ReducciÃn-de-etanol-en-vinos

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Reducción de etanol en vinos 
 ¿Qué ocurre cuando la biotecnología interviene en la enología? 
 
Por Raúl Andrés Cuello1, 2 e Iván Francisco Ciklic2 
1Corporación Vitivinícola Argentina, Domingo Faustino Sarmiento 199, 5500 Mendoza (0261) 420-3877 
2INTA EEA-Mendoza, San Martín 3853 Luján de Cuyo-Mendoza, Argentina. 0054-261-4963020 (317) 
 
 
INTRODUCCIÓN 
LA BIOTECNOLOGÍA LLAMA A LA PUERTA 
uestro trabajo se desarrolla en el marco de lo que hemos denominado 
“biotecnología enológica”1. Este concepto lejos ser moderno o innovador 
encuentra correspondencia con la historia de la enología desde sus orígenes. Podría 
decirse que el vino es una de las empresas biotecnológicas más antiguas en la cual 
los humanos han estado involucrados por más de 7000 años [3]. Desde las primitivas y 
rudimentarias formas de vinificación en los primeros tiempos, pasando por los postulados de 
Louis Pasteur sobre la fermentación como un proceso realizado por levaduras en condiciones 
de anaerobiosis, y hasta la utilización de levaduras seleccionadas por sus características 
distintivas, se han presenciado cambios significativos en los resultados y en el conocimiento del 
producto final. En el caso particular del vino existe un gran potencial para la aplicación de las 
herramientas de la ingeniería genética y la ingeniería genética de levaduras es un buen 
ejemplo para ilustrarlo. Específicamente, hay que destacar que la levadura Saccharomyces cerevisiae 
es uno de los organismos mejor estudiados (e.g. fue el primer organismo eucariota secuenciado 
y se dispone de la secuencia completa de los 6.000 genes ya desde 1996) lo que lo ha 
convertido en uno de los organismos más importantes en Biotecnología. 
En primera instancia y antes de abordar el tema que da origen a este trabajo queremos echar 
luz sobre el concepto de ingeniería genética, sus ventajas y limitaciones 
 
¿Qué es la ingeniería genética? [4] 
Cuando hablamos de ingeniería genética, nos referimos al conjunto de técnicas derivadas del 
ADN recombinante. Es decir, aquellas técnicas que nos permiten la manipulación del ADN 
posibilitando la aislación de genes o fragmentos de genes que luego pueden ser insertados en 
un organismo determinado. La ingeniería genética se ha desarrollado enormemente, y en la 
actualidad existen un sinfín de aplicaciones como pueden ser, el desarrollo de nuevas vacunas, 
la obtención de moléculas mejoradas como la insulina recombinante, la creación de semillas 
transgénicas resistentes a plagas, la producción de proteínas a gran escala y a bajo costo 
mediante el uso de microorganismos transgénicos etc. De todas maneras aún existe una 
 
1“Wine Biotechnology”: Término que aparece en el reciente trabajo: At the cutting-edge of grape and wine 
biotechnology [1]Además se hace referencia sobre “Biotecnología enológica” en el resumen presentado al último 
XXXVII congreso de la OIV [2]. 
N 
limitación importante con respecto al uso de la ingeniería genética en la industria vitivinícola, 
ya que en ese ámbito aún subsiste una fuerte resistencia al uso de GMOs2 especialmente por 
parte de los países del viejo mundo. La percepción negativa del público general hacia los 
GMOs a menudo se debe a las consecuencias de una mala difusión, como así también a las 
fallas en la educación de los consumidores con respecto a los beneficios de los Organismos 
Genéticamente Modificados para el consumidor [5]. En la actualidad existe un movimiento 
impulsado por algunas empresas e institutos de investigación denominado “iniciativa 
intragénica” que pretende promover la aceptación de la utilización de GMOs mediante una 
estrategia que hace hincapié en la utilización de variabilidad genética intraespecie o proveniente 
de organismos cercanamente emparentados[6]. Algunos autores proponen resaltar los efectos 
benéficos de los productos derivados haciéndolos más atractivos para los consumidores y 
recalcando que no sólo el productor es el único beneficiado en la venta de estos productos[5]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
El calentamiento global y el aumento del contenido alcohólico de los vinos 
La cosecha de uvas en su punto óptimo de madurez fenólica, sumado a los condicionamientos 
que genera el cambio climático, han contribuido a la tendencia actual de obtener vinos con 
elevada concentración de etanol [7]. Esto genera complicaciones con el mercado de 
exportación considerando la creciente demanda de vinos más ligeros. Por otro lado cabe 
destacar que existe una fuerte campaña nacional que fomenta la idea de reducir el consumo de 
alcohol por razones de seguridad y saludhttp://www.msal.gov.ar/. Dentro de este marco 
contingente se ha intentado solucionar este problema mediante diversos enfoques. 
En dicho escenario aparece Saccharomyces cerevisiae como la principal levadura encargada de 
llevar a cabo la fermentación alcohólica en el vino y por lo tanto el principal objeto de estudio 
(o de aplicación) [8]. Si bien esta problemática puede ser abordada desde distintos enfoques 
como son la aplicación de prácticas alternativas de viticultura, o la implementación de métodos 
físicos de desalcoholización del vino, la utilización de estrategias microbiológicas es una 
alternativa muy atractiva por su fácil implementación y bajo costo[9]. En este contexto ya se 
han realizado varios trabajos con el objetivo de obtener cepas genéticamente modificadas para 
la producción de vinos con niveles reducidos de etanol. Revisando la bibliografía sobre el tema 
 
