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i UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA CARRERA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA Detección de anticuerpos para el virus del distemper canino en tigrillos (Leopardus pardalis) mantenidos en cautiverio en el Ecuador Trabajo de titulación presentado como requisito previo a la obtención del Título de Médica Veterinaria Zootecnista AUTOR: De La Torre Manjarrez Karen Andrea TUTOR: MVZ, MSc. Gallo Díaz María Susana Quito, enero 2021 ii DERECHOS DE AUTOR Yo, KAREN ANDREA DE LA TORRE MANJARREZ en calidad de autor del trabajo y titular de los derechos morales y patrimoniales del trabajo de titulación: “Detección de anticuerpos para el virus del distemper canino en tigrillos (Leopardus pardalis) mantenidos en cautiverio en el Ecuador”, modalidad presencial, de conformidad con el Art. 144 del CÓDIGO ORGÁNICO DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia gratuitita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre la obra, establecidos en la normativa citada. Asimismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior. El autor declara que la obra objeto de la presente autorización es original en su forma de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la Universidad de toda responsabilidad. ________________________________ Karen Andrea De La Torre Manjarrez CC. 1717722860 karen_delat1.4@hotmail.com mailto:karen_delat1.4@hotmail.com iii APROBACIÓN DEL TUTOR En mi calidad de Tutor del Trabajo de titulación, presentado por el señor KAREN ANDREA DE LA TORRE MANJARREZ, para optar por el Título o Grado de Médico Veterinaria Zootecnista, cuyo título es: “Detección de anticuerpos para el virus del distemper canino en tigrillos (Leopardus pardalis) mantenidos en cautiverio en el Ecuador”. Considero que dicho trabajo reúne los requisitos y méritos suficientes para ser sometido a la presentación pública y evaluación por parte del tribunal examinador que se designe. En la ciudad de Quito, a los 19 días del mes de enero de 2021 _______________________________ Dra. MSc. María Susana Gallo Díaz DOCENTE-TUTORA 171616583 iv APROBACIÓN DEL INFORME FINAL TÍTULO DE TRABAJO DE TITULACIÓN Tribunal constituido por: Dr. Richar Rodriguez, Dr. Edison Encalada Luego de calificar el Informe Final de Investigación del trabajo de titulación denominado DETECCIÓN DE ANTICUERPOS PARA EL VIRUS DEL DISTEMPER CANINO EN TIGRILLOS (LEOPARDUS PARDALIS) MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN EL ECUADOR, previo a la obtención del título (o grado Académico) de Médico Veterinario Zootecnista presentado la señorita Karen Andrea De La Torre Manjarrez. Emite el siguiente veredicto: (aprobado/reprobado) / ordena que se hagan las siguientes correcciones:……………………………………… Fecha:…………………. Para constancia de lo actuado firman Nombre Apellido calificación firma Lector 1 Dr. Richar Rodríguez ………………….. ……………………. Lector 2 Dr. Edison Encalada …………………….. …………………….. v DEDICATORIA Este proyecto, la culminación de la etapa académica y la obtención del Título de grado está dedicado enteramente a mi madre y mis hermanos, por su ayuda, por su dedicación, por su entrega y su amor durante toda una vida; por no permitirme rendirme por su motivación y toda su ayuda incondicional durante la realización de este proyecto. vi AGRADECIMIENTOS Agradezco a Dios por haberme permitido tener la oportunidad de culminar con mis estudios, de brindarme el apoyo necesario para seguir adelante y darme la fortaleza para avanzar día con día, en cada paso de este camino. A mi madre, por su apoyo incondicional en cada momento, en cada paso y principalmente en cada caída durante este proceso y durante toda mi vida. A mis hermanos, por ser junto con mi madre mi núcleo fundamental, mi fuerza y la razón para mi dedicación; por bríndame todo su apoyo, su sabiduría, sus consejos y su apoyo. A la Dra. Susana Gallo, mi tutora y mentora en este camino, por brindar su ayuda, paciencia y dedicación durante toda esta jornada, por instruirme y guiarme buscando la excelencia. A la Dra. Lucía Luje y al Dr. Marco Chico por habernos ayudado con gran dedicación durante la realización del proyecto y brindarnos todo su apoyo y conocimientos para garantizar el cumplimiento del proyecto de la mejor manera. A todo el personal del Ministerios del Ambiente, Médicos Veterinarios, administradores, trabajadores y personal de los centros de manejo y zoológicos que colaboraron con la realización del proyecto y nos brindaron su apoyo durante este proceso. vii ÍNDICE GENERAL DERECHOS DE AUTOR ...................................................................................................... ii APROBACIÓN DEL TUTOR .............................................................................................. iii APROBACIÓN DEL INFORME FINAL TÍTULO DE TRABAJO DE TITULACIÓN .... iv DEDICATORIA ..................................................................................................................... v AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................... vi ÍNDICE DE CONTENIDOS……………………………………………………………….vi ÍNDICE DE TABLAS………………………………………………………….…………..ix RESUMEN ............................................................................................................................ xi CAPÍTULO I .......................................................................................................................... 1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 1 CAPÍTULO II ......................................................................................................................... 6 OBJETIVOS ........................................................................................................................... 6 CAPÍTULO III ....................................................................................................................... 7 MARCO TEÓRICO ............................................................................................................... 7 3.1 Leopardus pardalis .................................................................................................................... 7 3.1.1 Descripción ......................................................................................................................... 7 3.1.2 Clasificación taxonómica ................................................................................................... 7 3.1.3 Distribución geográfica...................................................................................................... 8 3.1.4 Característicasfísicas ......................................................................................................... 8 3.1.5 Alimentación ..................................................................................................................... 9 3.1.6 Situación actual ................................................................................................................. 9 3.2 Distemper canino .................................................................................................................... 10 3.2.1 Etiología ........................................................................................................................... 10 3.2.2 Taxonomía ....................................................................................................................... 14 3.2.3 Características del virus ................................................................................................... 14 3.2.4 Fisiopatología .................................................................................................................. 15 3.2.5 Sintomatología ................................................................................................................ 18 3.2.6 Diagnóstico ...................................................................................................................... 20 viii 3.2.7 Tratamiento ..................................................................................................................... 22 3.2.8 Prevención y control........................................................................................................ 23 CAPÍTULO IV ..................................................................................................................... 26 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 26 4.1 Materiales ............................................................................................................................... 26 4.2 Métodos .................................................................................................................................. 27 4.2.1 Modalidad y tipo de investigación. .................................................................................. 27 4.2.2 Factores de estudio. ........................................................................................................ 27 4.2.2.1 Variable dependiente .................................................................................................... 27 4.2.2.2 Variables independientes .............................................................................................. 27 4.2.3 Tamaño de la muestra ...................................................................................................... 