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Diagnóstico Molecular en 
Enfermedades Infecciosas:
Una Mirada desde la Clínica 
Dra. Natalia Conca M
Pediatra Infectolgo
Noviembre 2016
Conflictos de Interés 
Remuneraciones por parte de laboratorios 
Roche y GSK
Asistencia a cursos y congresos invitada por 
otros laboratorios 
Objetivos: 
1. Conocer ventajas y desventajas de las técnicas de biología 
molecular frente a técnicas convencionales 
2. Comprender las posibles fallas de los test moleculares en cuanto a 
la realización e interpretación 
3. Conocer algunas situaciones reales donde la biología molecular 
esta siendo de utilidad clínica (meningitis, virus respiratorios y 
sepsis)
4. Comprender la relevancia clínica de las nuevas plataformas de 
biología molecular 
Generalidades
• Dg etiológico  decisión clínica adecuada
 uso racional antimicrobiano
• Avance tecnológico Persistencia de infecciones
• Infecciones emergentes
• Resistencia a antimicrobianos
Métodos Clásicos de Diagnóstico
Ampliamente usados y conocidos
Diversidad de medios y condiciones
Sensibilidad a antimicrobianos
Automatización
Limitaciones Métodos Clásicos
Bacterias y virus de difícil cultivo
No crecen al usar ATB o muestra escasa
Detección Ag (sensibilidad y especificidad variable) 
Serología: inmunosuprimido, latencia
Microscopía: Baja sensibilidad y especificidad, operador
dependiente
Dogma Central
Biología Molecular
DNA RNA Proteína
Transcriptasa Reversa  cDNA
PCR
RT-PCR
Replicación ADN
Denaturación ADN:
Enzimas
RNA polimerasa sintetiza
pequeño oligonucleótido en 
sitio de inicio replicación
DNA polimerasa sintetiza hebra
complementaria
PCR
Denaturación ADN:
Altas temperaturas (94°)
Secuencias sintéticas (primers): 
Se usan 2 primers para
delimitar amplificación
DNA polimerasa: 
Taq polimerasa
British Medical Bulletin 2002; 61: 97-114
Diagnóstico molecular vs convencional
Cultivo IFI/IFD ELISA Sondas PCR
Rapidez + +++ +++ ++ ++/+++
Sensibilidad ++ / +++ ++ ++ ++ ++++
Especificidad +++ ++ ++ +++ ++++
Facilidad + + +++ + ++
Ventajas Diagnóstico Molecular
Resultados más rápidos
Técnicas estandarizadas, automatizadas
Microorganismos de difícil crecimiento
Mayor sensibilidad y especificidad
Investigación
Limitaciones Diagnóstico Molecular
Falsos (+): Contaminación
Falsos (-): Extracción ADN, inhibidores, partidores
Mayor costo (relativo)
Debe sospechar agente infeccioso
No informa sensibilidad antimicrobianos
¿Cuando elegir un método 
molecular?
1. Necesidad rápida de identificación 
2. Identificación de microorganismos fastidiosos
3. Necesidad rápida de determinación de genes de 
resistencia 
4. Identificación de agentes no cultivables 
5. Virus en general 
¿Dónde se hace una Reacción de 
Polimerasa en Cadena?
¿Qué tipos de RPC existen?
PCR
Cualitativa
Cuantitativa
Caso Clínico 1
• Embarazo normal , RNT, femenino, buen peso 
• Embarazo fisiológico, 
• Streptococcus agalactiae (+) en el tercer trimestre del embarazo.
• 25 días de vida: movimientos mioclónicos del hemicuerpo izquierdo 
estando en vigilia; somnolienta y disminución de la demanda por 
alimentos.
• SU: febril, en relativas buenas condiciones generales, sin movimientos 
anormales, fontanela con tensión normal, ausencia de lesiones en la piel y 
mucosas y su examen segmentario era normal.
• Evolución: respiración irregular, piel reticulada y movimientos mioclónicos
en el hemicuerpo derecho que no cedían a la contención. 
• RNM al 10 día con lesiones cerebrales compatibles con encefalitis
Manejo: tratamiento antimicrobiano empírico 
Primera RPC para herpes simplex 1 y 2(-)
Persiste sintomática Se adiciona aciclovir
2 muestra RPC para herpes simplex 1 y 2 (-)
Se toma 3era muestra LCR
Que salió mal?
• Mala muestra? 
– 1 causa 
– Tipo de muestra
• Presencia de inhibidores?
• Inadecuado almacenamiento y refrigeración ?
• Proceso de la muestra tardío ? 
• Bajo numero de copias bajo umbral de 
detección?