2 De las siglas en inglés“Organismos Genéticamente Modificados”. Se considera GMO a un organismo que ha 
sido modificado genéticamente mediante herramientas de ingeniería genética. 
http://www.msal.gov.ar/
se puede concluir que el recurso más explotado para obtener levaduras con una producción 
atenuada en etanol se ha llevado a cabo mediante la desviación de parte del flujo de carbono, 
desde la vía principal de etanol hacia vías metabólicas secundarias como la del glicerol [10]. Por 
ejemplo, se han logrado reducciones de etanol sobreexpresando los genes de la vía de glicerol 
GPD1 y/o GPD2, [11,12], o mediante la disminución de la expresión y actividad de la enzima 
alcohol deshidrogenasa Adh1p [13]. Aunque el aumento en la producción de glicerol permite 
reducir la de etanol, esto trae aparejado consigo un desequilibrio rédox en el interior de la 
célula. En estos casos, tal excedente es compensado mediante la sobreproducción de 
compuestos oxidados como ácido acético, acetoína, 2,3-butanodiol o succinato, de los cuales, 
principalmente el primero presenta un impacto negativo en las cualidades organolépticas del 
vino [8]. El redireccionamiento del metabolismo de glucosa hacia glicerol nos ha planteado el 
objetivo de construir una levadura mutante que disminuya la producción de etanol, cuyas 
cualidades no vayan en detrimento del correcto funcionamiento del metabolismo de S. cerevisiae 
y que además preserve la calidad del vino. 
 
ARMANDO EL ROMPECABEZAS 
¿Cómo se construyeron los mutantes? 
En nuestro laboratorio se diseñaron y realizaron una serie de mutaciones en regiones 
funcionales estratégicas del gen PDC2 de S. cerevisiae, el cual codifica para un factor de 
transcripción que regula la disponibilidad de la enzima piruvato decarboxilasa (PDC1) en la 
levadura. Para llevar esto a cabo, la hipótesis de trabajo que adoptamos propone que una 
variante mutante del factor de trascripción Pdc2ppuede ejercer un control positivo atenuado 
sobre PDC1 y PDC5, obteniéndose en consecuencia niveles de expresión reducidos de ambas 
enzimas con una caída en la actividad enzimática y eventualmente un redireccionamiento del 
flujo de carbono desde la vía principal del etanol, hacia la vía alternativa del glicerol. La 
transformación se realizó eliminando aproximadamente un tercio (Δ344) y dos tercios (Δ519) 
de la proteína,en cepas haploides (una copia del gen) y diploides (dos copias del gen). Luego 
de esto se corroboraron las mutaciones mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa). 
Contando ya con las levaduras mutantes se estudió su cinética de crecimiento. Posteriormente 
se llevaron a cabo tres fermentaciones a escala de laboratorio, en donde se compararon las 
cepas mutantes con sus respectivos controles donde se midió el porcentaje de etanol, acidez 
volátil y azúcares reductores. De todas las cepas, la que produjo menos etanol en todos los 
casos fueΔ519 (diploide) y fue también en todos los casos la cepa más ineficiente3. La 
diferencia de etanol que hubo entre esta cepa y su control en una de las fermentaciones fue de 
un 7%, lo que representa 1° alcohólico menos para un vino con un alcohol potencial de 15% 
v/v, siendo significativamente distinta. En el resto de las fermentaciones se mantuvo asimismo 
la tendencia de ser la cepa que menos alcohol produjo. Cabe destacar además que no hubo 
diferencias entre esta cepa y el resto con respecto a la producción de ácido acético. Esto fue un 
dato alentador ya que, se especulaba con que deleciones tan grandes sobre el gen PDC2 
podrían haber acarreado algún efecto negativo sobre el metabolismo. Los resultados positivos 
 