28 4.2.4 Características de las unidades experimentales ............................................................. 30 4.2.4.1 Criterio de inclusión ...................................................................................................... 30 4.2.4.2 Criterios de exclusión .................................................................................................... 31 4.2.5 Análisis estadístico .......................................................................................................... 31 4.2.6 Métodos específicos de manejo del experimento .......................................................... 32 4.2.6.1 Contención del animal .................................................................................................. 32 4.2.6.2 Obtención y conservación de la muestra ..................................................................... 33 4.2.6.3 Procesamiento de las muestras .................................................................................... 33 Procedimiento para Elisa IgG .................................................................................................... 34 Procedimiento para Elisa IgM ................................................................................................... 36 CAPITULO V ...................................................................................................................... 39 RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................................... 39 5.1 Análisis de los resultados obtenidos por centro de tenencia y manejo ................................. 41 5.1.1 Exposición al virus sin desarrollo de la enfermedad ...................................................... 44 5.1.2 IgM vs IgG ......................................................................................................................... 46 5.1.3 Estudios complementarios .............................................................................................. 48 5.2. Análisis estadístico de los factores de asociación .................................................................. 49 5.2.2 Presencia de perros dentro de las instalaciones .............................................................. 54 5.2.3 Presencia de perros callejeros o ferales en las cercanías del establecimiento ................ 55 5.2.5 Frecuencia de la limpieza del recinto ............................................................................... 57 5.2.6 Frecuencia de la desinfección del recinto ........................................................................ 58 5.2.7 Cercanía del recinto con el de otros felinos ..................................................................... 59 ix 5.2.8 Cercanía del recinto de tigrillos con el de otros carnívoros. ............................................ 60 5.2.4 Vacunación a otras especies silvestres contra el distemper canino. ............................... 62 5.2.1 Aplicación de la vacuna contra el distemper canino a tigrillos ........................................ 63 CAPITULO VI ..................................................................................................................... 64 CONCLUSIONES ................................................................................................................ 64 RECOMENDACIONES ...................................................................................................... 65 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 66 ANEXOS .............................................................................................................................. 75 x ÍNDICE DE TABLAS: pág. Tabla 1. Sintomatología por sistema afectado en felinos silvestres………………………………………………18 Tabla 2. Materiales y equipos utilizados en el estudio………………………………………………………………….26 Tabla 3. Repartición de los tigrillos muestreados en los diferentes centros de tenencia y zoológicos en la primera etapa por región (Año 2017)…………………………………………………………………………………..29 Tabla 4. Resultados de la primera etapa (2017) para determinación por Microelisa de anticuerpos IgG e IgM para distemper canino en tigrillos por región……………………………………………………………….41 Tabla 5. Resultados de la segunda etapa (2019) para determinación por Microelisa de anticuerpos IgG e IgM de distemper canino en tigrillos por región…………………………………………………………………..42 Tabla 6. Categorización de la titulación de anticuerpos de acuerdo a la prueba……………………..……48 Tabla 7. Evaluación mediante diferentes pruebas (PCR y Elisa) para determinación de distemper canino de ocelotes que fueron recientemente extraídos de su hábitat………………………………………..49 Tabla 8. Seropositividad para distemper canino en relación a las variables individualesen la segunda etapa (2019)…………………………………………………………………………………………………………….……...………….50 Tabla 9. Seropositividad para distemper canino en relación a la Región a la que pertenece cada centro de la segunda etapa…………………………………………………………………………………………………………..52 Tabla 10. Seropositividad para distemper canino en relación a los centros con las variables relacionadas con el contacto de perros………………………………………………………………………………………..54 Tabla 11: Seropositividad para distemper canino en relación a la frecuencia de limpieza y desinfección del recinto de los tigrillos en la segunda etapa…………………………………………………………57 Tabla 12: Seropositividad para distemper canino en relación a la cercanía de los recintos de los tigrillos con los recintos de otros felinos en la segunda etapa………………………………………………………59 Tabla 13. Seropositividad para distemper canino en relación a los centros que vacunan a otras especies de mamíferos para el distemper canino en la segunda etapa…………………………………………62 xi TÍTULO: Detección de anticuerpos para el virus del distemper canino en ocelotes (Leopardus pardalis) mantenidos en cautiverio en el Ecuador. Autor: De La Torre Manjarrez Karen Andrea Tutor: MVZ, MSc. Gallo Díaz María Susana RESUMEN El distemper canino es una enfermedad causada por un paramixovirus de la familia morbilivirus que afecta a múltiples especies, entre las que se encuentran los caninos, mustélidos, mefítidos, hiénidos, ailúridos, procíonidos, pinnípedos, vivérridos, úrsidos, felinos y primates no humanos. Es una de las principales enfermedades causantes de la muerte de miles de caninos domésticos en todo el mundo, además de haber sido responsable de la muerte masiva de ejemplares silvestres, afectando así a distintos ecosistemas. En Ecuador, no existen estudios previos de la enfermedad en especies silvestres; sin embargo, está presente en poblaciones caninas domésticas, por lo que resulta de importancia determinar la presencia de este virus entre especies amenazadas como son los felinos silvestres. Este estudio se realizó en 18 centros de manejo que albergan felinos silvestres en las tres regiones del país: costa, sierra y oriente, para identificar anticuerpos contra el virus del distemper canino. La investigación se realizó en dos etapas; la primera fue el procesamiento de 46 muestras de suero sanguíneo de ocelotes (Leopardus pardalis) obtenidas en el año 2017, las cuales se conservaron a -20 °C hasta su análisis mediante la técnica de Microelisa IgG e IgM. Así, se encontró 69,57% (32/46) de muestras seropositivas para IgM y ninguna muestra positiva para IgG. La siguiente etapa consistió en un segundo muestreo en los mismos centros de manejo en el año 2019, donde se analizó el suero sanguíneo de 19 animales que inicialmente fueron IgM positivos e IgG negativos usando la misma técnica de laboratorio. En la segunda fase se obtuvo un 47% de muestras con resultado positivo (9/19) para IgM y fueron negativos para IgG (0/19). Se evaluó, mediante análisis estadístico, los factores de asociación, como fueron: presencia de perros dentro de las instalaciones, presencia de perros callejeros o ferales en las cercanías, vacunación a otras especies silvestres contra distemper canino dentro del centro, la frecuencia de la limpieza y desinfección del encierro como de las jaulas de manejo, la cercanía con otros felinos, con otros carnívoros y con los poblados son factores relevantes para la presencia del virus. Por lo que se considera que al detectar anticuerpos para distemper canino en los individuos, el virus se encuentra actualmente circulando en la zona. PALABRAS CLAVE: DISTEMPER CANINO, Leopardus pardalis, MICROELISA, FACTORES DE ASOCIACIÓN. xii TITLE: Detection of antibodies for canine distemper virus in ocelots (Leopardus pardalis) kept in captivity in Ecuador. Author: De La Torre Manjarrez Karen Andrea Tutor: MVZ, MSc. Gallo Díaz María Susana ABSTRACT Canine distemper is a disease caused by a paramyxovirus in the morbilivirus family that affects multiple species, including canines, mustelids, mephids, hyenids, ailurides, procyonids, pinnitides, viverrids, ursids, felines and non-human primates. It is one of the main diseases causing the deaths of thousands of domestic canines worldwide, as well as being responsible for the mass death of wild specimens, thus affecting different ecosystems. In Ecuador, there are no previous studies of the disease in wild species; however, it is present in domestic canine populations, so it is important to determine the presence of this virus among threatened species such as wild felines. This study was conducted at 18 management centers housing wild felines