tesis_n5589_Rossi

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Tesis Doctoral
Estudio in vitro del potencial de la terapiaEstudio in vitro del potencial de la terapia
génica con IFN.beta como tratamiento paragénica con IFN.beta como tratamiento para
el melanoma. Efecto bystander, inhibición deel melanoma. Efecto bystander, inhibición de
la migración celular y potenciación conla migración celular y potenciación con
bortezomibbortezomib
Rossi, Úrsula Amaranta
2014
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Cita tipo APA:
Rossi, Úrsula Amaranta. (2014). Estudio in vitro del potencial de la terapia génica con IFN.beta
como tratamiento para el melanoma. Efecto bystander, inhibición de la migración celular y
potenciación con bortezomib. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de
Buenos Aires. http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5589_Rossi
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Rossi, Úrsula Amaranta. "Estudio in vitro del potencial de la terapia génica con IFN.beta como
tratamiento para el melanoma. Efecto bystander, inhibición de la migración celular y
potenciación con bortezomib". Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de
Buenos Aires. 2014. http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5589_Rossi
http://digital.bl.fcen.uba.ar
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http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5589_Rossi
http://hdl.handle.net/20.500.12110/tesis_n5589_Rossi
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UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES 
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales 
Estudio in vitro del potencial de la terapia génica con IFN-beta 
como tratamiento para el melanoma. Efecto bystander, inhibición 
de la migración celular y potenciación con bortezomib. 
Tesis presentada para optar al título de Doctor de la Universidad de Buenos Aires en 
el área Ciencias Biológicas 
Úrsula Amaranta Rossi 
Director de Tesis: Dr. Gerardo C. Glikin. 
Director Asistente: Dra. Liliana M.E. Finocchiaro. 
Consejero de Estudios: Dr. Gerardo C. Glikin. 
Lugar de trabajo: Unidad de transferencia Genética, Área Investigación, Instituto de 
Oncología “Ángel H. Roffo”, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires. 
Buenos Aires, 2013. 
Estudio in vitro del potencial de la terapia génica con IFN-beta como 
tratamiento para el melanoma. Efecto bystander, inhibición de la migración 
celular y potenciación con bortezomib. 
El melanoma es un cáncer maligno y altamente metastásico. Siendo el interferón-alfa 
humano recombinante (rhIFNα) un tratamiento aprobado para el melanoma, se propone la 
administración del gen del IFNα/β como estrategia alternativa para la terapia del melanoma. 
Esto permitiría una exposición sostenida a la proteína IFNα/β producida por las células tanto 
tumorales como no tumorales. 
Ensayamos la sensibilidad in vitro a la lipofección con el gen IFNβ de tres líneas celulares 
de melanoma cutáneo humano y cinco líneas de melanoma mucoso canino. El gen IFNβ 
produjo citotoxicidad tanto en cultivos de monocapas como de esferoides. Se comprobó la 
existencia de un efecto bystander en la lipofección con el gen IFNβ. Por otro lado, el gen 
IFNβ inhibió la migración celular en cultivos de monocapas y esferoides, a través de un 
mecanismo dependiente de especies reactivas del oxígeno (ROS), y redujo la adhesión 
celular al colágeno. 
La droga bortezomib aumentó la eficacia antitumoral del gen IFNβ, se observó un efecto 
de potenciación sobre la supervivencia celular, la supervivencia clonogénica, la apoptosis y 
la migración celular. La inhibición de la generación de ROS disminuyó la citotoxicidad 
inducida por el bortezomib, y suprimió el efecto de potenciación sobre la supervivencia 
celular del tratamiento combinado. 
Dado que la efectividad anti-tumoral del gen IFNβ no fue afectada por una baja eficiencia 
de lipofección, estos resultados fundamentan ampliamente el potencial clínico de este 
abordaje. 
Palabras clave: interferón-beta, terapia génica, melanoma, lipofección, bortezomib, 
migración celular, efecto bystander, especies reactivas del oxígeno, esferoides. 
In vitro study of the potential of interferon-beta gene therapy for treating 
melanoma. Bystander effect, inhibition of cell migration and enhancement with 
bortezomib. 
Melanomas are highly malignant and display a high metastatic potential. Recombinant 
human interferon-α (rhIFNα) has been approved for the treatment of malignant melanoma. 
Delivery of the gene encoding interferon (IFN) results in an alternative strategy for IFN-based 
therapy for melanoma, enabling sustained exposure to IFN protein produced by both tumor 
and non-tumor cells. 
We have analyzed the in vitro sensitivity to the IFNβ gene lipofection in three human 
cutaneous and five canine mucosal melanoma cells lines. The IFNβ transgene product 
induced cytotoxicity in cancer cells cultured as monolayers and spheroids. A bystander effect 
was seen in melanoma cancer cells when treated with IFNβ gene. In addition, we found that 
IFNβ gene inhibited cell migration in monolayer and spheroids cultures through a ROS-
dependent mechanism, and reduced cell adhesion to collagen. 
Bortezomib (BTZ) increased the antitumor efficacy of the IFNβ gene, clearly displaying 
potentiated effects on cell survival, clonogenic survival, apoptosis and cell migration. The 
inhibition of ROS production reduced the cytotoxicity induced by BTZ alone and suppressed 
the potentiation effect on cell survival induced by the combined treatment. 
As IFNβ gene was effective in a way not limited by low lipofection efficiency, these results 
strongly support the clinical potential of this approach. 
Key words: interferon-beta, gene therapy, melanoma, lipofection, bortezomib, cell migration, 
bystander effect, ROS, spheroids. 
 
 
ABREVIATURAS Y GLOSARIO 
 
βgal: β-galactosidasa 
BTZ: bortezomib. 
BTZ/IC50: dosis inhibitoria 50 del BTZ 
Cav-1: caveolina-1 
Ctrl: células control sin lipofectar 
CMV: promotor del Cito Megalo virus 
CAT: catalasa 
esf: esferoides 
esferoides βgal: esferoides formados a partir de células lipofectadas con βgal 
esferoides IFNβ: esferoides formados a partir de células lipofectadas con IFNβ 
FDA: Food and Drug Administration, USA 
GCV: ganciclovir 
Gm: intensidad media de fluorescencia 
GM-CSF: factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos 
HSVtk: timidina quinasa del virus herpes simplex 
IC50: concentración inhibitoria 50 
IL-2: interleuquina 2 
IFNs: interferones 
IFNβ: interferón-beta 
IFNα: interferón-alfa 
Lipofección: transferencia de ácidos nucleicos mediada por liposomas 
L-NAC: L-acetil-n-cisteína 
mcs: monocapas 
MC: medio condicionado 
MC βgal: medio condicionado de células lipofectadas con el gen β-galactosidasa 
MC IFNβ: medio condicionado de células lipofectadas con el gen interferón-beta 
MCR: resistencia multicelular 
MDR: resistencia a multi-drogra 
MEC: matriz extra-celular. 
MF: medio fresco 
MMP: metaloproteinasa de la matriz extra-celular 
MEMC: melanoma espontaneo mucoso canino 
MyM: Materiales y Métodos 
NFkB: factor nuclear kB 
NK: células natural killers (células nulas) 
ROS: especies reactivas del oxigeno 
SFB: suero fetal bovino 
A375, SB2, M8: líneas celulares de melanoma cutáneo humano. 
Ak, Bk, Br, Ch, Ol: líneas celulares de melanoma mucoso canino. 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
Al Instituto deOncología "Ángel H. Roffo", por brindarme la posibilidad de realizar mi Tesis 
Doctoral en sus instalaciones. 
 
A CONICET y FONCyT por la financiación. 
 
A los Dres. Gerardo Glikin y Liliana Finocchiaro por darme un lugar en su grupo de trabajo. 
A Lili por su comprensión y creatividad, a Gerardo por su dirección. 
 
A Doris Riveros, por enseñarme y asesorarme durante toda mi tesis doctoral. Por sus 
discusiones científicas y culturales. Por su amistad. 
 
A Lourdes Gil Cardeza y Marcela Villaverde por compartir sus conocimientos conmigo, por 
ser mis compañeras de laboratorio durante la mayor parte de mi tesis. A Lour por sus 
discusiones científicas; y a Marce por enseñarme a priorizar la buena convivencia. 
 
A Chiara Fondello por renovar la energía en la UTG, y por su alegre compañía durante estos 
últimos dos años. 
 
A Norberto Judewicz, por su asesoramiento en la clonación del plásmido psCMV-IFNβsf. 
 
A toda la gente del Área Investigación que me ayudo en más de una ocasión. 
 
A Elisa Bal por ser la directora del Área Investigación, y brindarme su ayuda y consejo. 
 
A Hebe Durán y Candelaria Bracalente por brindarme los clones de A375 A7, C10 y G10. 
 
A Graciela Zenobi, por facilitar enormemente mi trabajo; a Ana Varela y Gabriela Varela por 
preparar el material. Por su compañía y apoyo. 
 
A mis amigas de la facu, Celina Bonneto y Julieta Mallerman por sus conversaciones, 
consejos y apoyo. 
 
A mi pareja por apoyarme durante todo mi doctorado, y por crecer conmigo. 
 
