ ‘
70°C \ ‘
(u A10], \\ 'k
\ ‘ x ­
g 20_ 015h \\ ‘xN‘N
m ‘ PVP40 ‘ *
U ________ ** ‘ ‘ ‘ t PVP10
0 1 l l l l I-*“T'“:‘__m
-100 -90 -80 -70 -60 -50 -40 -30 -20 -10
(T'Tg)! 0C
n
Figura 19: Actividadremanente de lactasa en matn'ces líofilizadasde humedad "cero
en función del parámetro (T-Tg) luego de 10 y 15 horas de tratamiento térmico a
70°C.
45
a) 45°C
Kit-22%
Actividadremanente,96
FLH.=44%
/"
R.H.-75%
l l lJ
600 800 1 ,OOO 1 ,200
o J I ‘
O 200 400
tiempo, h
b) 57°C
R.H.-22'/.
EF
\ put-44%\
Actividadremanente,96
RH.=75°/. K ¿é
tiempo. h
c) 80°C
Kit-22%
Actividadremanente,‘36
0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 45 5
tiempo, h
Figura 20: Actividad remanente de lactasa en matrices Iiofilizadas de trehalosa
equilibradas a 22, 44 y 75 %H.R., en función del tiempo de calentamiento a 45°C (a),
57°C (b) y 80°C (c).
46
Este comportamiento se relacionó con el proceso de cristalización de
trehalosa (se sabe que la cristalizaciónde azúcares en estado amorfo puede ocurrir a
temperaturas mayores que su Tg, a una velocidad que depende del valor (T-Tg) y del
tiempo).
Como se mencionó en la sección 2.3.9., la cristalización puede observarse en
un DSC como un pico exotérmico luego de producirse la transición vitrea, lo cual se
muestra en la Figura 21. para sistemas de trehalosa conteniendo 22 y 33%
H.R.(Cardona y col, 1996).
En la Figura 22 se compara el DSC obtenido para trehalosa a mayores
humedades (44 y 58% H.R.), con el DSC de un sistema cristalino. El pico exotérmico
correspondiente a la cristalización, no se observa en las muestras equilibradas a 44 y
58% H.R., lo cual indica que a esas humedades la trehalosa ya comenzó a cristalizar
durante el periodo de equilibración (una semana) (Cardona y col, 1996).
Volviendo a la Figura 20, el parámetro (T-Tg) es mayor o igual que cero en
todos los sistemas estudiados, por lotanto el azúcar trehalosa podria cristalizar a
cualquiera de las humedades y temperaturas analizadas. Sin embargo como la
trehalosa cristaliza como un dihidrato, se requiere un 10,5% (bs) de agua para que
se produzca una cristalización completa. En los sistemas en los cuales la cantidad de
agua fue suficiente para permitir la cristalización en una proporción alta (44 y 75%
H.R., según Cardona y col, 1996), la enzima se inactivórápidamente. La matriz de
trehalosa conteniendo un 22% H.R. no habría cristalizado completamente (a 45 y
57°C) debido a la falta de agua, mostrando entonces una mayor protección de la
enzima.
Como el efecto protector de trehalosa parece estar relacionado con la
proporción de azúcar que cristaliza, se realizaron experimentos en los que se
incorporó MDa la matriz de trehalosa. Los resultados se muestran en las Figuras 23 y
_ 22% RH.
[A
O
X
I 0)
E .
m'
JL,
I i l U l Ï Í Ï I I Ï Ï
50 100 . 'C
33% R.H
A
O
X
I CJ
E
á
Ï Ï I I I ¡ Ï Í Ï l
50 . 'C
Figura 21: Tennogramas obtenidos por DSC para matrices amorfas de trehalosa
equilibrads a 22 y 33 %H.R. mostrando los picos de cristalización (Cardona y col.,
1996).
44% R.H.
Ao
x
I Ü
E
,4
l l 1 l I I I I I I I
0 50 . ’c
58% R.H.
8 y;xI
E o
o'
T1
I I l I I l I l I
50 100 . ' C
crystallíne dihydrate
A
S3 ‘
E (u
o"fi
I l l I l | l I l I l
50 100 . C
Figura 22: a) Tennogramas obtenidos por DSC para matrices de trehalosa
equilibradas a 44 y 58 %H.R. (mostrando el pico de fusión para sistemas equilibrados
a 58 %H.R.),' b) Tennograma obtenido por DSC para trehalosa cn'stalízada mostrando
el pico de fusión.
49
24 en forma comparativa con los resultados obtenidos para los sistemas conteniendo
MDo T solamente. Se graficó, para las distintas matrices y humedades estudiadas, la
actividad remanente de lactasa en función del tiempo de almacenamiento a 45°C
(Figura 24) y 57°C (Figura 24). Almacenando a 45°C (Figura 23), se observa que a
bajas humedades (22% H.R.) la protección en matrices de MDo T es similar, siendo
mayor la estabilidad de la enzima en la mezcla MD:T.AIaumentar la humedad en las
distintas matrices (44 y 75% H.R.), el incremento en la retención de actividad en la
matriz MD:T se hizo aún más evidente. Cuando se almacenó a 57°C (Figura 24)
también se observó mayor protección en la mezcla (MD:T)respecto a la estabilidad
de la enzima en MDo T.
