OPUyPIVBolAnembe2010

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Desde 1981, año en el que nació ”Virgil”, el primer ternero
procedente de un embrión producido in vitro (Brackett et
al., 1982) esta técnica ha experimentado en la especie
bovina una evolución considerable. Así, en la actualidad,
se está aplicando para mejorar el potencial reproductivo
de las vacas donantes dentro de los programas MOET (del
inglés MultiOvulation and Embryo Transfer) y en algunas
ocasiones sustituye a la superovulación (Herradón et al.,
2007).
Los datos estadísticos publicados por la International
Embryo Transfer Society (IETS) indican que durante el año
2006 se obtuvieron 440.000 embriones bovinos a nivel
mundial mediante PIV, de los que fueron transferidos unos
290.000, cerca del 66% del total de embriones (Thibier,
2007).
La utilización de la PIV de embriones bovinos permite
numerosas aplicaciones, entre las que destacamos:
Aumenta el rendimiento de los programas de producción
de embriones a partir de hembras de elevado valor
genético, al permitir la obtención de ovocitos en novillas
de más de 6 meses de edad, en vacas durante el primer
trimestre de gestación y a partir de las 2-3 semanas del
posparto (Galli et al., 2001).
No hay interferencia con los ciclos productivos o
reproductivos de la hembra donante, evitando la
utilización de gonadotropinas.
Permite producir embriones a bajo coste, lo que
permite transferir embriones de razas cárnicas en vacas
de aptitud láctea no destinadas a la recría o utilizarlos
para tratar la infertilidad por problemas de ovulación,
fecundación o mortalidad embrionaria precoz.
Permite obtener descendientes de hembras de elevada
calidad genética que deban ser sacrificadas por
padecer enfermedades, infertilidad, por edad o durante
los programas de erradicación de enfermedades
infecciosas (tuberculosis, brucelosis, leucosis, BSE).
Permite el aprovechamiento de animales con
determinadas formas de infertilidad (hembras con
alteraciones estructurales o funcionales del tracto
genital) y facilita la utilización de semen sexado.
Sin embargo, esta técnica es todavía poco eficiente, lo
que dificulta su aplicación a gran escala. El porcentaje
de ovocitos capaces de transformarse en embriones
transferibles se encuentra estancado entre el 30 y 40%
(Herradón et al., 2007).
ARTÍCULOS
ORIGINALES
---------------------------------------------------------------------------------
PRODUCCIÓN IN VITRO
DE EMBRIONES (PIV)
EN BIOTECNOLOGÍA 
DE LA REPRODUCCIÓN 
BOVINA
---------------------------------------------------------------------------------
Salvador Ruiz, Susana Astiz
Dpto. Fisiología. Facultad de Veterinaria. Universidad de Murcia.
Dpto. Reproducción Animal. INIA. Madrid.
sruiz@um.es
---------------------------------------------------------------------------------
INTRODUCCIÓN
Las grandes expectativas creadas por los procedimientos
de producción de embriones in vivose han visto defraudadas
con el tiempo. Ello es consecuencia de que su rendimiento
no es tan elevado como se suponía en un principio
(estabilizado en torno a 4’8 embriones transferibles en
la especie bovina), a la existencia de hembras que no
responden a los tratamientos para inducir superovulación,
a la necesidad de respetar periodos de descanso entre dos
recogidas consecutivas y a la obligatoriedad de que las
donantes estén en perfectas condiciones ginecológicas,
situación difícil de mantener en las hembras multíparas
(Herradón et al., 2007).
Estas circunstancias han creado la necesidad de
desarrollar un procedimiento alternativo para la producción
de embriones: la producción de embriones in vitro (PIV)
utilizando ovocitos inmaduros, recogidos directamente
del ovario con independencia de la edad y de la situación
fisiológica de la hembra. Sin embargo, existen varias
consideraciones, que dificultan la consecución de este
objetivo. Por un lado, la población de ovocitos presente en
el ovario es limitada disminuyendo progresivamente con la
edad debido a la atresia folicular y por otro, la población es
muy heterogénea en cuanto a calidad y grado de madurez.
