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Universidad de Concepción Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas Magíster en Ciencias y Recursos Naturales con Mención en Botánica ABUNDANCIA Y ACTIVIDAD PROMOTORA DEL CRECIMIENTO VEGETAL DE BACTERIAS ASOCIADAS A PLANTAS DE FORMACIONES XEROFÍTICAS ANDINAS Y SU USO POTENCIAL EN LA RESTAURACIÓN ECOLÓGICA Tesis para optar al grado académico de Magíster en Ciencias y Recursos Naturales con Mención en Botánica POR: CARLA AGUILERA TORRES Profesora Guía: Dra. Angela Sierra Profesor Co-guía: Dr. Mauricio Schoebitz Concepción, Chile, 2022 Se autoriza la reproducción total o parcial, con fines académicos, por cualquier medio o procedimiento, incluyendo la cita bibliográfica del documento. Esta tesis ha sido realizada en el Grupo de Ecofisiología Térmica en el Departamento de Botánica de la Facultad de Ciencias Naturales y Oceanográficas. Ha sido Aprobada por la siguiente comisión evaluadora: Profesor Guía ___________________________ Dra. Angela Sierra Almeida Profesor Co-Guía ___________________________ Dr. Mauricio Schoebitz Evaluadores ___________________________ Dr. Pablo Guerrero ___________________________ Dr. Rodrigo Hasbún ___________________________ Dr. Götz Palfner Directora de Programa __________________________ Dra. Fabiola Cruces Director Dirección de Postgrado __________________________ Dr. Bernardo Riffo Ocares A mis plantas, en ellas encuentro vida y preguntas. AGRADECIMIENTOS En este transcurso de intenso aprender, trabajar, infinitas colaboraciones y conversaciones, doy gracias a todas las personas que estuvieron presentes en estos dos años y 10 meses en el capítulo de mi vida llamado “que buena idea sería hacer un Magíster en Botánica”. A quien me dijo que si apenas escribí ese correo para postular al Magíster. A mi profe Angela Sierra…queridísima, eterna cómplice y guía espiritual que encauzó mis ideas, y en todo momento estuvo ahí apañándome, desafiándome, abriéndome las puertas de sus dos laboratorios, el que está en la universidad y el otro allá lejitos sobre el límite arbóreo. Por hacerme crecer en niveles que jamás pensé crecer. No caben las hojas, ni palabras, ni sentires para agradecer todo lo que aprendí de mi profe, una gran científica, persona y mujer, no pude haber tenido una mejor guía. Agradezco al profe Mauricio Schoebitz, por su paciencia y por enseñarme ese mundo bajo los suelos, por solucionar cada imprevisto y por dar calma cada vez que un ensayo no resultaba, por darme la confianza para asistir a su laboratorio y crecer en él. Gracias a todos mis compañeros del Laboratorio de Suelos, especialmente a Matías que nos ayudó a colectar suelos en Fumarolas y también a Gustavo Riveros que colaboró desinteresadamente en la elaboración de mi metodología, escritura del artículo, agradezco cada una de sus brillantes ideas, agradezco igual a Paulo que fue un apoyo tremendo cuando estuvo en el laboratorio, especialmente con la formulación de mis reactivos y su rigor para realizar cada experimento. A la profe Lola y a Felipe del Laboratorio de Bioactivos en plantas e Ingredientes Vegetales, por apañarme con cada insumo que faltaba, por las conversaciones metodológicas, por cada solución, y por ayudarme a realizar las mediciones en HPLC. Del Departamento de Botánica, agradezco al profe José Becerra por dar apoyo con sus instalaciones, personal y equipos para realizar las mediciones en el cromatógrafo, al igual que a la Dra. Claudia Pérez quien nos orientó con las primeras aproximaciones del ensayo ARA. También agradezco a Bartolo por permitirnos ocupar su sensor PAR. A Alfredo Saldaña por prestarnos el fluorímetro durante todo el periodo de mediciones. Al laboratorio de Fisiología Vegetal que nos colaboró con materiales para la realización del ensayo en las cámaras de crecimiento. Al profe Rodrigo Hasbún, quien con su proyecto de Fondo de Investigación del Bosque Nativo (CONAF FIBN 047/2020), permitió financiar la mayoría de los ensayos que se realizaron en esta tesis, quien también facilitó la identificación de mis bacterias, encauzó ideas para afinar mis resultados y confió en mi para modificar objetivos y metodologías. A Pablo Azúa, Coordinador del programa de Restauración Cayumanque, quien me facilitó 60 individuos de Gomortega keule para la realización de este ensayo. A mis compañeros GET: Loreto, Esteban, Diego y Catalina, que los quiero y alegran la vida en el Laboratorio, gracias por todo lo que entregan, por esa energía de vivir la montaña y compartir las plantas, por cada pregunta curiosa que encendía la llama, por los mates, las risas, conversaciones profundas y no tan profundas, por crecer juntos, acompañarnos y ser el equipo que toda persona querría tener… aprendí de formas hermosas junto a ustedes. Mención honrosa a mi Dra. Morales, que gran amiga, tan sabia y perseverante, gracias por todo lo bonito que aprendí de ti. A mi mamá y mi hermana, que me apoyaron emocionalmente cada vez que la moral bajaba, por su amor, especialmente el primer año de pandemia. Gracias por esperarme con comida rica cada vez que volví a casa, por consentir mis mañas, por las diarias e infaltables llamadas, ánimos y risas… pero por sobre todo por dejarme ser, hacer y vivir libremente de las plantas. A mi Antü que en el primer año me acompañó intensas madrugadas, por sus exigentes solicitudes para salir a pasear y curiosear juntas. A mí misma, por las múltiples Carlas, que perseveraron, dieron espacio y se entregaron a las locuras de la Carli estudiosa y curiosa… Lo dimos todo. Y a mis plantas… A mis plantas siempre. INDICE ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................. 1 ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................ 4 RESUMEN ............................................................................................................... 6 ABSTRACT ............................................................................................................. 8 INTRODUCCIÓN ................................................................................................... 10 A. PREGUNTAS, HIPÓTESIS, OBJETIVOS ................................................................ 20 OBJETIVO ESPECÍFICO 1. DETERMINAR CÓMO VARÍA LA ABUNDANCIA Y ACTIVIDAD DE BACTERIAS ASOCIADAS A DOS ESPECIES VEGETALES DE FORMACIONES XEROFÍTICAS ANDINAS QUE CRECEN EN LADERAS OPUESTAS. .............................................................................................................................. 22 METODOLOGÍA................................................................................................. 22 RESULTADOS ................................................................................................... 32 OBJETIVO ESPECÍFICO 2. EVALUAR DIFERENCIAS EN LA SUPERVIVENCIA, DESEMPEÑO Y CRECIMIENTO DE PLANTAS NATIVAS EXPUESTAS A SEQUÍA, AL SER INOCULADAS CON PGPB ASOCIADAS A PLANTAS DE FORMACIONES XEROFÍTICAS ANDINAS. ..................................................................................... 44 METODOLOGÍA................................................................................................. 44 RESULTADOS ................................................................................................... 53 DISCUSIÓN ........................................................................................................... 61 CONCLUSIÓN ....................................................................................................... 72 REFERENCIAS .....................................................................................................75 1 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Sitio de estudio ubicado en el complejo volcánico Nevados de Chillán. Letras a. y b. indican las laderas norte y sur respectivamente. Las especies seleccionadas presentes en ambas laderas se indican en el costado derecho: c. A. prolifera y d. B. empetrifolia. .................................................................................. 24 Figura 2. Condiciones climáticas del suelo medidas en dos laderas contrastantes del complejo volcánico Nevados de Chillán. a. El potencial hídrico (MPa) y la b. Temperatura del suelo (°C) fueron medidos a 15 cm de profundidad del suelo en dos laderas contrastantes. Los valores corresponden a la media ± EE (n = 3). Las flechas azules indican las nevadas. Los asteriscos muestran diferencias significativas (ANOVA de medidas repetidas, p <0,05). ........................................ 35 Figura 3. Abundancia bacteriana calculada en Log UFC g¯¹ para el suelo de A. prolifera (a) y B. empetrifolia (b). Los valores indican media ± EE (n = 3). Las letras indican diferencias significativas entre las laderas (prueba de Wilcoxon, p > 0,05) .............................................................................................................................. 39 Figura 4. Árbol filogenético de 9 aislados bacterianos obtenidos de las especies A. prolifera y B. empetrifolia, en las laderas norte y sur en el complejo volcánico Nevados de Chillán. .............................................................................................. 40 2 Figura 5. Producción de ácido indolacético (IAA) de bacterias aisladas de 2 especies de formaciones xerofíticas andinas en laderas opuestas. Para todos los mecanismos las columnas se dividieron por especie: en la izquierda la especie A. prolifera y a la derecha la especie B. empetrifolia. Para cada especie las laderas se indican con colores: verde para la ladera norte y celeste para la ladera sur. Los valores indican la media±EE. Letras iguales indican que no existen diferencias (t- test o equivalente no paramétrico, p > 0,05). ........................................................ 