Por lo tanto la adición de MD a la matn‘z de trehalosa permitió mantener el
efecto protector del azúcar a humedades relativamente altas (44 y 75% H.R.). La
adición de MD estaría de algún modo inhibiendo o retardando la cristalización del
azúcar trehalosa, ya sea por un incremento en la Tg del sistema o modificando las
condiciones que favorecen la cristalización , sin un cambio significativo en la Tg.
50
Remalnlngacklvlty,%
o l í l l I l l
0 300 600 900 1.200 1.500 1,800 2,100
tlme, h
Remainlngactivity,%
T
o 1 l l l l l
0 200 400 600 800 1,000 1,200
tlme. h
100 45'C
R.H.=75%
¡Q
E
.2
8
W
m
C
'Eo \w
n: , .
l |
800 1.000 1.200
time, h
Figura 23: Actividad remanente de lactasa en matrices de MD, Ty MD:Tequilibradas
a 22,44 y 75 %H.R., en función del tiempo de almacenamiento a 45°C.
57'C
R.H.=22%
¡e 80
é
E
g 60a
cn
.E
I:
'5 40
E0l:
MO
ll l l l l
O 100 200 300 400 500 600 700 800
tlme, h
8
Remainíngactivity,96
8
20
n l l l
U
W l
0 100 200 300 400 500 600 700
time, h
57°C
FLH.= 75%
Remainingactivity,%
bCDcnooo
Ó M O
time, h
Figura 24: Actividad remanente de Iactasa en matrices de MD, T y MD:Tequilibradas
a 22, 44 y 75 %H.R., en función del tiempo de almacenamiento a 57°C.
6.Conc|us¡ón.
La estabilidad térmica de la enzima lactasa se vio notablemente incrementada
en los sistemas amorfos estudiados (PVP, MD, T, y MDzT),respecto a lo observado
en medio liquido, aún cuando Ia temperatura de almacenamiento de los sistemas fue
mayor que la Tg correspondiente ((T-Tg)>0,estado gomoso).
Debido a que la inactivación requiere un reordenamiento espacial de las
moléculas, es razonable pensar que la estabilidad proteica (o enzimática) debería
incrementarse en una matriz vitrea, donde Ia movilidad molecular está muy reducida
(Franks, 1993 : Levine and Slade, 1992 a). Sin embargo los resultados obtenidos en
el presente trabajo sobre la estabilidad térmica de lactasa en matrices de PVP, MD,T
y MDzT,sugieren que la inactivación enzimática en estos sistemas de humedad
reducida no puede predecirse únicamente en base a la transición vítrea.
Se observó inactivación de la enzima en el estado vítreo, y la temperatura de
calentamiento mas que el parámetro (T-Tg) parece ser el factor principal en la
inactivación de Iactasa en sistemas amorfos. La estabilidad de la enzima no mostró
un cambio drástico a temperaturas cercanas a la Tg, según se esperaría si Ia
inactivación fuese sólo dependiente de la transición vitrea. Por otro lado se observó
que Ia matn'z tiene un efecto específico importante sobre la estabilidad térmica (a
valores de (T-Tg) similares la enzima fue mas estable en MDque en PVP).
La estabilidad de la enzima en matrices polimén'cas deshidratadas estuvo
directamente relacionada con la Tg de las matrices. Sin embargo el azúcar trehalosa
mostró un alto grado de protección a humedades bajas (“cero" y 22% H.R.), que no
pudo atribuirsea su temperatura de transición vitrea. Se observó que el efecto
protector se pierde cuando una alta proporción de trehalosa cristaliza. La transición
vítrea promueve un cambio drástico en las características físicas de la matriz amorfa
de trehalosa que conducen a una mayor movilidad y en consecuencia mayor
probabilidad de cristalización. Al producirse la cristalización, las moléCUlas proteicas
son empujadas fuera de la estructura cristalina perdiendo el azúcar su acción
protectora.
La incorporación de MDa sistemas conteniendo trehalosa, permitió una mayor
estabilidad de Iactasa principalmente a altas humedades (44 y 75% H.R.),
condiciones en las cuales un alto porcentaje de trehalosa hubiese cristalizado. La
adición de MD, estaría de algún modo inhibiendo o retardando la cristalización del
azúcar trehalosa, ya sea por un incremento en la Tg del sistema o modificando las
condiciones que favorecen la cristalización, sin un cambio significativo en la Tg.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que la Tg no puede
utilizarse como el único parámetro importante para predecir la estabilidad de lactasa
en sistemas amorfos. Los efectos especificos de temperatura, contenido de humedad
y tipo de matn'z son evidentes y es necesario considerarlos. La temperatura de
transición vitrea puede utilizarse como una “herramienta” más que como un factor
determinante de la estabilidad enzimática en sistemas de baja humedad.
Q (“ergo/4;
Dm. Maui321M¡Quem Mmmm-t mmm,
54
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