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Producción in vitro de embriones (PIV)
La producción de embriones in vitro (PIV) consta de varias
etapas,cadaunadelas cualespuedeafectara losresultados
finales del proceso. Estas etapas pueden resumirse en las
siguientes: obtención de ovocitos, selección de ovocitos,
maduración in vitro (MIV), fecundación in vitro (FIV) y
cultivo de los cigotos resultantes hasta blastocistos (CIV).
1. Obtención de Ovocitos. Ovum Pick-Up (OPU)
La obtención de los ovocitos se realiza a través de dos
procedimientos básicos:
A partir de hembras sacrificadas en el matadero,
mediante la obtención de sus ovarios y la aspiración
de los folículos con un diámetro comprendido entre 3
y 6 mm.
A partir de animales vivos utilizando la técnica
de aspiración folicular transvaginal guiada por
ultrasonografía (OPU, Ovum Pick-Up).
La OPU fue desarrollada originalmente para la reproducción
asistida en la especie humana (Lenz y Lauritsen, 1982),
usándose por primera vez, en ganado vacuno, en Holanda,
al final de los 80 (Pieterse et al., 1988). El empleo de OPU
de forma rutinaria en reproducción asistida veterinaria se
inicia en 1994 (Kruip et al., 1994).
Según los datos de la Association Européenne de Transfert
Embryonnaire (AETE), se han realizado en Europa en el
periodo 2000-2008 más de 40.000 sesiones de OPU, con
una producción de embriones por sesión que oscila entre
1’4 y 2’3 y una media de 1’78 embriones. En el último
año del que se tienen datos (2008), el número total de
sesiones de OPU realizadas en Europa fue de 3.753,
lo que supone un aumento del 8’1% con respecto al
2007. En 2008, cuatro países de Europa (Países Bajos,
Alemania, Italia y Francia) aplicaron sistemas de OPU/
PIV para la producción comercial de embriones, con una
producción de 6.751 embriones transferibles y una media
de producción de embriones de 1´80 por sesión (Merton,
2009).
La OPU es una técnica con muchas posibilidades. Puede
ser usada en vacas cíclicas, no cíclicas, durante el
primer tercio de la gestación y en las que no responden
a estímulos hormonales; también, en animales con
desórdenes reproductivos de origen no genético (Galli et
al., 2001), y en terneras y novillas prepúberes a partir del
6º-8º mes de edad (Taneja et al., 2000).
Artículos Originales
Distintas imágenes ecográficas de los folículos visibles durante la sesión de OPU
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LaOPUsuponeunaalternativaa laproduccióndeembriones
bovinos a partir de ovocitos procedentes de matadero.
En la OPU trabajamos con ovocitos obtenidos de vacas
vivas de origen genético conocido, consiguiéndose así
un mayor número de embriones (hasta 100 embriones al
año por vaca) respecto del obtenido mediante protocolos
estándar de transferencia embrionaria (TE). La aplicación
conjunta de ambas tecnologías (OPU/PIV) permite la
producción de más de 50 terneros por vaca donante y año,
convirtiéndose en las herramientas ideales para obtener
nacimientos adicionales de donantes de alto valor genético
que no pueden ser sometidas a un programa convencional
de superovulación (van Wagtendonk-de Leeuw, 2006). La
recuperación repetida de ovocitos mediante OPU permite
obtener la mayor descendencia posible de animales más
valiosos, acelerando los procesos de selección y mejora
genética (vía paterna y materna) a la vez que supone una
fuente extra de ovocitos para clonación y transgénesis
(Ding et al., 2008).