41 Figura 6. Mecanismos promotores del crecimiento vegetal de carácter enzimático de bacterias aisladas de 2 especies de formaciones xerofíticas andinas en laderas opuestas. Para todos los mecanismos las columnas se dividieron por especie, en la izquierda la especie A. prolifera y a la derecha la especie B. empetrifolia. Para cada especie las laderas se indican con colores, verde para la ladera norte y celeste para la ladera sur. La actividad de la enzima ACC desaminasa (a y b) se presentan como µM de α-cetobutirato. La solubilización de fosfato (c y d) se presenta como Indice P. La fijación de nitrógeno (e y f) se indica como nmoles C₂H₄ d¯¹vial¯¹. Barras de error indican la media±EE. Letras distintas por sobre barras de error indican diferencias significativas entre laderas (T test o equivalente no paramétrico, p < 0,05), letras iguales indican que no existen diferencias (T test o equivalente no paramétrico, p > 0,05). .......................................................................................... 43 Figura 7. Condición inicial de plantas de G. keule utilizadas para inoculación bacteriana.............................................................................................................. 48 3 Figura 8. Medias del potencial hídrico (MPa) de los suelos de los tratamientos riego y sequía durante el ensayo de inoculación bacteriana en plantas de G. keule. Los valores corresponden a la media ± EE. La Línea vertical de color negro muestra el período en el cual se realizó el desfonde de los maceteros. ................................. 54 Figura 9. Gráfico de la tabla de supervivencia proveniente de análisis Kaplan-Meyer para los tratamientos con riego (a) y sequía (b), con tres tipos de inoculación (NIAA, PACC y sin bacteria). ............................................................................................ 55 Figura 10. Indicadores de desempeño de la planta para los tratamientos riego (izquierda) y sequía (derecha), con 3 tipos de inoculación (NIAA, PACC y sin bacteria). Barras de error indican error estandar (media ±EE). Líneas verticales de color negro indican el tiempo en el cual se realizó el desfonde de los maceteros para el tratamiento con sequía. La eficiencia fotoquímica máxima del fostosistema II (Fv/Fm) se indican con las letras a y b. La conductancia estomática (nmol/m2s) se indican con las letras c y d. ............................................................................... 57 Figura 11. Indicadores de crecimiento para determinar el efecto de la inocuación bacteriana en plantas de G.keule en los tratamientos riego (izquierda) y sequía (derecha), con tres tipos de inoculación (NIAA, PACC y sin bacteria). Baras de error indican el error estándar (media ±EE). Comparaciones estadísticas (ANOVA de varianza factorial o equivalente no paramétrico) se indican con letras por sobre las barras de error: a y b indican que existen diferencias estadísticamente significativas (p < 0,05), letras iguales indican que no existen diferencias estadísticamente 4 significativas (p > 0,05). El número de hojas se indica en los paneles a y b. Las medias del Área Específica de la Hoja (SLA, mm2 mg-1) se indican en los paneles c y d. La Longitud Específica de la Raíz (LER, m g-1) se indican con las letras e y f. Relación Raíz Brote de plantas se indican en los paneles g y h. ..................... 60 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Condiciones térmicas y de humedad del aire medidas en dos laderas contrastantes de la zona alpina del complejo volcánico Nevados de Chillán. Los valores corresponden a la media ± EE (n = 3) para todo el período sin nieve entre el 28 de octubre de 2021 y el 19 de abril de 2022. Letras distintas indican diferencias significativas (p <0,05). Las temperaturas extremas se muestran entre paréntesis como valores absolutos. ........................................................................................ 33 Tabla 2. Caracterización química de los suelos bajo el dosel de las especies A. prolifera y B. empetrifolia, ubicadas en las laderas norte y sur en el complejo volcánico Nevados de Chillán. Los valores representan la media + EE (n = 3). Las letras diferentes indican diferencias significativas entre las laderas (prueba T o equivalente no paramétrico, p ≤ 0,05). .................................................................. 37 5 Tabla 3. Caracterización de inóculos bacterianos utilizados en el ensayo, señalando actividad, ladera y especie asociados a ellos junto con la identidad probable de la bacteria y la concentración del inóculo (Log UFC g -1) .......................................... 46 Tabla 4. Tratamientos diferenciales en disponibilidad hídrica y tipo de inoculación para el desarrollo de individuos juveniles de G. keule, con distintos tipos de inóculos. .............................................................................................................................. 49 6 RESUMEN Las plantas interactúan con una gran diversidad de bacterias promotoras del crecimiento vegetal (PGPB, del inglés Plant Growth-Promoting Bacteria), que mejoran su desempeño fisiológico, especialmente en condiciones de estrés. En sistemas naturales con componente extrema como la alta montaña, este tipo de interacción ha sido escasamente estudiada, pese a que se tiene conocimiento que las plantas de estos sistemas poseen una alta especialización y un microbioma asociado potencialmente benéfico. En la zona centro sur de la cordillera de los Andes, se ubican una de las formaciones xerofíticas más australes de Chile, que componen centros de alta biodiversidad,y a su vez se encuentran expuestos a una alta degradación de sus hábitats producto de la constante actividad antrópica. Las especies que componen estos sistemas sobreviven y crecen pese a la sequía estival y a las bajas temperaturas propias de un sistema alpino, por lo que es probable que la capacidad de estas plantas para enfrentar las limitaciones climáticas esté complementada por la interacción benéfica con PGPB. Considerando la potencialidad de estos microbiomas para asistir a otras especies nativas en condiciones extremas, es que el presente proyecto buscó realizar una primera aproximación a este sistema, a través de dos preguntas claves ¿Existen diferencias en la abundancia y en la actividad promotora del crecimiento de bacterias asociadas a plantas de las formaciones xerofíticas andinas que crecen en laderas opuestas? y ¿Cuáles son los efectos en el crecimiento y supervivencia de plantas nativas expuestas a sequía cuando son inoculadas con PGPB aisladas de especies de formaciones xerofíticas andinas? Para responder estas preguntas se midió la 7 abundancia de bacterias presentes en los suelos de las especies arbustivas Azorella prolifera y Berberis empetrifolia, ambas presentes en laderas de exposición contrastante en la zona alpina del complejo volcánico Nevados de Chillán. Las bacterias más abundantes fueron seleccionadas y aisladas para evaluar la actividad de distintos mecanismos promotores del crecimiento vegetal: la actividad de la enzima nitrogenasa, fosfatasa, ACC desaminasa y la fitohormona ácido indolacético, las cuales fueron comparadas entre laderas. Posteriormente, se seleccionaron 4 cepas bacterianas abundantes correspondientes a los géneros Arthrobacter y Pseudoarthrobacter, las cuales obtuvieron mayor actividad en cada uno de los mecanismos evaluados, para ser bioencapsuladas e inoculadas en plantas de Gomortega keule en condiciones de vivero. Se evaluó el efecto de la inoculación en condiciones de sequía sobre distintos indicadores de supervivencia, desempeño y crecimiento de las plantas inoculadas. Los resultados indicaron una mayor abundancia bacteriana (Log UFC g-1) en los suelos de B. empetrifolia de la ladera norte (6,43 Log UFC g-1), mientras que la actividad de los mecanismos promotores del crecimiento vegetal varió entre laderas y las tendencias de dependieron de la especie. La inoculación bacteriana no tuvo efectos en la supervivencia, desempeño y crecimiento de las plantas de G. keule. Es probable que los microorganismos de la rizósfera de G. keule hayan interactuado de forma negativa con los microorganismos inoculados. Es necesario explorar el microbioma asociado a plantas nativas que se deseen inocular, y el de los sustratos generalmente utilizados en programas de viverización, ya que esta información sería relevante para predecir la interacción entre microorganismos inoculados y no inoculados. 