Aplicaciones de la biología molecular y metodología del ADN reombinante (bioquimica)

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Aplicaciones de la biología molecular y metodología del ADN recombinante
Prof. Roger Duran
Universidad de Carabobo 
Sede Aragua
Facultad de Ciencias de la Salud
Escuela de Medicina “Dr. Witremundo Torrealba”
Departamento de Fisiología y Bioquímica
Catedra de Bioquímica
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción son una herramienta primordial para la ejecución de diversos ensayos útiles en investigación clínica, desde la determinación de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (restriction fragment length polymorphism, RFLP), así como en la construcción de vectores con ADN recombinante y clonación de secuencias de ADN provenientes de humano, virus, bacterias y demás microorganismos de interés para la generación de conocimiento o para su aplicación en el área de la medicina.
Son enzimas especificas capaces de reconocer secuencias palidrómicas de ADN y cortar los enlaces del material genético en un punto especifico.
Palidrómicas quiere decir que leen en dirección opuestas el mismo orden de nucleótidos
Nucleasas
Enzimas capaces de cortar los enlaces fosfodiéster que unen los nucleótidos de una cadena de ácidos nucleicos
Endonucleasas y Exonucleasas
Las nucleasas se denominan endonucleasas si son capaces de cortar el enlace fosfodiester en nucleotidos localizados dentro de la cadena del acido nucleico, y reciben el nombre de exonucleasas si cortan los enlaces fosfodiester de los nucleotidos en los extremos de las cadenas. Asi, existen 3’exonucleasas las que escinden enlaces en el extremo 3’ de la cadena, y 5’exonucleasas que rompen enlaces fosfodiester en el extremo 5’ de la cadena
Endonucleasas que generan extremos cohesivos
Endonucleasas que generan extremos romos
Las endonucleasas de restricción forman parte de la maquinaria con la que cuenta la bacteria para defenderse de infecciones virales. El ADN de la bacteria que produce la enzima de restricción no se ve afectado por su propia enzima, ya que las bacterias metilan determinadas secuencias a su propio ADN para diferenciarlo del ADN viral por medio de una enzima metiltransferasa en bases especificas
Por acuerdo internacional, la nomenclatura de las enzimas de restricción se asigna según su origen bacteriano y se define basándose en las siguientes reglas:
1. Tres letras en cursiva que corresponden al nombre cientifi co de la bacteria de donde fue atraída (p. ej., Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin), etc.). La primera letra, en mayúscula, corresponde al genero; las otras dos, a la especie.
2. La cepa o estirpe, si la hubiese (p. ej., EcoR, aislada de la cepa “RY13” de E. coli).
3. En números romanos, un numero para distinguir si hay mas de una endonucleasa aislada de esa misma especie (p. ej., EcoRI, EcoRV).
4. Todas deberían indicar con una “R” por restricción o una “M” por metilasa, según la función de la enzima, pero generalmente se omite.
Hind III:
H = genero Haemophilus.
in = especie influenzae.
d = cepa DSM 11121.
III = tercera endonucleasa aislada en este organismo.
Eco RI:
E = genero Escherichia.
co = especie coli.
R = cepa RV 13.
I = primera endonucleasa aislada de esta cepa.
De acuerdo a su función las enzimas de restricción se han clasificado en tipo I, II, III.
Se denomina isoesquizomeros a las enzimas de restricción obtenidas de diferente especie bacteriana pero que reconocen la misma secuencia diana de ADN y cortan entre diferentes nucleótidos de dicha secuencia
Ligasa
En bioquímica, ligasa (del latín lig(āre) “juntar”, “unir”) son aquellas enzimas que catalizan la unión de dos moléculas a partir de la formación de enlaces covalentes acompañado por la hidrolisis del ATP
Reacción en cadena de la polimerasa
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se considera una de las técnicas más sensibles y específicas de las pruebas moleculares. Fue desarrollada en 1986 por el Dr. Kary Mullis, en los laboratorios de CETUR Corporation, en Estados Unidos, lo que le hizo valedor del premio Nobel en 1993.
Obtener un gran número de copias de fragmentos específicos de ADN de manera rápida y económica
Componentes de la PCR
El elemento principal en la PCR es el ADN
El buffer es la solución amortiguadora que se usa en la reacción y generalmente está compuesta de Tris-HCL (pH = 8) cuya concentración final de trabajo debe ser 1X.