– Sensibilidad RPC en LCR para herpes 1 y 2 100%
– Especificidad 97%
Métodos de laboratorios usados en 
infección SNC
Que busca el clínico en examen de biología 
molecular 
• Definir infecciones que 
amenacen la vida (MBA-
HSV)
• Confirmar o excluir 
infecciones tratables
• Iniciar tratameinto atb
adecuado 
Conca y cols al, Rev Chil Pediatr. 2016; 87(1): 24-30
Sensibilidad de PCR pacientes diagnosticados clínicamente 93% vs 55% de 
cultivo
Con uso de ATB: s pcr 89,4% vs 10,5%
Aporte:
Mejor diagnostico
Terapia adecuada 
Duración de tratamiento adecuada 
Ramers y cols, JAMA may 24/31,2000 vol 283,N°20
Clinical Infectious Diseases 2013;57(8):1114–28
Bacterias
Escherichia coli K1
Haemophilus influenzae
Listeria monocytogenes
Neisseria meningitidis
Streptococcus agalactiae
Streptococcus pneumoniae
Virus
Cytomegalovirus (CMV)
Enterovirus
Herpes virus simplex 1 
(HSV-1)
Herpes virus simplex 2 
(HSV-2)
Herpes virus simplex 3 
(HSV-3)
Parechovirus Humano
VirusVaricella zóster (VZV)
Levaduras
Cryptococcus
neoformans/gattii
Aprobado por FDA 2012
Caso clínico
• Niño de 1 año 4 meses con cuadro de 2 días de tos, 
luego fiebre y evoluciona con dificultad respiratoria 
leve a moderada, polipnea y signología obstructiva. 
Saturación de O2 de 89%. 
Rev Chil Infect 2003; 20 (Supl 1): S59 - S62
Infecciones Respiratorias en niños
SÍNDROME AGENTE ETIOLÓGICO
Bronquiolitis VRS, MPVh, VPI, ADV, Influenza, Rinovirus
Asma / Wheezing VRS, Rinovirus, MPVh
Croup Parainfluenza, Influenza
Neumonia Influenza, S pneumoniae, VRS, VPI, ADV, S 
pyogenes, Rinovirus
Clinical Infectious Diseases 2011; 52:S284-S289
IDSA recomienda fuertemente el desarrollo e 
implementación de técnicas de diagnostico molecular 
para detección de virus respiratorios”
Inmunofluorescencia
Ventajas Desventajas
Bajo costo Operador 
entrenado
Procesa varias 
muestras a la vez
Controles 
adecuados 
Simple de realizar Microscopia de 
fluorescencia
Técnicas por BM
• Examen ideal :
• Disponible 24/7, en pocas 
horas 
• Idealmente realizado en el 
lugar de atención
• Precio razonable 
• Que reduzca el riesgo de 
bacterias resistentes 
• Que sea capaz de diferenciar 
entre colonización e infección 
(cuantitativo o 
semicuantitativo
CID 2011:53 (supl 4)
PACIENTE ONCOLOGICO CON 
NEUTROPENIA FEBRIL, SINTOMAS 
RESPIRATORIOS
CATEGORIZADO EN ALTO RIESGO 
PACIENTE A 
ESQUEMA TRIASOCIADO Y 
HEMOCULTIVOS + PVR
PACIENTE B
ESQUEMA TRIASOCIADO 
HEMOCULTIVOS Y BM PARA VIRUS 
RESPIRATORIOS 
BUENA EVOLUCION 
CLINICA
BUENA EVOLUCION 
CLINICA
SIGUE CON ATB HASTA 
AUMENTO DE RAN 
CON HEMOCULTIVOS (-)
SIN EVIDENCIA DE OTRO 
AGENTE CAUSAL 
INFLUENZA A (+) HC (-)
SIN EVIDENCIA DE OTROS 
PATOGENOS RESPIRATORIOS
SE DEJA OSELTAMIVIR ORAL
SUSPENDE ATB
ALTA
Torres JP. Pediatr Infect Dis J 2012
Film Array RVP
(*): Aprobado por FDA 2012
Comparación de film array con tecnicas de 
IF+PCR para HRV
Comparación de las técnicas de Pneumovir/PCR en tiempo real y Biofire
FilmArray para la detección de patógenos respiratorios virales y bacterianos 
Torres JP, Farfán M y cols. Sochinf 2014
Laboratorio Biología Molecular Clínica Las Condes. Gentileza Dr. M. Farfán
Laboratorio Biología Molecular Clínica Las Condes
Antimicrobial prescription after multiplex PCR (+)
Children study (n=1707; retrospective, inpatients with ARI)
• 50% received ATB
• 47% RVP was performed 87% (+)
• Children tested received more often ATB (54 vs 46%)
• RVP (+): OR 0.53 (CI 0.34-0.81)
• RVP (+) for influenza : oseltamivir use OR 27.38 (CI 14-42)
McCulloh et al. J Ped Infect Dis Soc 2014;3:146-53