8 ABSTRACT Plants interact with a great diversity of Plant Growth-Promoting Bacteria (PGPB), which improve the physiological performance of their host, especially under constraint conditions. In natural systems with extreme components such as high- elevation systems, this type of interaction has been scarcely studied, although it is known that plants in these systems have high specialization and a potentially beneficial associated microbiome. In the south-central zone of the Chilean Andes, one of the southernmost xerophytic formations in Chile is located, which are “Hotspot of Biodiversity” and is exposed to habitat degradation by anthropogenic activity. Plants that live in these systems have to cope with summer drought and low temperatures. Thus, the ability of plants to tolerate climatic limitations could be favored by the beneficial interaction between plants and their associated PGPB. Considering the potential of these microbiomes to assist other native species in extreme conditions, this proposal deals with two key questions: Are there differences in the abundance and growth-promoting activity of bacteria associated with plants from Andean xerophytic formations growing on opposite slopes? What is the effect on the growth and survival of native plants exposed to drought when are inoculated with PGPB isolated from species of Andean xerophytic formations? To answer these questions, was measured the abundance of bacteria present in the soils of Azorella prolifera and Berberis empetrifolia species, both present on contrasting slopes in the Nevados de Chillán volcanic complex. The most abundant bacteria were selected and isolated to evaluate the activity of different plant growth-promoting mechanisms: the activity of the enzyme nitrogenase, phosphatase, ACC deaminase, and the 9 phytohormone indoleacetic acid, which were compared between slopes. Subsequently, 4 abundant bacterial strains with the highest activity per mechanism corresponding to the genus Arthrobacter and Pseudoarthrobacter were selected to be bioencapsulated and inoculated in Gomortega keule plants under nursery conditions. The effect of inoculation under drought conditions on different indicators of survival, well-being, and growth of the inoculated plants was evaluated. PGBP (Log CFU g-1) were more abundant in B. empetrifolia soils on the northern slope (6,43 Log CFU g-1), while mechanisms do not have the same activity between slopes and their trends depend on the plant species. As for the bacterial inocula, no effect on the survival, welfare and growth of inoculated plants was observed. Further studies have to explore the microbiome associated with native plants to be inoculated, and that of commercial soils generally used in nursery programs, as this information would be relevant to predicting the interaction between inoculated and non-inoculated microorganisms. 10 INTRODUCCIÓN Las bacterias promotoras del crecimiento vegetal (del inglés, Plant Growth- Promoting Bacteria, PGPB) son un grupo diverso de microorganismos benéficos para las plantas, que poseen formas de vida libre o endófitas y habitan distintos compartimentos de la planta (Douza et al. 2015: Afzal et al. 2017). La promoción del crecimiento vegetal puede ocurrir de forma directa o indirecta a través de mecanismos que han sido ampliamente documentados (e.g. Gamalero & Glick, 2011; Ramakrishna et al. 2019) y que incluyen actividades enzimáticas y la producción de fitohormonas bacterianas (Glick, 2012). Entre los mecanismos más documentados se encuentran la fijación de nitrógeno, la solubilización de fosfatos, la producción de fitohormonas, los sideróforos y la actividad de enzimas como la ACC desaminasa, que promueven la resistencia a diferentes factores de estrés (e.g. sequía, Ashry et al. 2022; salinidad, Kumar et al. 2020, metales pesados, Kong & Glick, 2017). Las formas en las que opera cada mecanismo promotor del crecimiento son diversas. Por ejemplo, la enzima bacteriana nitrogenasa cataliza el nitrógeno molecular a amoníaco, que es absorbido por las plantas aumentando el rendimiento de los cultivos (Franche et al. 2009). Asimismo, bacterias con actividad enzimática ACC desaminasa pueden degradar el 1-aminociclopropano-1- carboxilato (ACC, precursor del etileno) produciendo amoníaco y α-cetobutirato (Hontzeas et al. 2006). La disminución de los niveles de etileno permite a la planta sobrevivir en condiciones de estrés (como, sequía y salinidad) (Glick et al. 2007; Orozco-Mosqueta et al. 2021). Igualmente, la solubilización de fosfatos opera a través de la actividad de enzimas bacterianas como la fosfatasa, la fitasa y la liasa 11 C-P solubilizan el fosfato orgánico en fosfato inorgánico, que puede ser absorbido y utilizado para el metabolismo de las plantas (Rawat et al. 2020). También, fitohormonas como el ácido indol acético (IAA), producido por las bacterias estimulanla división celular de la planta, potenciando el crecimiento de las raíces y de las estructuras aéreas (Duca & Glick, 2020). A pesar de que la forma en que opera cada uno de estos mecanismos ha sido ampliamente estudiada, no ocurre lo mismo para los estudios relacionados a los factores que influyen en una mayor o menor actividad de cada uno. Existen distintos factores controlados por la planta que determinan la abundancia y actividad de distintas PGPB. Entre estos factores bióticos, el exudado radicular de las plantas, rico en azúcares para el metabolismo microbiano, es uno de los factores que favorecen significativamente la actividad promotora del crecimiento y la interacción planta-PGPB (Bais et al. 2006). La liberación de exudados radiculares está sujeta a las condiciones abióticas a las que se exponen las plantas, como la disponibilidad de agua y nutrientes en el suelo y la temperatura ambiental (Hale & Moore, 1980). La composición de estos exudados radiculares puede favorecer la presencia y actividad de las PGPB, especialmente cuando las condiciones ambientales son estresantes para las plantas (Vives-Peris et al. 2018; Barbosa et al. 2020). Por ejemplo, en un trabajo realizado por Xiong et al. (2020) observaron que en condiciones de estrés salino la supervivencia de la planta Limonium sinense (Girard) Kuntze aumentaba cuando era inoculada con bacterias del género Bacillus, efecto que ocurría en respuesta al cambio en la composición de los exudados radiculares que favorecían la interacción. Considerando los antecedentes expuestos, donde los exudados radiculares pueden favorecer o 12 repeler a las PGPB en determinadas condiciones ambientales sería esperable que bajo condiciones de mayor estrés para las plantas la probabilidad de encontrar estos microorganismos sería mayor. Los factores abióticos del suelo también pueden afectar al microbioma de las plantas. Por ejemplo, la composición química del suelo influye en la actividad de los mecanismos promotores del crecimiento vegetal (Kumar et al. 2020; Alemneh et al. 2022). En primer lugar, la fijación de nitrógeno se ve favorecida por el aumento de la disponibilidad de fósforo y carbono, pero disminuye en presencia de metales pesados (Liengen, 1999; Wakelin et al. 2010). Para la solubilización de fosfato, estudios como los de Mujahid et al. (2015) mencionan que el carbono y el nitrógeno del suelo potencian esta actividad, mientras que otros señalan que la solubilización de fosfato está correlacionada negativamente con el nitrógeno, el fósforo y el carbono (Alemneh et al. 2022). Con respecto a la producción de ácido indol acético (IAA), se menciona que esta se correlaciona positivamente con la presencia de triptófano y metales pesados y se relaciona negativamente con la disponibilidad de azúcares, nitrógeno y fósforo (Ahmad et al. 2005; Mendoza-Hernández et al. 2016; Alemneh et al. 2022). En cuanto a la actividad ACC-desaminasa, las bacterias aumentan su capacidad de desaminar ACC en presencia de metales pesados (Mendoza-Hernández et al. 2016). La temperatura y la humedad ambiental también se han definido como impulsores de la actividad promotora del crecimiento bacteriano (Rousk et al. 2010). La temperatura ideal para la solubilización del fosfato está por debajo de los 25°C (Mujahid et al. 2015), mientras que las temperaturas más altas junto con una mayor acidez del suelo aumentan la producción de IAA (Kanu & Dakora, 2009; Alemneh et al. 2022). La disponibilidad de agua, a su vez, 13 ha sido definida como un recurso indispensable para la actividad de las bacterias fijadoras de nitrógeno en climas fríos como la tundra ártica (Rousk et al. 2018). Si bien, cada grupo bacteriano posee requerimientos particulares que influyen en su abundancia y actividad, aún no se comprende del todo cómo esta variabilidad ambiental afecta a los microorganismos cuando provienen de un mismo sistema. En general, la caracterización de las PGPB ha sido explorada en sistemas agrícolas, debido a la demanda alimentaria a nivel global (Bhattacharyya & Jha, 2012; Ramakrishna et al. 2019). Sin embargo, en los sistemas naturales con una menor proporción de estudios, se han encontrado PGPB con un gran potencial y novedad (Pérez-Jaramillo et al. 2018) especialmente en ambientes climáticamente limitantes. Por ejemplo, Sezen et al. (2016) aislaron bacterias de la rizósfera de distintas plantas silvestres de las regiones montañosas de Turquía, y posteriormente evaluaron distintos mecanismos promotores del crecimiento, que permitieron seleccionar seis aislados para inoculación en plantas de trigo, donde la totalidad de ellos tuvo un efecto positivo en el crecimiento de las plantas inoculadas. Así mismo, en el altiplano chileno, se aislaron bacterias con ACC desaminasa de la rizósfera de la planta nativa Parastrephia quadrangularis (Meyen) Cabrera, las cuales se inocularon en plantas de trigo y aumentaron su biomasa en condiciones de estrés salino (Acuña et al. 2019). En el desierto de Atacama también se han detectado una gran proporción de PGPB correspondientes a los taxones Actinobacteria y Proteobacteria en el microbioma rizosférico de plantas perennes como Baccharis calliprinos Griseb y Solanum chilense (Dunal) Reiche (Fuentes et al. 2020), y de otras efímeras como Cistanthe longiscapa (Barnéoud) Carolin ex Hershkovitz que sólo crecen durante los eventos del desierto florido (Astorga-Eló et al. 2020). Sin 14 duda la capacidad de las PGPB para crecer y promover el crecimiento vegetal en ambientes climáticamente limitantes para muchas formas de vida, fomentan su exploración para encontrar soluciones en la recuperación de suelos o producción de plantas. Los sistemas alpinos representan un laboratorio natural para explorar la presencia y la actividad de los PGPB debido a las múltiples condiciones limitantes para la vida (Körner et al. 2004; Li et al. 2020; Rahman