Después del desarrollo inicial de la técnica de OPU, se
han llevado a cabo muchos estudios investigando diversos
factores que puedan incrementar los resultados. Éstos
se pueden dividir en factores técnicos y biológicos (Ruiz,
2010):
Factores Técnicos. Se ha investigado sobre la geometría
de la aguja de aspiración y la presión de vacío (Bols et
al., 1995, 1996) con lo que se ha conseguido mejorar la
calidad de los ovocitos recogidos reduciendo el número de
ovocitos denudados, aunque sin que se haya provocado
un incremento del número total de ovocitos obtenidos por
sesiónde OPU. La mejora técnica más significativa ha sido
la sustitución de la aguja original de 50 cm de longitud por
una aguja mucho más corta (7 cm), estéril, descartable
y fácilmente reemplazable entre diferentes donantes,
reduciendo así el riesgo de contaminación. Además, estas
agujas tienen un volumen muerto menor lo que minimiza
el tiempo en el que los complejos cúmulo-ovocito (COCs)
están expuestos a un ambiente desfavorable y permite la
obtención de fluido folicular de folículos individuales para
propósitos de investigación.
a. Factores Biológicos. Entre éstos podemos incluir
los siguientes: el animal donante, la pre-estimulación
hormonal, el tiempo y frecuencia de la OPU y la
experiencia del operador.
Animal donante. Al igual que en los sistemas MOET, la vaca
donante puede explicar aproximadamente un 20% de la
variación observada en términos de ovocitos por OPU y de
eficiencia en la producción de embriones.
Artículos Originales
Distintos estadios embrionarios resultados de su producción in vitro, tras la maduración y fertilización de los 
ovocitos obtenidos tras la OPU 
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Artículos Originales
Pre-estimulación con FSH. La mejora más significativa con
respecto al rendimiento en la calidad de los ovocitos y,
por consiguiente para la producción de embriones, ha sido
la pre-estimulación hormonal previa a la OPU mediante
el uso de gonadotropinas (De Roover et al., 2005, 2008).
Blondin et al. (1997) observaron que el mejor desarrollo
aparece cuando la estimulación se efectúa 48 h antes
de la aspiración. Chaubal et al. (2006) realizaron un
estudio comparativo entre sistemas de OPU con y sin
estimulación hormonal, concluyendo que la retirada del
folículo dominante seguida de la administración de FSH
y de OPU 48 h más tarde, fue el mejor protocolo en base
a la respuesta folicular, la recuperación de ovocitos y
la producción de embriones. El ensayo fue realizado
con éxito, durante 10 semanas seguidas. Estos autores
emplearon una dosis semanal única de FSH, reducida en
comparación con la dosis completa estándar que se utiliza
en la ovulación múltiple de rutina en el sistema MOET. Esto,
además de evitar la hiperestimulación ovárica, reduce el
estrés asociado con múltiples inyecciones de FSH.
Frecuencia de OPU. El intervalo entre sesiones de OPU
tiene influencia sobre la cantidad y calidad de los ovocitos
obtenidos. El periodo de tiempo entre dos aspiraciones
afecta de forma significativa la tasa de producción de
ovocitos, obteniéndose un mayor número cada 7 días
en comparación con la obtención cada 3 ó 4 días (Rizos,
2009).
Experiencia del operador. La técnica de OPU se realiza por
1 ó 2 personas y en determinadas empresas, la misma
persona lleva a cabo el desarrollo de la técnica de una
forma similar durante años, usando las mismas condiciones
técnicas. La experiencia del operador (en un sistema de
una sola persona) o del operador y el ayudante (en un
sistema de dos personas) tiene un efecto significativo
en el número y la calidad de los ovocitos recolectados
(Merton et al., 2003) y hasta cierto punto, una adecuada
selección de los operadores y/o asistentes puede ayudar
a mejorar los resultados.