A mi familia. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A mis educadores, formales y no formales. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 
INTRODUCCIÓN 
Melanoma ............................................................................................................................................ 1 
Melanoma mucoso canino ….………………………........................................................................... 2 
Terapia génica del cáncer …………………................................................................................... 2 
Estrategias para la terapia génica del cáncer ..................................................................................... 3 
Vectores y sistemas de transferencia genética ……………..……………………………………………… 5 
Los liposomas catiónicos son vehículos eficientes, sencillos y seguros …………………………… 6 
La motilidad celular y la invasión como blancos para la terapia del cáncer ………..…………….. 6 
Interferones en el tratamiento del cáncer ………………..………………………………………………. 7 
Interferones …………………………………………………………………………………………………...… 7 
Efecto anti-tumoral del IFNβ en distintos modelos experimentales y tipos de cáncer …………….….... 7 
La administración de IFNα está aprobada por la FDA para el tratamiento del cáncer …………………. 8 
Terapia génica con el gen IFNα/β ………………………………………………….………………………… 9 
Efecto bystander en la terapia génica con IFNα/β ………..…………………………………...…………… 9 
Bioquimioterapia ……………………………………………………………………………………….…. 10 
El bortezomib es un inhibidor del proteosoma aprobado para 
el tratamiento del mieloma múltiple …………….………………………………………………….……….. 11 
Mecanismos de acción del BTZ ……………………………………………………………….………. 11 
Tratamiento combinado con BTZ y otros agentes antineoplásicos ……….…………………………….. 12 
Las especies reactivas del oxígeno en el tratamiento del cáncer …………………………………. 13 
La terapia génica con IFNβ aumenta los niveles intracelulares de ROS……………………………….. 14 
La sobreproducción de ROS es un paso crítico en la inducción de la apoptosis por BTZ …………… 14 
Modelos tumorales ………………………………………………………………………………..………… 14 
Tumorigenicidad diferencial entre las líneas de melanoma humano A375 y SB2 …………………….. 14 
Líneas de melanoma mucoso canino como herramienta de investigación 
en la oncología comparada ………………………………………………………………………………….. 15 
Esferoides como modelo tumoral in vitro …………………………………………………….…………….. 15 
La resistencia multicelular es un fenómeno exclusivo de las estructuras tridimensionales …...... 16 
Diferencias en la adhesión celular entre esferoides y en monocapas …………………………….. 17 
 
OBJETIVOS ……………………………………………………………………………................................ 18 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
Líneas celulares ................................................................................................................................... 19 
Establecimiento de las líneas Ch y Ol ……………………………………………………………………… 19 
Cultivos ................................................................................................................................................ 19 
Plásmidos ……………………………………………………………………………………………………… 19 
Lipofecciones ………………………………………………………………………………………………….. 20 
Tinción con la enzima β-galactosidasa …………………………………………………………………….. 21 
Viabilidad Celular: permeabilidad (azul tripán) ……………………………………………………………. 21 
Viabilidad Celular: metabolismo (APH) …………………………………………………………….………. 21 
 
 
Efecto de las lipofecciones sobre la viabilidad celular ……………………………………………………. 21 
Efecto del agregado exógeno de proteína interferón-α/β (rhIFNα/β) sobre la viabilidad celular ….…. 21 
Efecto del medio condicionado (MC) sobre la viabilidad ……………………………………………….... 22 
Efecto del tratamiento combinado con IFNβ y BTZ sobre la viabilidad celular …………………...…… 22 
Ensayo de efecto bystander ……………………………………………………………………………….. 22 
Análisis del ciclo celular y apoptosis por citometría de flujo …………………………………………….. 22 
Determinación de especies reactivas del oxígeno (ROS) intracelulares ………………………..……… 23 
Determinación de anión superóxido …………………………………….………………………………….. 23 
Migración celular en monocapas (ensayo de cierre de la herida) ………………………………………. 24 
Efecto del MC sobre la migración celular en monocapas de Ol ………………………………………… 24 
Tinción con faloidina ………………………………………………………………………………………… 24 
Migración celular desde esferoides ………………………………………………………………………... 25 
Calceína-AM …………………………………………………………………………………………………... 25 
Ensayo de adhesión celular in vitro …………………………………………………………..…………….. 25 
Zimografía en gelatina ………………………………………………………………………………………. 25 
Tinción con Hematoxilina y Eosina ………………………………………………………………………… 26 
Determinación del efecto de lipofección sobre la dosis inhibitoria 50 (IC50) del bortezomib ……….… 26 
Ensayo de supervivencia clonogénica ……………………………………………...……………………… 26 
Estadística ……………………………………………………………………………………….……………. 26 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 
Parte I 
El gen IFNβ provocó citotoxicidad en monocapas de líneas celulares 
de melanoma humanas y caninas ………………………………………………………………………… 27 
La lipofección con el gen IFNβ provocó una citotoxicidad similar o mayor 
que la incubación con 10.000 UI de rhIFNβ ……………………………………………………………….. 27 
El gen IFNβ provocó una disminución en la viabilidad de esferoides …………………………………... 29 
La respuesta de los esferoides al gen IFNβ es independiente del número inicial de células ……...… 31 
Se observó efecto bystander en la lipofección con el gen IFNβ ………………………………………… 32 
El efecto bystander depende del contacto físico entre células en Ch …………………………….……. 34 
El medio condicionado de células lipofectadas con el gen IFNβ resultó citotóxico 
en las líneas caninas pero no en las humanas ….………………………………………………………. 34 
El MC IFNβ produjo citotoxicidad aun al ser diluido ……………………………………………………… 37 
El MC IFNβ de la línea celular resistente Ol resultó citotóxico sobre la línea celular Ch …………….. 37 
El factor citotóxico presente en el MC IFNβ mostró termo-labilidad …………………...…………….…. 38 
No se comprobó la existencia de un factor citotóxico en el MC IFNβ de las líneas humanas ………. 39 
Las monocapas produjeron concentraciones citotóxicas de la proteína IFNβ 
especie no-especifico 24 h después de la lipofección ………………….……………………………….. 40 
La expresión de IFNβ intracelular provocó citotoxicidad en SB2 y M8 pero no en A375 …………….. 41 
El gen IFNβsf también resultó citotóxico cuando las células fueron cultivadas comoesferoides ....... 43 
 
 
 
El gen IFNβ provocó un aumento de la fracción apoptótica en A375 pero no produjo 
cambios en el patrón de ciclo celular en SB2 ni en las líneas caninas ………………………………... 44 
El gen IFNβ indujo cambios en el estado oxidativo celular ……………………………………………… 45 
Clones de A375 que sobre-expresan el gen de la catalasa son más sensibles a los efectos 
citotóxicos del gen IFNβ y del gen IFNβsf que la línea parental A375 …………………………………. 47 
Parte II 
La lipofección con el gen IFNβ provocó una disminución en la migración sobre plástico 
de células de melanoma creciendo en monocapas ……………….…………………………………… 49 
El MC IFNβ provocó una disminución de la migración de células cultivadas en monocapas …..…… 50 
La proteína IFNβ provocó una disminución de la migración en SB2, 
pero no se observó efecto con la proteína IFNα …………………………………………………………. 51 
El gen IFNβ inhibió la migración sobre un recubrimiento gelatina 
de células cultivadas en esferoides ………………………………………………………………………... 52 
El gen IFNβ inhibió parcialmente la adhesión celular a componentes de la matriz extracelular …….. 55 
La lipofección con el gen IFNβ no modificó la actividad metaloproteinasa-9 
en el medio condicionado …………………………………………………………………………………… 55 
El efecto modulador de la migración producido por el gen IFNβ es inhibido por la catalasa ………… 57 
Parte III 
La lipofección con el gen IFNβ produjo una disminución de la concentración 
inhibitoria 50 del agente antineoplásico bortezomib …………………………………………………….... 61 
La exposición a una concentración sub-farmacológica de BTZ (5 nM) potenció 
el efecto citotóxico del gen IFNβ en monocapas y esferoides ……………………………..…………… 62 
Efecto de potenciación entre el gen IFNβ y el BTZ en la disminución de células 
con capacidad clonogénica ………………………………………………………………………………… 63 
El tratamiento combinado con el gen IFNβ y BTZ (5nM) indujo apoptosis 
en monocapas de A375 y SB2 …………………………………………………………………………….. 66 
La combinación con el gen IFNβ y BTZ (5nM) produjo aumento de ROS intracelular 
mayor al producido por los tratamientos individuales en SB2 y Ol ……………………………………… 66 
El antioxidante N-acetil-L-cisteína inhibió el efecto de potenciación 
en la viabilidad celular del tratamiento combinado ………………………………………………………. 68 
El BTZ potenció el efecto inhibitorio del gen IFNβ sobre la migración 
de células de Ol creciendo en monocapas …………………………………………………………...…… 69 
 
CONCLUSIONES ………………………………………………………………………............................... 71 
 
DISCUSIÓN GENERAL ………………………..……..………………………………………………...…… 73 
 
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………...........................................................… 77 
 