in the three regions of the country: coast, saw and east, to identify antibodies against the canine distemper virus. The research was conducted in two stages; the first was the processing of 46 blood serum samples of ocelots (Leopardus pardalis) obtained in 2017, which were kept at -20oC until analysis using the Microelisa IgG and IgM technique. Thus, 69.57% (32/46) of HIV-positive samples for IgM and no positive samples for IgG were found. The next stage consisted of a second sampling in the same management centers in 2019, where the blood serum of 19 animals that were initially IgM positive and IgG negative was analyzed using the same laboratory technique. In the second phase, 47% of samples were obtained with positive result (9/19) for IgM and were negative for IgG (0/19). Through statistical analysis, association factors were assessed, such as: the presence of dogs within the premises, the presence of stray or feral dogs nearby, vaccination of other wild species against canine distemper within the center, the frequency of cleaning and disinfection of the lockdown as well as the driving cages, the proximity to other felines, other carnivores and with the villages are relevant factors for the presence of the virus. So it is considered that when detecting antibodies for canine distemper in individuals, the virus is currently circulating in the area. KEYWORDS: CANINE DISTEMPER, Leopardus pardalis, MICROELISA, ASSOCIATION FACTORS. I certify that the text above is a complete and exact translation of the original document in Spanish. MSc. Mirian Cuenca Fernández Certified Translator ID: 1102409859 Registration number: 1045-14-86045372 Registration date: 20-03-2014 1 CAPÍTULO I INTRODUCCIÓN En los últimos años, se ha observado una significativa disminución de poblaciones de animales silvestres en todo el mundo, incluso algunas ya se encuentran extintas en vida libre. Las causas están directamente relacionadas con la intervención del hombre en los ecosistemas, afectando de manera significativa al hábitat de múltiples especies, siendo estas incapaces de adaptarse a dichos cambios y de esta manera se reducen las poblaciones de animales salvajes. La fragmentación de su hábitat, la expansión de la frontera agrícola y ganadera y el incremento de la población humana en zonas urbanas y rurales son las causas asociadas más importantes (Castellanos, 2006; Ceballos, Chávez, List, & Zarza, 2007; Medina-Vogel, 2010). De esta forma, existe mayor oportunidad para que los animales silvestres entren en contacto con agentes infecciosos provenientes de animales domésticos, causando así enfermedad y muerte para dichas especies. Como es el caso del virus de distemper en focas, parvovirus en leones, micosis en anfibios, tuberculosis en mustélidos, entre otros (Ceballos et al., 2007; Medina-Vogel, 2010). Una de las principales fuentes de infecciones de tipo viral para los animales silvestres son los perros domésticos; siendo más común, la transmisión de estos agentes a los carnívoros (Weber, 2010). El virus del distemper canino corresponde a la familia Paramixoviridae, del género Morbillivirus, conocido por ser uno de losprincipales agentes causantes de mortalidad en caninos domésticos (Canis familiaris) y una amenaza significativa para la conservación de especies silvestres en peligro de extinción. Este virus afecta a animales jóvenes y/o 2 susceptibles; aquellos animales que no posean inmunidad, pueden adquirir el virus a cualquier edad (Céspedes, Cruz, & Navarro, 2010; Greene, 2012; Quin et al., 2011). El virus afecta a varias especies silvestres presentando en ellos sintomatología muy similar a la que se observa en el canino doméstico; es decir, presenta síntomas respiratorios y gastrointestinales, inclusive pueden desarrollar la fase nerviosa de la enfermedad, con una evolución aproximada de un mes de duración, que puede variar en cada individuo (Appel et al., 1994; Carter, Wise, & Flores, 2005; Fenner et al., 2011). Alrededor del mundo, se conoce sobre la presencia del virus en diversas especies de felinos y su impacto en ellas, debido a que no han sido previamente expuestas, provocando así problemas de conservación (Ceballos et al., 2007; Rossi, 2012). Varios estudios a lo largo de los años demuestran su existencia en ecosistemas en todo el mundo. Se han encontrado e identificado serotipos en África, reconociendo la semejanza entre las cepas encontradas en leones y hienas en Serengueti. (Avendaño et al., 2016; Chaber, Cozzi, Broekhuis, Hartley, & W. McNutt, 2017; Furtado et al., 2016; Sulikhan et al., 2018). En América latina, se ha demostrado la presencia del virus en Brasil, donde se estudiaron ocho especies de carnívoros, de las cuales resultaron ser positivos a la detección de anticuerpos neutralizantes, el lobo amelenado (Chrysocyon brachyurus), el zorro come cangrejos (Cerdocyon thous) y el ocelote o tigrillo (Furtado et al., 2016). Adicionalmente, se ha comprobado la presencia del virus en Costa Rica, mediante la identificación del virus en heces con la prueba molecular de PCR, en donde se muestrearon felinos de vida libre, encontrando una prevalecía del 2% para este virus en tigrillos, pumas (Puma concolor) y jaguares (Panthera onca); aunque la prevalencia sea baja (Avendaño et al., 2016). 3 A nivel mundial, el ocelote recibe la clasificación de ¨Preocupación menor¨ de acuerdo a la Lista Roja de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), debido a que no existe un riesgo significativo para su extinción; sin embargo, la tendencia de la población sigue siendo hacia la disminución de los ejemplares; esto se debe a la reducción de su hábitat y a la reducción de especies que sirven como principal fuente de alimento, pero también se conoce que su territorio se ve limitado. Estos animales entran cada vez más en contacto con animales domésticos, principalmente perros, ya que estos felinos se desplazan hacia zonas pobladas en busca de alimento, lo que indica la necesidad de estudiar si ciertos patógenos originarios del perro, también pueden ser causantes del declive de la especie (Paviolo et al., 2016). En el Ecuador, el Tigrillo se encuentra bajo estado de alerta, ya que está en la categoría de especie ¨Casi amenazada¨, según el Libro Rojo de Mamíferos del Ecuador. Las amenazas puntuales para la especie son la pérdida de hábitat y la presión de cacería, tomando en cuenta que se desconoce completamente el estado sanitario de sus poblaciones (Espinosa, Tirira, & Zapata R., 2011). Los felinos domésticos (Felis catus), no desarrollan la enfermedad como en el perro, pero se ha reportado presencia de anticuerpos para distemper canino, mostrándose asintomáticos o con pequeños cambios como fiebre y leucopenia transitoria; sin embargo, han presentado lesiones cutáneas en coinfección con orthopoxvirus (Beineke, Baumgärtner, & Wohlsein, 2015; Ikeda et al., 2001; Wiener, Welle, & Origgi, 2013). Debido a las amenazas antes mencionadas sobre las especies de fauna silvestre, en el Ecuador, existen varios centros creados para su protección, siendo los centros de rescate y tenencia los encargados de albergar y proteger a estas especies en peligro de extinción. En el 4 Ecuador, existen alrededor de 40 centros distribuidos en las zonas de mayor biodiversidad y pese a varios avances en temas de bienestar animal y de monitoreo de salud, no se realizan estudios a fondo respecto a los riesgos epidemiológicos que estos animales pueden enfrentar (Ministerio de Agricultura, Ganaderia & Agrocalidad, 2017; Ministerio del Ambiente, 2015). En definitiva, es hace importante tener una línea base acerca del estado sanitario de los ejemplares de felinos que actualmente se encuentran bajo cuidado humano en el Ecuador; para conocer si además de las amenazas antes expuestas, también se encuentran en peligro por la presencia de patógenos como el virus de distemper canino en especies silvestre, pues este estudio, sería el primero en obtener información respecto al virus del distemper canino en una especie de felino silvestre en el país; además, es importante conocer cuáles son los indicadores epidemiológicos que podrían contribuir a la presencia del virus y qué medidas de control podrían implementarse para la disminución del riesgo de transmisión. De esta forma, las entidades responsables de conservar a estas especies pueden tomar decisiones informadas en cuanto al tipo de medidas necesarias en temas de medicina preventiva y vigilancia epidemiológica, que se pueden implementar para conservar efectivamente a este y otros felinos ecuatorianos. La identificación de los centros de tenencia y manejo que posean ejemplares expuestos, reflejaría el contacto que los individuos tengan con caninos domésticos, por lo que resulta importante identificar aquellos centros que podrían tener fallas en su manejo y bioseguridad con las especies que protege; aunque en este estudio se incluye únicamente tigrillos (Leopardus pardalis), el riesgo resulta potencial para las demás especies susceptibles al distemper canino, de esta manera y mediante la identificación de factores de asociación se 5 pueden realizar mejores protocolos de manejo y cuidado para especies protegidas, además de establecer un punto de partida para futuras investigaciones en el tema.. 6 CAPÍTULO II OBJETIVOS 2.1. Objetivo general Determinar la presencia de anticuerpos para el virus del distemper canino en tigrillos (Leopardus pardalis) mantenidos en cautiverio en el Ecuador. 