La ADN polimerasa se encarga de la catálisis de la reacción, sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanco. La enzima más usada con frecuencia se llama Taq ADN polimerasa
El MgCl2 es un cofactor necesario para la actividad enzimática de las ADN polimerasas. La concentración óptima de MgCl2 debe determinarse empíricamente para cada polimerasa, secuencia y par de cebadores
Un oligonucleótido o cebador es una secuencia corta de ADN o ARN, con cincuenta pares de bases o menos. Tienen distintas funciones: se utilizan como cebadores en reacciones de amplificación, como sondas de hibridación y en bloqueos específicos de ARN mensajero.
Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) Provee de nucleótidos (base+ azúcar + fosfato) a la reacción para la síntesis de ADN.
El agua es el disolvente en la reacción y se usa en su forma destilada libre de nucleasas, enzimas que degradan a los ácidos nucleicos.
Componentes de la PCR
Como funciona una PCR
Cada ciclo de la PCR se lleva a cabo en tres etapas principales: desnaturalización, hibridación y extensión
Desnaturalización
Hibridación o Anillamiento
Extensión o Elongación
Amplificación final Una vez terminados los ciclos designados para la PCR, la temperatura de extensión (72°C) se mantiene por cinco minutos, lo que permite que la polimerasa termine la extensión de los productos a los cuales se encuentra unida.
Almacenamiento temporal Durante la programación de los ciclos de la PCR se programa también un ciclo final de 4°C por varias horas, lo que permite conservar los productos de PCR hasta que se retiren los tubos de reacción del equipo.
Como funciona una PCR
¿Donde ocurre esto?
Revelado
Diferentes orígenes de ADN
Cuantificación del numero de copias de ADN
Tipos de PCR
PCR Larga o L-PCR, amplifica dianas de gran tamaño (5 y10kb) pero su limitante se encuentra en la ausencia de mecanismos de corrección de secuencias
PCR anidada: Técnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada
Tipos de PCR
PCR in situ: Se realiza en una muestra de tejido embebida en parafina (laminilla) o congelada y cortada en criostato. No requiere extracción del ADN del tejido. En la laminilla se añaden los reactivos necesarios para la PCR y se colocan en un termociclador especial, ya que en lugar de tener orificios para colocar tubos contiene ranuras para colocar las laminillas. Esta modalidad de PCR permite saber qué tipo celular presente en un tejido expresa un determinado gen o cuál célula está infectada por un patógeno.
Tipos de PCR
PCR múltiple: PCR en la cual se amplifica simultáneamente más de una secuencia. Para ello, se combinan dos o más pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reacción en cantidades suficientes, para amplificar simultáneamente varios segmentos de ADN.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR): Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa para realizar la síntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). 
Tipos de PCR
PCR en tiempo real o PCRq (qPCR)(RT-qPCR): El término en tiempo real se refiere a que la detección de los productos amplificados sucede en cada ciclo de la reacción. Por su parte, el término cuantitativo hace referencia a que es posible cuantificar la cantidad de ADN en la muestra, a diferencia de la PCR punto final en donde no es posible detectar en tiempo real ni cuantificar la secuencia blanco. Un láser que detecta fluorocromos acoplados a los primers o a una sonda que hibridaen medio de los primers, que se degrada y libera su fluorocromo por la acción exonucleasa 3’-5’ de la polimerasa
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
La Técnica de Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, más conocida como RFLP (del inglés: Restriction Fragment Length Polymorphism) es una técnica de biología molecular que nos permite detectar fragmentos de ADN de diferentes longitudes, esta técnica se basa en la acción de las enzimas de restricción, las cuales reconocen secuencias específicas de nucleótidos del ADN y hacen un corte en la cadena.
Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción
Polimorfismos
La palabra polimorfismo está compuesta por poli (muchos), morfo (forma) e ismo (proceso o estado); es decir, “de muchas formas”. Los ácidos nucleicos y las proteínas tienen la propiedad de presentarse en diferentes formas moleculares o en múltiples alelos, lo que puede tener implicaciones en las patologías moleculares. Un polimorfismo puede observarse en un individuo completo (polimorfismo fenotípico), en formas variables de proteínas o grupos sanguíneos (polimorfismo bioquímico), en las características morfológicas de los cromosomas (polimorfismo cromosómico) o en el ADN, por diferencias en la secuencia nucleotídica (polimorfismos del ADN).