 
INTRODUCCIÓN
1 
 
Melanoma 
 
El melanoma maligno es un cáncer de piel de estirpe melanocítica. Generalmente se 
encuentra localizado en la piel (melanoma cutáneo), pero también puede generarse en la 
úvea del ojo (melanoma uveal) o las mucosas (nasal, oral, genital, etc). Es un tumor 
altamente invasivo y metastásico. 
Hay dos posibles vías etiológicas para el desarrollo del melanoma. En la más común, se 
considera que el melanoma se desarrolla a partir de un nevo común (lunar normal) que 
progresa lentamente a un melanoma in situ, en el cuál las células cancerosas se encuentran 
sólo en la epidermis. Luego de esta fase de crecimiento radial, puede pasar a una fase de 
crecimiento vertical con una alta capacidad metastásica. En la otra vía, los melanomas 
surgen rápidamente y sin la participación de lesiones melanocíticas previas. La radiación 
ultravioleta (UV) es un factor de riesgo establecido para el melanoma, con una magnitud de 
riesgo dependiente de los patrones de exposición solar (intermitente o acumulativa), 
frecuencia de exposición excesiva y susceptibilidad heredada a sus efectos. [Erdei E. y 
Torres S., 2010]. 
El melanoma es uno de los cánceres más frecuente en adultos jóvenes. Según 
estimaciones de la American Cancer Society se esperaban alrededor de 76.690 casos 
nuevos y 9.480 muertes por melanoma en USA en el 2013 [http://www.cancer.org/ 
cancer/skincancer-melanoma]. Según el Consenso Nacional Inter-sociedades sobre 
Melanoma Cutáneo (2001) se observó un promedio de 2.471 muertes/año (con una tasa de 
mortalidad de 1,3 defunciones /100.000 personas) en Argentina para el periodo 2000-2004 
[Asociación Médica Argentina et al, 2011]. Linos et al. (2009) reportaron que la incidencia del 
melanoma se incrementa un 3,1 % por año en USA, y se estima un incremento similar en 
Argentina. 
El pronóstico para los pacientes con melanoma depende de la etapa de la enfermedad, 
caracterizada por el tamaño del tumor, la ulceración, y la presencia de metástasis. Según el 
sistema de estadificación del cáncer del American Joint Committee, el melanoma cutáneo en 
estadio I está caracterizado por tumores de menos de 1 mm de espesor localizados en la 
piel; los melanomas en estadio II son mayores a 1 mm de espesor, pueden tener ulceración, 
pero aún están localizados en la piel; en el estadio III, el tumor está diseminado en los 
ganglios linfáticos cercanos pero todavía no es detectado en sitios distantes. En el estadio 
IV, el tumor está diseminado más allá del área original de la piel y los ganglios linfáticos 
cercanos, en otros órganos o en áreas distantes de la piel o ganglios linfáticos. La tasa de 
supervivencia de cinco años para los estadios I, II, III y IV se estima en 92, 68, 45, y 11 %, 
respectivamente [Balch C. et al, 2004]. 
El tratamiento primario del melanoma es la cirugía con márgenes de resección definidos 
de acuerdo al espesor del tumor. Dado que el melanoma es uno de los tumores sólidos más 
refractarios a las terapias clínicas, el diagnóstico temprano y la remoción quirúrgica del 
tumor primario es la única práctica curativa contra el melanoma. En pacientes con 
metástasis aisladas y resecables en distintos órganos, la cirugía también es la mejor opción 
terapéutica. El interferón-alfa (IFNα) es la única droga aprobada como tratamiento 
adyuvante; si bien no hay dudas sobre el impacto favorable en cuanto a sobrevida libre de 
recaída, el impacto en la sobrevida global sigue siendo controvertido, y las toxicidades 
comunes asociadas con el IFNα, como fiebre, mialgias, deterioro psico-cognitivos y eventos 
autoinmunes, afectan negativamente la calidad de vida de los pacientes [Bhatia S. et al, 
2009]. Por otro lado, la Interleuquina-2 (IL-2) y la dacarbazina son las únicas drogas 
aprobadas por la Food and Drug Administration (FDA, USA) para el tratamiento del 
2 
 
melanoma avanzado (estadio IV), pero las tasas de respuesta son bajas, de alrededor del 
15% [Serrone L. et al, 2000]. 
La alta tasa de mortalidad asociada con el melanoma metastásico y la falta de un 
tratamiento eficaz realzan la necesidad de comprender los mecanismos que promueven la 
progresión del melanoma, y de optimizar las estrategias utilizadas para combatirlo. 
 
Melanoma mucoso canino 
En perros, los melanomas representan el 4-7% de todos los tumores, y el 9-20% de todos 
los tumores de piel. La incidencia más alta se encuentra en los perros de edades 
comprendidas entre 7 y 14 años. La incidencia es mayor en los perros con piel pigmentada, 
y en los machos. Los tumores generalmente se encuentran en la mucosa bucal, la piel o en 
la zona digital. Los melanomas espontáneos mucosos caninos (MEMC) tienen un pronóstico 
desfavorable. Incluso cuando la resección quirúrgica es temprana, se producen recidivas, 
metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis en órganos distantes. La cirugía es el 
método principal de tratamiento de perros con melanoma [Baba A. y Câtoi C.; 2007] 
A diferencia del melanoma humano, el canino no se encuentra asociado a la exposición 
solar. Sin embargo, los melanomas orales se asemejan al humano en su biología y 
respuesta a los tratamientos. Al igual que en humanos, el melanoma mucoso canino es 
refractario a la quimioterapia y radioterapia[Vail D. et al, 2000; Porrello A. et al, 2006]. 
El desarrollo e investigación de nuevos tratamientos para el MEMC, además de proveer 
una nueva opción de tratamiento para dicha enfermedad, permite reducir costos y tiempo 
para la transferencia del tratamiento a pacientes humanos. Un protocolo clínico para definir 
la seguridad y efectividad de un tratamiento en pacientes caninos, requiere entre 1 y 3 años; 
mientras que en pacientes humanos requiere entre 5 y 15 años. 
Recientemente, varias terapias para el melanoma fueron estudiadas en este modelo de 
investigación. Entre ellas se encuentran: plásmidos que codifican genes de citoquinas y 
tirosinasa [Dow S. et al, 1998; Bergman P. et al, 2003]; una vacuna tumoral alogénica 
[Alexander A. et al, 2006]; y una vacuna estimulada por citoquinas y terapia génica con gen 
suicida como tratamientos adyuvantes de cirugía [Finocchiaro L. y Glikin G., 2008]. 
 
 
 
Terapia génica del cáncer 
 
La terapia génica involucra la transferencia de material genético (ADN, ARN, siARN, 
oligonucleótidos antisentido) a células somáticas de pacientes para corregir una disfunción 
celular o proveer nuevas funciones a las células, con el propósito de curar o frenar la 
progresión de una enfermedad [Pfeifer A. y Verma I., 2001]. Para ello es necesario superar 
las barreras biológicas y lograr la entrada del DNA dentro de las células de interés y la 
expresión del/los genes dentro de las mismas. 
Las células tumorales evidencian mutaciones en genes relacionados con el control del 
crecimiento y la apoptosis, y poseen alteraciones funcionales que facilitan su capacidad de 
invadir y hacer metástasis. La interacción de las células tumorales con su microambiente, 
que incluye matriz extracelular, células del sistema inmune y células necesarias para la 
inducción de angiogénesis, es un componente crítico del crecimiento tumoral. Entonces, 
existen muchos blancos potenciales en los que la introducción de nuevos genes y la 
inactivación de genes activos o defectuosos pueden limitar o eliminar el crecimiento del 
tumor. A medida que aumenta la comprensión de la biología tumoral y de las interacciones 
tumor-hospedador, el número de blancos posibles se incrementa. Sin embargo, algunos de 
3 
 
estos blancos no son inactivados tan fácilmente como lo predice la teoría, y la aplicación de 
una terapia génica completamente segura y eficiente es una tarea muy compleja. 
En la terapia génica del cáncer hay tres desafíos principales. El primero es el diseño de 
estrategias para eliminar o frenar el crecimiento de las células tumorales. El segundo es el 
desarrollo de vectores y sistemas de transferencia genética que sean seguros, eficientes y, 
en la medida de lo posible, direccionados. El tercer desafío es la traducción de estudios 
preclínicos a protocolos clínicos y ensayos para evaluar la seguridad y eficacia de la terapia 
[Gottesman et al, 2003]. La transferencia eficiente de los genes terapéuticos in vivo es un 
paso fundamental, que sigue siendo una de las principales barreras para el éxito de este 
abordaje [Barar J. y Omidi Y., 2012]. 
La mayor parte (más del 60%) de los ensayos clínicos de terapia génica han sido 
dirigidos al cáncer (Fig. 1). Según la base de datos de protocolos clínicos de The Journal of 
Gene Medicine (2012), los cánceres más frecuentemente tratados en los protocolos clínicos 
de terapia génica son el melanoma, el cáncer de próstata, el cáncer de pulmón y el cáncer 
de mama [Strauss B. et al, 2013]. 
 
 
 
Figura 1. Indicación de los protocolos clínicos de Terapia Génica. Adaptado de The Journal of 
Gene Medicine (Julio 2013). Total: 1970 protocolos. [http://www.abedia.com/wiley/indications.php] 
 
 
Estrategias para la terapia génica del cáncer 
El cáncer es un proceso que comprende varias alteraciones moleculares tales como la 
pérdida de genes supresores de tumores y la ganancia de oncogenes dominantes en las 
células malignas; el incremento de la angiogénesis en el ambiente tumoral, y defectos 
inmunológicos adicionales que conducen a la incapacidad del sistema inmune para destruir 
células tumorales. Este conocimiento sobre la biología tumoral contribuyó en gran medida a 
la elaboración de los distintos enfoques de la terapia génica del cáncer [Seth P. et al, 2005], 
algunos de los enfoques que se estudian actualmente son: 
 La transferencia de genes supresores tumorales en células que hayan perdido o no su 
expresión endógena, con el fin de inducir apoptosis o arresto del ciclo celular. Aparte, 
algunos supresores tumorales provocan efectos antitumorales adicionales como la 
inhibición de la angiogénesis y la invasión tumoral. Algunos ejemplos son la introducción 
del gen de p53 o del gen de retinoblastoma (pRB). [Tazawa H. et al, 2013] 
Cáncer 64,2%
Monogénica 8,9%
Infecciosa 8,2%
Cardiovascular 8,1%
Neurológica 1,9%
Ocular 1,4%
Inflamatoria 0,7%
Otros 1,4%
Marcación génica 2,5%
Voluntarios sanos 2,6%
Enfermedades tratadas en protocolos clínicos de terapia génica
4 
 
Interferon tipo I
HSV-Tk
TCR
HLA-B7
GM-CSF
Antigeno asociado 
a melanoma
Interleuquinas
T
ip
o
 d
e
 g
e
n
Protocolos Clínicos (%)
 La introducción de genes suicidas que codifican enzimas que convierten pro-drogas no 
tóxicas en drogas citotóxicas activas. Por ejemplo la transferencia del gen de la timidina 
quinasa del herpes simple (HSVtk) que fosforila a la pro-droga ganciclovir convirtiéndolo 
en la droga citotóxica ganciclovir fosforilado. Una ventaja de este enfoque es el efecto 
bystander de los productos tóxicos, que matan también a las células adyacentes que no 
fueron transfectadas [Duarte S. et al, 2012]. 
 La introducción de genes cuya expresión produzca la inhibición de oncogenes 
dominantes. Por ejemplo, genes que codifiquen para siARNs, oligonucleótidos antisentido 
o ribozimas dirigidos contra los oncogenes K-ras o her-2/neu [Lisiansky V., 2012]. 
 La introducción de genes inmuno-moduladores con la finalidad de generar una respuesta 
inmune eficiente contra las células tumorales. Esta estrategia puede estar dirigida a 
activar el sistema inmune del huésped o alterar el microambiente inmunológico tumoral. 
Por ejemplo, la introducción de gen de la IL-12, GM-CSF o genes que codifiquen para 
moléculas co-estimulatorias de linfocitos T [Choi K. et al, 2012]. 
 La introducción de genes que afecten la angiogénesis, la invasión tumoral y la metástasis 
como el gen del inhibidor de metaloproteasas TIMP-1, o siRNA contra VEGF [Zhang Y. et 
al, 2013]. 
 La introducción de genes que aumenten la sensibilidad de las células tumorales a la 
quimioterapia o radioterapia, por ejemplo la terapia génica anti-VEGF aumenta la 
sensibilidad al paclitaxel [Sopo M. et al, 2012]. 
 La utilización de virus modificados genéticamente para que se repliquen solamente en 
células tumorales, conocidos como virus oncolíticos de replicación condicionada. 
Adicionalmente, se pueden introducir otros genes terapéuticos en el genoma del virus. 
 
