TFM_PALOMA_MENDEZ_SILVA

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APLICACIÓN DE EXTRACCIÓN 
ASISTIDA POR ULTRASONIDOS Y 
MICROONDAS A LA 
RECUPERACIÓN DE 
BIOMOLÉCULAS 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
TRABAJO FIN DE MÁSTER 
PARA LA OBTENCIÓN DEL 
TÍTULO DE MÁSTER EN 
INGENIERÍA QUÍMICA 
SEPTIEMBRE 2022 
 
Paloma Méndez Silva 
 
DIRECTORES DEL TRABAJO FIN DE MÁSTER: 
María González Miquel 
Emilio J. González Gómez 
P
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lo
m
a
 M
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z
 S
il
v
a
 
Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva I 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
AGRADECIMIENTOS 
 
 
En primer lugar, me gustaría agradecer a mis tutores, María González Miquel y 
Emilio José González Gómez por su tiempo y constante atención para ayudarme a que 
este Trabajo Fin de Máster saliese adelante. También a Blanca por su ayuda y por sus 
consejos, los cuales me han resultado muy útiles para trabajar de forma adecuada en el 
laboratorio. 
A continuación, agradecer a mis padres, Victoria y José, y a mi hermano, Alberto, 
por apoyarme de principio a fin y guiarme en el camino. Sin los valores que me enseñan y 
su apoyo incondicional no hubiese llegado hasta aquí. 
Por último, agradecer a mis amigos, compañeros, y demás personas que de una 
forma u otra han vivido y compartido conmigo los buenos y no tan buenos momentos a lo 
largo de mis años de estudio. 
A todos vosotros, muchas gracias. 
Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva II 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
 