Variable RVP (+) n=703 RVP (-) n=106
Received ATB * 51 % 67 %
Stopped ATB 6 % 0
Started ATB after
result *
11 % 100 %
* p < 0.05
PCR sens esp
SGA 98,3% 94,2%
Influenza A 100% 96.8%
Influenza B 100% 94,1%
VRS
Cobas Liat PCR
Point of care
Rápido (20 min)
No requiere operador experto
No requiere extraccion de DNA
Fácil de usar 
Seguro para el operador 
“Aumento del diagnóstico etiológicoen lactantes 
< 3 meses que se hospitalizan por síndrome 
febril sin foco al incorporar detección molecular 
para enterovirus y virus respiratorios” 
Cecilia Piñera , Alejandra Vergara, Romina Valenzuela, Bernardita Coublé, 
Macarena Moya, Thelma Suau, Anita Fritis, Carolina Roa, 
Maria Elena Santolaya, Juan Pablo Torres
Fondo de investigación Saval- Facultad de Medicina de Universidad de Chile
• Síndrome febril sin foco (SFSF): 
Fiebre en ausencia de un foco aparente luego de una anamnesis y examen 
físico completo
– 19 a 30% consultas ambulatorias
• Causas en < 3 meses:
– Infecciones bacterianas: 10-27%
– Infecciones virales: %??
– Otros
Rol de la biología molecular en diagnóstico infecciones virales
Baraff LJ, Pediatr Ann. 2008 Oct;37(10):673-9.
Aumentar el diagnóstico etiológico de SFSF en niños 
< 3 meses al incorporar técnicas de detección 
molecular para
• enterovirus (EV) en sangre y LCR
• virus respiratorios en hisopado nasofríngeo (HNF)
por sobre el diagnóstico microbiológico 
convencional
Objetivos del estudio
Confirmación etiológica de los diagnósticos de egreso 
con microbiología convencional
Diagnóstico clínico infecciones 
bacterianas: 38/101 niños
Confirmado microbiología 
convencional: 31/38  82%
– Hemocultivos (+) 7
• E coli: 3
• SBHGA: 2
• SBHGB: 2
– Urocultivo (+) 23
• E coli: 20 / Klebsiella: 1 / 
Enterococcus: 1/ Enterobacter
cloacae: 1
Diagnóstico clínico infección
viral: 25/101 niños
Confirmado microbiología 
convencional: 3/25  12%
– Rotavirus: 3
Diagnósticos etiológicos confirmados
Infecciones Bacterianas
30%
21%
Infecciones virales
3%
32%
Coinfección Virus-
Bacteria
1%
11%
Etiología (-)
66%
36%
Diagnóstico Microbiológico Convencional
Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular
Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico 
de un 34 a 63% (p 0,0001)
Diagnósticos etiológicos confirmados
Infecciones Bacterianas
31%
21%
Infecciones virales
2%
32%
Coinfección Virus-
Bacteria
1%
11%
Etiología (-)
66%
36%
Diagnóstico Microbiológico Convencional
Diagnóstico Microbiológico Convencional + Biología Molecular
Globalmente se aumentó diagnóstico etiológico 
de un 34 a 63% (p 0,0001)
Genómica y
Proteómica
HUMANA
I
N
F
E
C
T
O
M
A
Genómica y
Proteómica
PATÓGENO
F
A
R
M
A
C
O
M
A
Efecto DROGAS
Genómica y
Proteómica
HUMANA
Efecto DROGAS
Genómica y
Proteómica
PATÓGENO
HOSPEDERO MICROORGANISMO
Microarrays
• Pequeño vidrio o chip de 1-2 cm2
• Muestras de DNA ordenadas en el vidrio
• Detectan miles de secuencias de DNA o RNA
3357 transcritos diferentes entre los niños 
con infección bacteriana vs los controles 
No supervisado
97%
BIOFIRMA de niños con y sin infección bacteriana 
2486 genes 
Agrupo correctamente 76% (72/95)
Conclusiones
• Nuevas técnicas diagnósticas acortan tiempo de 
respuesta, disminuyen complejidad, realizan test 
múltiples y optimizarían variables clínicas
• Incorporación en pacientes hospitalizados / 
inmunocomprometidos
• Datos apoyan la costo-efectividad del diagnóstico 
molecular de virus respiratorios en meningitis y en sepsis
• Importante considerar realidad nacional/local
• Falta conocer aún más el impacto en variables clínicas
Lo mas importante !!!!!