et al. 2020). En los sistemas alpinos, la temperatura, la radiación, la exposición y la precipitación varían con la estación, la altitud, la pendiente y la orientación (Körner & Ohsawa, 2005), produciendo una heterogeneidad espacial de las condiciones ambientales (Siles & Margesin, 2016; Körner, 2021), que puede afectar desde las respuestas fisiológicas individuales hasta la distribución y la estructura comunitaria de las plantas (Chaturvedi & Shivaji, 2006; Rumpf et al. 2018; López-Angulo et al. 2019; Sklenář et al. 2021). Dicha heterogeneidad ambiental se ha estudiado principalmente a lo largo de gradientes altitudinales y laderas contrastantes. En concreto, los suelos de las laderas orientadas al polo tienden a ser más húmedos, fríos y con mayor materia orgánica que los de las laderas orientadas al ecuador (Scherrer & Körner 2011). Estas diferencias ambientales entre laderas influyen en distintos aspectos de las plantas, por ejemplo, la floración que se adelanta 1-2 meses en la ladera norte respecto a la sur en Los Andes de Chile central (Rozzi et al. 1997). Así mismo, a nivel comunitario la mayor riqueza y cobertura de especies ocurre en las laderas con orientación polar (Tang et al. 2013; Måren et al. 2015; Viale et al. 2019; Yang et al. 2020). Mientras, los efectos de la heterogeneidad espacial sobre la diversidad vegetal han sido ampliamente explorada (e.g. Zeng et al. 2014; Yang et al. 2020), 15 para otros organismos como las PGPB ha sido casi inexplorada. Hasta la fecha, se sabe que la diversidad bacteriana disminuye con la altitud (Adamczyk et al. 2019), mientras que la abundancia relativa, especialmente en los psicrófilos de vida libre, aumenta con la elevación (Siles & Margesin, 2016; Rui et al. 2022). Los PGPB nativos de los sistemas alpinos son de gran interés en la actualidad debido a su capacidad para hacer frente a las bajas temperaturas y promover el crecimiento de las plantasa través de diferentes mecanismos en condiciones de frío y suelos pobres en nutrientes (Chaturvedi & Shivaji, 2006; Jaggy et al. 2020; Farooq et al. 2022). Estas condiciones limitantes para las plantas pueden ser aliviadas por las PGPBs a través de la actividad de enzimas y fitohormonas que favorecen la absorción de nutrientes por parte de las plantas y la resistencia al estrés (Haselwandter et al. 1983; Widawati & Suliashi, 1970; Joshi et al. 2014; Yarzábal, 2014; Kadioglu et al. 2018; Pandey & Yarzábal, 2018; Fan et al. 2021). Algunos estudios han informado de la presencia de PGPB en ecosistemas alpinos (Yadav et al. 2015), han descrito su diversidad en términos de factores que estructuran las comunidades bacterianas (Rui et al. 2022; Tang et al. 2020; Wang et al. 2020) y han cuantificado su actividad promotora del crecimiento vegetal (Haselwandter et al. 1983; Widawati & Suliashi, 1970; Viruel et al. 2011; Yadav et al. 2015; Kadioglu et al. 2018). Aunque la interacción con microorganismos beneficiosos podría formar parte de la estrategia adaptativa de las plantas en sistemas de alta elevación (Farooq et al. 2022), falta información para comprender sobre su abundancia y actividad de PGPB en microhábitats climáticamente contrastantes. 16 En el altiplano chileno se han caracterizado comunidades bacterianas del suelo, con dos grandes particularidades: la primera referida a una proporción del 30% de especies nuevas y la segunda relacionada al potencial biotecnológico de las especies encontradas, entre ellas potenciales PGPB de los géneros Arthrobacter, Bacillus, Microbacterium, Paenibacillus, Pseudomonas, Rhodococus, Stenotrophonas y Streptomyces (Maza et al. 2019). Por otro lado, en los Andes centrales de Chile se han aislado Alphaproteobacterias de la rizósfera de Equisetum arvense y de Blechnum chilense. Esta clase de bacterias incluye a distintos simbiontes que fijan nitrógeno, tales como Rhizobium, Bradyrhizobium, Mesorhizobium y géneros dominantes como Burkholderia, donde algunas son PGPB (Jorquera et al. 2016). A su vez, Maldonado et al. (2022) caracterizaron el microbioma de Hoffmannseggia doellii Phil., una hierba perenne, que crece sobre los 2700 m en la cordillera norte de Chile, en suelos con baja disponibilidad hídrica y con déficit de nutrientes, detectando una gran proporción de microorganismos benéficos que además interactuaban de forma positiva con la planta hospedera. A pesar de estos reportes, que en su mayoría detectan microorganismos y los caracterizan a través de métodos de secuenciación, existen pocos estudios que midan la actividad de los distintos mecanismos promotores del crecimiento vegetal de bacterias asociadas a plantas presentes en ambientes climáticamente limitantes. Las formaciones xerofíticas son un grupo de plantas nativas que se desarrollan en ambientes con limitaciones hídricas (Cabrera, 2002). En Chile, estas formaciones xerofíticas se distribuyen desde la zona norte en la región de Arica y Parinacota hasta la zona centro-sur en la región de Biobío de forma discontinua, 17 llegando a habitar zonas extremadamente áridas como el desierto de Atacama, hasta las zonas alpinas con grandes oscilaciones térmicas y sequía estival en la región de Biobío (Sáez, 2010). Las especies dominantes de estas formaciones son importantes para mantener la diversidad biológica en zonas degradadas por la erosión o la sequía, ya que mejoran las propiedades químicas del suelo y mantienen una mayor humedad bajo sus doseles, generando así microclimas propicios para el refugio de especies herbáceas nativas que tienen menor tolerancia a la escasez hídrica (Gutiérrez & Squeo, 2004; Pagano et al. 2012). A su vez, especies que componen estas formaciones, exhiben un gran potencial para la recuperación de suelos. Por ejemplo, especies como Baccharis linearis (Ruiz & Pav.) Pers. se ha reportado como una especie colonizadora en zonas de vertederos de relaves mineros, en ambientes como el desierto de Atacama y por ello, se ha utilizado en ensayos de recuperación de suelos a través de técnicas de fitoestabilización (Ginocho et al. 2021). Otras especies que también componen estas formaciones xerofíticas como Escallonia illinita C. Presl, Muehlenbeckia hastulata (Sm.) I.M. Johnst., Proustia cuneifolia D., Fabiana imbricata Ruiz & Pav. han sido estudiadas para la recuperación de suelos en taludes, teniendo excelentes resultados (Doll et al. 2013). Cabe destacar que, a pesar de la relevancia ecológica, sumada a la gran distribución y potencial para la restauración que poseen estas formaciones, han sido escasamente caracterizadas, aun cuando existen incentivos estatales que fomentan el estudio y recuperación de sus poblaciones (Ley de Bosque Nativo, 20.283, BCN, 2020). 18 La pérdida de biodiversidad en Chile, producto de múltiples factores bióticos y abióticos ha fomentado diversas prácticas de restauración ecológica en los últimos 35 años (Smith-Ramírez et al. 2015). Donde los esfuerzos por recuperar zonas degradadas no han sido suficientes para frenar la tasa de desertificación y pérdida de ecosistemas diversos con alto valor ecológico (Miranda et al. 2017; Braun et al. 2021), compuestos por especies emblemáticas y otras seriamente amenazadas en sus categorías de conservación (Hechenleitner et al. 2005). Se cree que las causas de estos resultados subyacen a que la oferta de especies nativas en viveros es escasa, y a que la mayoría de estas plantas no cumplen con los estándares mínimos de calidad para la reintroducción a sistemas naturales, obteniendo grandes pérdidas en el periodo de establecimiento que a su vez coincide con el periodo de mayor escasez hídrica (Bannister et al. 2018; Acevedo et al. 2021). Frente a este escenario, se ha vuelto necesario reforzar las prácticas de restauración a través de la utilización de especies nativas adaptadas a condiciones extremas como la sequía (Alvarez-Maldini et al. 2020). Así como también se ha propuesto crear herramientas que faciliten la transferencia tecnológica y de conocimiento a viveristas para favorecer la introducción de especies nativas a sistemas naturales (Acevedo et al. 2021). Probablemente, considerar el microbioma asociado a plantas nativas adaptadas a condiciones extremas podría ser la respuesta a este problema. Ya existen algunos trabajos al respecto como los de Molina-Montenegro et al. (2016), que evaluaron el aumento del efecto nodriza de la especie Porlieria chilensis I.M. Johnst. cuando se consideraba su microbioma asociado. Por lo cual, es muy probable que la consideración de especies nativas adaptadas a condiciones 19 climáticas limitantes con sus microbiomas asociados podría ser la respuesta a las limitantes en la restauración ecológica en Chile. El complejo volcánico Nevados de Chillán, es una zona de transición climática mediterránea - templada (Arroyo et al. 2004), caracterizada por una topografía compleja (González-Ferrán 1995; Dixon et al. 1999), con una gran diversidad vegetal y endemismo (Rodríguez et al. 2008). Esta zona se encuentra emplazada en el corredor biológico Nevados de Chillán - Laguna del Laja creado bajo la categoría de Reserva de la Biósfera (San Martín, 2014). La parte inferior del cinturón vegetacional alpino está dominada por vegetación xerófita, donde se ubican una de las formaciones xerofíticas más australes de Chile (Squeo et al. 2008). Las formaciones xerofíticas “andinas” de esta zona enfrentan la escasez hídrica estival y las bajas temperaturas propias del sistema alpino a través de un despliegue especializado de estrategias (Cabrera, 2002; Larcher et al. 2010). Sin embargo, lo que hasta la fecha no se sabe es si parte de esta adaptación a condiciones climáticamente limitantes podría estar siendo complementada por la interacción benéfica con PGPBs. Se cree que formacionesxerofíticas andinas pueden tener un microbioma modelo para el estudio del impacto de la variabilidad ambiental de la montaña en la abundancia y actividad de las PGPB, siendo un excelente punto de partida para relevar la importancia de estas interacciones, comprendiendo que su estudio puede permitir elaborar herramientas biotecnológicas para asistir a otras especies de plantas nativas a través de prácticas de restauración. 