 
La Unión Europea está considerada como la principal productora de vino y derivados a 
nivel mundial, representando en torno al 45% de la extensión vitivinícola mundial, el 
48% del consumo total y el 64% de la producción mundial en los últimos años. Con unos 
niveles de producción tan elevados se debe tener en cuenta el elevado volumen de 
residuos que se generan a lo largo de un proceso productivo de estas características, 
constituidos principalmente por el orujo, que incluye las cáscaras y las semillas de la uva. 
En la actualidad la mayor parte de dichos residuos se destinan al compostaje, a la 
alimentación animal y a la elaboración de destilados, con un grado de recuperación y 
aprovechamiento muy bajo. Sin embargo, existen números estudios en los que se 
demuestra que los residuos derivados de la industria del vino contienen compuestos de 
gran interés para su aplicación en otro tipo de industrias. 
Los compuestos presentes en los residuos pueden ser muy variables en función de 
la variedad de uva que se haya utilizado, el método de cultivo, el clima, las condiciones 
del suelo, la localización, la tecnología empleada o las condiciones del proceso de 
elaboración del vino, con lo cual el abanico de aplicaciones también varía en función del 
tipo de compuesto. Por lo general, los polifenoles constituidos por dos o más subunidades 
fenólicas, también conocidos como flavonoides, son los compuestos de mayor interés 
presentes en los residuos de uva, lo cual se debe principalmente a la alta capacidad 
antioxidante que poseen, a sus beneficios nutricionales y a sus características sensoriales. 
Por este motivo, los flavonoides ofrecen beneficios muy significativos en diversos 
sectores, como por ejemplo la industria cosmética, farmacéutica y alimentaria, de ahí que 
la demanda de compuestos polifenólicos provenientes de fuentes naturales presente una 
tendencia creciente y cada vez se destinen más recursos a la recuperación y revalorización 
de residuos de origen vegetal, como es el caso de los residuos de uva. 
Para llevar a cabo la recuperación de los compuestos de interés presentes en los 
residuos se pueden utilizar técnicas de extracción sólido-líquido, basadas en la separación 
de uno o varios compuestos presentes en una fase sólida mediante un disolvente líquido 
que los separa de forma selectiva. Dichas técnicas de extracción pueden ser 
convencionales y basadas principalmente en la utilización de disolventes orgánicos o no 
convencionales, empleando técnicas más modernas como ultrasonidos o microondas. Con 
respecto a los disolventes orgánicos utilizados tradicionalmente, estos presentan un gran 
número de desventajas a nivel medioambiental y de eficiencia de extracción, con lo cual 
surgió la necesidad de buscar alternativas más verdes capaces de realizar extracciones de 
forma más sostenible. 
Los disolventes eutécticos (DE) son mezclas eutécticas de dos o más componentes 
con un punto de fusión menor que el de los componentes por separado debido a la 
 Índice 
III Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
combinación de una especie aceptora de enlaces de hidrógeno (HBA, del inglés Hydrogen 
Bond Acceptor) con una especie dadora de enlaces de hidrógeno (HBD, del inglés 
Hydrogen Bond Donor) que provoca una deslocalización de carga responsable del 
descenso de su punto de fusión. Estos disolventes se preparan por agitación y 
calentamiento de dos o más compuestos hasta alcanzar el punto eutéctico en el que tiene 
lugar el cambio de fase de sólido a líquido. Destacan por sus buenas propiedades 
fisicoquímicas, su gran versatilidad, su facilidad de preparación y de recuperación, su 
bajo coste, y su baja toxicidad para la salud y el medioambiente. Además, los DE siguen 
la tendencia mundial de la química verde, y constituyen una de las alternativas más 
prometedoras en lo que se refiere al uso de disolventes verdes. 
Teniendo en cuenta las ventajas que ofrece la utilización de disolventes eutécticos 
en extracciones sólido-líquido como alternativa a los disolventes tradicionales, el 
principal objetivo del presente trabajo es la selección de la mejor opción por medio de un 
barrido entre diferentes DE para posteriormente llevar a cabo una optimización de las 
condiciones de extracción por medio de técnicas asistidas como el ultrasonidos y el 
microondas. De esta forma, es posible evaluar y comparar los resultados derivados del 
uso de DE con las extracciones convencionales llevadas a cabo en la industria hasta el 
momento, pudiendo ver si los disolventes verdes consiguen mejorar las eficiencias 
tradicionales o no y que tipo de intensificación es más favorable para el sistema en 
cuestión. 
En primer lugar se llevó a cabo un estudio preliminar de las propiedades y el 
comportamiento de los DE a evaluar para poder prepararlos y utilizarlos posteriormente 
en la extracción de compuestos de interés de la uva. Con esto, se establecieron las 
diferentes alternativas de DE a estudiar, que sumaron un total de 15 opciones, de los 
cuales solo 13 resultaron válidos para ser probados en un sistema de extracción sólido- 
líquido: ClCh:1,2-butanediol [1:3], prolina:1,2-butanediol [1:3], betaína:1,2-butanediol 
[1:3], ClCh:1,2-butanediol [1:4], prolina:1,2-butanediol [1:4], betaína:1,2-butanediol 
[1:4], ClCh:glicerol [1:4], prolina:glicerol [1:4], betaína:glicerol [1:4], ClCh:1,2- 
propanodiol [1:4], prolina:1,2-propanodiol [1:4] y betaína:1,2-propanodiol [1:4]. Cabe 
mencionar que se realizó una extracción con cada uno de los disolventes eutécticos 
formados y que todas ellas se llevaron a cabo en un agitador orbital bajo las mismas 
condiciones de operación, optimizadas de acuerdo con la bibliografía consultada. De 
forma paralela, se fue evaluando la calidad de las extracciones a medida que estas se iban 
realizando, utilizando para ello diferentes metodologías de análisis y cuantificación, como 
son: 
• La cuantificación de los compuestos fenólicos totales (TPC) presentes en 
el extracto utilizando el método Folin-Ciocalteu (FC) y el método HPLC. 
• La cuantificación del contenido total de flavonoides (TFC) presentes en el 
extracto. 
• La cuantificación de la capacidad antioxidante del extracto. 
Una vez realizadas las extracciones con cada uno de los DE, así como con agua y 
con etanol, como ejemplos de disolventes tradicionales, se realizó un análisiscon todos 
los resultados para poder seleccionar y justificar el DE que ofrece unos resultados más 
favorables en comparación con los resultados derivados de las extracciones 
convencionales. Finalmente, se utilizó el disolvente eutéctico profundo seleccionado para 
llevar a cabo la intensificación mediante técnicas de extracción asistida por ultrasonidos 
(UAE, del inglés Ultrasound Assited Extraction) y por microondas (MAE, del inglés 
Microwave Assited Extraction) y buscar las condiciones de operación que dan lugar a los 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva IV 
 
