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Estudio comparativo sobre diferentes protocolos de 
trabajo para caracterizar la morfología eritrocitaria 
mediante microscopía electrónica de barrido
Cintia Vanesa Elías1, Martina Avalos2, Bibiana Riquelme1
1. Área Física, Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas 
(UNR). Grupo Óptica Aplicada a la Biología, Instituto de Física 
Rosario (CONICET-UNR). Rosario, Argentina
riquelme@i� r-conicet.gov.ar;
2. Laboratorio de Microscopía Electrónica CCT Rosario - IFIR 
avalos@i� r-conicet.gov.ar.
Resumen. La evolución de los conocimientos en Hemorreología en 
las últimas décadas ha hecho de esta rama de la Ciencia una herra-
mienta indispensable para la evaluación de determinadas situaciones 
clínicas. La necesidad de condiciones experimentales especí� cas y la 
de� nición de parámetros necesarios al enfoque reológico de la sangre 
y sus componentes conducen a la concepción de nuevos equipos y 
técnicas generalmente fundamentados en principios ópticos y mecá-
nicos. Las alteraciones en la morfología y en el comportamiento visco-
elástico de la membrana eritrocitaria pueden producir serios disturbios 
en la microcirculación sanguínea. En particular, es de gran interés el 
estudio de la relación existente entre la viscoelasticidad de la membra-
na eritrocitaria y diversas alteraciones morfológicas como las obser-
vadas en patologías hematológicas, renales y vasculares así también 
como en diversos tratamientos in vitro y en el almacenamiento de la 
sangre o de sus componentes. Entre todas las técnicas utilizadas para 
el estudio de la morfología celular (Microscopía Convencional, Micros-
copía de Fluorescencia, etc.), la Microscopía Electrónica de Barrido 
o MEB (Scanning Electron Microscopy o SEM en inglés) es la que 
ofrece mayores ventajas debido a que presenta mayor poder de reso-
lución y mayor profundidad de campo.
Palabras clave: microscopía electrónica de barrido, glóbulos rojos, 
morfología eritrocitaria.
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Introducción
El estudio detallado de componentes y morfología de célu-
las y tejidos animales o vegetales, por el tamaño que poseen, re-
quiere el uso de instrumentos que permitan resolver la imagen de 
las estructuras que los constituyen. El microscopio fue el instru-
mento empleado por los primeros biólogos para estudiar la célula 
y los tejidos. Su nombre deriva etimológicamente de dos raíces 
griegas: mikrós, que signi� ca pequeño y skopéoo, que signi� ca 
observar. Si consideramos por ejemplo, que el ojo humano tiene 
un poder de resolución de aproximadamente 1/10 milímetros es 
claro que él necesita del microscopio para ver organismos y es-
tructuras que a simple vista serían invisibles.
En la actualidad se dispone de poderosos microscopios 
que permiten amplias escalas de aumento y de gran cantidad 
de técnicas para preparar muestras para su examinación con el 
máximo detalle. Cada tipo de microscopio y cada método de pre-
paración de muestras ofrece alguna ventaja precisa para mostrar 
determinados aspectos morfológicos.
Existe una gran variedad de microscopios considerando las 
diferentes �fuentes� que se utilicen para obtener una imagen. En 
este trabajo se han utilizado el microscopio óptico (luz visible) y el 
microscopio electrónico (electrones) ya que resultan adecuados 
para el estudio de aspectos morfológicos. En el microscopio de 
luz (MO) la ampli� cación se obtiene mediante un sistema de len-
tes convencionales y la fuente de iluminación son fotones. En el 
microscopio electrónico (ME) la ampli� cación se logra mediante 
un sistema de lentes magnéticas y la fuente que utiliza para �ilu-
minar� son electrones. Existen dos tipos de ME: el microscopio 
electrónico de transmisión (MET o TEM) y el microscopio electró-
nico de barrido (MEB o SEM). Ellos brindan información diferente 
y complementaria sobre las características de una muestra. El 
MEB provee información sobre morfología y características de la 
super� cie, mientras que con el MET podemos observar la estruc-
tura interna y detalles ultraestructurales.
Tanto en el MO como en el MET, los fotones o los electrones 
atraviesan la muestra. En el MEB lo que se observa es el resulta-
do de interacciones super� ciales provenientes de la muestra.