3 Se calcula la eficienciacomo los gramos de azúcar necesarios para producir un grado alcohólico. 
obtenidos en estas fermentaciones dieron pie a una cuarta, tomando como referencia la cepa 
diploide control y las cepas diploides Δ344 yΔ519. Esto se realizó por quintuplicado para darle 
mayor rigor estadístico a los resultados y se midieron los mismos parámetros que en las 
fermentaciones anteriores. Luego del análisis de los datos, Δ519nuevamente demostró ser 
significativamente la cepa con menor producción de etanol, reduciendo en un 7,4% el grado 
alcohólico, sin presentar diferencias en cuanto al consumo de azúcar, haciendo de esta cepa la 
menos eficiente de todas y donde la producción de ácido acético fue la más baja comparada 
con al resto. En cuanto a la producción de glicerol, no se verificaron diferencias entre las cepas 
controles y las mutantes. Actualmente se está evaluando realizar una quinta fermentación en la 
cual se puedan determinar otros subproductos como piruvato, succinato, acetoína y 2,3-
butanodiol además de glicerol, para poder definir hacia donde se está redirigiendo el 
metabolismo de la levadura. 
Paralelamente a esto se está trabajando con un fragmento de gen sintético con los residuos de 
interés mutados en el sitio de unión a ADN de PDC2. Ya se clonó el fragmento mutante 
completo (1086bp) en Escherichia coli y se tienen programados dos clonaciones más con las dos 
fracciones separadas del extremo C-terminal de PDC2, para clonarlas asimismo en E. coli. Una 
vez obtenidas estas clonaciones programadas se pasará a la siguiente etapa de transformación 
en la levadura ΔPDC2 (cepa que no posee el gen PDC2) para efectuar a continuación los 
ensayos con fermentaciones a escala de laboratorio. 
 
 
 
 
 
 
Composición del equipo de trabajo 
Desde el año 2009, mediante el programa de Recursos Humanos para la Radicación 
Investigadores en Áreas Tecnológicas Prioritarias (PRH-FONCyT) y con apoyo y el aval del 
INTA y de la Dra. Mariana Combina, se efectuó la incorporación del Dr. Iván Francisco 
Ciklic4 a la E.E.A. INTA Mendoza. A partir de ese año comenzó a gestarse el área de 
biotecnología enológica de microorganismos, con la implementación de la ingeniería genética 
de levaduras. En el año 2010 se termina de construir el edificio que albergará al Laboratorio de 
biotecnología. Luego de ese momento y con fondos de Agencia Nacional de Ciencia y Técnica, se 
comienza a equipar el laboratorio de biotecnología que cuenta con tecnología de punta para 
investigaciones referidas a la disciplina. El primer proyecto “Mejoramiento genético de cepas 
nativas de Saccharomyces cerevisiae para optimización de procesos enológicos y bio-etanol” se 
pone en marcha. En este periodo se inicia también la formación de recursos humanos 
mediante la incorporación de dos becarios para la realización de sus respectivas tesis de grado y 
postgrado: Karina Flores Montero, estudiante de Licenciatura en Biología de la Universidad 
 
4 Iván Ciklic recibió el título de Doctor rerumnaturalium, título impartido por la UniversitätOsnabrück de Alemania. 
Nacional de Cuyo; y Raúl Andrés Cuello, Licenciado en Enología y estudiante de la Maestría 
en Viticultura y Enología de la misma Universidad. 
 
Agradecimientos 
Queremos agradecer a la Corporación Vitivinícola Argentina, que mediante su programa de 
becas permite a jóvenes investigadores la continuidad de sus estudios de postgrado y el 
desarrollo de I+D a nivel local. Es menester recalcar el interés que ha prestado el 
Observatorio Vitivinícola Argentino por la divulgación de la ciencia. No es menos 
importante resaltar nuestro compromiso con la Estación Experimental Agropecuaria 
INTA Mendoza, que nos brinda todas las herramientas para el desarrollo de nuestra 
disciplina. Una mención especial también para el Centro de Estudios Enológicos y el 
Departamento de Microbiología Enológica a cargo de la Dra. Mariana Combina. 
 
BIBLIOGRAFÍA 
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