2. Selección de ovocitos
La selección de los ovocitos se realiza generalmente en
base a tres criterios: diámetro, aspecto del citoplasma y
características de las células del cúmulo. El diámetro de
los ovocitos condiciona su capacidad para madurar (Fair
et al., 1995), de tal forma que los ovocitos bovinos con
un diámetro inferior a 110 μm se encuentran todavía en
fase de crecimiento y no han adquirido aun la capacidad
para madurar. Los ovocitos rodeados por un cúmulo
compacto formado por varias capas de células, presentan
mayores porcentajes de maduración, fecundación y
de desarrollo hasta blastocisto, que los que carecen
de cúmulo o los que están rodeados solamente por la
corona radiada (Stojkovic et al., 2001). Se ha tratado de
establecer una relación entre el aspecto del citoplasma y
la competencia del ovocito para madurar, ser fecundado
y soportar el desarrollo posterior (Nagano et al., 1999).
Se ha comprobado que los ovocitos que presentan un
ooplasma oscuro muestran acumulación de lípidos y un
buen potencial para el desarrollo, y los que presentan un
citoplasma pálido tienen una baja densidad de orgánulos y
escaso potencial de desarrollo. Los ovocitos con ooplasma
negro están envejecidos y presentan un menor potencial
de desarrollo (Nagano et al., 2006).
3. Maduración in vitro (MIV)
La MIV constituye una etapa decisiva en el rendimiento
del proceso de PIV. Sin embargo, se le ha prestado
una escasa atención, ya que si revisamos la bibliografía
existente podemos comprobar que se continúa
empleando el procedimiento descrito por Fukui y Ono
(1989), consistente en cultivar durante 24 horas los
ovocitos inmaduros en TCM-199, suplementado con
suero fetal, gonadotropinas (FSH y LH) y 17 -estradiol,
a una temperatura de 38’5ºC en una atmósfera con un
5% CO2 en aire. Actualmente, se realizan trabajos para
adecuar los medios de maduración, sustituyendo el TCM-
199 por fluido oviductal sintético modificado (SOFm), a
cambiar las condiciones de incubación en una atmósfera
gaseosa con bajo contenido en O2 y a evitar la utilización
de suplementos de composición indefinida (Herradón et
al., 2007).
El SOF es el medio más utilizado en la actualidad para el
cultivo in vitro de los embriones bovinos. Se ha utilizado
también durante la maduración, para evitar continuos
cambios en la concentración de iones, sustratos
energéticos, pH y osmolaridad. Resultados referentes
a maduración de ovocitos bovinos han demostrado que
el SOF, suplementado con distintas sustancias, permite
obtener resultados comparables a los del TCM-199 (Ruibal
et al., 2006). La MIV, generalmente, se realiza bajo una
atmósfera con niveles de O2 del 20%, situación distinta de
la existente en el tracto genital (el O2 en folículos ováricos,
oviducto y útero oscila de 1’5 a 8%; Harvey, 2007). Estudios
recientes han analizado el efecto de la MIV a bajas
tensiones de O2, pero los resultados son contradictorios,
observándose mejoras en el porcentaje de blastocistos
(Park et al., 2005), ausencia de diferencias (Iwamoto et al.,
2005) o efectos desfavorables (Oyamada y Fukui, 2004).
Se ha comprobado que el suero favorece la MIV bovina
(Leibfried-Rutledge et al., 1986), pero su composición
compleja, indefinida y variable transforma en indefinido
cualquier medio de cultivo al que sea añadido y representa
un riesgo sanitario. La sustitución de estas proteínas por
macromoléculas sintéticas no metabolizables (polivinil
pirrolidona) permite obtener resultados similares (Ruibal
et al., 2006) y al mismo tiempo disponer de un medio de
maduración químicamente definido.
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4. Fecundación in vitro (FIV)
Una vez que disponemos de ovocitos maduros, el siguiente
objetivo es lograr la fecundación de los mismos. Para ello
se incuban junto con espermatozoides capacitados en
un medio Tyrode suplementado con fuentes energéticas
(piruvato, lactato) y BSA (Yanagimachi, 1994). En la especie
bovina, la capacitación espermática se ve favorecida por
la incorporación de heparina al medio (Gordon, 1994).