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Para ser observadas utilizando cualquier técnica de mi-
croscopía, las muestras deben ser sometidas a un tratamiento 
previo. En el MET o el MO, el contraste necesario para la forma-
ción de una imagen requiere que las diferentes partes de la cé-
lula di� eran en su respuesta a la fuente, ya sea ésta de fotones 
o electrones. Las partes de la muestra que permiten el paso de 
fotones o de electrones aparecen brillantes, mientras que las 
partes que bloquean el paso del haz de iluminación aparecen 
oscuras. En el MEB la intensidad de la señal de electrones dis-
persados por la muestra depende básicamente de la interacción 
de los electrones del haz con la muestra. 
La principal cualidad para evaluar un microscopio es el po-
der de resolución “d” o capacidad de ver dos puntos como dife-
rentes. Este valor viene dado por la ecuación de Abbe (Bogner A. 
et al., 2007) que muestra que existe una relación directa entre d y 
la longitud de onda (λ) de la fuente que se usa como iluminación. 
Esta relación fue el factor principal para el desarrollo de la ME 
ya que la λ asociada a los electrones es X órdenes de magnitud 
menor que la asociada a los fotones. Con respecto a los valo-
res del d, los mejores MO tradicionales tienen un d de 0,2 μm y 
el ME 100 veces mayor. La λ de los electrones emitidos por el 
electrodo metálico (cátodo) depende del voltaje aplicado, siendo 
menor a mayor voltaje aplicado, para acelerar los electrones y 
generar el haz. Sin embargo, establecer un valor es relativo, ya 
que la tecnología cambia rápidamente aumentando la posibili-
dad de mejorarlo en forma permanente. 
Junto con el poder de resolución, la otra gran ventaja del 
MEB es que las imágenes formadas tienen una gran profundi-
dad de campo, aproximadamente 500 veces que la del MO. 
Todos los microscopios electrónicos cuentan con los mis-
mos elementos básicos. Disponen de un emisor que emite los 
electrones que conforman el haz que impactará en la muestra. 
Se utilizan lentes electromagnéticas para crear campos magnéti-
cos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes 
convencionales utilizadas en los MO no tienen sentido con los 
electrones. El sistema de vacío es una parte relevante del ME, 
ya que el camino libre medio de los electrones debe tener máxi-
ma longitud. Esto implica evitar colisiones de los electrones con 
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las moléculas del aire para no ser desviados y mantener así un 
haz colimado que en estas condiciones pueda ser enfocado.
El ingreso de electrones de alta energía a la muestra ge-
nera eventos que dan lugar a las señales que luego al ser co-
lectadas permiten formar las imágenes. Una vez en el interior 
de la muestra, los electrones interactúan con el campo eléctri-
co tanto de los núcleos de la muestra como de los electrones 
de la misma. Estas interacciones son eventos de dos clases: 
elásticos e inelásticos; y son los responsables de una multi-
tud de señales como por ejemplo electrones retrodispersados, 
electrones secundarios, rayos-X, electrones Auger, cátodolu-
miniscencia (Figura 1). 
Figura 1. Señales producidas por la interacción del haz de electrones con la 
muestra
Los eventos inelásticos ocurren básicamente cuando el 
haz de electrones interactúa con el campo eléctrico del elec-
trón de un átomo de la muestra. El resultado es la transferen-
cia de energía al átomo de la muestra y la expulsión de un 
electrón del átomo denominado Electrón secundario (SE). Los 
SE tienen energías menores a 50 eV. Si la vacante generada 
por la salida de este SE es cubierta por un electrón prove-
niente de un orbital de mayor nivel, la diferencia de energía 
es emitida como un fotón de rayos-X característico de la dife-
rencia de energía de los orbitales en ese átomo.
Los eventos elásticos ocurren cuando los electrones 
provenientes delhaz interaccionan con el campo eléctrico del 
núcleo de un átomo de la muestra, resultando en un cambio 
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de dirección de los electrones sin una pérdida signi� cativa 
en la energía del haz (<1eV). Estos electrones se denomi-
nan Retrodispersados (BSE). Los BSE colectados para for-
mar imágenes tienen energías cercanas a la energía del haz 
incidente.
Otro elemento importante a tener en cuenta en la mi-
croscopía electrónica es lo que se denomina �volumen de in-
teracción� (Figura 2), de� nido como el volumen de la muestra 
en el cual se producen los SE y BSE provenientes de diferen-
tes profundidades en la muestra, que condiciona su resolu-
ción y debe ser tenido en cuenta para de� nir las condiciones 
de operación del equipo.