 
mejores resultados, comparándolos a su vez con los resultados derivados de extracciones 
con etanol bajo las mismas condiciones. Cabe destacar que en el caso de la extracción 
asistida por ultrasonidos (UAE) las condiciones a optimizar fueron el tiempo y la 
potencia, mientras que para la extracción asistida por microondas (MAE) se optimizaron 
el tiempo y la temperatura. 
En cuanto a resultados, la extracción sólido-líquido en agitador orbital (60 ºC y 
100 min) utilizando DE ofrece mejores resultados que utilizando disolventes tradicionales 
como el agua o el etanol. Además, estos resultados son mejorables con la intensificación 
de la extracción por medio de microondas, ya que a pesar de necesitar una mayor 
temperatura de extracción, el tiempo requerido es mucho menor (100 ºC y 3 min) para 
alcanzar una eficiencia de extracción mayor, lo cual implica grandes ventajas a nivel 
medioambiental, operacional y económico. Por el contrario, para este caso en concreto, 
con la extracción asistida por ultrasonidos el DE se va degradando con el tiempo, e 
incluso a alta potencia y durante un tiempo prolongado la eficiencia de la extracción no 
consigue mejorar el sistema tradicional con etanol. Cabe destacar que para poder disponer 
de resultados más detallados sobre esta optimización sería necesario disponer de un 
mayor tiempo de experimentación para poder conocer en mayor detalle el 
comportamiento del DE bajo diferentes condiciones de operación, lo cual no es objeto del 
presente trabajo y requeriría de un trabajo de experimentación futuro o incluso paralelo a 
este. 
Por lo tanto, las técnicas de extracción con disolventes eutécticos, al igual que con 
otro tipo de disolventes verdes, suponen una alternativa prometedora a nivel industrial, 
principalmente en términos medioambientales. Sin embargo, este no es el único punto que 
se debe considerar y se necesita de un mayor trabajo de investigación en este campo con 
el fin de encontrar un equilibrio entre los beneficios sociales, ambientales y económicos 
para trasladar los resultados derivados de los estudios a escala de laboratorio a una escala 
industrial. De la misma forma, también es importante implementar un cambio de 
perspectiva a nivel educacional que permita sentar las bases para formar a futuros 
profesionales más comprometidos con la sostenibilidad y la química verde, responsables 
de actualizar y desarrollar actividades más respetuosas desde el punto de vista de la 
extracción sólido-líquido y de la industria química en general. 
Palabras clave: uva, extracción sólido-líquido, DE, compuestos fenólicos, flavonoides, 
capacidad antioxidante, ultrasonidos, microondas. 
Códigos UNESCO: 
 
230690 Química de productos naturales orgánicos 
330303 Procesos químicos 
330304 Separación química 
330311 Química industrial 
332818 Transferencia de masa 
332825 Extracción sólido-líquido 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Índice 
V Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ÍNDICE 
 
 
AGRADECIMIENTOS ......................................................................................... III 
RESUMEN .............................................................................................................. V 
1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................. 1 
1.1 El sector vitivinícola................................................................................... 1 
1.1.1 Residuos generados .............................................................................. 2 
1.1.2 Composición de los residuos ................................................................ 3 
1.2 Revalorización de los residuos ................................................................... 5 
1.3 Recuperación de compuestos de interés mediante técnicas de extracción.6 
1.3.1 Principales técnicas de extracción: revisión del estado del arte ........... 6 
1.3.2 Características de los disolventes eutécticos (DE) ............................... 9 
1.4 Justificación de la utilización de disolventes eutécticos (DE) ................. 10 
2 OBJETIVOS .................................................................................................... 13 
3 MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................ 14 
3.1 Materiales y equipos................................................................................. 14 
3.1.1 Material vegetal .................................................................................. 14 
3.1.2 Compuestos químicos ......................................................................... 14 
3.1.3 Instrumentación de laboratorio ........................................................... 15 
3.2 Preparación de los DE .............................................................................. 19 
3.2.1 DE a preparar ...................................................................................... 19 
3.2.2 Propiedades físicas ............................................................................. 20 
3.2.3 Estudio previo ..................................................................................... 20 
3.2.4 Método de preparación ....................................................................... 21 
3.3 Método de extracción ............................................................................... 22 
3.3.1 Preparación de las muestras ............................................................... 22 
3.3.2 Condiciones de extracción .................................................................. 22 
3.3.3 Condiciones de centrifugación ........................................................... 22 
3.4 Rectas de calibrado ................................................................................... 23 
3.4.1 Fundamentos ...................................................................................... 23 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
VI Paloma Méndez Silva 
 