Polimorfismos
Polimorfismos
Cualquier tipo de SNP puede estar relacionado con una enfermedad o tener asociado un fenotipo observable, de forma que:
Ciertos SNP en las regiones no codificantes de algunos genes correlacionan con un aumento en la probabilidad de desarrollar cáncer.
Algunos SNP en regiones codificantes consistentes en sustituciones sinónimas, pese a no modificar la secuencia aminoacídica de la proteína, podrían alterar su función. Esto ocurre, por ejemplo, en el caso del receptor de resistencia múltiple a drogas 1 (MDR1), donde un SNP de mutación silenciosa ralentiza la traducción del péptido naciente, haciendo que se pliegue adoptando una conformación alternativa menos funcional que la estructura tridimensional nativa.
Los SNP que implican una sustitución con cambio de sentido alteran la secuencia aminoacídica y son los que más frecuentemente están asociados a la aparición de enfermedades. Un ejemplo de esto es el SNP 1580G>T en el gen LMNA, que provoca el cambio de arginina por leucina en la proteína, fenotipo relacionado con enfermedades como la progeria o la displasia mandibuloacral.
Los SNP sin sentido provocan la aparición de un codón de stop prematuro que trunca la proteína resultante, haciéndola incompleta y normalmente no funcional. Esto se refleja en la mutación G542X en el gen CTFR, causante de la fibrosis quística.
Polimorfismos
Polimorfismo de conformación de cadena simple
ADN Recombiante
El ADN recombinante, producto de la recombinación genética, es una molécula de ADN híbrida formada por la unión de dos secuencias de ADN provenientes de dos orígenes distintos, cuando hablamos del ADN recombinante en el ámbito de la ingeniera genética nos referimos a una molécula de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos distintos que normalmente no se encuentran juntos
Proceso general para la clonación de Genes
No hay un solo objetivo en la clonación, sino que este varia dependiendo el uso posterior del gen clonado, por lo que si, solo queremos obtener varias copias de ADN el objetivo y metodología de la clonación será diferente a si se quiere expresar este gen y posteriormente el péptido traducible
Proceso general para la clonación de Genes
La clonación de ADN, o clonación molecular, es la introducción de un fragmento de ADN denominado inserto dentro de una molécula de ADN denominada vector, que puede replicarse de manera autónoma e independiente del genoma de la célula hospedera.
Vectores de clonación
Un vector se define como una molécula de ADN de doble cadena (DNAds), con capacidad de albergar un fragmento de ADN exógeno (de otro origen).
Elementos que forman un vector de clonación
Origen de replicación: es una secuencia en el ADN del vector que provee un sitio único de reconocimiento a las proteínas que identifican el sitio de inicio de la replicación (ORI).
Elementos que forman un vector de clonación
Marcador de selección: es un gen que generalmente confiere resistencia a un antibiótico o genera un fenotipo particular con el cual puede seleccionarse la célula que incorporó el vector.
Elementos que forman un vector de clonación
Sitio de clonación múltiple: es un fragmento de ADN que contiene una serie de sitios únicos de reconocimiento para enzimas de restricción, muy cercanos entre sí, con una amplia gama de posibilidades de insertar cualquier fragmento de ADN 
Tipos de Vectores
Clonación
La clonación de cualquier fragmento de ADN involucra los siguientes pasos
1. Preparación del inserto de ADN que se va a clonar.
2. Preparación del vector para la clonación.
3. Ligación del inserto y el vector.
4. Preparación de células competentes.
5. Transformación celular.
6. Identificación de las colonias celulares que contienen el
vector recombinante.
Clonación
La selección de la(s) enzima(s) que corten el ADN es un punto crítico que determina la facilidad y la eficiencia de la metodología. Para facilitar la clonación se prefiere el uso de enzimas de restricción cuyos sitios de corte estén presentes en el sitio de clonación múltiple del vector, con lo que se evita la necesidad de una posible modificación posrestricción del inserto
Transformación o Transfección
Preparación de células competentes: Para su replicación, los vectores requieren encontrarse dentro de una célula, que debe prepararse para hacerla permeable a la entrada del vector recombinante, proceso denominado generación de células competentes. Las células competentes generalmente son células procariotas. La bacteria más utilizada para este procedimiento es E. coli, que carece de un mecanismo natural para la incorporación de ADN exógeno. El estado de competencia puede inducirse por diferentes métodos de laboratorio, y la elección del método dependerá del procedimiento de transformación seleccionado.