La estrategia más utilizada en melanoma es la introducción de genes inmuno-
moduladores, sólo uno de los genes más frecuentemente utilizados (HSVtk) no corresponde 
a esta categoría (Fig. 2). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2: Tipo de genes transferidos en protocolos clínicos de Terapia Génica en Melanoma 
TCR: receptores de linfocitos T; HLA-B7: Antígenos leucocitarios humanos B7; GM-CSF: factor 
estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos. Datos tomados de la base de datos de 
protocolos clínicos de The Journal of Gene Medicine (2012) [Strauss B. et al, 2013]. 
5 
 
Vectores y sistemas de transferencia genética 
La búsqueda de formas de introducir genes en células tumorales dio lugar a muchos 
avances en el desarrollo de vectores virales y no virales. 
Varios virus que infectan humanos, especialmente retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociados, han sido modificados para generar vectores de expresión eficientes, que pueden 
integrarse al ADN genómico o bien persistir como elementos extra-cromosómicos. La 
principal ventaja de los vectores virales es su capacidad para infectar un alto porcentaje de 
las células blanco en relación a otros vectores. Unos de los principales problemas que 
limitan su aplicación es que estos vectores son inmunogénicos. La respuesta inmunológica a 
de estos vectores puede causar una menor efectividad en aplicaciones repetidas; así como 
también efectos nocivos en los pacientes [Seth P., 2005]. Los vectores virales fueron los 
más frecuentemente utilizados en protocolos clínicos de terapia génica (Fig. 3). 
Los genes también pueden ser introducidos a los núcleos celulares mediante vectores no 
virales. El método más sencillo es la administración directa de vectores plasmídicos para la 
expresión del gen terapéutico de interés bajo un promotor eucariota. Dado que la eficiencia 
de transfección de este método es muy baja, se desarrollaron metodologías fisicoquímicas 
que aumentan la entrada de los vectores plasmídicos a las células. Una de las metodologías 
más utilizada es la que involucra liposomas. Dado que el ADN plasmídico está cargado 
negativamente, puede formar complejos con liposomas catiónicos. Otra de las metodologías 
es la transferencia genética mediada por partículas, en la cual se recubren partículas 
metálicas con el ADN a transferir, y estas partículas son introducidas en los tejidos mediante 
un "cañón génico" (gene gun). Estos vectores son más seguros que los virales, y no 
desencadenan una respuesta inmune importante, pero poseen una eficiencia de 
transfección más baja que los vectores virales. [Seth P., 2005]. 
En general, la eficacia de transfección in vivo de la mayoría de los vectores es demasiado 
baja para ser efectiva en la terapia génica del cáncer. Las estrategias que inducen un efecto 
bystander o que utilizan vectores virales con capacidad de replicarse (virus oncolíticos) 
pueden superar este problema; y por lo tanto, la investigación en este área es 
potencialmente valiosa. 
 
 
 
 
Figura 3: Vectores utilizados en protocolos clínicos de terapia génica. Adaptado de The Journal 
of Gene Medicine (Julio 2013). Total: 1970 protocolos. [http://www.abedia.com/wiley/vectors.php] 
Vectores utilizados en protocolos clínicos de terapia génica 
Adenovirus 23,5%
Retrovirus 19,1%
ADN plasmidico/desnudo 17,7%
Vaccinia virus 7,8%
Lipofección 5,5%
Virus adeno-asociados 5,2%
Poxvirus 4,8%
Lentivirus 3,3%
Virus herpes simplex 3,1%
Otras categorias 6,8%
Desconocido 3,2%
6 
 
 
Los liposomas catiónicos son vehículos eficientes, sencillos y seguros 
Los lípidos catiónicos se asocian espontáneamente con el ADN plasmídico por 
interacción de cargas para formar estructuras llamadas lipoplexes, en las que el ADN está 
protegido de la degradación. Estos complejos tienen alta afinidad por las membranas 
celulares, cargadas negativamente, debido a un exceso de cargas positivas. La endocitosis 
de estos compuestos seguida de la ruptura de la membrana del endosoma parece ser el 
principal mecanismo de la transferencia genética. 
Los liposomas catiónicos generalmente contienen un lípido catiónico y un lípido neutro 
(co-lípido), que brinda estabilidad a los liposomas. La razón por la cual existe tan amplia 
diversidad en las formulaciones es que la eficiencia de estos vehículos varía mucho in vitro e 
in vivo, según los tipos celulares y los tejidos apuntados, y según la vía de administración, 
por lo tanto es crucial la elección del lípido adecuado para cada experimento o tratamiento. 
El grupo polar catiónico es crítico para la toxicidad y la eficiencia de transfección de estos 
lípidos. [Gao X. et al, 1995] 
Aunque estos vectores comenzaron con bajas eficiencias de transferencia y expresión, 
han mejorado sensiblemente en los últimos años. Son químicamente definidos, pueden ser 
preparados en grandes cantidades y su control de calidad resulta sencillo, y por lo tanto 
económico. Otra ventaja de este sistema sobre otros métodos es la amplia variedad de 
células huésped, su limitada toxicidad en animales o humanos, su fácil uso y un mejor 
estándar de bioseguridad que los vectores virales. Pueden ser administrados en forma 
intravenosa y pueden transferir genes a numerosos tipos de tejido [Mountain A. et al, 2000]. 
 
 
 
La motilidad celular y la invasión como blancos para la terapia del cáncer 
 
La mayoría de las muertes por cáncer no se debe las neoplasias primarias, sino a las 
metástasis. La metástasis es un proceso que implica una serie de pasos relacionados. 
Algunos de dichos pasos son: perdida de la adhesión intercelular, la proteólisis de la matriz 
extracelular (MEC), la migración invasiva a través de la membrana basal, la intravasación a 
los vasos sanguíneos o linfáticos, la supervivencia en el torrente sanguíneo, la 
extravasación, y la invasión y proliferación en un nuevo órgano. 
Durante la metamorfosis de una célula normal a una célula tumoral con potencial invasivo 
se producen cambios fenotípicos y bioquímicos drásticos. Estas alteraciones involucran la 
señalización de factores de crecimiento, la adhesión intercelular, la expresión genética, la 
motilidad y la morfología celular. Las células de la inmunidad innata y adaptativa, las células 
del estroma, así como las quimoquinas y sus receptores también desempeñan un papel vital 
en la propagación de las células cancerosas. Además, el micro-ambiente tumoral, la 
vascularización y el suministro de citoquinas especiales afectan los cambios anteriormente 
mencionados [Leber M. y Efferth T., 2009]. 
La capacidad invasiva es el rasgo más importante que distingue a las lesiones benignas 
de las malignas. Durante la intravasación y la extravasación, y durante el establecimiento de 
colonias tumorales en los sitios secundarios, las células tumorales deben moverse a través 
de los límites de los tejidos, por los que la mayoría de las células normales no pueden pasar. 
Mecanismos similares son también utilizados por las células endoteliales activadas durante 
la angiogénesis que permite tanto el crecimiento sostenido como la difusión de los tumores. 
En la actualidad se reconoce que estos procesos, la motilidad celular y la invasión, podrían 
proporcionar una gran fuente de blancos para la terapia del cáncer, y que los inhibidores 
7 
 
apropiados podrían restringir tanto la metástasis como la neo-angiogénesis [Eccles S. et al, 
2005]. 
Existen numerosos métodos in vitro que imitan los pasos individuales de la metástasis, 
estos se utilizan para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la invasión 
tumoral y la metástasis, así como para la evaluación del potencial anti-metastásico de 
nuevas estrategias para el tratamiento del cáncer. Algunos de estos métodos permiten 
evaluar la adhesión intercelular, la adhesión celular a componentes de la MEC, la proteólisis 
de la MEC, la migración celular y la invasión a través de proteínas de la MEC. 
 
 
 
Interferones en el tratamiento del cáncer 
 
Interferones 
Los interferones (IFNs) son glicoproteínas producidas por el sistema inmune como 
respuesta a agentes patógenos, poseen actividad antiviral, citostática e inmunomoduladora. 
Modifican tanto la respuesta innata como adaptativa [Gerlach et al, 2006]. Los IFNs se 
dividen en dos grandes subgrupos, según su capacidad de unirse a un tipo de receptor 
común. Los IFNs de tipo I se unen al receptor de IFN tipo I, este subgrupo incluye al IFN-α, 
β, ω y τ; mientras que IFNγ es el único de tipo II y se une al receptor de IFN tipo II. 
Recientemente, se identificó un nuevo subgrupo compuesto por el IFNλ (IFN tipo III) que 
posee una estructura similar al IFNγ pero funcionalmente es muy similar a los IFNs de tipo I, 
y se une al receptor de IFN tipo III [Donnelly R y Kotenko S., 2010]. 
Mientrasque el IFNγ es una citoquina pro-inflamatoria producida por las células T y las 
células NK, los IFNs tipo I pueden ser producidos por prácticamente todas las células y se 
consideran, en la mayoría de los casos, citoquinas anti-inflamatorias [Borden E. et al, 2007]. 
En consecuencia, el IFNγ está implicado en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria 
esclerosis múltiple, mientras que la administración de proteína IFNβ es uno de las 
principales tratamientos que se utiliza para dicha enfermedad [Codarri L. et al, 2010]. 
Los IFNs poseen un amplio espectro de acción: actividad antiviral, impacto sobre el 
metabolismo celular y la diferenciación, y también actividad antitumoral. Los efectos 
antitumorales parecen deberse a una combinación de efectos anti-proliferativos tanto de 
manera directa, como indirecta por medio de la inmuno-modulación y la inhibición de la 
angiogénesis. [Jonasch E. y Haluska F., 2001] 
La actividad biológica del IFN tipo I incluye inhibición de la proliferación celular, inducción 
de apoptosis, activación de los linfocitos NK y aumento de la expresión del complejo mayor 
de histocompatibilidad (MHC) clase I. 
En las últimas décadas, se evaluaron los distintos tipos de IFN como terapia en un gran 
número de enfermedades malignas y no malignas. Las principales indicaciones oncológicas 
para el IFN incluyen melanoma, carcinoma de células renales, sarcoma de Kaposi 
relacionado con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), linfoma folicular, 
leucemia de células pilosas y leucemia mieloide crónica. Si bien diversas terapias con IFN 
resultaron efectivas, producen una toxicidad significativa con un gran impacto en la calidad 
de vida del paciente [Jonasch E. y Haluska F., 2001]. 
 