 
3.4.2 Método Folin-Ciocalteau (FC) ........................................................... 24 
3.4.3 Flavonoides totales ............................................................................. 25 
3.4.4 HPLC .................................................................................................. 25 
3.5 Métodos para cuantificar la calidad de la extracción ............................... 26 
3.5.1 Cuantificación del contenido total de polifenoles (TPC) por el método 
Folin-Ciocalteu (FC) .................................................................................................. 26 
3.5.2 Cuantificación del contenido total de flavonoides (TFC) ................... 27 
3.5.3 Cuantificación de capacidad antioxidante .......................................... 29 
3.5.4 Cuantificación de compuestos fenólicos mayoritarios por HPLC ...... 30 
3.6 Análisis y selección del mejor DE ........................................................... 31 
3.7 Utilización de técnicas de intensificación de la extracción ...................... 32 
3.7.1 Extracción asistida por ultrasonidos (UAE) ....................................... 32 
3.7.1.1 Fundamentos ...............................................................................32 
3.7.1.2 Optimización de las condiciones de extracción ........................... 34 
3.7.2 Extracción asistida por microondas (MAE) ....................................... 34 
3.7.2.1 Fundamentos ............................................................................... 34 
3.7.2.2 Optimización de las condiciones de extracción ........................... 36 
4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................... 37 
4.1 DE a utilizar.............................................................................................. 37 
4.2 Rectas de calibrado ................................................................................... 38 
4.2.1 Método Folin-Ciocalteau (FC) ........................................................... 38 
4.2.2 Flavonoides totales ............................................................................. 38 
4.2.3 HPLC .................................................................................................. 39 
4.3 Análisis y selección del mejor DE ........................................................... 43 
4.3.1 Contenido total de polifenoles (TPC) y de flavonoides (TFC)........... 43 
4.3.2 Capacidad antioxidante ...................................................................... 47 
4.3.3 Compuestos fenólicos mayoritarios por HPLC .................................. 51 
4.4 Intensificación de la extracción ................................................................ 55 
4.4.1 Extracción asistida por ultrasonidos (UAE) ....................................... 55 
4.4.1.1 Compuestos fenólicos mayoritarios por HPLC ........................... 55 
4.4.2 Extracción asistida por microondas (MAE) ....................................... 56 
4.4.2.1 Compuestos fenólicos mayoritarios por HPLC ........................... 56 
5 CONCLUSIONES ........................................................................................... 59 
6 LÍNEAS FUTURAS ........................................................................................ 63 
7 BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................. 65 
8 PLANIFICACIÓN TEMPORAL Y PRESUPUESTO .................................... 68 
8.1 Planificación temporal .............................................................................. 68 
 
 
 
 Índice 
VII Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
8.2 Presupuesto............................................................................................... 71 
8.2.1 Costes directos .................................................................................... 71 
8.2.1.1 Licencias ...................................................................................... 71 
8.2.1.2 Reactivos ..................................................................................... 71 
8.2.1.3 Equipos y material de laboratorio ............................................... 72 
8.2.1.4 Consumibles ................................................................................ 74 
8.2.1.5 Personal ....................................................................................... 74 
8.2.2 Costes indirectos ................................................................................. 75 
8.2.3 Coste total ........................................................................................... 75 
9 VALORACIÓN DE IMPACTOS ................................................................... 77 
10 ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................ 79 
11 ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................. 81 
12 ABREVIATURAS, UNIDADES Y ACRÓNIMOS ................................... 83 
ANEXO: CÁLCULOS....................................................................................... 84 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 1 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 INTRODUCCIÓN 
 