Transformación bacteriana
Transformación bacteriana
Transfección
En sentido amplio, la transfección consiste en la introducción de material genético externo en células eucariotas mediante plásmidos u otras herramientas para la transferencia. En un sentido más reducido, frecuentemente se usa solo para referirse a la introducción de material genético en células animales, prefiriéndose otros términos para otras células
Métodos Químicos: Basados en la formación de complejos que las células sean capaces de adquirir e incorporar, ya sea directo mediante la ruta endocítica o a las membranas.
Método del fosfato cálcico: Basado en la formación de un precipitado, entre el cloruro de calcio y el DNA en una solución salina de fosfatos; estos forman unos agregados que son endocitados/fagocitados por las células. Aparentemente el agregado con calcio protege al DNA de la degradación por las nucleasas celulares.
Método del DEAE dextrano: Basado en la obtención de complejos entre la resina y DEAE y el DNA, los polímeros del DEAE dextrano tienen una carga que les permite unirse a las cargas muy negativas de las moléculas del DNA. El DNA acomplejado se introduce en las células mediante choque osmótico mediante DMSO o glicerina.
Método de lipofección: Se basa en la formación de complejos entre lípidos catónicos y DNA, este complejo tiene afinidad por la membrana y permite la entrada del DNA en el cito-sol; una de las vías es la incorporación de liposomas a la membrana y la entrada flip-flap.
Métodos Físicos: Basados en la introducción mecánica de las moléculas en el interior de la célula.
Micro-inyección directa: Se emplea en la introducción del DNA recombinante en las células embrionarias en el proceso de obtención de animales transgénicos, esta técnica es muy efectiva pero laboriosa.
Electroporación: se provoca unaumento significativo de la permeabilidad de la membrana plasmática celular mediante un campo eléctrico aplicado externamente, que genera poros que el ADN puede atravesar. Una variante es la nucleofección, una electroporación optimizada para dirigir ácidos nucleicos no solo al citoplasma, sino al núcleo celular.
Biobalística: introducción del DNA adherido a micro-partículas que se disparan sobre la célula
Terapia génica
La terapia genética (también conocida como terapia génica o genoterapia) es una técnica experimental que utiliza los genes para tratar o prevenir enfermedades. La forma más común de terapia genética incluye la inserción de un gen normal para sustituir a uno anormal. Otros tipos incluyen:
Intercambio de un gen anormal por uno normal
Reparación de un gen anormal
Alteración del grado en el que se active o se desactive un gen
Tipos de terapia génica
Terapia génica somática: se realiza sobre las células somáticas de un individuo, por lo que las modificaciones que implique la terapia solo tienen lugar en dicho paciente.
Terapia in vivo: la transformación celular tiene lugar dentro del paciente al que se le administra la terapia. Consiste en administrarle al paciente un gen a través de un vehículo (por ejemplo un virus), el cual debe localizar las células a infectar. El problema que presenta esta técnica es que es muy difícil conseguir que un vector localice a un único tipo de células diana.
Terapia ex vivo: la transformación celular se lleva a cabo a partir de una biopsia del tejido del paciente y luego se le trasplantan las células ya transformadas. Como ocurre fuera del cuerpo del paciente, este tipo de terapia es mucho más fácil de llevar a cabo y permite un control mayor de las células infectadas. Esta técnica está casi completamente reducida a células hematopoyéticas pues son células cultivables, constituyendo así un material trasplantable.
Terapia génica germinal: se realizaría sobre las células germinales del paciente, por lo que los cambios generados por los genes terapéuticos serían hereditarios. No obstante, por cuestiones éticas y jurídicas, esta clase de terapia génica no se lleva a cabo hoy en día.
Un oligonucleótido antisentido es una cadena de entre 13 y 25 nucleótidos que tiene una secuencia de bases complementaria de un fragmento de ARN mensajero. Se obtienen artificialmente en el laboratorio y se utilizan como agente terapéutico en enfermedades de origen genético, o bien para estudiar la función de un gen concreto
Oligonucleotidos antisentido
Oligonucleotidos antisentido
Induciendo el silenciamiento de determinados exones que contienen una mutación perjudicial.
Excluyendo un pseudoexón, provocado por una mutación en el lugar de empalme exón-intrón en la cadena de ADN.
Saltándose uno o varios exones de forma que la lectura del ADN evita la zona mutada