Efecto anti-tumoral del IFNβ en distintos modelos experimentales y tipos de cáncer 
Las respuestas anti-proliferativas y pro-apoptóticas a las diferentes especies de IFNs 
varían considerablemente entre las diferentes líneas celulares de cáncer; en general el 
IFNβ es más potente que el IFNα y que el IFNγ. Por otra parte, el IFNγ puede tener efectos 
8 
 
pro-tumorigénicos en algunos casos [Ambjørn M. et al, 2013]. El IFNβ indujo cito-toxicidad 
en células tumorales de distintito tipo, algunos ejemplos son células de carcinoma de colon 
[Juang S. et al, 2004], de cáncer de páncreas [Vitale G. et al, 2012], de cáncer de mama 
[Ambjørn M. et al, 2013] y de cáncer de endometrio [Yi B. et al, 2011]. 
La proteína IFNβ también produjo marcados efectos anti-tumorales en distintos modelos 
murinos. El tratamiento con IFNβ resultó más potente que el tratamiento con IFNα en la 
inhibición del crecimiento tumoral en un modelo murino de melanoma xenogeneico [Johns T. 
et al, 1992]. Ogasawara S. et al. (2007) reportaron que el IFNβ reduce el tamaño tumoral, 
incrementa el número de células apoptóticas y disminuye la cantidad de vasos sanguíneos 
en los tumores de un modelo murino de cáncer de hígado; se observaron resultados 
similares en un modelo murino de glioblastoma [Hong Y. et al, 2000]. También se observó 
un efecto anti-angiogénico con el IFNβ en tumores formados por la línea de melanoma 
humano SK-MEL-1 en ratones inmunodeficientes (nude) [Baker D. et al, 2006]. Por último, 
se reportó que el IFNβ disminuye el número de células tumorales con propiedades stem en 
los tumores de modelos murinos de glioma tanto ortotópico como heterotópicos, y que este 
efecto se debe a la remodelación de la vasculatura tumoral más que a un efecto citotóxico 
directo sobre las células con propiedades stem [Williams R. et al, 2010], 
Estudios clínicos reportaron resultados alentadores del tratamiento combinado con IFNβ 
e IL2 o IFNβ, retinoides y tamoxifenos en pacientes con cáncer de mama con metástasis 
distantes [Nicolini A. y Carpi A., 2005; Recchia F. et al, 2009]. En un estudio clínico en fase 
II, el tratamiento con dosis altas de IFNβ produjo una baja tasa de respuesta en pacientes 
con melanoma metastásico, aunque se observó un aumento en los niveles séricos de la 
citoquina pro-apoptóticas TRAIL, IL-1 y quimoquinas inmuno-moduladoras y anti-
angiogénicas (CXCL10 y CCL8); así como también una disminución en los niveles de las 
proteínas pro-angiogénicas VEGF y CXCL-5 [Borden E. et al, 2011]. 
 
La administración de IFNα está aprobada por la FDA para el tratamiento del cáncer 
La bioterapia sistémica con el IFNα (IFN-α2b: producido en E. coli mediante las técnica 
del DNA recombinante) es una terapia aprobada por la FDA en el año 1993 para el 
tratamiento adyuvante de distintas neoplasias especialmente para pacientes con melanoma 
resecado estadio IIb o III, con alto riesgo de recurrencia o de metástasis distantes. En éstos 
pacientes, el IFNα mejora la supervivencia libre de enfermedad respecto de los controles 
(3,8 vs. 2,8 años) [Kirkwood et al, 2000]. El efecto de este tratamiento sobre la sobrevida 
global no está claro, mientras que algunos meta-análisis detectaron un beneficio (reducción 
del riesgo de muerte del 11%), otros grupos no detectaron diferencias significativas [Mocellin 
S. et al, 2010]. Estudios fármaco-cinéticos demostraron que la vida media de los IFNs en 
circulación de los pacientes tratados es de 3 a 5 h. Por lo tanto, la falta de niveles sostenidos 
puede ser un factor responsable de la ineficiencia del tratamiento con IFNs para inhibir o 
erradicar los tumores sólidos [Salmon P. et al, 1996; Einhorn S. y Grander D., 1996]. 
Desafortunadamente, el tratamiento con IFNα está asociado a una considerable toxicidad 
sistémica, que limita la compleción de la terapia en aproximadamente un 25% de los 
pacientes y deteriora considerablemente la calidad de vida de los mismos. Los efectos 
secundarios del tratamiento con IFNα incluyen fatiga, fiebre, mialgia, toxicidad hepática, 
efectos neuro-psiquiátricos como depresión, vértigo y algunos casos de manía, y efectos 
hematológicos como trombocitopenia. 
El IFNα pegilado (PEG-IFNα) posee una mayor vida media que disminuye la frecuencia 
de las dosis, mejorando la efectividad del tratamiento y disminuyendo levemente su 
toxicidad [Simonsson B. et al, 2011]. 
 
9 
 
Terapia génica con el gen IFNα/β 
Una forma alternativa de tratamiento en la que se produce una administración continua 
de bajas dosis de IFNα/β evitaría la toxicidad del IFNα/β manteniendo su eficacia antitumoral 
[Slaton et al, 1999]. Este tipo de farmacocinética podría ser llevado a cabo eficazmente por 
la administración de los genes de estas citoquinas en un enfoque de terapia génica. Más 
aún la liberación continúa del IFNα/β obtenida por medio de la terapia génica podría 
aumentar la eficacia antitumoral al lograr niveles sostenidos de dicha proteína. 
Es interesante notar que las características biológicas y bioquímicas de la terapia de 
transferencia del gen IFNα/β a las células tumorales difieren de la terapia convencional con 
la proteína interferón. La transferencia de un plásmido conteniendo el gen IFNβ complejado 
con liposomas catiónicos, puede inducir apoptosis en células tumorales resistentes a la 
proteína IFNβ como glioma, melanoma y carcinoma de células renales [Yagi K. et al, 1999; 
Yoshida J. et al, 2004]; se observaron resultados similares con el gen IFNα transferido por 
adenovirus en células de cáncer de vejiga [Benedict W. et al, 2004]. 
La terapia génica antitumoral por lipofección del gen IFNβ, restringe a la progresión 
tumoral por citotoxicidad directa mediante supresión de la proliferación e inducción de 
apoptosis; e indirectamente por estimulación del sistema inmune del paciente y supresión de 
la angiogénesis [Kageshita T. et al, 2001; Streck C et al, 2006]. 
La muerte celular inducida directamente por lipofección del gen IFNα/β involucra 
apoptosis y catástrofe mitótica o senescencia [Yoshida J. et al., 2004]. 
El IFNβ es un potente inhibidor de la angiogénesis por toxicidad directa sobre las células 
endoteliales. Además, disminuyela expresión de bFGF, VEGF, colagenasa tipo IV y MMP-9 
[Slaton et al, 1999]. Esto produce un importante efecto antitumoral por privación de oxígeno 
y nutrientes a la masa tumoral [Streck C. et al, 2006]. 
Por otro lado, las células tumorales lipofectadas con el gen IFNβ, producen, además de 
IFNα/β, las interleukinas IL-1 e IL-6, el factor de necrosis tumoral-α (TNFα), la proteína 
quimiotáctica de los monocitos (MCP-1) y la proteína-10 inducible por IFNα/β (IP-10) 
[Yoshida J. et al, 2004].Todas estas citoquinas ejercen un potente efecto antitumoral, ya que 
neutralizan la inmunosupresión local, y facilitan la infiltración del tumor por gran número de 
células inmunes antitumorales, principalmente NK y macrófagos. Los linfocitos NK con 
actividad antitumoral espontánea, son extremadamente eficientes en la eliminación intra-
vascular de un amplio rango de células tumorales, previniendo una mayor incidencia 
metástasis. [Fujimiya Y. et al, 1995; Ryuke Y. et al, 2003]. El IFNβ también induce la 
expresión de la molécula de adhesión intercelular-I y de los MHC I y II en la superficie de las 
células tumorales e inmunes, aumentando la inmunogenicidad. 
 
En los últimos años se realizaron ensayos clínicos en fase I de terapia génica con el gen 
IFNα e IFNβ en cáncer de vejiga y mesotelioma maligno pleural respectivamente, 
obteniéndose resultados alentadores. En ambos casos los genes fueron transferidos 
mediante adenovirus. [Sterman D. et al, 2010; Dinney C. et al, 2013]. 
 