20 a. Preguntas, hipótesis, objetivos. Preguntas de investigación: i. ¿Existen diferencias en la abundancia y en la actividad promotora del crecimiento vegetal de bacterias asociadas a plantas de las formaciones xerofíticas andinas que crecen en laderas opuestas? ii. ¿Cuáles son los efectos en la supervivencia, desempeño y crecimiento de plantas nativas expuestas a sequía cuando son inoculadas con PGPB asociadas a especies de formaciones xerofíticas andinas? Hipótesis: i. La abundancia y actividad promotora del crecimiento vegetal de diferentes bacterias asociadas a plantas de formaciones xerofíticas andinas será mayor en la ladera con condiciones climáticas más limitantes. ii. Las plantas inoculadas con consorcios de PGPB asociadas a plantas de formaciones xerofíticas andinas presentarán una mayor supervivencia, desempeño y crecimiento bajo condiciones de sequía que plantas sin inocular. 21 Objetivo General: Estudiar la abundancia y la actividad promotora del crecimiento vegetal de diferentes cepas de PGPB asociadas a dos plantas de formaciones xerofíticas andinas en laderas opuestas y evaluar su potencial para favorecer la supervivencia, desempeño y crecimiento de especies nativas en condiciones de sequía. Objetivos específicos 1. Determinar cómo varía la abundancia y actividad de bacterias asociadas a dos especies vegetales de formaciones xerofíticas andinas que crecen en laderas opuestas. 2. Evaluar diferencias en la supervivencia, desempeño y crecimiento de plantas nativas expuestas a sequía, al ser inoculadas con PGPB asociadas a plantas de formaciones xerofíticas andinas. 22 OBJETIVO ESPECÍFICO 1. Determinar cómo varía la abundancia y actividad de bacterias asociadas a dos especies vegetales de formaciones xerofíticas andinas que crecen en laderas opuestas. METODOLOGÍA El área de estudio se encuentra a 70 km al este de la ciudad de Chillán, en la región de Ñuble, Chile, en el sector de Fumarolas de Nevados de Chillán (36°55'15''S, 71°26'25''O). Es un sistema de origen volcánico, donde existe una fuerte influencia del clima de transición mediterráneo (Armesto & Martínez, 1978). La vegetación está compuesta por elementos esclerófilos y bosques templados perennifolios, con una flora altamente endémica (Rodríguez et al. 2008). Según los datos de las estaciones meteorológicas de las estaciones de las Trancas y Nevados de Chillán se sabe que las precipitaciones anuales sobrepasan los 2000 mm, con estaciones secas en verano con precipitaciones que no superan los 25 mm entre los meses diciembre y febrero, mientras que las temperaturas durante la temporada de crecimiento de las plantas pueden fluctuar entre 0°C y 23°C (DGA, 2022). En general, los ambientes de estos sistemas alpinos están influenciados por dos componentes extremos dentro del gradiente altitudinal: escasez hídrica y fluctuación térmica. En las zonas bajas, el déficit hídrico es uno de los factores abióticos más limitantes para las plantas, donde dominan las especies de arbustos esclerófilos de hoja pequeña, caducifolios y perennes, que conforman las formaciones xerofíticas (Cabrera, 2001). Las asociaciones dominantes de interés donde están presentes las formaciones xerofíticas en nuestra área de estudio ocurren entre Adesmia emarginata-Pozoa 23 coriacea, Adesmia emarginata-Berberis empetrifolia, Adesmia emarginata-Loasa lateritia, Chusquea culeou-Coironales (Pfanzelt et al. 2008). En el área de Las Fumarolas, hay 2 laderas que tienen orientación opuesta: Ladera de exposición norte (36°54'24.25''S 71°24'10.16''O), a una altitud de 1.984 msnm y ladera de exposición sur (36°54'16.90''S 71°23'58.83''O) a 2.089 m sobre el nivel del mar (Figura 1a y b). La utilidad de estas laderas fue confirmada con la información existente sobre la presencia de las especies reconocidas dentro de las formaciones xerofíticas. Selección de especies Con el apoyo del listado de flora registrado para el sector de Nevados de Chillán (Rodríguez et al. 2008), una preselección de especies en base a los registros de colecta del herbario de la Universidad de Concepción (CONC) y el conocimiento previo del área, se seleccionaron 2 especies de formaciones xerofíticas andinas localmente abundantes. Se consideraron especies arbustivas dominantes y abundantes en ambas laderas (norte y sur). Las especies seleccionadas fueron Azorella prolifera (Cav.) G.M. Plunkett & A.N. Nicolas (Apiaceae) y Berberis empetrifolia Lam. (Berberidaceae). A. prolifera es un arbusto y subarbusto que puede formar cojines de hasta 100 cm de alto, de color verde-amarillento y a veces glauco, muy aromático, sus hojas son pecioladas y miden hasta 0,5 cm de largo, numerosas y alternas, con foliolos triangulares a subulados, cilíndricos o planos, duros y punzantes, sus flores son amarillas, hermafroditas al centro y masculinas en el borde, dispuestas en umbelas simples que sobresalen por sobre el follaje, su 24 fruto es un esquizocarpo alado amarillo-rojizo (Fernández & Calviño, 2019). B. empetrifolia es un arbusto de baja estatura, espinoso, de hasta 500 cm de altura, de espinas tripartidas, y hojas pecioladas a subsésiles, dispuestas en fascículos, coriáceas, mucronadas, la sección transversal se redondea por encima con un surco profundo por debajo, sus flores son solitarias y amarillas, su fruto es una baya subglobosade color violeta a negruzca, de sabor agridulce (Landrum et al. 1999). Tanto A. prolifera como B. empetrifolia especies que logran importantes asociaciones para el reclutamiento (Nuñez et al. 1999; Rodríguez et al. 2008) y presentan resistencia a diferentes tipos de estrés (Durante et al. 2011; Golluscio et al. 2011; Varas et al. 2013; Sierra-Almeida et al. 2016). Las laderas y especies seleccionadas se muestran en la Figura 1 (Figura 1c y d). Figura 1. Sitio de estudio ubicado en el complejo volcánico Nevados de Chillán. Letras a. y b. indican las laderas norte y sur respectivamente. Las especies seleccionadas presentes en ambas laderas se indican en el costado derecho: c. A. prolifera y d. B. empetrifolia. 25 Caracterización microclimática de las laderas Se caracterizó el microclima de las laderas norte y sur en base a las condiciones térmicas e hídricas que imperan durante el período libre de nieve. En cada ladera se instalaron tres sensores de temperatura del aire (°C) y humedad relativa (%), a 15 cm sobre el nivel del suelo (U23 Hobo Pro v2 6', Onset Comp, USA) y se programaron para registrar cada 30 minutos durante la temporada de crecimiento. Para la ladera norte, los sensores se instalaron el 28 de octubre (2021), mientras que para la ladera sur se instalaron el 2 de diciembre, producto de la nieve presente antes de esta fecha. Los datos de humedad se utilizaron para calcular la humedad media, máxima y mínima. El registro de la temperatura del aire se utilizó para estimar los grados-día de crecimiento (GDDs; McMaster y Wilhelm, 1997), la amplitud térmica, extremas, frecuencia y duración de los eventos de temperaturas extremas. Los GDD se utilizaron como una medida de la acumulación de calor (en ◦C) por encima de una temperatura base (es decir, 0°C) para representar un índice de la energía acumulada disponible para las plantas en crecimiento, que se calculada como: GDD0 = [[(temperatura máxima diaria + temperaturamínima diaria) /2]] - temperatura base Las GDD diarias se sumaron para toda la temporada de crecimiento en cada ladera. Utilizamos 0°C como temperatura base por encima de la cual las plantas realizan sus funciones metabólicas, las plantas de clima frío varían en su temperatura base de crecimiento absoluta, y este valor abarca esta variabilidad (Körner, 2011). 26 La temperatura y potencial hídrico del suelo se registraron mediante el uso de psicrómetros (PST-55, C52 Wescor Inc., Utah, Estados Unidos), que se instalaron a 15 cm de profundidad del suelo (n = 3 por pendiente). Estos sensores se enterraron en la misma fecha que los sensores de aire. La temperatura y la humedad del suelo se registraron manualmente una vez al mes con un microvoltímetro (HR 33T; Wescor Inc., Utah, EE.UU.). En abril no se realizaron mediciones de la temperatura y el potencial hídrico del suelo porque el suelo se cubrió de nieve el día de monitoreo. Todos los sensores se retiraron de las dos laderas 19 de abril de 2022. El 8 de abril de 2021, se tomaron muestras de suelo bajo la cubierta vegetal para su caracterización química. Un total de doce muestras de suelo de 1 kg (3 réplicas x 2 especies x 2 ladera) fueron colocadas en bolsas de plástico, marcadas, y transportadas al Laboratorio de Microbiología de Suelos de la Universidad de Concepción (Concepción). Luego, las muestras de suelo fueron enviadas para su análisis químico completo al Laboratorio de Análisis de Suelos y Plantas de la Universidad de Concepción en Chillán. Abundancia bacteriana En cada ladera, se colectó el suelo que rodea las raíces de cinco individuos de A. prolifera y cinco individuos de B. empetrifolia, separados por al menos 2 m de distancia (5 réplicas x 2 especies x 2 laderas, n = 20). Las muestras de suelo se tomaron en condiciones estériles con guantes, desinfectante y equipo esterilizado con alcohol al 70%. Las muestras fueron rotuladas y guardadas por 8 