2.2. Objetivos específicos - Determinar la presencia del virus mediante la detección de anticuerpos IgG e IgM en muestras de suero sanguíneo de los ocelotes o tigrillos mantenidos en cautiverio en el Ecuador. - Identificar los factores de riesgo asociados a la presencia del virus. 7 CAPÍTULO III MARCO TEÓRICO 3.1 Leopardus pardalis 3.1.1 Descripción También conocido como gato onza, manigordo, ocelote, jaguarcito, cunaguaro, jaguatrica, jaguarete o tigrillo, pertenece a la familia de los félidos (Castagnino, 2015; Paviolo et al., 2016). La palabra “ocelote” proviene de la palabra azteca “tlalocelot” que significa tigre de campo (Castagnino Vera, 2015). El género Leopardus proviene del latín Leo que significa un león; y pardus, refiriéndose a una pantera o un leopardo, “un león leopardo”. El calificativo pardalis proviene del latín pardus y alis, que significa, perteneciente; es decir relacionado al leopardo. Se le considera actualmente la especie felina más abundante en Latinoamérica (Vallejo, 2017). 3.1.2 Clasificación taxonómica Reino: Animalia Filo: Chordata Clase: Mammalia Orden: Carnivora Familia: Felidae Subfamilia: Felinae 8 Género: Leopardus Especie: Pardalis Subespecies: pardalis, pseudapardalis, aequatorialis, melanurus, albescens, mitis, nelsoni, pusaeus, sonoriensis y steinbachi (Clavijo & Ramirez,2009; Paviolo et al., 2016; Wilson & DeeAnn, 2005). 3.1.3 Distribución geográfica El tigrillo está distribuido a lo largo de América, desde Estados Unidos y México bajando hacia Centro y Sudamérica, hasta Argentina, el sur de Brasil y norte de Uruguay. Se encuentra en todos los países de Sudamérica menos en Chile; en Estados Unidos, se lo ha visto en Arizona y algunas partes de Texas. Es el felino pequeño más largo que existe (Kolowski & Alonso, 2010; Paviolo et al., 2016; Vallejo, 2017). En el Ecuador, se encuentra distribuido en todo el Oriente, toda la Costa y en algunas provincias de las Sierra, siendo el felino silvestre más abundante del país (Vallejo, 2017). Habitan en zonas húmedas, pantanos, bosques tropicales, manglares, etc.; prefiriendo zonas de alta densidad para mayor facilidad de obtención de sus presas. Pueden habitar a la altura del mar y hasta los 1200 msnm; sin embargo, se adaptan a cualquier clima y altura en cautiverio (Castagnino Vera, 2015; Sunquist & Sunquist, 2002). 3.1.4 Características físicas Se caracteriza por su estatura mediana, con un peso entre 8 a 11 kilogramos, largo de 1,4 metros y altura de 50 centímetros, siendo el macho más grande que la hembra (Paviolo et al., 9 2016; Sunquist & Sunquist, 2002; Vallejo, 2017). Su actividad es principalmente nocturna; sin embargo, pueden llegar a tener actividad diurna (Paviolo et al., 2016). Posee pelaje corto y suave, su color es amarillo dorado y amarillo grisáceo; posee patrón de manchas únicas en cada individuo y presenta manchas negras en el cuello y cola (Castagnino Vera, 2015). Alcanza la madurez sexual a los 2 años aproximadamente, y su gestación dura entre 79 y 82 días, pare entre una y dos crías, teniendo un intervalo entre partos aproximadamente de 2 años (Vallejo, 2017). 3.1.5 Alimentación Obtiene su alimentación a nivel del suelo y de los árboles; se alimenta principalmente de mamíferos pequeños y en ocasiones de peces, reptiles pequeños y aves que pesen menos de un kilogramo o que representen menos del 10% de su peso total (Sunquist & Sunquist, 2002; Vallejo, 2017). 3.1.6 Situación actual A nivel mundial, el tigrillo recibe la clasificación de ¨Preocupación menor¨, de acuerdo a la Lista Roja de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) debido a que no existe un riesgo significativo para su extinción; sin embargo, la tendencia es hacia la disminución (Paviolo et al., 2016). Su población se ha visto reducida principalmente a causa de la cacería para obtener su piel, además de la fragmentación del hábitat y de la disminución de especies que sirven para su alimento (Clavijo & Ramirez, 2009). 10 En Latinoamérica, su población también se ha visto disminuida aunque no se encuentra en estado de riesgo; sin embargo, en Norte América, especialmente en la zona sur de Estados Unidos, es una especie considerada en alto riesgo de desaparición (Clavijo & Ramirez, 2009; Espinosa et al., 2011). En el Ecuador, se encuentra en la categoría de especie ¨Casi amenazada¨; según el Libro Rojo de mamíferos del Ecuador, siendo las amenazas más importantes, la pérdida de hábitat y la presión de cacería; se desconoce el estado sanitario actual de sus poblaciones (Espinosa et al., 2011). 3.2 Distemper canino 3.2.1 Etiología El distemper canino, enfermedad de Carré o moquillo, es una enfermedad producida por un virus de distribución mundial, que causa infecciones sistémicas involucrando a múltiples órganos, siendo altamente contagioso y febril (Carter et al., 2005; Quin et al., 2011). La enfermedad del distemper canino es producida por un Paramixovirus del género Morbillivirus, que afecta a varias especies de mamíferos, entre las que se encuentran los caninos, mustélidos, mefítidos, hiénidos, ailúridos, procíonidos, pinnípedos, vivérridos, úrsidos, felinos y primates no humanos (Feng et al., 2016; Fenner et al., 2011; Jin et al., 2017; Quin et al., 2011; Rossi, 2012). Este virus se aisló por primera vez en felinos en 1988 en Des Moines, Iowa mediante la técnica de inmunofluorescencia indirecta; los primeros casos sintomáticos en felinos se 11 identificaron en 1991 y 1992, en individuos de cautiverio en reservas y zoológicos de Estados Unidos (Appel et al., 1994). Los individuos afectados fueron leopardos (Panthera pardus), tigres (Panthera tigris), leones (Panthera leo), y jaguares (Panthera onca) , donde se observó una alta mortalidad (Appel et al., 1994; T. A. Seimon et al., 2013). En 1994, se presentó un brote en África, que causó la muerte del 30% de la población total de leones en el Serengueti, siendo este uno de los casos más relevantes en felinos (Fenner et al., 2011; Quin et al., 2011; Rossi, 2012). Es importante mencionar que, algunos de los felinos silvestres que han sido afectados por el virus, muestran un cambio de comportamiento característico, que incluye la pérdida de miedo a las poblaciones humanas; esto se reporta debido a avistamientos de individuos infectados cerca de poblados, representado así un riesgo para ellos y para la población humana. El caso más conocido, se dio en Rusia en la zona de Primorskii Krai; en donde un Leopardo del lejano oriente (Pantera pardus orientalis), se acercó a la población, siendo capturado y comprobándose posteriormente que estaba infectado por el virus; atribuyendo que, su cambio de comportamiento, su mal estado de salud y su baja condición corporal se debían a la infección por distemper canino (Guiserix, Bahi- Jaber, Fouchet, Sauvage, & Pontier, 2007; Sulikhan et al., 2018). También, se conocen casos en Rusia y China, en donde a partir del 2001, se observaron varios ejemplares de tigre de Amur (Panthera tigris altaica), con sintomatología nerviosa; por lo que en el 2010, se estudiaron individuos con esta sintomatología que murieron o fueron asesinados, comprobando la presencia de este virus (Seimon, Miquelle, & Chang, 2013). Además de los felinos, ha causado disminución significativa de algunas especies como las focas (Phoca vitulina) en Holanda en 1988 y el perro salvaje (Licaon pictus) en África, en 2002; asimismo, es responsable de que se encuentre en peligro de extinción el hurón de 12 patas negras (Mustela nigripes) (Medina-Vogel, 2010; Rossi, 2012; Van de Bildt et al., 2002). Varios estudios a lo largo de los años demuestran la existencia del virus en ecosistemas en todo el mundo, afectando principalmente a individuos que no hayan tenido contacto previo con el distemper canino. Se han encontrado e identificado serotipos en África, reconociendo así, la semejanza entre las cepas encontradas en leones y hienas en Serengueti, siendo la zona de Botswana la de más alta prevalencia, con un 26% en el año 2016 (Chaber et al., 2017; Nikolin, Wibbelt, Michler, Wolf, & East, 2012; Quin et al., 2011). En América latina, se ha demostrado la presencia de distemper canino en poblaciones de carnívoros silvestres; tanto en Brasil como en Costa Rica con prevalencias variables. (Avendaño et al., 2016; Furtado et al., 2016). Cabe destacar que en varios estudios se ha verificado la presencia del virus sin haber observado sintomatología evidente, pudiendo así encontrar individuos que no cursan la enfermedad de manera clínica o de la forma típica observada en perros (Avendaño et al., 2016; Chaber et al., 2017; Furtado et al., 2016; Nikolin et al., 2012). Las zonas más estudiadas en felinos silvestres respecto a la enfermedad, son las pertenecientes a África, dado que son zonas de mayor riesgo por su abundancia de felinos en peligro de extinción y los casos de brotes que han causado muertes masivas. En Uganda, se observó una prevalencia de 79% (11/14) en leones de vida libre, En Namibia, se observó una prevalencia de 24% (17/70) en guepardos (Acinonyx jabatus). En Botswana,en leones de vida libre se obtuvo una prevalencia de 4,8% (1/21); todos estos casos corresponden a grupos 13 de individuos asintomáticos (Alexander et al., 2010; Driciru et al., 2006; Munson et al., 2004; Ramsauer, Bay, Meli, Hofmann-lehmann, & Lutz, 