Efecto bystander en la terapia génica con IFNα/β 
Como se ha explicado anteriormente, una de las principales limitaciones de la terapia 
génica del cáncer es la imposibilidad de que un gran porcentaje de células tumorales sean 
directamente alcanzadas por los vectores, dado los bajos porcentajes de transfección 
obtenidos in vivo. Una estrategia para superar esta barrera es el tratamiento con genes cuya 
expresión produzca efecto bystander. Se denomina efecto bystander al fenómeno que 
extiende la citotoxicidad provocada por una terapia en un grupo de células a las células del 
entorno que no fueron directamente alcanzadas por la terapia. El efecto bystander ha sido 
10 
 
ampliamente investigado en la irradiación con partículas α; mientras que una línea de 
investigación indica que el efecto bystander es mediado por uniones GAP, una serie 
separada de estudios sugiere un mecanismo dependiente de un factor proteico y de 
radicales libres [Grosovsky A., 1999]. 
Por otro lado, se sabe que el efecto bystander es fundamental en la eficacia de la terapia 
génica suicida con el gen HSVtk y la administración de la pro-droga GCV [Culver et al, 
1992]. Uno de los mecanismos propuestos para el efecto bystander in vitro es la 
transferencia del GCV fosforilado (tóxico) a las células adyacentes que no expresan HSVtk, 
a través de uniones GAP. En el efecto bystander in vivo, se sabe que, además de la quimio-
sensibilización de las células vecinas al GCV, juega un rol muy importante la destrucción de 
la vasculatura tumoral, y la estimulación de la respuesta inmune antitumoral [Freeman S. et 
al, 1996]. 
Varios grupos reportaron evidencias claras de efecto bystander en la terapia génica con 
IFNα/β. Por ejemplo, se reportó que al co-inyectar subcutáneamente células de la línea de 
melanoma B16 con células de la línea A375 transfectadas con el gen IFNβ murino en 
ratones, las células A375 que expresan IFNβ murino revierten la tumorigenicidad de las 
células B16 no transfectadas; y que la producción de óxido nítrico estaría implicada en el 
efecto bystander [Xie K. et al, 1997]. Benedict W. et al. (2004) trataron a ratones con 
tumores ortotópicos de cáncer de vejiga con adenovirus con el gen del IFNα, y observaron 
apoptosis en células tumorales que no expresaban el transgen del IFNα. Ambos grupos 
atribuyeron un rol principal en el efecto bystander a los efectos inmuno-estimulatorios y anti-
angiogénicos del IFN. 
En cuanto al efecto bystander in vitro, Zhang X. et al (2006) reportaron que el gen IFNα 
produce un fuerte efecto bystander mediado por factores solubles y termo-estables en 
células de cáncer de vejiga. También se reportó que la lipofección con el gen IFNβ produce 
un marcado efecto bystander en una línea de sarcoma de Ewing, y que las especies 
reactivas del oxígeno (ROS) podrían estar involucradas en este efecto [Villaverde et al, 
2012a]. 
 
 
 
Bioquimioterapia 
 
El término bioquimioterapia refiere a los regímenes que combinan la quimioterapia con 
agentes citotóxicos con la bioterapia con IFNα/β o IL2. Se han desarrollado muchos 
protocolos clínicos de bioquimioterapia, en los cuales, por ejemplo, se combina al IFNα con 
dacarbacina o temozolomida. En la mayoría de estos ensayos, la bioquimioterapia fue 
asociada con una tasa de respuesta más alta, pero esto no resultó en una mejora 
significativa de la supervivencia global [Bhatia S. et al, 2009]. 
La aplicación simultánea de más de un agente anti-neoplásico intenta frenar el desarrollo 
de células tumorales resistentes a los agentes individuales. Teóricamente, las drogas 
seleccionadas para utilizarse en terapias combinadas deben haber demostrado un efecto 
antitumoral o por lo menos una actividad biológica sobre el tumor a tratar. Algunos fármacos 
que inhiben señales de transducción, angiogénesis, u otros blancos moleculares tienen una 
respuesta individual muy pobre pero potencian significativamente la acción de otras drogas 
citotóxicas [Slamon D. et al, 2001]. En la combinación de fármacos hay que tener en cuenta 
que difieran en sus mecanismos de acción y no compartan un mismo mecanismo de 
resistencia. Por otro lado, nunca deben combinarse las drogas en sus dosis tóxicas. El 
11 
 
resultado ideal de las terapias combinadas es que la combinación logre mayor efectividad, 
con menores efectos secundarios que los agentes anti-neoplásicos por separado. 
Esta consideración llevó a proponer, como paso previo de la investigación clínica 
veterinaria que se realiza en nuestro laboratorio, la evaluación de los efectos de la 
combinación de la bioterapia por transferencia del gen IFNβ con drogas anti-neoplásicas 
citotóxicas. En un screening previo sobre monocapas de células de MEMC se observó un 
efecto prometedor de la combinación de la transfección del gen IFNβ con el bortezomib 
sobre la proliferación celular, en comparación a la combinación con paclitaxel, etoposido, 
vincristina, dacarbacina, gemcitabina o cisplatino [datos propios no mostrados]. 
 
El bortezomib es un inhibidor del proteosoma aprobado para el tratamiento del 
mieloma múltiple 
La degradación sistemática y oportuna de las proteínas es un proceso vital para la 
función celular y el mantenimiento de la homeostasis celular. El sistema ubiquitina-
proteosoma es la principal vía no-lisosomal de degradación de proteínas. El proteosoma es 
un complejo multi-enzimático que se compone de un núcleo catalítico (20S) y 2 subunidades 
reguladoras (19S), y exhibe 3 actividades enzimáticas: quimotripsina, tripsina y símil-
caspasa. Las proteínas destinadas a la degradación por el proteosoma son marcadas con 
una cadena multimérica de ubiquitina en los residuos de lisina, la ubiquitina-tranferasa es la 
enzima principal en este proceso. Muchas proteínas degradada por el proteosoma están 
implicadas en procesos celulares cruciales como proteínas reguladoras del ciclo celular 
(ciclinas A, B, D y E, p21 y p27), el supresor tumoral p53, el inhibidor de NFκB (IκB), y 
proteínas de adhesión celular (ICAM-1, VCAM-1). Además, las células tumorales son mucho 
más sensibles a la inhibición del proteosoma que las células normales. Esto se debe, en 
parte, a la alta tasa de replicación de las células malignas. Esto implica una síntesis elevada 
de proteínas y un rápido recambio proteico. Por otra parte, los cambios genéticos que 
acompañan a la transformación desactivan diversos mecanismos de check-point. En 
consecuencia,la inhibición del proteosoma resulta una estrategia alentadora para la terapia 
del cáncer [Pérez-Galán P. et al, 2006]. 
El inhibidor del proteosoma bortezomib (BTZ) fue aprobado rápidamente por la FDA en el 
año 2003, luego de que 2 protocolos de fase II demostraran un 25-30 % de respuesta en 
tumores que fallaron con el primer tratamiento [Jagannath S. et al, 2006]. En el 2006, la FDA 
aprobó el uso de BTZ en pacientes con linfoma de células de manto [Kane R. et al, 2007]. El 
BTZ (Fig. 4) es un análogo modificado del ácido dipeptidil bóronico que se une 
reversiblemente a la subunidad con actividad quimotríptica del nucleo 20S del proteosoma 
26S [Adams J. y Kauffman M., 2004]. 
Entre los efectos adversos del BTZ se encuentran trombocitopenia, diarrea y fatiga. La 
mielosupresión es leve y reversible. Cerca de un 10% de los pacientes presentan una 
dolorosa neuropatía periférica que en muchos casos limita el tratamiento [Mitchell B., 2003]. 
 
Mecanismos de acción del BTZ 
A pesar de que el proteosoma afecta numerosas proteínas, la inhibición de la 
translocación al núcleo del factor nuclear κB (NFκB) se considera una de las principales vías 
en la muerte celular inducida por el BTZ. Diversos tipos tumorales tienen una hiper-actividad 
constitutiva de NFκB que les confiere una ventaja en la supervivencia y resistencia a la 
apoptosis. NFκB es un factor de transcripción que regula positivamente genes relacionados 
con el crecimiento y la angiogénesis, y una suma de genes anti-apoptóticos. Normalmente 
NFκB se encuentra inactivo en el citoplasma unido a IκB, el bortezomib inhibe la 
degradación de IκB, y por lo tanto inhibe la translocación nuclear de NFκB. Sin embargo, el 
12 
 
bortezomib también induce apoptosis por medio de otros mecanismos, dado que la 
inhibición de NFkB por sí sola no induce apoptosis en muchos modelos tumorales sensibles 
al BTZ, y que el BTZ es también efectivo en células tumorales que no tienen alterada la vía 
de NFkB [Shahshahan M. et al, 2011]. 
 
 
 
 
Figura 4: Estructura molecular del bortezomib. 
 
 
 
Un mecanismo de acción del BTZ más recientemente estudiado es la inducción de estrés 
del retículo endoplasmático a través de la acumulación de proteínas mal plegadas o 
modificadas por oxidación dentro de la célula; estas proteínas inducen vías de reparación 
que, de no solucionarse dicha acumulación, llevan a la apoptosis [Shahshahan M. et al, 
2011]. 
Por otro lado, el BTZ inhibe la angiogénesis y bloquea la producción de IL6, un factor 
clave en la proliferación del mieloma. Además, promueve la fosforilación y el clivaje de la 
proteína anti-apoptótica Bcl-2 y bloquea la proteólisis de p21 y p27, permitiendo la apoptosis 
de las células hipóxicas o dañadas [Hideshima et al, 2003]. 
 
Tratamiento combinado con BTZ y otros agentes antineoplásicos 
No se observó una respuesta importante al BTZ en pacientes con melanoma; en un 
estudio clínico sólo el 22% de los pacientes mostraron una respuesta al tratamiento con BTZ 
[Markovic S. et al, 2006], y la toxicidad sistémica provocada por este tratamiento limita el 
ensayo con dosis más altas. Frecuentemente, el BTZ no es suficiente para inducir apoptosis 
en células de melanoma. Numerosos estudios in vitro mostraron una gran efectividad 
antitumoral al combinar el BTZ con otros agentes antineoplásicos. Por ejemplo, el BTZ actúa 
sinérgicamente con el gen IFNα en la reversión de la sobre-expresión de proteínas anti-
apoptóticas y en la inducción de apoptosis en células de cáncer de vejiga [Papageorgiou A. 
et al, 2009]. También se observaron resultados alentadores al combinarlo con temozolomida 
en un modelo murino de melanoma [Shahshahan M. et al, 2011]. Nos propusimos estudiar 
los efectos del tratamiento combinado con el gen IFNβ y BTZ en células de melanoma. 
 