No obstante, para lograr unos resultados óptimos es
necesario ajustar la concentración de heparina y el número
de espermatozoides para cada eyaculado concreto (Lu
y Seidel, 2004). Recientemente, se ha publicado un
trabajo en el que se comprueba que la utilización de una
baja tensión de oxígeno durante la fecundación in vitro
de ovocitos ovinos mejora la calidad de los blastocistos
obtenidos (Leoni et al., 2007).
Dada la problemática del uso del Percoll® como gradiente
de densidad para la separación de espermatozoides, cuyo
uso está prohibido en algunos países como Alemania, se
ha estudiado su sustitución por otros gradientes cuyo
empleo no conlleve ninguna restricción en biotecnología
de la reproducción (Bovipure®, Puresperm®, etc.). Un
estudio comparativo empleando Percoll® y Bovipure®
como protocolosde separación de espermatozoides de
toro para FIV, demostró que los porcentajes de división y
de blastocistos fueron mayores en el grupo Bovipure® que
en el grupo Percoll®, aunque no se encontraron diferencias
en el porcentaje de blastocistos eclosionados (Samardzija
et al., 2006).
5. Cultivo in vitro (CIV)
Los primeros intentos de cultivar embriones bovinos in
vitro se toparon con la dificultad de que los embriones
no superaban la etapa de 8 a 16 células (“bloqueo del
desarrollo”) (Eyestone y First, 1991). Para evitar este
bloqueo se utilizó el cocultivo con células somáticas o
medios condicionados por dichas células (Fukui y Ono,
1989) y se suplementaron con suero (Sirard y First, 1988).
Sin embargo, la aplicación de estos procedimientos de
cultivo generaba diversos inconvenientes ya que al usar
medios indefinidos, se dificulta el conocimiento de las
necesidades de los embriones durante sus etapas de
desarrollo temprano y suponen un elevado riesgo de
incorporar patógenos durante el cultivo. Por otra parte,
diversos estudios han demostrado que la incorporación
de suero al medio de cultivo es uno de los factores
responsables del síndrome de exceso de volumen fetal y de
la baja resistencia a la criopreservación de los embriones
obtenidos (Farin et al., 2001).
Sesión de OPU. Operador trabajando solo.
Ovocitos aspirados por OPU. Calidad 1 y 2.
Posteriormente, se pudieron lograr elevados porcentajes
de blastocistos en ausencia de células somáticas con
una tensión de O2 reducida (Liu et al., 1995). El siguiente
reto fue eliminar el suero o la albúmina, sustituyéndolos
por macromoléculas sintéticas. Keskintepe y Brackett
(1996) realizaron los primeros estudios en los que se
demostró la posibilidad de cultivar los cigotos bovinos
hasta blastocistos en un medio completamente definido,
obteniendo un pequeño número de gestaciones.
Los medios simples más utilizados para el cultivo de los
embriones bovinos son: el fluido oviductal sintético (SOF)
(Holm et al., 1999) y KSOM (Liu y Foote, 1995). Estos
medios se suplementan con numerosos componentes
al objeto de satisfacer las necesidades nutricionales
de los embriones. Los componentes “nuevos” que
más han contribuido a incrementar la eficacia de estos
medios simples son los aminoácidos esenciales y no
esenciales (Gardner et al., 1994). Sin embargo, todavía se
requieren mejoras puesto que el cultivo de los embriones
producidos in vitro en el interior del oviducto incrementa
notablemente su calidad. Algunos autores señalan que
la utilización de un único medio durante todo el periodo
de cultivo impide la consecución de buenos resultados.
Ello motivó el desarrollo de los denominados medios
de cultivo secuenciales, que han sido diseñados para
satisfacer las necesidades nutricionales de los embriones
en sus distintas etapas de desarrollo (Lane et al., 2003;
Nedambale et al., 2006) o los medios de cultivo dinámicos
(Wheeler et al., 2007). No obstante, se necesita continuar
desarrollando estos medios de cultivo para aumentar su
eficiencia durante el cultivo de embriones bovinos.
Artículos Originales
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Artículos Originales
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