2007). En Estados Unidos, se evidenció una prevalencia de 2,9% (12/417) en jaguares utilizando la técnica de seronutralización. Mientras que en Canadá, en el año 2009, se reportó anticuerpos en linces (Lynx canadienses) de vida libre, con un prevalencia del 3% (5/196) y previamente en el año 2002, un 33% (2/6) (Biek et al., 2002, Biek et al 2006; Daoust, Mcburney, Godson, Bildt, & Osterhaus, 2009). En Ecuador, no existen datos acerca de la presencia del virus en felinos silvestres ni en ninguna otra especie de mamífero silvestre. Sin embargo, existe evidencia epidemiológica en caninos domésticos en el Ecuador, ya que es una enfermedad que se atiende frecuentemente en clínicas veterinarias de especies menores, existiendo algunos estudios que demuestran una prevalencia aproximada del 66% (101/154) de los caninos muestreados que han acudido a un centro de atención veterinaria debido a síntomas que concuerda con el distemper canino en ciertas zonas de Quito ( Digangi et al., 2019). En el caso de los felinos domésticos (Felis catus), no se han reportado afectación sistémica, como es el caso de la presentación característica gastroentérica, respiratoria y/o nerviosa en el perro; solo se ha observado titulación positiva para anticuerpos de distemper canino, mostrándose asintomáticos, con síntomas muy leves como fiebre ligera y leucopenia transitoria; sin embargo, han presentado lesiones cutáneas en coinfección con orthopoxvirus (Beineke et al., 2015; Ikeda et al., 2001; Wiener et al., 2013). 14 3.2.2 Taxonomía Orden: Mononegavirales Familia: Paramyxoviridae Género: Morbillivirus Especie: Morbillivirus canino (International Committee on Taxonomy of Viruses, 2017). 3.2.3 Características del virus Es un virus ARN de genoma no segmentado, de una cadena sencilla o simple, con polaridad negativa. Es un virus envuelto, pleomórfico de tamaño 150 a 300 nanómetros (nm), posee nucleocápside helicoidal simétrica. Su envoltura posee una cubierta de espículas de glicoproteína. Este virus se replica en el citoplasma del hospedador, mientras que adquiere su envoltura de la membrana celular (Carter et al., 2005; Fenner et al., 2011; Quin et al., 2011; Stanchi, 2007). La estructura genómica del virión está compuesta por dos proteínas de membrana, Hemoaglutinina (HA) y proteína de fusión (F); la proteína de matriz (M), la proteína de nucleocápside (N) y dos proteínas que integran el complejo ARN polimerasa ARN dependiente, la proteína larga (L) y la fosfoproteína (P) (Sarute et al., 2011). Los morbillivirus unen sus proteínas (HA) y (F) a las moléculas de activación de linfocitos de señalización (MALS), que se encuentran en los linfocitos T y B actuando como receptores e ingresan a las células inmunológicas. Los aminoácidos de las MALS y las HA son específicos de especie. 15 Las HA son las proteínas más variables del virus del distemper canino, debido a que están encargadas del tropismo celular y la especificidad del hospedador; mientras que la proteína F, al recibir la señal por un cambio en la proteína HA, media la fusión del virus con la célula del hospedador (Kapil & Yeary, 2011; Zhao et al., 2010). La mutaciones en los aminoácidos 530 y 549 de las HA del virus sugieren ser las causantes del salto entre especies, observándose que en algunos casos, el virus con variaciones en estos aminoácidos pueden afectar a múltiples especies (Terio & Craft, 2013). Debido a que el gen HA es el que le otorga el tropismo celular al virus y confiere le variabilidad, también le diferencia al virus en linajes. A causa de la variación genética y el polimorfismo de este gen en particular, existen brotes de la enfermedad en poblaciones caninas protegidas con la vacuna y en especies silvestres (Cespedes, Carlos, Paulina, & Cornejo, 2010; Duque-valencia & Olarte-castillo, 2019). Se han reconocido 17 diferentes linajes del virus del distemper canino, de acuerdo al análisis de secuencia del gen HA hasta el momento, entre los que se encuentran: Asia-1, Asia-2, Asia- 3, Asia 4, América-1, América-2, América-3, América-4, Ártico, Europeo silvestre, Europeo, Africano-1, Africano-2, Rockborn, Sudamericano-1, Sudamericano-2 y Sudamericano 3; posiblemente se encuentren más en el futuro (Duque-valencia & Olarte-castillo, 2019; Fenner et al., 2011; Gámiz et al., 2011; Woma, van Vuuren, Bosman, Quan, & Oosthuizen, 2010). 3.2.4 Fisiopatología El virus ingresa al sistema respiratorio del hospedador a través de aerosoles, y se replica en los macrófagos y células dendríticas del tracto respiratorio superior después de ser 16 fagocitados, para luego dirigirse a las tonsilas y linfonodos bronquiales tras dos días de la infección (Céspedes et al., 2010; Fenner et al., 2011; Quin et al., 2011). Luego, se dirige a la sangre entre el segundo y tercer día de la exposición encontrándose en los linfocitos B y T infectados, pudiendo provocar fiebre en esta etapa y posteriormente llega al timo, linfonodos retrofaríngeos y bazo (Fenner et al., 2011; Quin et al., 2011; Rossi, 2012). La replicación viral se produce en los órganos linfáticos, generando de esta manera leucopenia, causando inmunosupresión y facilitando infecciones secundarias en el hospedador (Quin et al., 2011). El grado de la enfermedad y la velocidad de diseminación a otros sistemas como: sistema respiratorio, gastrointestinal y nervioso, dependerán de la repuesta del sistema inmune del individuo y la cepa asociada a la infección (Couto & Nelson, 2010). La infección se disemina a través del sistema linfático a los tejidos linfoideos del intestino y las células de Kupffer del hígado; los viriones que se formaron en estos sitios, son llevados por la sangre causando la segunda viremia y el segundo pico de fiebre; se diseminan a las células epiteliales del intestino, vejiga y piel (Fenner et al., 2011). Finalmente, llega al sistema nervioso en la mayoría de los animales infectados, presentando sintomatología evidente sin respuesta inmune desarrollada. (Couto & Nelson, 2010; Fenner et al., 2011). En algunos individuos con una baja respuesta inmunitaria, entre los 9 y 14 días se produce viremia masiva y generalmente mueren por fallo multisistémico. En el caso de animales con respuesta inmune elevada, el virus se eliminará completamente a los 14 días post infección y, en la mayoría de casos, los pacientes no presentarán sintomatología clínica (Couto & Nelson, 2010). 17 Durante las primeras semanas de infección, la unión de antígeno con los linfocitos B primerizos causa la formación de anticuerpos de tipo IgM e IgD; conforme se vaya produciendo la infección, los linfocitos B que ya tuvieron previo contacto con el antígeno, empiezan a cambiar estos anticuerpos para formar los anticuerpos de tipo IgG, IgA e IgE, este proceso se lo conoce como conmutación de clase o “class switching”, que permite aumentar la capacidad del sistema inmune para eliminar el patógeno (Stavnezer, Schrader, Stavnezer, & Schrader, 2014). 18 3.2.5 Sintomatología Tabla 1. Sintomatología por sistema afectado en felinos silvestres Sistema afectado Signo y Síntoma Bibliografía General Digestivo Respiratorio Nervioso Ocular - Decaimiento - Pérdida de peso - Anorexia - Fiebre - Adipsia - Deshidratación - Gastroenteritis - Diarrea fétida, hematoquécica o mucosa - Vómitos - Tenesmo - Intususepsión - Secresión oculonasal - Tos - Disnea - Traquobronquitis - Faringitis - Neumonía- Anosmia - Tonsilitis - Hiperestesia - Convulsiones (pueden llegar a estado epiléptico) - Paresia o tetraparesia - Mioclonos (con movimientos masticatorios) - Psialorre. - Cambio de comportamiento - Rigidez cervical o paraespinal - Síntomas vestibulares y cerebelosos - Tremores musculares - Queratoconjuntivitis ulcerativa - Conjuntivitis mucopurulenta - Pupilas sin respuesta - Uveítis Appel et al., 1994; Fenner et al., 2011; Georoff, 2019; Greene, 2012; Quin et al., 2011; Rossi, 2012; Stanchi, 2007. Fenner et al., 2011; Greene, 2012; Quin et al., 2011. Couto & Nelson, 2010; Ettinger & Edward C. Feldman, 2013; Fenner et al., 2011; Greene, 2012; Quin et al., 2011; Rossi, 2012; Stanchi, 2007. Fenner et al., 2011; Greene, 2012; Timm C. Harder et al., 1995; Quin et al., 2011; Rossi, 2012; Sulikhan et al., 2018. S. Ettinger & Feldman, 2007; Greene, 2012; Stanchi, 2007. 19 En la Tabla.1 se indica la sintomatología que los felinos afectados pueden desarrollar, de acuerdo al sistema afectado. El periodo de incubación puede ser de hasta 4 semanas aproximadamente (Quin et al., 2011). La enfermedad puede presentarse de forma aguda o crónica, siendo más común la forma aguda en felinos silvestres; en general en aquellos animales que no han desarrollado una respuesta inmune previa (Appel et al., 1994; Sulikhan et al., 2018). Los sistemas que se afectan principalmente son: el sistema respiratorio, gastrointestinal y nervioso; sin embargo, pueden estar comprometidos otros sistemas, dependiendo de la severidad de la infección. En felinos silvestres no se han reportado lesiones dérmicas pustulares ni hiperqueratosis en pulpejos, como se ha identificado en el perro (Couto & Nelson, 2010; Quin et al., 2011; Rossi, 2012). La signología nerviosa se observa entre la primera y tercera semana posterior al inicio de los síntomas. El distemper canino debe ser un diagnóstico diferencial ante cualquier síntoma nervioso general o focal, así no incluyan los síntomas nerviosos comúnmente presentados en la enfermedad. Cuando dichos signos y síntomas se desarrollan, el pronóstico es desfavorable o malo (Amude, Alfieri, & Alfieri, 2007; Couto & Nelson, 2010; Fenner et al., 2011). En felinos, se han notado marcados cambios de comportamiento, como la ausencia de temor al acercarse a poblaciones humanas (Sulikhan et al., 2018). Existe evidencia de la presencia del virus en gatos domésticos, se han reportado casos asintomáticos, pero desarrollan anticuerpos para el distemper canino. Sin embargo, existe morbilidad causada por el virus en co-infección con otro agente que es el orthopoxvirus, observándose lesiones cutáneas (Ikeda et al., 2001; Wiener et al., 2013). 