 
 
 
 
13 
 
Las especies reactivas del oxígeno en el tratamiento del cáncer 
 
Los radicales libres son especies químicas que poseen por lo menos un electrón 
desapareado como el óxido nítrico, el oxígeno (2 e- desapareados) y la mayoría de los 
metales de transición. Los electrones desapareados del oxígeno reaccionan rápidamente 
formando especies parcialmente conocidas como especies reactivas del oxígeno (ROS), 
incluyendo: anión superóxido (.O2−), peróxido de hidrógeno (H2O2), radical hidroxilo (HO.) y 
peroxinitrito (ONOO.-). El uso celular del oxígeno genera ROS en forma permanente, estas 
especies químicas son muy inestables y reactivas. Existen varios sistemas enzimáticos que 
producen estas especies reactivas, como la cadena mitocondrial (transportadora de 
electrones) el citocromo P450, las lipoxigenasas, cicloxigenasas, el complejo NADPH 
oxidasa, xantino oxidasa, y los peroxisomas. El metabolismo del oxígeno a nivel mitocondrial 
es la principal fuente de .O2−, como resultado de un acoplamiento incompleto entre los 
electrones y H+ con el oxígeno. 
El balance redox, es decir, la relación entre las especies reducidas y las oxidadas juega 
un rol clave en la regulación de las vías de señalización incluyendo la activación de quinasas 
y fosfatasas tanto a nivel de su expresión como directamente oxidando los grupos tioles de 
estas enzimas. De esta manera, de acuerdo a su nivel de exposición a ROS la célula 
atravesará distintas situaciones, que abarcan desde la proliferación a la muerte (Fig. 5A). 
Los niveles fisiológicos de ROS están regulados por varias enzimas que neutralizan estos 
oxidantes tóxicos (Fig. 5B). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. (A) Estado celular dependiente de la exposición a ROS (B) Actividad de las 
principales enzimas antioxidantes [Fruehauf J. y Meyskens F., 2007]. 
 
 
 
En general, las células tumorales contienen altos niveles de ROS. Estos niveles de ROS 
confieren una ventaja a las células tumorales en cuanto a proliferación y supresión de la 
apoptosis. Entre los factores de transcripción y genes regulados por ROS se encuentran: el 
factor inducible por hipoxia-1 (HIF-1), NF-kB, VEGF y metaloproteinasas de matriz (MMPs). 
Por lo tanto alterar el estado oxidativo de las células tumorales es una buena estrategia para 
combatir el cáncer [Thannickal et al, 2000; Ushio-Fukai M. et al, 2008]. 
A B 
14 
 
Una de las estrategias para disminuir la exposición a ROS es aumentar los niveles de los 
sistemas antioxidantes (sobreexpresión de enzimas antioxidantes). De esta manera se 
impide la señalización mediada por H2O2 y se inhibe el crecimiento tumoral. Es importante 
resaltar que, una vez que la célula se transformó en una especie maligna, la situación se 
torna irreversible, quedando como único camino generar una mayor exposición a ROS. 
Entonces, se puede interferir con el sistema antioxidante o bien promover una mayor 
generación de especies reactivas lo que resultaría en un exceso de ROS que conduciría a la 
muerte celular. Entre los daños intracelulares ocasionados directamente por altos niveles de 
ROS intracelulares se encuentran el daño al DNA y activación de p53, la oxidación lipídica y 
la oxidación proteica [Thannickal et al, 2000; Ushio-Fukai M. et al, 2008]. 
 
La terapia génica con IFNβ aumenta los niveles intracelulares de ROS 
La lipofección con el gen IFNβ aumenta los niveles de anión superóxido y peróxidos 
hidrosolubles en la línea de sarcoma de Ewing EW7; lo que podría deberse a la inducción de 
inhibidores de peroxidasa. Por otro lado, produce un incremento en los niveles intracelulares 
de ROS totales en la línea de melanoma M8 y la línea de sarcoma de Ewing EW7. El 
tratamiento con una combinación de superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT) provoca 
una leve diminución del efecto citotóxico del gen IFNβ [Villaverde M. et al, 2012a]. 
 
La sobreproducción de ROS es un paso crítico en la inducción de la apoptosis por 
BTZ 
Fribley et al. (2004) reportaronque el BTZ produce una sobreproducción de ROS en 
células de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello, y que el BTZ pierde su 
capacidad de inducir estrés de retículo endoplasmático, activación de caspasas y apoptosis 
cuando se inhibe la sobreproducción de ROS. Por otro lado, en líneas celulares de linfoma 
de células de manto, el BTZ induce generación de ROS, despolarización de las 
mitocondrias, activación del factor de transcripción NOXA y activación de caspasas. En este 
caso, la inhibición de la generacion de ROS o la inhibición de NOXA, pero no la inhibición de 
caspasa, producen una disminución en la sensibilidad al BTZ [Pérez-Galán P. et al, 2006]. 
La sobreproducción de ROS también tiene un rol crítico en la citotoxicidad del BTZ en 
células de cáncer de pulmón, leucemia y meduloblastoma [Ling Y. et al, 2003; Yu C. et al, 
2004; Ohshima-Hosoyama S. et al, 2011]. Por último, el BTZ sensibiliza a células de 
mieloma múltiple a la inducción de apoptosis por inhibidores de desacetilasas de histonas 
(HDAC); estos tratamientos se potencian en la generación de ROS y el antioxidante L-acetil-
N-cisteína (LNAC) disminuye la sobreproducción de ROS, disminuyendo la liberación de 
citocromo c, la degradación de PARP y la apoptosis inducida por el tratamiento combinado 
[Pei et al, 2004]. 
 
 
 
Modelos tumorales 
 
Tumorigenicidad diferencial entre las líneas de melanoma humano A375 y SB2 
Si bien ambas líneas derivan de un tumor cutáneo primario, SB2 posee un potencial 
tumorigénico muy bajo en ratones inmunodeficientes mientras que A375 posee un alto 
potencial tumorigénico; ambas líneas poseen diferentes patrones de expresión de genes 
relacionados con la progresión tumoral. Por lo tanto, representan modelos sustancialmente 
diferentes para la evaluación de agentes anti-neoplásicos. Es importante que las terapias 
contra el cáncer actúen sobre los dos tipos de células, ya que alteraciones en la expresión 
15 
 
de un solo gen en SB2 puede aumentar drásticamente su tumorigenicidad. [Meadows G. et 
al, 2001; Hazarika P. et al, 2004]. 
 
Líneas de melanoma mucoso canino como herramienta de investigación en la 
oncología comparada 
La oncología espontánea, en comparación a la oncología experimental, estudia aspectos 
de la carcinogénesis, la epidemiología, el diagnóstico y el tratamiento del cáncer en 
animales de compañía o producción en los cuales el cáncer se da como una enfermedad 
espontánea. Un aspecto especial de la investigación de los tumores espontáneos, es la 
comparación con lo que se conoce o investiga en los seres humanos. Los resultados y las 
conclusiones obtenidas a partir de la investigación con animales, a veces, pueden ser 
extrapolados a la oncología humana y/o permiten una mejor comprensión de la enfermedad 
del cáncer en general. Los casos portadores de neoplasias espontáneas se pueden utilizar 
en el estudio de la enfermedad tumoral y en la experimentación de metodologías de 
tratamiento que se pueden implementar posteriormente en los seres humanos [Baba A. y 
Câtoi C.; 2007] 
En el marco de los estudios clínicos veterinarios realizados por nuestro grupo de trabajo 
para evaluar el potencial antitumoral de nuevos tratamientos en pacientes caninos con 
melanoma [Finocchiaro L. y Glikin G., 2008, Finocchiaro L. y Glikin G., 2012], resulta de 
suma importancia la investigación con líneas celulares de melanoma mucoso canino 
derivadas de tumores de pacientes incluidos en dichos estudios, tanto para la evaluación de 
nuevos agentes terapéuticos previa a futuros ensayos clínicos veterinarios, como para 
aumentar el conocimiento sobre el funcionamientos de agentes terapéuticos utilizados en los 
protocolos veterinarios. 
 
Esferoides como modelo tumoral in vitro 
Durante muchos años se han investigado los mecanismos del crecimiento maligno y la 
respuesta de las células tumorales a diversas terapias utilizando como modelo líneas 
celulares tumorales estables creciendo en monocapa. Sin embargo, el crecimiento bi-
dimensional de las células tumorales, donde todas las células están igualmente expuestas a 
oxígeno y nutrientes, no representa completamente las características de los tumores 
sólidos tri-dimensionales, en los que la distribución no uniforme de oxígeno y nutrientes, así 
como otros tipos de estrés físico y químico, resultan en una significativa heterogeneidad 
celular [Santini M. y Rainaldi G., 1999]. 
Los esferoides constituyen un modelo de cultivo tridimensional in vitro de células que 
crecen agrupadas en suspensión. Este modelo, de complejidad intermedia entre los cultivos 
en monocapa y los tumores in vivo, recrea las áreas pobremente oxigenadas y necróticas de 
los tumores, así como también las uniones intercelulares, y permite estudiar muchas de las 
diferencias en la respuesta a la radio y quimioterapia observada entre las células creciendo 
en monocapa y los tumores in vivo [Hamilton G., 1998]. A pesar de las limitaciones que 
presenta por ser un modelo in vitro, ofrece una herramienta muy interesante para pruebas 
de sensibilidad a drogas citotóxicas ya que este modelo permite ensayos en células 
adaptadas a las condiciones impuestas por la configuración espacial adquirida, con todas la 
facilidades temporales, económicas y bioéticas de un modelo in vitro. 
Los esferoides se asemejan a los tumores sólidos in vivo en su dinámica de crecimiento; 
los cultivos en monocapa crecen exponencialmente, mientras que los tumores sólidos y los 
esferoides tumorales se caracterizan por una fase exponencial temprana seguida de un 
período de crecimiento más lento [Casais C. et al, 2006] (Fig. 6). La primera fase es más 
independiente de la estructura circundante, mientras que la segunda fase depende del 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=Meadows%20GG%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=11694646
16 
 
tamaño del tumor y de las restricciones nutricionales impuestas a las células que se 
localizan en el interior del tumor [Santini M. et al, 2000]. 
El modelo de cultivo influye muy significativamente en el patrón de expresión génica de 
las células. Dangles V. et al. (2002) observaron marcadas diferencias en la expresión de 24 
genes involucrados en el desarrollo y progresión tumoral entre células de la misma línea 
celular creciendo en monocapas o esferoides. 
 