El efecto de carga sobre la muestra es una condición 
que ocurre cuando un material no puede conducir efectiva-
mente los electrones. Las muestras no conductoras acumulan 
carga y la imagen se ve brillante o con una distorsión gene-
ral. Para eliminar esta carga de la super� cie de la muestra 
existen dos opciones: una de ellas es trabajar en bajo vacío y 
que los iones presentes en la cámara neutralicen la carga so-
bre la muestra. La otra opción es recubrir la muestra con � lm 
conductores (carbón, oro-paladio, platino, etc.) para facilitar 
el � ujo de electrones y trabajar en alto vacío. Esta opción es 
indispensable cuando se necesita mayor resolución ya que se 
requiere un haz de electrones colimado y para ello un camino 
hacia la muestra libre de moléculas con las cuales colisionar. 
La contaminación puede ser una seria limitación cuando 
se trabaja a bajos voltajes de aceleración. Ésta resulta de la 
interacción del haz de electrones con gases residuales y con 
hidrocarburos depositados en la super� cie de la muestra. Una 
imagen producida por SE es particularmente vulnerable a la 
contaminación por su bajo nivel de energía. La contaminación 
se puede reducir realizando una correcta limpieza de la mues-
tra, disminuyendo la corriente de emisión, evitando una alta 
magni� cación o usando una trampa de anticontaminación en 
la columna.
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El material de estudio elegido para este trabajo es el 
glóbulo rojo (GR), también llamado hematíe o eritrocito. Es 
una célula sin núcleo cuya forma � nal normal es de disco bi-
cóncavo. Las variaciones en la forma y en las dimensiones de 
los GR son útiles en el diagnóstico diferencial de las anemias. 
Los hematíes humanos normales tienen un diámetro de 7,5 μm 
a 8,7 μm, con un ligero descenso de la densidad de la célula con 
la edad. Tienen un volumen medio de 90 fL y un área super� cial 
de 136 μm aproximadamente. El exceso de membrana le permi-
te a la célula, tanto adquirir una forma esférica de 150 fL aproxi-
madamente como elongarse para pasar a través de capilares de 
2,8 μm de diámetro. 
El GR pasa la mayor parte de su vida circulando en el in-
terior de los microcapilares. Durante estos 100 a 120 días reco-
rren una distancia de 250 km aproximadamente. En las zonas de 
remanso de la circulación o de � ujo muy lento, los GR viajan en 
agregados de pares a docenas de células, formando rouleaux 
(pilas de monedas), mientras que al salir de los vasos grandes, 
la agregación se rompe debido a las tensiones de cizallamiento 
aumentadas en los capilares.
El eritrocito tiene la importante misión de proteger y trans-
portar la hemoglobina, pigmento respiratorio del organismo. La 
con� guración discoidal es muy adecuada para la función eritro-
citaria. La relación entre la super� cie y el volumen se aproxima 
al valor máximo posible, facilitando así la transferencia gaseosa. 
Figura 2: Esquema del volumen de interacción
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Además, el disco bicóncavo es más deformable que la esfera y 
en consecuencia puede sufrir los cambios necesarios para des-
plazarse dentro de la microcirculación. 
La membrana del GR es responsable de la característica 
forma discoidal del eritrocito y le con� ere su deformabilidad y 
elasticidad. Al igual que cualquier otra membrana biológica, está 
constituida por lípidos, proteínas e hidratos de carbono, los cua-
les están organizados en tres niveles:
1. la bicapa lipídica con proteínas ensambladas;
2. el citoesqueleto, que es una red de proteínas que cu-
bren la super� cie interna de la bicapa lipídica;
3. los glúcidos y las proteínas que se proyectan a una cier-
ta distancia de la super� cie celular.
Las propiedades reológicas del GR son un re� ejo de su 
estructura viscoelástica, porque presenta un comportamiento de 
sólido elástico, dado por el citoesqueleto que le otorga propie-
dades elastoplásticas y un comportamiento � uido, dado por la 
bicapa lipídica que obliga a que los cambios de forma se den sin 
variación del área. 
Cualquier modi� cación que se produzca en la membrana 
de los GR va a afectar su deformabilidad y elasticidad. 