20 3.2.6 Diagnóstico El diagnóstico se hace en base a las evidencias clínicas, hallazgos histopatológicos, observaciones por diagnóstico de imagen y exámenes de laboratorio serológicos, aislamiento viral y moleculares (Couto & Nelson, 2010). En exámenes complementarios como el hemograma, se puede observar linfopenia y trombocitopenia y menos común, monocitosis. En placas radiográficas de tórax se identifica un patrón intersticial o patrón alveolar; en muestras de líquido cefalorraquídeo (LCR), si la infección ha llegado hasta el sistema nervioso, puede verse incrementada la concentración de proteínas y células mononucleares, incluso en algunos casos puede hallarse antígenos o anticuerpos presentes del virus en LCR. El aislamiento viral por este medio, se puede realizar únicamente si se ha desarrollado encefalitis (Fenner et al., 2011; Pinotti, 2011). Se pueden tomar muestras mediante hisopado conjuntival y de secreciones nasales, muestras de sangre tanto para aislamiento viral, pruebas moleculares, como para serología. Se pueden realizar análisis histopatológicos de cerebro, vejiga, piel, pulmones y estómago. Hallazgos de infiltraciones eosinofílicas en cerebelo y epitelios son característicos de animales con la enfermedad (Quin et al., 2011; Rossi, 2012). Pruebas de inmunohistoquímica o de inmunofluorescencia en muestras de conjuntiva, biopsia de piel en animales vivos o post mortem, resultan útiles en el diagnóstico. (Fenner et al., 2011). Las pruebas moleculares son de mayor importancia en la actualidad, debido a su alta especificidad y sensibilidad, siendo el PCR en tiempo real el más usado (Nemeth, Oesterle, Campbell, Ojkic, & Jardine, 2018; Quin et al., 2011). 21 Adicionalmente, las pruebas serológicas para la identificación de anticuerpos en respuesta a la presencia del virus se utilizan de forma rutinaria, estas permiten identificar la etapa de la enfermedad en la que un paciente se encuentra, siendo los anticuerpos IgG e IgM los más comunes (Couto & Nelson, 2010; Greene, 2012). Las ventajas de las pruebas de inmunoensayo, son su alta sensibilidad y especificidad, bajo costo, procedimientos rápidos y sencillos y su versatilidad por presentar variedad de cromógenos y sustratos (Ochoa, 2012). Se han realizado algunos estudios para distemper canino en felinos silvestres utilizando la técnica de Elisa, en leones en Japón y en el gato montés (Felis silvestris) en Portugal (Duarte, Fernandes, Santos, & Tavares, 2012; Endo, Uema, Miura, Tsukiyama-kohara, & Tsujimoto, 2004). Para el diagnóstico clínico, es de gran importancia conocer si los felinos están o no vacunados, la vacunación contra distemper canino en felinos silvestres no es obligatoria, pero se recomienda su aplicación cuando existe riesgo de exposición (Información completa sobre la vacuna se encuentra en el capitulo de Prevención y control), y la edad (Couto & Nelson, 2010; Georoff, 2019). En especies de vida silvestre, se ha realizado el diagnóstico mediante inmunofluorescencia, Elisa indirecto, RT-PCR, aislamiento viral y neutralización sérica (Avendaño et al., 2016; Furtado et al., 2016; Nava et al., 2008). Existen grandes diferencias entre cada método, aquellos que identifican la presencia del antígeno (RT-PCR, aislamiento viral, Elisa directo) y aquellos que miden los anticuerpos (Inmunofluorescencia, Neutralización sérica, Elisa indirecto) en cada método su eficacia se ve relacionada con la habilidad de los técnicos a cargo, la integridad de los sustratos y 22 compuestos a usarse, y la toma correcta de la muestra junto con su adecuada conservación (Crespo Ortiz, 2000). 3.2.7 Tratamiento No existe un tratamiento específico para combatir la enfermedad causada por este virus; por lo que únicamente se aplica terapia de soporte. Se recomienda el uso de antibióticos para combatir las infecciones gastrointestinales y respiratorias secundarias, e incluir fluidoterapia para compensar la deshidratación debido a las pérdidas por vómitos y diarrea (Carter et al., 2005; Fenner et al., 2011; Pinotti, 2011; Quin et al., 2011). Para el control de los síntomas respiratorios, se recomienda el uso de expectorantes, nebulización y aplicación de antibióticos de amplio espectro (Greene, 2012). La administración de multivitamínicos es recomendable, aunque su efecto no esté completamente comprobado. La suplementación de complejo B ayuda a reponer las pérdidas de estas vitaminas producidas por diarrea, vómito y diuresis, además de estimular el apetito; la administración de vitamina A y E también se recomienda, mientras que el uso de la vitamina C debe ser moderado o restringido en etapas avanzadas (Céspedes et al., 2010; Pinotti, 2011). Se recomienda el uso de anticonvulsivantes, tales como benzodiacepinas (Diazepam) para el control de las convulsiones en el momento y barbitúricos (Fenobarbital) para el mantenimiento y prevención de mioclonos. Los corticoides están contraindicados en el transcurso de la enfermedad, debido a que si ya existe daño a nivelnervioso, este exacerbará el deterioro ; sin embargo, puede ser utilizado en animales que presenten daño nervioso 23 crónico, una vez superada la enfermedad; como es el caso de la encefalitis del perro viejo que suele presentarse como secuela de la enfermedad (Céspedes et al., 2010; Couto & Nelson, 2010; Greene, 2012; Plum, 2007). Esta terapéutica no ha sido probada con éxito en felinos silvestres. Existen ciertas pautas de tratamiento que en ocasiones han resultado útiles en caninos; como el uso de la Ribavirina (antiviral), la Azatioprina (antiviral) y los lipopolisacaridos de origen bacteriano (inmunoestimulador), pero no existe eficacia comprobada en felinos silvestres (Céspedes et al., 2010; Pinotti, 2011; Plum, 2007; Sumano & Ocampo, 2006). En animales silvestres, resulta más complicado el manejo frente a la enfermedad, por lo que el primer paso es la cuarentena, debido al riesgo alto de transmisión a otros individuos. El tratamiento de soporte es administrado durante los primeros síntomas; sin embargo, al presentarse la fase nerviosa, siendo esta de mal pronóstico, se procede a la eutanasia (Appel et al., 1994; Georoff, 2019; T. C. Harder et al., 1996). 3.2.8 Prevención y control La prevención y el control están enfocados principalmente a la identificación de los animales enfermos para aislarlos mediante cuarentena y sanitización (Fenner et al., 2011). Existen vacunas para este virus que son eficaces en perros, pero han tenido diversos resultados en carnívoros no domésticos. Las vacunas para el distemper canino pueden ser de dos tipos: vivas atenuadas (son comúnmente utilizados en perros) y las recombinantes vectorizadas de Canary-poxvirus. (Connolly, Thomas, Woodroffe, & Raphael, 2014; Fenner et al., 2011; Zhang et al., 2017). 24 La vacuna viva atenuada ha demostrado no tener la eficacia necesaria, en la mayoría de carnívoros no-domésticos, la titulación de anticuerpos resulta muy baja o nula; sin embargo, aún está sujeta a investigaciones en felinos silvestres (Fenner et al., 2011; Georoff, 2019; Sadler et al., 2015). La vacuna vectorizada presenta mayor eficacia, generando mayor titulación de anticuerpo debido a que pueden presentar una respuesta de tipo celular y humoral simultáneamente (Georoff, 2019) Actualmente, las vacunas contra distemper canino no son utilizadas como parte del calendario vacunal de los felinos silvestres; sin embargo, en países desarrollados se ha utilizado la vacuna vectorizada en situaciones de riesgo ante un posible brote de la enfermedad; no obstante, se requieren más estudios que garanticen su eficacia y seguridad. No se recomiendan como parte de un protocolo sanitario debido a que su eficacia es controvertida en algunas especies como los felinos silvestres (Chinnadurai, Kinsel, Adkesson, & Terio, 2017; Georoff, 2019; Johnson, Asa, & Baker, 2016; Zhang et al., 2017). Existe garantía de una eficaz seroconversión en canidos no domésticos, pandas y mapaches con el uso de la vacuna vectorizada (Georoff, 2019). Algunas especies como los hurones de patas rojas (Mustela nigripes), los pandas (Ailuropoda melanoleuca) y algunos vivérridos que han presentado sensibilidad a la vacuna viva atenuada, causando en algunos casos la enfermedad, reacciones anafilácticas y encefalitis (Reed-Smith, Lombardy, Winkler, & Kimble, 2011). El virus puede permanecer en el ambiente mediante la ayuda de antioxidantes y proteínas circundantes, además de poder sobrevivir por semanas a temperatura baja, entre los 0 y 4 °C; 25 sin embargo, es susceptible al calor y a la resequedad. Por lo tanto, la inactivación puede realizarse utilizando luz ultravioleta además de ser sensible a los desinfectantes comunes. (Greene, 2012). Como parte de los protocolos de prevención de la enfermedad, se incluye la limpieza y desinfección de los espacios con frecuencia, la desinfección de los insumos y equipo utilizados por los cuidadores para el manejo de los animales, control de fauna urbana y silvestre en las cercanías de los centros (Céspedes et al., 2010; Georoff, 2019). 