horas en 27 neveras para el traslado al Laboratorio de Microbiología de Suelos en la Universidad de Concepción, donde fueron almacenadas a -20°C inmediatamente y hasta el inicio de las pruebas microbiológicas de abundancia y actividad. Para determinar la abundancia bacteriana de PGPB asociadas a las especies A. prolifera y B. empetrifolia en las laderas norte y sur, 1 g de cada muestra de suelo, proveniente del suelo circundante a las raíces, se diluyó en serie en 9 ml de medio PBS, en condiciones estériles. Las diluciones de 10¯² y 10¯³ se sembraron en placas con medio de agar para recuento en placa (Plate count, DIFCO) y se incubaron durante dos días a 25°C. Luego, se contaron las colonias presentes en las placas y se transformaron a Unidades Formadoras de Colonias (UFC) y posteriormente a su logaritmo natural (Log UFC g-1). Identificación de los aislados bacterianos mediante el estudio del gen 16S rRNA Una vez contabilizadas las colonias cultivables bacterianas en medios sólidos, se seleccionaron las 10 cepas más abundantes morfológicamente distintas según su apariencia en lupa. Las colonias bacterianas se cultivaron en un medio semisólido TBS. Se realizaron extracciones de ADN de colonias individuales utilizando el kit DNeasy® Plant Mini (QIAGEN, Dusseldorf, Alemania) según las instrucciones del fabricante. Se visualizó la integridad de las muestras de ADN en electroforesis en gel de agarosa y se determinó la concentración por espectrofotometría (A260/A280) utilizando Infinite ® M200 Pro NanoQuant (Tecan®, Tecan Trading AG, Suiza) y las muestras de ADN se mantuvieron a -20 °C. 28 La PCR se llevó a cabo para amplificar y secuenciar parte del gen 16S rRNA. Las reacciones de PCR contienen 1X tampón de reacción GoTaq® (1,5 mM MgCl2), 200 µM de dNTP, 0 2 µM de cada cebador (16S_27F; 5'- AGAGTTTGATCCTGCTCAG-3' y 16S_805R; 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC- 3'), 1 U de GoTaq ADN Polimerasa (Promega, Madison, EEUU), 20 ng/µl de ADN y se llenó hasta 20 µl con agua de grado molecular filtrada y estéril. Las condiciones térmicas se lograron con un ciclo a 94 °C durante 3 min, seguido de 35 ciclos de desnaturalización del ADN a 94 °C durante 60 s, recocido de cebadores a 45 °C durante 40 s y elongación del ADN a 72 C durante 60 s, y una extensión final a 72 °C durante 7 min. Los productos de la PCR se corrieron en geles de agarosa al 1% (p/v) con SYBR Safe DNA Gel Stain (Thermo Fisher Scientific, Inc., Carlsbad, CA) en un tampón TAE a 80 V durante 45 min. Los amplicones se fotografiaron en un transiluminador de luz UV. Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron y se secuenciaron directamente en ambas direcciones (Macrogen, Seúl, Corea del Sur). Los análisis de las similitudes entre las secuencias se llevaron a cabo con la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, NCBI) y luego se compararon en línea en busca de homologías con otras secuencias de la base de datos del Instituto Europeo de Bioinformática (EBI, Cambridge, Reino Unido). Se construyó un árbol filogenético utilizando el programa Seaview 4.0 con el método de unión de vecinos para determinar las relaciones filogenéticas con otras bacterias anotadas relacionadas. El árbol de consenso resultante se construyó utilizando 1000 réplicas. 29 Actividad de los mecanismos promotores del crecimiento vegetal Se seleccionaron 19 cepas más abundantes y morfológicamente diferentes para evaluar la actividad de los distintos mecanismos promotores del crecimiento vegetal. Cada una de las cepas asociadas a A. prolifera o B. empetrifolia en la ladera norte o sur, se aislaron en medio sólido (Plate count, DIFCO) y se incubaron durante 12 a 18 horas en medio TBS líquido. Luego se almacenaron en glicerol a -20°C hasta la realización de los ensayos que evaluaron la actividad promotora del crecimiento vegetal de las bacterias. Antes de cada ensayo que evaluó cada mecanismo promotor del crecimiento vegetal, todas las cepas aisladas fueron activadas en medio TBS líquido a 28°C durante 18 horas a 120 pm. Los mecanismos promotores del crecimiento vegetal evaluados comprendieron 1 de carácter fitohormonal y 3 enzimáticos, todos estos mecanismos se evaluaron en las 19 cepas seleccionadas. Para evaluar la producción de la fitohormona ácido indol acético (IAA), las cepas seleccionadas cultivables se inocularon en caldo nutritivo genérico (1 gr D-(+)-glucosa, 15 g de peptona, 6 g de NaCl, 3 gr de extracto de levadura), con 0,15% (p/v) de triptófano en la oscuridad durante 96 h a 30°C con 120 rpm, la producción de IAA se midió mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC; Primaide, Hitachi Co, Ltd., Tokio, Japón) (Gang et al. 2019) en el Laboratorio Bioactivos en Plantas e Ingredientes Vegetales de la Facultad de Agronomía (Universidad de Concepción). La curva de calibración se preparó con soluciones seriadas de ácido indol acético que iban de 0 a 50 ppm en metanol, se inyectaron 50 µl de las muestras en una columna kromasil C-18 equipada con un detector de matriz de diodos, y los tiempos de retención 30 oscilaron entre 5,7 min y 7,9 min todas las muestras se analizaron por triplicado. Los resultados fueron expresados en µg ml-1 de IAA bacteriano. Para determinar evaluar el mecanismo enzimático promotor del crecimiento vegetal ACC-desaminasa, se siguió el protocolo de Senthilkumar et al. (2021) y Penrose & Glick (2003) con modificaciones. Se preparó un medio de cultivo mínimo DF líquido, donde se inocularon las bacterias de interés a 28°C durante 72 horas; las bacterias que mostraron turbidez se sembraron en un medio mínimo DF sólido para confirmar la presencia de ACC-desaminasa. En los cultivos que evidenciaron crecimiento en placa en medio DF sólido, la actividad enzimática de la ACC desaminasa se midió por la producción de α-cetobutirato, que se determinó mediante espectrofotómetro (SpectroquantProve 300) a 540 nm por comparación con la curva estándar de α-cetobutirato, que oscilaba entre 0 y 100 μM (Honma & Shimomura, 1978). Las concentraciones más altas de α-cetobutirato fueron indicadoras de una mayor actividad enzimática (Ali et al. 2014). La actividad de la enzima fosfatasa se evaluó a través del índice de solubilización de fosfato. Los cultivos bacterianos se sembraron en medio sólido PVK a 28°C para determinar el índice de solubilización de fosfato mediante la formación de un halo que se midió y calculó según Senthilkumar et al. (2021), las muestras se analizaron por triplicado. Para determinar la capacidad de las bacterias aisladas para fijar nitrógeno se midió la actividad de la enzima nitrogenasa a través del ensayo de reducción de acetileno en el Laboratorio de Química de Productos Naturales (Universidad de Concepción). Las 19 cepas seleccionadas se incubaron en un medio NFK 31 semisólido sin nitrógeno durante 72 horas a 28°C. En las muestras que mostraron indicios de turbidez se eliminó el 10% de la atmósfera con una jeringa y se sustituyó por acetileno. Después de 20 horas, se tomaron 4,4 ml de gas de cada vial para analizar la cantidad de etileno formada mediante cromatografía de gases. El proceso de inyección se realizó en el cromatógrafo de gases GC 6890N (Agilent Technologies) equipado con columna GC J&W HP-5, 30 m, 0,25 mm, 0,25 µm, detectores de H₂, N₂ y aire, con caudales de 40, 24 y 450 ml /min respectivamente. Las temperaturas de inyección fueron de 150 °C, de detección de 150 °C y de columna de 50 °C. Los tiempos de retención oscilaron entre 1 y 1,5 min. Cada muestra se midió por triplicado. Se inyectaron 4,5 ml por 10 min para cada muestra. La curva de calibración se preparó con soluciones compuestas por diferentes concentraciones de etileno expresadas en nmol C₂H₄ d¯¹vial¯¹. Análisis estadístico Las diferencias en los parámetros de temperatura y humedad relativa entre laderas se realizaron con pruebas t o equivalentes no paramétricos. Las diferencias de medias para las características químicas de los suelos entre laderas se compararon también mediante pruebas t o su equivalente no paramétrico (p ≤ 0,05). Las diferencias en la frecuencia de heladas y calor entre laderas se evaluaron con Chi2. Las diferencias entre laderas para la temperatura y humedad del suelo fueron evaluadas con ANOVA de medidas repetidas (p ≤ 0,05). Las diferencias en abundancia de PGPB como la actividad de los mecanismos promotores del 32 crecimiento vegetal de A. prolifera y B. empetrifolia entre laderas se evaluaron usando pruebas no paramétricas de Wilcoxon (p ≤ 0,05). RESULTADOS Caracterización climática de las laderas La ladera norte fue potencialmente más extrema que la ladera sur, según los datos microclimáticos obtenidos durante el periodo completo sin nieve (Tabla 1). Aunque la temperatura media del aire fue similar entre laderas (t = 0,02, p = 0,985), los GDD0 fue un 22% mayor ( = 3133, p < 0,0001) y la amplitud térmica fue 3,9°C mayor (t = 7,3, p <0,001) en la ladera norte que en la ladera sur. Además, se observaron diferencias considerables en las temperaturas extremas (Tabla 1). Por ejemplo, la temperatura mínima media fue menor en la ladera norte que en la ladera sur (2,5°C ± 0,2 frente a 4,3°C ± 0,2, t = 4,2, p < 0,0001). La intensidad de las heladas fue de -2,4°C de media en ambas laderas (t = 0,11, p = 0,74), pero su frecuencia fue 2,4 veces mayor en la ladera norte que en la sur ( = 10,7, p = 0,001), con una temperatura mínima de -9,9°C registrada el 4 de noviembre, mientras la ladera sur estaba cubierta de nieve. La duración de las heladas fue un 25% mayor en la ladera sur que en la ladera norte (t = 5, p = 0,028), pero en ambos micrositios duraron al menos 4 horas (Tabla 1). En el otro extremo, la temperatura media