 
 Materiales
Se utilizaron muestras de sangre de dadores sanos. La 
sangre fue extraída por punción venosa y anticoagulada con 
EDTANa. Se utilizó sangre entera (SE) y GR, estos últimos 
fueron separados del plasma por centrifugación y lavados con 
solución salina (PBS). Para realizar la � jación se utilizó gluta-
raldehído (Prevensida 2% y Sigma-Aldrich 25%) en sus corres-
pondientes diluciones. Las deshidrataciones se realizaron con 
solución � siológica con acetona o etanol. 
Se utilizaron soportes de aluminio pulidos, � ltros de poli-
carbonato Nucleopore (1,0 μm; 5,0 μm), portaobjetos de vidrio 
comunes y excavados y � ltros para jeringas Acrodisc (0,5 μm).
Se utilizó el siguiente equipamiento:
� Microscopio Óptico Invertido (Union Optical)
� Microscopio Óptico Leica
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� Cámara Fotográ� ca Canon Power Shot y adaptador 52 
mm para MO,
� Microscopio Electrónico de Barrido Amray
� Microscopio Electrónico de Barrido FEG Quanta 200
� Microscopio Metalográ� co Olympus
� Equipo de Metalización. 
Métodos
A � n de evaluar el más conveniente se ensayaron los si-
guientes protocolos: 
Fijación de las muestras: se utilizaron glutaraldehídos de 
diferentes marcas comerciales para la � jación, seguido de des-
hidratación con acetona (Figura 3), deshidratación con etanol 
(Figura 7), y sin deshidratar (Figuras 4, 5 y 8). Se colocaron 
5 μL de cada muestra sobre el portamuestra y se secaron por 
corriente de aire.
Filtrado: se trabajó sobre � ltros de policarbonato con po-
ros de 1,0 μm de diámetro, haciendo succión con una bomba 
de vacío. Para ello, se realizó la � jación de las muestras y luego 
se colocaron sobre una jeringa conteniendo en su extremo un 
soporte con el � ltro de policarbonato. A continuación, se agrega-
ron unas gotas de solución � siológica y se comenzó a realizar la 
succión. Luego, se realizaron los pasos de deshidratación con 
etanol. Finalizada la succión, se retiró el � ltro de su soporte y se 
permitió el secado con corriente de aire. Se adhirió dicho � ltro 
sobre el portamuestra mediante una lámina de carbón. Como el 
� ltro de policarbonato no es conductor, además de la utilización 
de la lámina de carbón, se realizó un recubrimiento con Au-Pd 
(Figura 6).
Resultados y discusión
A continuación se muestran imágenes tomadas de los di-
ferentes protocolos ensayados. 
 
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Entre las variables consideradas en este estudio está el 
voltaje de aceleración. Un alto voltaje hace que los electrones 
penetren más en la muestra, haciendo que se pierdan detalles 
super� ciales y se gane información de regiones más profundas 
(Figura 7). 
Figura 3. Glóbulo rojo normal 
fijado con glutaraldehído Preven-
sida al 0,5%. Imagen registrada 
con MEB AMRAY a 20 keV, con 
recubrimiento
Figura 4. Glóbulos rojos normales 
� jados con glutaraldehído Sigma-
Aldrich 2,5%. Imagen registrada 
con MEB AMRAY a 10 keV, con 
recubrimiento
Figura 5. Sangre entera � jada 
con glutaraldehído Sigma-
Aldrich 2,5%. Imagen registrada 
con MEB AMRAY a 10 keV, con 
recubrimiento 
Figura 6. Imagen de glóbulo rojo 
normal obtenida con el protocolo 
de � ltrado. Imagen registrada con 
MEB FEG QUANTA 200 a 5 keV, 
con recubrimiento
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Figura7: Glóbulos rojos normales � jados con glutaraldehído Prevensida al 
1,0%. Imágenes registradas con MEB FEG QUANTA 200 sin recubrimiento: 
imagen superior a 10 keV e imagen inferior a 30 keV
Otro punto a tener en cuenta es el daño por radiación al 
que las muestras biológicas son muy sensibles. Este daño de-
pende de la energía del haz de electrones. 
Un elemento a considerar es la pureza de las soluciones 
utilizadas. En esto estudio se observó la in� uencia de las impu-
rezas en la calidad de las imágenes (Figura 8).