26 CAPÍTULO IV MATERIALES Y MÉTODOS 4.1 Materiales Los materiales usados en el estudio se detallan a continuación en la Tabla 2. Tabla 2.- Materiales y equipos utilizados en el estudio Fases del estudio Materiales Equipos Contención del animal Jeringas con agujas calibre 21G x1 1/2 de 3ml Redes de manejo Anestésicos (Xilacina + Ketamina) Guantes de manejo Toma, conservación y transporte de la muestra Jeringas con agujas calibre 21G x1 1/2 de 3 a 5 ml. Torniquete Tubos para muestra sanguínea sin anticoagulante de 4 ml Cooler Guantes de latex Refrigerantes Alcohol Centrífuga Algodón Gradilla Pipetas plásticas Pasteur Tubos de microcentrífuga de 2ml. Análisis de la muestra para IgG Placas con pocillos Lector cromatográfico Guantes de látex Micropipetas Control positivo y negativo Puntas plásticas paras micropipetas Solución de lavado Solución de conjugado Solución de sustrato Solución de frenado Análisis de la muestra para IgM Placas con pocillos Lector cromatográfico Guantes de látex Micropipetas Control positivo y negativo Incubadora Puntas plásticas paras micropipetas Solución de lavado Solución de conjugado Antígeno preparado Solución de sustrato Solución de frenado 27 4.2 Métodos 4.2.1 Modalidad y tipo de investigación. Es un estudio observacional de tipo descriptivo y transversal, a conveniencia del investigador. 4.2.2 Factores de estudio. 4.2.2.1 Variable dependiente Presencia o ausencia de anticuerpos IgG o IgM de distemper canino detectados mediante la técnica de Microelisa indirecta. En este caso se toman como individuos positivos para el análisis estadístico a aquellos que resultaros positivos en la segunda etapa (2019). 4.2.2.2 Variables independientes - Edad - Región - Sexo - Vacunación a los tigrillos contra el distemper - Vacunación a otras especies contra el distemper canino - Presencia de perros dentro de las instalaciones - Presencia de perros ferales o callejeros en las cercanías - Cercanía de los recintos de tigrillos con los recintos de otros felinos. - Cercanía de los recintos de tigrillos con recintos de carnívoros no felinos. - Distancia del centro con el poblado más cercano Los detalles de las variables se encuentran en el Anexo 1. 28 4.2.3 Tamaño de la muestra Existen alrededor de 40 centros de manejo y tenencia de animales silvestres en el Ecuador, de los cuales 17 centros mantienen tigrillos en sus instalaciones con un total aproximado de 75 ejemplares en cautiverio en el Ecuador de acuerdo con los datos de MAE (Ministerio del Ambiente del Ecuador; 2017). Primera etapa (2017): Se cuenta con 46 muestras de suero sanguíneo de tigrillos, obtenidas durante el periodo de julio a diciembre de 2017. Estas muestras provienen de 15 centros que fueron parte de proyectos de investigación previos a este (Tabla 3). La estructura de este muestreo es la siguiente: - En aquellos lugares que tienen más de 5 ejemplares, se decidió muestrear al menos a 5 de ellos, en algunos casos se logró muestrear a más individuos. - En aquellos centros con menos de 5 individuos, se realizó el muestreo a todos los animales. 29 Tabla 3.- Repartición de los tigrillos muestreados en los diferentes centros de tenencia y zoológicos en la primera etapa por región (Año 2017). Región Centro de tenencia y manejo N° de tigrillos muestreados /N° de tigrillos en el centro Costa A B C D E 4/4 9/20 4/4 0/2 5/6 Sierra F G H I 2/2 2/2 3/4 3/3 Amazonía J K L M N O 2/4 5/6 1/1 1/3 3/32/2 Total 15 46/66 Nota: El numerador representa el número de tigrillos que fueron muestreados por cada centro, mientras que el denominador representa el número de animales que cada centro tenía al momento del muestreo. Segunda etapa (2019): Se realizó un muestreo entre enero a julio de 2019 de aquellos tigrillos que resultaron seropositivos en la primera etapa (2017). 30 4.2.4 Características de las unidades experimentales - La primera etapa (2017) está conformada por 46 muestras de suero sanguíneo de tigrillos (Leopardus pardalis), mantenidos en cautiverio en 7 centros de rescate y en 8 zoológicos de las regiones costa, sierra y amazonía del Ecuador, obtenidas durante el periodo comprendido entre junio y diciembre de 2017, conservadas a -20 °C, en el laboratorio UNIETAR, ubicado en la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador. Los tigrillos a los que pertenecen las muestras son animales de ambos sexos de varias edades (entre los rangos jóvenes, jóvenes adultos y gerontes), que se encontraban aparentemente sanos. Para la segunda etapa (2019), las unidades experimentales fueron todos aquellos individuos que resultaron positivos en 2017. 4.2.4.1 Criterio de inclusión Primera etapa (2017): Todos los sueros sanguíneos obtenidos de los tigrillos mantenidos en cautiverio en el Ecuador, que se encuentran almacenados en UNIETAR. Segunda etapa (2019): Todos los animales que resultaron seropositivos en el primer muestreo. 31 4.2.4.2 Criterios de exclusión Primera etapa (2017): - Cantidad insuficiente de suero sanguíneo Segunda etapa (2019): - Defunción del animal - Estado de salud no recomendable para la sedación - Animales mantenidos en instalaciones que no permiten el ingreso 4.2.5 Análisis estadístico Se utilizaron tablas de frecuencia para evaluar la presencia de anticuerpos IgG e IgM para el virus del distemper canino. Para la determinación de los factores de asociación en relación con la exposición al virus del distemper canino, se utilizó la prueba exacta de Chi cuadrado de Pearson o Fisher. La elección de los dos test se realizó conforme a los resultados de las tablas de frecuencia, si las frecuencias son mayores a 5, se utiliza la prueba de Chi cuadrado de Pearson. Los resultados se considerarán estadísticamente significativos cuando p<0.10. Para la obtención de los datos necesarios se realizó una encuesta con preguntas generales sobre cada centro de tenencia y por cada grupo de felinos, dicha encuesta se realizó al encargado del centro. El análisis de los factores de riesgo se realizó de los centros fueron 32 muestreados durante la segunda etapa, tomando en consideración a cada individuo que fue muestreado (2019). 4.2.6 Métodos específicos de manejo del experimento La investigación está dividida en dos etapas: - Primera etapa (2017): Se realizó el procesamiento de las muestras de suero sanguíneo de tigrillos obtenidos en investigaciones previas, mediante la técnica de Microelisa para detección de anticuerpos de distemper canino IgG e IgM. Las muestras se tomaron de 46 tigrillos de una población total de 75 tigrillos en cautiverio en el Ecuador; estas muestras se han mantenido congeladas en el laboratorio UNIETAR de la Universidad Central del Ecuador. - Segunda etapa (2019): Se tomaron muestras de los individuos positivos identificados en la primera etapa; además, se recolectaron datos mediante encuestas a los encargados de cada centro de manejo y tenencia. Posteriormente, se realizó el procesamiento de las muestras obtenidas en esta etapa y análisis estadístico de los factores de asociación. 4.2.6.1 Contención del animal En cada centro se tomaron las muestras, realizando contención física y/o química previa. 33 Contención física: Se realizó mediante el uso de redes de manejo, se capturó al individuo en el recinto, con ayuda de los encargados de cada centro. Existieron casos en donde se tomó la muestra únicamente mediante contención física (Herrera, Landa, Gonzales, Camarillo, & Gual, 2018). Contención química: La contención química se realizó por sedación, utilizando la mezcla de dos anestésicos: Ketamina y Xilacina. La Ketamina se utilizó a dosis de 2,5 a 10 mg/Kg junto con Xilacina a dosis de 0,3 a 1 mg/Kg, por vía Intramuscular (IM) (Buss & Miller, 2019; Herrera et al., 2018; Restrepo, 2013). 4.2.6.2 Obtención y conservación de la muestra Una vez que el animal se encontraba contenido, se realizó la extracción de 3 a 5 ml de sangre de una vena que en este caso fue: cefálica, safena o de yugular, se colocó en los tubos sin anticoagulante, para posterior centrifugación. El suero obtenido se colocó en tubos de microcentrífuga, previamente identificados para transportarlos hasta el Laboratorio UNIETAR de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Central del Ecuador, en donde se mantuvieron a -20°C hasta el momento de su análisis. 