máxima del aire fue 2,2°C mayor en la ladera norte que en la ladera sur (Tabla 1, Z = 2,86, p = 0,004). En la ladera norte, los eventos de calor fueron 1,8 veces más frecuentes ( = 9,8, p = 0,002), 1,3 veces más largos (Z = 2,3, p = 0,022) y 1,3°C más calientes (Z = 2,5, p = 0,011) que en la ladera sur. Además, sólo se registraron eventos de calor con 33 temperaturas superiores a los 40°C en la ladera norte (Tabla 1). En cuanto a la humedad relativa del aire (HR), fue en promedio 51% y similar para ambas laderas (t = 2,7, p = 0,077), pero la HR mínima fue 6,5% menor (t = 3,9, p = 0,001) y la HR máxima fue 4% mayor (t = 2,1, p = 0,034) en la ladera norte que en la sur. Tabla 1. Condiciones térmicas y de humedad del aire medidas en dos laderas contrastantes de la zona alpina del complejo volcánico Nevados de Chillán. Los valores corresponden a la media ± EE (n = 3) para todo el período sin nieve entre el 28 de octubre de 2021 y el 19 de abril de 2022. Letras distintas indican diferencias significativas (p <0,05). Las temperaturas extremas se muestran entre paréntesis como valores absolutos. Variable Ladera Norte Ladera Sur Periodo sin nieve (d) 174 140 Temperatura media (°C) 11,9 ± 0,1a 12,3 ± 0,1a GDD0 (°C día-1) 2363.4 ± 153a 1846.8 ± 78.5b Amplitud térmica (°C) 22.1 ± 0.3a 18.2 ± 0.3b Temperatura mínima (°C) 2.6 ± 0.2a 4.3 ± 0.2b Intensidad de congelación (°C) -2,5 ± 0,2a [-9,9] -2,3 ± 0,3a [-6,6] Duración de la congelación (h) 4.1 ± 0.3a 5.5 ± 0.6b Frecuencia de congelación (%) 29.3a 11.4b Temperatura máxima (°C) 24.6 ± 0.4a 22.5 ± 0.6b Intensidad térmica (°C) 33,5 ± 0,3a [41,3] 32,2 ± 0,2b [35,8] Duración del calor (°C) 3.2 ± 0.2a 2.4 ± 0.3b 34 Frecuencia de calentamiento (%) 48,9a 27,9b Humedad relativa media (%) 51,9 ± 0,2a 51 ± 0,3a Humedad relativa mínima (%) 21,9 ± 0,6a 28,4 ± 1,2b Humedad relativa máxima (%) 84 ± 0,6a 80,4 ± 1,3b * En la ladera norte, la congelación se produjo el 4 de noviembre de 2021, mientras que el calor se produjo el 17 de enero de 2022; en la ladera sur, el calor se produjo el 8 de febrero y la congelación el 3 de abril de 2022. La temperatura del suelo fue similar en las laderas norte y sur (Figura 2, Ladera, F1,4 = 0.5, p = 0.519), con variaciones que se documentaron a lo largo de toda la estación de crecimiento (Figura 2, Fecha, F2,8 = 15,3, p = 0,002). Por el contrario, la humedad del suelo disminuyó en la ladera norte desde -0,68 MPa en diciembre a -1,96 MPa en marzo y fue 2,2 veces mayor que en la ladera sur (fecha x ladera, F2,8 = 9,3, p = 0,008). En abril no se realizaron registros porque la nieve cubrió los sensores. 35 Figura 2. Condiciones climáticas del suelo medidas en dos laderas contrastantes del complejo volcánico Nevados de Chillán. a. El potencial hídrico (MPa) y la b. Temperatura del suelo (°C) fueron medidos a 15 cm de profundidad del suelo en dos laderas contrastantes. Los valores corresponden a la media ± EE (n = 3). Las flechas azules indican las nevadas. Los asteriscos muestran diferencias significativas (ANOVA de medidas repetidas, p <0,05). Las propiedades químicas de los suelos bajo el dosel de A. prolifera y B. empetrifolia y entre laderas presentaron diferentes patrones, especialmente en los micronutrientes (Tabla 2). Independiente de la especie, los suelos de la ladera norte tuvieron mayor saturación de Ca (Especie x Ladera, H3,12=9,46, p =0,02). En cuanto a las diferencias entre especies, encontramos diferencias marginales en el pH del suelo, donde estos fueron más alcalinos en los suelos de A. prolifera que en B. empetrifolia (Especie x Ladera, H 3,12 = 8,43, p = 0,04). Mientras que la saturación 36 de Al fue marginalmente mayor para los suelos de la especie B. empetrifolia que los de A. prolifera (Especie x Ladera, H3,12=9,25, p=0,04). A su vez, el intercambio de Al fue marginalmente mayor en los suelos de B. empetrifolia (Especie x Ladera, H3,12=9,04, p=0,04). Los suelos de A. prolifera en la ladera norte tuvieronlas menores concentraciones de materia orgánica en comparación con los otros suelos (Especie x Ladera, H3,12=9,15, p=0,04). El K disponible, alcanzo sus extremos en los suelos de A. prolifera donde fue un tercio menor en la ladera norte en comparación con los suelos de la ladera sur de la misma especie y los suelos de B. empetrifolia (Especie x Ladera, H3,12=8,43, p=0,04), mientras que en la ladera sur de la misma especie se alcanzaron las concentraciones más altas de este nutriente (Especie x Ladera, H3,12=8,43, p=0,04). El S disponible por su parte fue 8 veces mayor en la ladera sur de la especie A. prolifera en comparación con los suelos de la ladera norte de la misma especie y los suelos de B. empetrifolia (Especie x Ladera, F1,4=12,94, p =0,001). En cuanto a la saturación de K, en la ladera norte bajo A. prolifera tuvo las concentraciones más bajas con respecto a la ladera sur de la misma especie y los suelos de B. empetrifolia (Especie x Ladera, H3,12=9,25, p=0,04), mientras que en la ladera sur, los suelos de B. empetrifolia alcanzaron la mayor saturación de K con respecto a los otros suelos (Especie x Ladera, H3,12=9,35, p=0,04). La saturación de Mg fue casi el doble mayor en la ladera norte en los suelos de B. empetrifolia, con respecto a la ladera sur de la misma especie y los suelos de A. prolifera (Especie x Ladera, F1,4=4,81, p =0,02). 37 Tabla 2. Caracterización química de los suelos bajo el dosel de las especies A. prolifera y B. empetrifolia, ubicadas en las laderas norte y sur en el complejo volcánico Nevados de Chillán. Los valores representan la media + EE (n = 3). Las letras diferentes indican diferencias significativas entre las laderas (prueba T o equivalente no paramétrico, p ≤ 0,05). Azorella prolifera Berberis empetrifolia Propiedades químicas del suelo Ladera norte Ladera sur Ladera norte Ladera sur pH al agua 6,36 ± 0,07a 6,32 ± 0,27a 5,34 ± 0,07b 5,32 ± 0,09b Materia orgánica (%) 0,85 ± 0,19a 1,87 ± 0,14bc 2,48 ± 0,22b 1,63 ± 0,05c Nitratos (N-NO3) (mg kg¯¹) 2,8 ± 0,40a 2,27 ± 1,45a 4 ± 1,25a 8,43 ± 2,24a Amonio (N-NH4) (mg kg¯¹) 1,8 ± 0,36a 1,3 ± 0,15a 2,7 ± 0,32a 1,7 ± 0,21a Nitrógeno disponible (mg kg¯¹) 4,63 ± 0,12a 3,57 ± 1,58a 6,7 ± 1,33a 10,1 ± 2,37a Fósforo Olsen (mg kg¯¹) 4,27 ± 1,72a 3,93 ± 0,44a 4,27 ± 1,07a 3,93 ± 0,21a K disponible (mg kg¯¹) 53,5 ± 20,9a 162 ± 3,61b 150 ± 25,8bc 97,9 ± 18,6c K intercambiable (cmol kg¯¹) 0,22 ± 0,03a 0,41 ± 0,01a 0,39 ± 0,06a 0,25 ± 0,05a 38 Ca intercambiable (cmol kg¯¹) 14,6 ± 2,67a 12,2 ± 3,38a 9,53 ± 3,44a 1,22 ± 0,18a Mg intercambiable (cmol kg¯¹) 1,44 ± 0,37a 1,24 ± 0,46a 2,98 ± 1,27a 0,26 ± 0,05a Na intercambiable (cmol kg¯¹) 0,06 ± 0,02a 0,03 ± 0,01a 0,04 ± 0,00 3a 0,02 ± 0,00 3a Suma de bases (cmol kg¯¹) 16,3 ± 2,79a 13,8 ± 3,65a 12,9 ± 4,78a 1,76 ± 0,28a Intercambio Al (cmol kg¯¹) 0,14 ± 0,09a c 0,08 ± 0,05a 1,44 ± 0,34b 0,47 ± 0,13c CICE (cmol kg¯¹) 16,5 ± 2,72a 13,9 ± 3,6a 14,4 ± 5,02a 2,23 ± 0,38a Saturación de Al (%) 1,09 ± 0,81a 1 ± 0,79a 10,9 ± 2,4b 20,9 ± 3,81b Saturación de K (%) 1,37 ± 0,1a 3,57 ± 1,15b 3,02 ± 0,54b 11,2 ± 0,21c Saturación de Ca (%) 88 ± 3,58a 85,8 ± 3,82a 66 ± 1,24b 55 ± 3,48b Saturación de Mg (%) 9,08 ± 2,6a 9,34 ± 2,4a 19,7 ± 1,53b 11,5 ± 0,49a S disponible (mg/kg) 0,97 ± 0,5a 8,83 ± 1,36b 1,93 ± 0,37a 3,97 ± 0,63a Fe (mg kg¯¹) 8,2 ± 1,36a 15,3 ± 5,13a 18,3 ± 2,27a 10,2 ± 0,31a Mn (mg kg¯¹) 1,83 ± 0,3a 3,53 ± 0,13a 2,57 ± 1,07a 1,5 ± 0,47a Zn (mg kg¯¹) 0,17 ± 0,03a 0 ± 0a 0,1 ± 0a 0,17 ± 0,03a Cu (mg kg¯¹) 0,6 ± 0,12a 1,27 ± 0,38a 0,67 ± 0,09a 0,4 ± 0a B (mg kg¯¹) 0,13 ± 0,03a 0,23 ± 0,03a 0,1 ± 0a 0,13 ± 0,03a 39 Abundancia bacteriana La abundancia bacteriana varió entre laderas sólo para los suelos de la especie B. empetrifolia, siendo un 6,3% mayor en la ladera norte que en la sur (Figura 3b, Ladera, F 1,8= 0,59, p = 0,031). Los suelos de la especie A. prolifera no existieron diferencias en la abundancia bacteriana entre las laderas (Figura 3a, Ladera, F 1,18= 2,38, p = 0,16). Abundancia bacteriana Figura 3. Abundancia bacteriana calculada en Log UFC g¯¹ para el suelo de A. prolifera (a) y B. empetrifolia (b). Los valores indican media ± EE (n = 3). Las letras indican diferencias significativas entre las laderas (prueba de Wilcoxon, p > 0,05). En el árbol filogenético (Figura 4), se detectaron 4 géneros de las bacterias más abundantes en los suelos de la ladera norte y bajo los doseles de A. prolifera y B. empetrifolia. El primer clado correspondió a Pseudomonas, con similitud a la especie P. fluorescens para los aislados de la ladera norte y sur bajo los doseles de B. empetrifolia, correspondientes a 4SBER4 y 2HBER4 respectivamente. El segundo clado correspondió a Rhodococcus con una alta similitud con R. 40 kyotonensis correspondiente a un aislado de la ladera sur en los suelos de B. empetrifolia (2HBER10). El cuarto clado correspondió a Pseudarthrobacter/Arthrobacter donde se agruparon 5 aislados correspondientes a suelos de las dos laderas y las dos especies (4HBER2, 1SBER5, 4HAZO6, 2SAZO6 y 6 SAZO5). El quinto clado correspondió a Leifsonia donde se agrupó el aislado 3HBER9 de la ladera sur bajo los suelos de B. empetrifolia con similitud a la especie L. bigeumensis. Figura 4. Árbol filogenético de 9 aislamientos bacterianos obtenidos de las especies A. prolifera y B. empetrifolia de las laderas norte y sur del complejo volcánico Nevados de Chillán. 2HBER4, 2HBER10, 4HBER2, 3HBER9 corresponden a aislamientos de la especie B. empetrifolia de la ladera sur. 4SBER4, 1SBER5 corresponden a aislados de la especie B. empetrifolia en la ladera norte. 4HAZO6 corresponde a aislados de la especie A. prolifera en la ladera sur. 2SAZO6, y 6SAZO5 corresponden a aislados de la especie A. prolifera en la ladera norte. 