 
 
 
Figura 6: Curva de crecimiento de esferoides de la línea de melanoma espontáneo canino Ak. 
Se sembraron 2x104 células por pozo recubiertos con agar de una placa de 96 pozos. Las proteínas 
se determinaron en un conjunto de 8 pozos por el método de Bradford. El experimento se hizo por 
duplicado. (Gráfico cedido por Gil-Cardeza M., Finocchiaro L. y Glikin G.) 
 
 
 
La resistencia multicelular es un fenómeno exclusivo de las estructuras tridimensionales 
La resistencia a los tratamientos de los tumores in vivo no se ve representada por 
completo en los cultivos en monocapa. Pero cuando las células tumorales son cultivadas 
como esferoides adquieren una resistencia multicelular (MCR) similar a la resistencia 
observada en los tumores in vivo [Barbone D. et al, 2011]. En presencia de MCR, que 
comienza menos de 24 h después de iniciar el cultivo en esferoides, las células pueden 
volverse resistentes a la mayoría de las drogas antitumorales, la inmunoterapia, diversas 
clases de radioterapia y la terapia génica [Desoize B. y Jardillier J., 2000, Gil-Cardeza 2010]. 
Los mecanismos de la MCR pueden ser divididos en dos clases: la resistencia por 
contacto, similar a la observada en monocapas confluentes, y la resistencia relacionada con 
la estructura heterogénea de los agregados tridimensionales. Los mecanismos involucrados 
incluyen: inhibición de la apoptosis por contacto entre células o entre célula y matriz, alta 
proporción de células quiescentes; modulación diferencial de la expresión de proteínas; 
potenciales problemas de permeabilidad; y presencia de un centro hipóxico y/onecrótico 
[Desoize B. y Jardillier J., 2000]. 
La investigación de la resistencia al tratamiento del cáncer se centró durante más de 20 
años en la resistencia múltiple a drogas (MDR). La MDR involucra la sobreexpresión de la 
glicoproteína P (Pgp), que aparentemente funciona como una bomba dependiente de ATP 
que expulsa drogas hidrofóbicas [Sharom F., 1997]. Algunas evidencias permiten diferenciar 
claramente la MCR de la MDR; por otro ejemplo, se han encontrado niveles equivalentes de 
ARNm para Pgp en células cultivadas en esferoides y en monocapas [Sakata K. et al, 1994]. 
 
17 
 
Diferencias en la adhesión celular entre esferoides y en monocapas 
En los esferoides, las células se mantienen unidas por micro-proyecciones de la 
membrana celular, por moléculas de adhesión, por matriz extracelular y por una variedad de 
uniones intercelulares (uniones estrechas, adherentes, en hendidura o gap y desmosomas). 
Se ha observado que la cantidad de matriz extracelular en esferoides de glioma, 
osteosarcoma y melanoma es mucho mayor que en monocapas de las mismas líneas 
celulares, y que su composición y organización se asemeja mucho a la de la matriz 
extracelular de los tumores in vivo. Lo mismo ocurre con el patrón de expresión de 
integrinas, el cual puede ser modulado por el microambiente y los contactos intercelulares 
en los esferoides. También se han encontrado diferentes patrones de expresión entre 
esferoides y monocapas de cadherinas y otras moléculas de adhesión [Santini M. et al, 
2000]. 
Existe una estrecha relación entre la supervivencia de varios tipos celulares y la adhesión 
celular, la que incluye contactos célula-célula y célula-matriz extracelular. Durante mucho 
tiempo se ha creído que el crecimiento independiente de anclaje es fundamental para la 
progresión tumoral. La acumulación de evidencia experimental indica que la adhesión 
celular puede proveer señales compensatorias que promuevan la viabilidad celular, y esta 
supervivencia aberrante podría contribuir al crecimiento neoplásico, así como al desarrollo 
de resistencia multicelular [Bates R. et al, 2000]. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
OBJETIVOS
18 
 
Teniendo en cuenta que: 
 
- la alta tasa de mortalidad asociada con el melanoma y la falta de un tratamiento eficaz 
crean la necesidad de optimizar las estrategias utilizadas para combatirlo; 
- el desarrollo e investigación de nuevos tratamientos para el melanoma espontáneo 
mucoso canino, además de proveer una nueva opción de tratamiento para dicha 
enfermedad, permitiría reducir costos y tiempo para la transferencia del tratamiento a 
pacientes humanos; 
- la administración de IFNα está aprobada para el tratamiento adyuvante del melanoma, y 
el IFNβ posee un potente efecto anti-tumoral; 
- la terapia génica con IFNs permitiría una administración continua de bajas dosis de 
IFNα/β evitando la toxicidad del IFNα/β, permitiendo niveles sostenidos de la proteína y 
manteniendo su eficacia antitumoral; 
- las estrategias que inducen un efecto bystander pueden superar la mayor limitación de la 
terapia génica, las bajas eficiencias de transfección obtenidas in vivo; 
- el bortezomib fue aprobado para el tratamiento del mieloma múltiple pero no se observó 
una buena respuesta a la droga en pacientes con melanoma, y la combinación de esta 
droga con otros agentes antineoplásicos podría revertir la resistencia observada en 
tumores sólidos; 
 
establecimos los siguientes objetivos de trabajo: 
 
1. Medir la citotoxicidad de la transferencia no viral del gen IFNβ en líneas celulares de 
potencial tumorigénico diferencial. 
2. Explorar la presencia de efecto bystander en la lipofección con el gen IFNβ en líneas 
celulares derivadas de melanomas cutáneos humanos y de melanomas mucosos 
caninos tanto en cultivos de monocapas como de esferoides. 
3. Evaluar la actividad intracelular de la proteína IFNβ no secretada en líneas de melanoma 
humano. 
4. Estudiar el efecto de la lipofección con el gen IFNβ sobre parámetros involucrados en el 
potencial metastásico como la migración y la adhesión celular. 
5. Ensayar in vitro el potencial terapéutico de la bioterapia combinada del gen IFNβ y la 
droga bortezomib en líneas de melanoma cutáneo humano y mucoso canino. 
6. Investigar el rol de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en los efectos observados. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIALES Y METODOS 
 
19 
 
 
Líneas celulares 
Se utilizaron las líneas celulares de melanoma humano A375 (ATCC # CRL-1619), M8 
[Gnjatic S. et al, 1998] y SB2 [Verschraegen C. et al, 1991]; y seis líneas de melanoma 
mucoso canino: cuatro previamente establecidas por nuestro grupo de trabajo Ak, Bk y Br 
[Gil-Cardeza M. et al, 2010], y dos líneas recientemente establecidas: Ch y Ol. Los clones de 
A375: A7, G10 y C10 fueron generados por C. Bracalente bajo la dirección de H. Durán en 
CNEA [Bracalente C. et al, 2012]. 
 
Establecimiento de las líneas Ch y Ol 
Estos cultivos celulares se establecieron a partir de tumores de melanoma mucoso 
espontáneo canino extirpados mediante cirugía. Los análisis patológicos de los tumores 
originarios confirmaron el diagnóstico de melanoma. 
Los tumores se lavaron con PBS, se realizó un lavado rápido con agua mili-Q para lisar 
los glóbulos rojos, y se disgregaron mecánicamente en medio de cultivo con 10% de suero 
fetal bovino (SFB). Los fragmentos de tumor y el sobrenadante se pasaron a un frasco de 
cultivo, y se incubaron en estufa gaseada (5% de CO2 en aire) a 37ºC [Freshney, 1986]. 
Ch mostró una morfología del tipo epitelial al ser cultivada en monocapa, y Ol mostró una 
morfología del tipo fibroblastoide. Mientras que Ch posee un tiempo de duplicación lento (≈ 
40 h), Ol posee un tiempo de duplicación rápido (≈ 23 h). Las tinciones inmunohistoquímicas 
para melan A y citoqueratina sustentaron el diagnóstico para melanoma, ya que ambas 
líneas resultaron positivas para melan A y negativas para citoqueratina. Melan A es una 
proteína antigénica que se encuentra asociada a la membrana plasmática de los 
melanocitos, y se utiliza como marcador especifico de linaje melanocítico; la citoqueratina es 
un marcador especifico de queratinocitos [Coulie P. et al, 1994]. 
Las tinciones inmunocitoquímicas se realizaron de la siguiente manera: las células se 
cultivaron sobre vidrios hasta alcanzar sub-confluencia. Luego se lavaron, se fijaron con 
etanol, se secaron y se re-hidrataron para ser incubadas con los siguientes anticuerpos 
monoclonales siguiendo las indicaciones de los fabricantes: melan A antihumano (BioGenex, 
San Ramon CA, USA; clon A103); cytokeratina antihumano (Dako; clones AE1/AE3). Luego 
de ser lavadas, se incubaron con inmunoglobulinas Multi-Link (BioGenex) conjugadas con 
estreptavidina/peroxidasa y se revelaron con 3,3’-diaminobenzidina. 
 
Cultivos 
Las células fueron cultivadas a 37°C en atmósfera húmeda con 95% de aire y 5% de CO2 
con medio D-MEM/F12 (Invitrogen, USA) suplementado con suero fetal bovino (SFB) al 10% 
(PAA, Austria), HEPES 10 mM (Sigma, USA) (pH 7,4) y antibióticos. Las líneas celulares se 
mantuvieron realizando repiques seriados mediante tripsinización (tripsina 0,25% y EDTA 
0,02% en PBS) de monocapas subconfluentes. 
Los esferoides multicelulares fueron preparados utilizando la técnica de liquid overlay 
[Santini M. et al, 1999]. Brevemente, se fundió agar para cultivo celular