4.2.6.3 Procesamiento de las muestras El estudio se realizó mediante el procesamiento de las muestras de suero sanguíneo, previamente obtenidas de los tigrillos (Leopardus pardalis), mediante la técnica de Elisa indirecto (Ensayo inmunoenzimático de captura para la detección y/o cuantificación de IgM 34 e IgG específica frente al virus del distemper canino en suero), que determina la presencia de anticuerpos IgG e IgM. Procedimiento para Elisa IgG Las pruebas se realizaron mediante el Kit Ensayo inmunoenzimático de tipo indirecto, para la detección y/o cuantificación de IgG especificas frente al virus de Moquillo (INGEZIM MOQUILLO IgG) del laboratorio INGENASA (Inmunología y genética aplicada SA). - Se coloca aproximadamente 5 ul de la muestra de cada tigrillo en 500 ul de diluyente en un tubo de microcentrífuga por cada muestra. - Utilizando un pocillo para cada una de las muestras, que previamente poseía el antígeno específico del virus, se coloca 100 ul de los sueros diluidos previamente preparados. Se cubre cada pocillo y se dejó reposar 10 minutos. - Posteriormente, se procede a lavar los pocillos, para remover antígenos o anticuerpos que no se unieron, es decir, aquellos que formaron la unión se mantendrán en los pocillos, el lavado se realiza con una solución de lavado previamente preparado. Este procedimiento se realiza 4 veces. - Una vez lavado, se procede a colocar el anti-anticuerpo ligado a la enzima, que es el conjugado que se unirá al complejo antígeno- anticuerpo, la enzima posee un elevado 35 poder catalítico. Se coloca 100 ul se vuelve a cubrir y se deja reposar 10 minutos (Ochoa, 2012). Se realiza nuevamente el proceso de lavado 4 veces. - Finalmente se agrega el sustrato, que será el responsable de causar cambios de color si la prueba resulta positiva, se coloca 100 ul se vuelve a cubrir y se espera 5 minutos. (Ochoa, 2012; Tortora, Funke, & Case, 2007). - Se coloca 100 ul de solución de frenado en cada pocillo. - Se coloca los pocillos en el lector cromatográfico y se obtienen los resultados. Lectura de resultados: La lectura se realizó con a una longitud de onda de 450 nm. Como valor de cada muestra y controles se tomó la media aritmética del duplicado. Se realizó la validación del kit con el control + y control - conforme a las indicaciones del fabricante: - Abs450nmcontrol positivo 1 - Abs450nm control negativo < 0.2 Interpretación: Se consideraron muestras negativas a aquellas cuyo valor de absorbancia fue menor al punto de corte ( 0,419) y positivas a aquellas con un valor de absorbancia mayor según las siguientes categorías: 36 Títulos bajos: 0,419-0,839; Títulos medios: 0,840- 1,678y Títulos altos: mayores a 1,679 (Inmunologíay Genética Aplicada, S.A., 2013a). Procedimiento para Elisa IgM Las pruebas se realizaron mediante el Kit Ensayo inmunoenzimático de captura, para la detección y/o cuantificación de IgM especifica frente al virus de Moquillo (INGEZIM MOQUILLO IgM) del laboratorio INGENASA (Inmunología y genética aplicada SA). - Se coloca aproximadamente 5 ul de la muestra de cada tigrillo en 500 ul de diluyente en un tubo de microcentrífuga por cada muestra. - Utilizando un pocillo para cada una de las muestras, se coloca 100 ul de los sueros diluidos previamente preparados. Se cubre cada pocillo y se coloca en la incubadora a 37°C por 15 minutos. - Posteriormente, se procede a lavar los pocillos, para remover antígenos o anticuerpos que no se unieron, es decir, aquellos que formaron la unión se mantendrán en los pocillos, el lavado se realiza con una solución de lavado previamente preparado. Este procedimiento se lo realizará 4 veces. - Se añade 100ul de antígeno previamente preparado en relación 1 a 100, se procede a cubrirlo y a incubar a 37°C por 15 minutos. Se vuelve a realizar el proceso de lavado 4 veces. 37 - Se coloca 100 ul de conjugado a cada pocillo, se cubre y se procede a incubar por 15 min a 37° C, y se realiza el proceso de lavado 4 veces. - Se coloca 100ul de la solución de sustrato, se cubre y se mantiene la reacción por 5 minutos a temperatura ambiente. - Se añade 100 ul de solución de frenado a cada pocillo. - Se coloca los pocillos en el lector cromatográfico y se obtienen los resultados. Lectura de resultados: La lectura se realizó con a una longitud de onda de 450 nm. Como valor de cada muestra y controles se tomó la media aritmética del duplicado. Se realizó la validación del kit con el control + y control - , conforme a las indicaciones del fabricante: Abs450nm control positivo 0.8 Abs450nm control negativo < 0.15 Interpretación: Se consideraron muestras negativas a aquellas cuyo valor de absorbancia fue menor al punto de corte ( 0,295) y positivas a aquellas con un valor de absorbancia mayor, según las siguientes categorías: Títulos bajos 0,295 – 1.0 y Títulos altos: mayores a 1,1 38 (Inmunología y Genética Aplicada, S.A., 2013b). 39 CAPITULO V RESULTADOS Y DISCUSIÓN Al momento del muestreo inicial en el año 2017, la población de tigrillos en cautiverio en el Ecuador era de 75 individuos aproximadamente, distribuidos en 3 regiones del país. Para esta investigación se logró procesar efectivamente muestras del 61,33% (46/75) de la población total en cautiverio en el país hasta ese momento (Ministerio del Ambiente, 2017). Esta investigación fue realizada en dos etapas: En la primera etapa, se analizaron 46 muestras obtenidas de suero sanguíneo de ocelotes en cautiverio, recolectadas en el año 2017. De estas muestras, el 69% (32/46) fueron positivas para anticuerpos de tipo IgM y no se obtuvieron muestras seropositivas para anticuerpos de tipo IgG (0/46); los resultados se observan en la Tabla 4. Los individuos al momento del muestreo se encontraban aparentemente sanos de acuerdo a sus signos vitales, apariencia general y antecedentes por parte del personal del centro. La segunda etapa, realizada en el año 2019, consistió en la toma de muestras de sangre de los 32 animales que tuvieron titulación positiva para IgM identificados previamente en la primera etapa (Tabla 4), ya que no se encontraron individuos positivos para IgG. Sin embargo, no fue posible tomar muestras de 13 individuos, ya que uno de estos había fallecido por obstrucción de vías urinarias y los restantes se encuentran en centros que no accedieron a la realización de este estudio. Por tanto, se trabajó con 19 animales seropositivos a IgM. De esta forma, en la segunda etapa se 40 obtuvo un total de 47% (9/19) de individuos con titulación positiva para IgM y no se encontraron anticuerpos de tipo IgG. Los resultados se observan en la Tabla 5. Los individuos al momento del muestreo se encontraban aparentemente sanos de acuerdo a sus signos vitales, apariencia general y antecedentes por parte del personal del centro. Se tomaron muestras de 3 tigrillos nuevos durante la segunda etapa que no estaban incluidos en la primera etapa, debido a que son individuos recientemente llegados a los recintos, por lo que no estaban incluidos en remuestreo que se planificó de acuerdo con los resultados de la Tabla 4, de los cuales 1 fue seropositivo para IgM, estos individuos no fueron tomados en cuenta para el análisis estadístico del estudio. 41 5.1 Análisis de los resultados obtenidos por centro de tenencia y manejo Tabla 4. Resultados de la primera etapa (2017) para determinación por microelisa de anticuerpos IgG e IgM para distemper canino en tigrillos por región. Región Centro de tenencia y manejo Animales positivos a anticuerpos IgG Animales positivos a anticuerpos IgM Costa Aa Ba Ca Da Ea 0/3 0/9 0/4 0/1 0/5 2/3 6/9 4/4 1/1 3/5 Sierra Fa Ga Ha Ia 0/2 0/2 0/3 0/3 1/2 2/2 1/3 3/3 Oriente J Ka La M Na Oa 0/2 0/5 0/1 0/1 0/3 0/2 0/2 4/5 1/1 0/1 2/3 2/2 Total 15 0/46 32/46 Nota: Las letras mayúsculas representan a cada uno de los centros muestreados que por cuestión de confidencialidad no se colocan los nombres. El numerador indica el número de animales positivos a cada examen y el denominador representa el número de animales muestreados en cada centro. (a)Centros de manejo, tenencia y zoológicos que entran en la segunda etapa de muestreo por tener individuos positivos. 42 Tabla 5. Resultados de la segunda etapa (2019) para determinación por Microelisa de anticuerpos IgG e IgM de distemper canino en tigrillos por región. Región Centro de tenencia y manejo Animales positivos a anticuerpos IgG Animales positivos a anticuerpos IgM Costa B C E 0/3 0/4 0/2 3/3 3/4 0/2 Sierra F G I 0/1 0/1 0/2 0/1 0/1 0/2 Oriente K N O 0/4 0/1 0/1 3/4 0/1 0/1 Total 13 0/19 9/19 Nota: El numerador indica el número de animales positivos a cada examen y el denominador representa el número de animales muestreados en cada centro. Es importante mencionar que los animales se encontraban aparentemente sanos al momento del examen clínico y sin antecedentes de signos compatibles con esta enfermedad u otras, conforme lo indican los responsables de los centros; demostrando que, estos individuos presentan anticuerpos, sin mostrar desarrollo aparente de la enfermedad. En estudios previos, se ha observado una prevalencia para distemper del 4% en ocelotes de vida libre en Costa Rica, mediante la detección por PCR en heces (Avendaño et al., 2016). En Brasil, se encontró una prevalencia del 18% en ocelotes de vida libre, mediante la técnica de sero-neutralización; mientras que, en un estudio previo en ese país, no se encontró ningún 43 ejemplar positivo (Furtado et al., 2016; Nava et al., 2008). En Panamá, tampoco encontraron ejemplares positivos mediante la misma técnica (Franklin et al., 2008). En Bolivia, se observó prevalencia del 70% (7/10) en ocelotes de vida libre, siendo la más alta para Latinoamérica (Fiorello, Noss, Deem, Maffei, & Dubovi, 2007). En el presente estudio, se obtiene una seroprevalencia de 54% (25/46) en la primera etapa y de 47% (9/19) en la segunda etapa, siendo estas prevalencias mayores que las encontradas en los estudios mencionados, con excepción del estudio de Fiorello (2007) en Bolivia. La diferencia fundamental con los estudios antes descritos radica en que los ocelotes de esta investigación están en cautiverio y no en vida libre. Esto
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