41 Comparación de la actividad de diferentes mecanismos promotores del crecimiento de las plantas. El mecanismo promotor del crecimiento de carácter hormonal correspondiente a la producción de ácido indol acético (IAA), tuvo rangos de producción hormonal cercanos al 1,5µg ml-1 de IAA. La actividad de IAA fue similar entre laderas para A. prolifera (Figura 5a, Ladera, F 1,22=16,49, p=0,90) y B. empetrifolia (Figura 5b, Ladera, F 1,25=0,89, p=0,46). Producción de Ácido Indolacético (IAA) Figura 5. Producción de ácido indolacético (IAA) de bacterias aisladas de 2 especies de formaciones xerofíticas andinas en laderas opuestas. Para todos los mecanismos las columnas se dividieron por especie: en la izquierda la especie A. prolifera y a la derecha la especie B. empetrifolia. Para cada especie las laderas se indican con colores: verde para la ladera norte y celeste para la ladera sur. Los valores indican la media±EE. Letras iguales indican que no existen diferencias (t- test o equivalente no paramétrico, p > 0,05). 42 Con respecto a los mecanismos promotores de tipo enzimático se encontró lo siguiente: Para los mecanismos promotores del crecimiento enzimáticos, la actividad ACC desaminasa de todos los aislados se muestra en la Figura 6a y 6b. Las bacterias cultivables aisladas de A. prolifera en la ladera norte tuvieron una actividad 7 veces mayor que en la ladera sur (7,05 vs 1,03, Figura 6a, Ladera, F 1,7= 0,80, p = 0,013). En contraste, actividad ACC desaminasa fue similar entre laderas para las bacterias aisladas de B. empetrifolia (Figura 6b, Ladera, F 1,8 =0,04, p=0,41). La actividad fosfatasa, medida a través del índice de solubilización de fosfato presentó diferencias entre las laderas solo para las bacterias asociadas a A. prolifera, siendo un 12% mayor en la ladera norte (Figura 6c, Ladera, F 1,15=1,811, p=0,007). Para B. empetrifolia la capacidad de las bacterias para solubilizar fosfato fue similar entre las laderasnorte y sur (Figura 6d, Ladera, F 1,21 =0,24, p =0,87). La actividad de la enzima nitrogenasa fue mayor en ladera norte para las dos especies. Particularmente, para los aislados de A. prolifera, la producción de etileno fue en promedio de 396 nmoles C₂H₄ d¯¹vial¯¹ en la ladera sur, inferior a los 1109 nmoles C₂H₄ d¯¹vial¯¹ presentes en la ladera norte (Figura 6e, Ladera, F 1,25= 0,95, p=0,007). Para los aislados de suelo de B. empetrifolia, también se observó la misma tendencia con 1302 nmoles C₂H₄ d¯¹vial¯¹ en la ladera norte, mayor que los 396 nmoles C₂H₄ d¯¹vial¯¹ de la ladera sur (Figura 6f, Ladera, F 1,25=3,5, p = 0,001). 43 Actividades promotoras del crecimiento enzimáticas Figura 6. Mecanismos promotores del crecimiento vegetal de carácter enzimático de bacterias aisladas de 2 especies de formaciones xerofíticas andinas en laderas opuestas. Para todos los mecanismos las columnas se dividieron por especie, en la izquierda la especie A. prolifera y a la derecha la especie B. empetrifolia. Para cada especie las laderas se indican con colores, verde para la ladera norte y celeste para la ladera sur. La actividad de la enzima ACC desaminasa (a y b) se 44 OBJETIVO ESPECÍFICO 2. Evaluar diferencias en la supervivencia, desempeño y crecimiento de plantas nativas expuestas a sequía, al ser inoculadas con PGPB asociadas a plantas de formaciones xerofíticas andinas. METODOLOGÍA Obtención de inóculos de PGPB Considerando los resultados del objetivo 1, se realizó una selección de bacterias con mayor actividad para cada mecanismo promotor del crecimiento. Es decir, se seleccionó una bacteria con la mayor actividad ACC-desaminasa, otra con producción de ácido indol acético (IAA), fijación de nitrógeno y solubilización de fosfato (Tabla 3). Las bacterias seleccionadas se encapsularon según el método de microencapsulación por gelificación inversa descrito por Martins et al. (2015) con modificaciones. Primero, se preparó un pellet con las bacterias seleccionadas y previamente enriquecidas en medio TBS, el cual se centrifugó y lavó 3 veces con presentan como µM de α-cetobutirato. La solubilización de fosfato (c y d) se presenta como Indice P. La fijación de nitrógeno (e y f) se indica como nmoles C₂H₄ d¯¹vial¯¹. Barras de error indican la media±EE. Letras distintas por sobre barras de error indican diferencias significativas entre laderas (T test o equivalente no paramétrico, p < 0,05), letras iguales indican que no existen diferencias (T test o equivalente no paramétrico, p > 0,05). 45 solución PBS. Posterior a ello, se disolvió 0,1 M de cloruro de calcio (CaCl₂), 0,02 % de triptófano y 1% TBS en 100 ml de Glicerina. Una vez lista esta solución se agregaron 2 ml de pellet bacteriano (solución bacteriana). La segunda etapa consistió en preparar una solución con 1 g de alginato y 0,1 g de tween 20 en 100 ml de agua (solución de alginato), que se mantuvo en un agitador mientras caían por gravedad gotas de la solución bacteriana contenidas en una bureta. Una vez obtenidas las cápsulas, se protegieron con una solución de quitosano al 4% mezclada con 0,8 % v/v de ácido glacial (pH se ajustó previamente a 5). Para crear las combinaciones de consorcios bacterianos que fueran compatibles entre ellos, se realizaron pruebas de antagonismo dual con todas las posibles combinaciones entre las 4 bacterias. La prueba de antagonismo dual consiste en sembrar un par de bacterias en medio sólido generando intersecciones entre ambas bacterias, donde existe compatibilidad, las intersecciones presentan crecimiento microbiano de ambas bacterias, mientras que donde existe antagonismo crece sólo una o ninguna (Molina-Romero et al. 2017). Las combinaciones seleccionadas para la generación de consorcios bacterianos consideraron dos combinaciones, en la primera aquellas bacterias con mayor actividad para solubilización de fosfato y ACC desaminasa (PACC). La segunda combinación consideró a las bacterias con mayor actividad de nitrogenasa y producción de ácido indol acético (NIAA). En total se inocularon 4 g por cada combinación, ósea 2 g por bacteria, su concentración se muestra en la Tabla 3. 46 Tabla 3. Caracterización de inóculos bacterianos utilizados en el ensayo, señalando actividad, ladera y especie asociados a ellos junto con la identidad probable de la bacteria y la concentración del inóculo (Log UFC g -1) Mecanismo promotor del crecimiento vegetal Ladera Especie de planta asociada Identidad probable Log UFC g-1 ACC desaminasa Sur B. empetrifolia Pseudoarthrobacter chlorophenolicus 3,5 IAA Norte A. prolifera Arthrobacter oryzae 3,08 Fijación de nitrógeno Norte B. empetrifolia Pseudoarthrobacter chlorophenolicus 2,58 Solubilización de fosfato Norte A. prolifera Sin identificar 3,08 Ensayo de vivero Los consorcios bacterianos fueron inoculados en las raíces de plantas de Gomortega keule (Molina) Baill. (Gomortegaceae). G. keule es un árbol endémico de la cordillera de la Costa, crece entre las regiones del Maule y Biobío, entre los 0- 700 msnm (Rodríguez et al. 2018). G. keule es una especie perenne que alcanza hasta los 30 metros de altura, sus hojas son coriáceas, ovaladas de 15 cm de alto y un color verde brillante en su haz, y de color verde claro en su envés y fragantes, sus frutos son redondos y de color amarillo brillante. La mayoría de sus poblaciones 47 se encuentran en el bosque maulino, crecen cercanas a cursos de agua o en valles con influencia oceánica. En el límite sur de su distribución G. keule crece en laderas pronunciadas y sobre suelos metamórficos asociadas a árboles perennes (Hechenleitner et al. 2005). Esta especie es un Monumento Natural (Decreto 13/1995) y está en peligro de extinción, amenazada por la deforestación y el monocultivo (MMA, 2022). Las actividades para la recuperación de las poblaciones de G. keule son complejas debido principalmente a las dificultades que existen en su propagación, crecimiento y aclimatación, ya que se ha observado alta mortalidad en los primeros estados y luego de trasplantes (Muñoz-Concha et al. 2010) dada estas dificultades es que se consideró G. keule como una especie atractiva para estudiar los efectos de la inoculación de PGPB sobre su supervivencia, desempeño y crecimiento en condiciones de sequía. Se obtuvieron 60 plantas de Gomortega keule del vivero del Centro de Semillas, Genética y Entomología (CONAF, Chillán). Las plantas tenían aproximadamente 2 años y sus semillas provenían de dos sitios: Reserva Nacional Los Queules (región del Maule) y de Cobquecura (región de Ñuble). El sustrato con el que provenían estas especies era del tipo “sustrato de pino compostado” muy utilizado en viveros para producción de árboles, ya que posee una alta concentración de materia orgánica y retención de humedad (Zapata et al. 2015; Coker, 2021). Para ensayos de inoculación generalmente se esterilizan los suelos, pero este proceso afecta negativamente la actividad enzimática de las bacterias (Xun et al. 2015), así como también exacerban el efecto de la actividad promotora del crecimiento vegetal puesto a que no existen otros microorganismos que interactúen con los inóculos (Goldstein et al. 1985). Considerando que nuestro 48 trabajo es una aproximación práctica se decidió dejar los suelos sin esterilizar, con la finalidad de observar el efecto de los inóculos bacterianos en la promoción del crecimiento vegetal en presencia de los microorganismos originales que vienen con los sustratos empleados en procesos de viverización. Previo al ensayo de inoculación y sequía, las plantas fueron aclimatadas desde noviembre (2021) a enero (2022) a condiciones de vivero en cámaras de crecimiento ubicadas en el Laboratorio de Microbiología de Suelos (Universidad de Concepción). La temperatura