Figura 8. Glóbulos rojos incubados con glucosa (1,5g%) y NaCl (7,5g/l) y 
� jados con glutaraldehído Sigma-Aldrich 2,5%. Imagen registrada con MEB 
AMRAY a 10 keV, con recubrimiento
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 Conclusiones
Para estudiar la morfología de glóbulos rojos existe una 
gran cantidad de protocolos que pueden ser utilizados con éxi-
to. Sin embargo, antes de realizar la experimentación hay que 
decidir cuál es la resolución de las imágenes requerida a � n 
de elegir la técnica microscópica adecuada y económicamente 
conveniente. 
Para obtener imágenes de calidad por MEB se requiere: 
de� nir previamente la potencia de trabajo según cuál sea el 
material a analizar para no dañar la muestra y utilizar solucio-
nes de alta pureza en la preparación de las mismas (protocolos 
de� nidos).
Agradecimientos
Agradecemos a los donantes de sangre y al Técnico 
Pablo Díaz. Este trabajo pudo ser realizado gracias al apoyo 
económico del Instituto de Física Rosario (CONICET-UNR) y 
al subsidio otorgado por la Universidad Nacional de Rosario, 
Res. CS Nº 875/2008, al proyecto BIO184 (2008-2011) radica-
do en el Área Física de la Facultad de Ciencias Bioquímicas y 
Farmacéuticas.
Referencias
Arenas Alatorre J. (2005). Contribuciones de la física en la histo-
ria de la microscopía. Revista Digital Universitaria 6 (7), 1067-6079.
Beutler E., Lichtman M., Coller B., Kipps T., Seligsohn U. Williams 
Hematology, 8ª ed. Marbán.
Bogner A., Jouneau P., Basset D., Gauthier C. (2007). A history 
of scanning electron microscopy developments: Towards ��wet-STEM�� 
imaging. Micron 38, 390-401.
Conboy J., Shitamoto R., Parra M., Winardi R., Kabre A., Smith 
J., Mohandas N. (1991). Hereditary elliptocytosis due to both qualita-
tive and quantitative defects in membrane skeletal protein 4.1. Blood 
78 (9), 2438-2443.
Davidson M., Abramowitz M. Optical Microscopy. National High 
Magnetic Field Laboratory, The Florida State University.
100
Di Tullio Budassi L. (2010). Estudio de la morfología eritrocitaria 
mediante el Método de Zipursky-Forconi. Aplicaciones en Hemorreo-
logía Clínica. Trabajo Final de Especialización en Inmunohematología, 
Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR.
Ford B. (2002). El nacimiento del microscopio. ContactoS 45, 29-38. 
Goldstein J. (1992). Scanning electron microscopy and X-ray mi-
croanalysis, Plennun Press, New York.
Hafner B. (2007). Scanning Electron Microscopy Primer. Character-
ization Facility, University of Minnesota-Twin Cities.
Hernández F. Historia de la microscopía electrónica, los primeros 
microscopios electrónicos. Centro de Investigación y Diagnóstico en pa-
rasitología (CIDPA) y Facultad de Medicina Universidad de Costa Rica, 
199-202.
Hetcht E. Óptica. 3ª ed. Pearson Addison Wesley. Capítulo 5: Ópti-
ca Geométrica, 206-234.
Liu S., Derick L., Agre P., Palek J. (1990). Alteration of the erythro-
cyte membrane skeletal ultrastructure in hereditary spherocytosis, he-
reditary elliptocytosis and pyropoikilocytosis. Blood 76 (1), 198-205.
Perez S. (2004). Beta talasemias, interrelación entre el defecto ge-
nético y el fenotipo hematológico y clínico familiar. Tesis Doctoral, Facul-
tad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, UNR.
Pla, L. (2000). Contribution a l'étude de l'af� nité des anticorps mo-
noclonaux par des méthodes d'optique physique, Tesis Doctoral, Uni-
versité Henri Poincare - Nancy 1, Francia. 
Sans-Sabrafen J., Besses Raebel C., Vives Corrons J. Hematolo-
gía Clínica, 5ª ed. Elsevier, 10-11; 82-83.
Sorrivas de Lozano V., Morales A. Introducción a la Microscopía 
Electrónica, Centro Regional de investigaciones básicas y aplicadas de 
Bahía Blanca.
Zipursky A., Brown E., Palko J., Brown E. (1983). The erythrocyte 
differential count in newborn infants. The American Journal of Pediatric 
Hematology/Oncology 5 (1), 45-51.