 
1.1 El sector vitivinícola 
El término vitivinícola incluye a su vez dos sectores: el vitícola, asociado a la 
actividad de cultivo de los distintos tipos de uva y el vinícola referido al propio proceso 
de elaboración de vinos de diversas calidades. 
A modo de introducción y en términos numéricos, la Unión Europea está 
considerada como la principal productora mundial de vino, con una producción media en 
torno a los 165 millones de hectolitros anuales, de acuerdo con los datos situados entre los 
años 2016 y 2020. Además en el año 2020 la Unión Europea representó el 45 % de la 
extensión vitivinícola mundial, el 64 % de la producción mundial y el 48 % del consumo 
mundial de vino (1). 
En cuanto al sector vitivinícola español, y de acuerdo con datos del año 2021, el 
país cuenta con una extensión total de viñedos de 941.086 hectáreas que representan 
aproximadamente el 13 % de la extensión total a nivel mundial. Dichas cifras sitúan a 
España como el tercer país del mundo que más vino produce por detrás de Italia y Francia 
y con una producción media entre 40 y 42 millones de hectolitros al año. Además, España 
cuenta con una variedad de 150 especies autóctonas de uva siendo las más cultivadas la 
garnacha tinta, la boba, la airen y el tempranillo, que permiten la elaboración de una 
amplia variedad de vinos catalogados con denominación de origen. 
La cadena de valor del sector vitivinícola cuenta con una extensa red de agentes, 
desde el cultivo de la uva hasta la comercialización del vino, pasando por la elaboración y 
la distribución de este. Por lo tanto, este sector genera y mantiene el 2,4 % del total de 
empleos en España, bien sean de forma directa, en campo y bodegas, o de forma indirecta 
en otros sectores como son la industria de la madera y del corcho, la fabricación de 
maquinaria y de equipos industriales, la industria del vidrio, el turismo o la hostelería, 
entre otros (2). 
Los altos niveles de producción del sector también llevan asociados una gran 
cantidad de residuos generados a lo largo de la cadena de producción del vino que, por lo 
general, se destinan a la alimentación animal, a la elaboración de destilados y al 
compostaje. Sin embargo, diversos estudios corroboran que existen distintos compuestos 
que permanecen en los subproductos generados a lo largo de las diferentes etapas del 
proceso de elaboración del vino y que pueden ser de interés para su aplicación en otros 
tipos de industrias. Por este motivo, se está estudiando la posibilidad de recuperar dichos 
componentes de interés, que permite reducir el impacto medioambiental asociado 
principalmente a la acumulación estacional de residuos y a la dificultad que poseen para 
 
 
 
 Introducción 
2 Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
degradarse, lo cual da lugar a problemas como son los malos olores o la contaminación 
del agua. Además, la revalorización de residuos posee otra ventaja importante como es 
poder obtener beneficios económicos y tecnológicos derivados de la reutilización de 
productos con valor añadido. 
1.1.1 Residuos generados 
Tal y como se ha mencionado anteriormente, el sector vitivinícola genera una gran 
cantidad de residuos y efluentes en las distintas etapas del proceso de producción del 
vino. Dichos residuos se presentan resaltados en color malva en el diagrama de bloques 
de la Figura 1.1. A su vez, los diferentes residuos que aparecen diferenciados en la Figura 
1.1 pueden agruparse en cuatro bloques principales en función de su aspecto y de sus 
características que facilitan la cuantificación de estos: 
• Orujos: Constituidos únicamente por la cáscara de la uva y las semillas que 
contiene. 
• Raspón: Incluye las uvas que se desechan, elescobajo, las hojas, y las 
cabezas y colas de las ramas. 
• Lías: Son los residuos generados en los procesos de fermentación 
alcohólica y clarificación, también conocidos como borras. 
• Lodos: Engloban los efluentes líquidos derivados del tratamiento de aguas 
residuales y la vinaza resultante del proceso de destilación del vino base. 
 
Figura 1.1: Residuos generados en el proceso de producción del vino. Fuente: (3) 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 3 
 
 
Dado que España es uno de los principales productores de vino a nivel mundial, 
también es uno de los principales generadores de residuos, de hecho según datos de la 
Organización Internacional del Vino (OIV), por cada 100 kg de uva tratada se generan 
aproximadamente 25 kg de desechos, de los cuales el orujo es el residuo mayoritario, tal y 
como se muestra en la Figura 1.2. 
 
Figura 1.2: Distribución de residuos generados. Fuente: (4) 
Tal y como se muestra en la Figura 1.2 más de la mitad de los residuos derivados 
del proceso productivo del vino son orujos, de ahí que la cuantificación, la reducción y la 
revalorización de residuos se centre mayoritariamente en este grupo. En la Figura 1.3 se 
presenta la producción mundial de orujo por países, expresada en millones de toneladas, 
la cual, como era de esperar, coincide con el nivel de producción de vino, pues a mayor 
producción mayor cantidad de residuos generados. 
 
Figura 1.3: Producción de orujo por países en millones de toneladas. Fuente: (5) 
 
1.1.2 Composición de los residuos 
De forma general, todos los residuos de uva presentan una cantidad de fibra que suele 
estar entre el 43 % y el 75 % del peso seco de residuos de uva, y cuyo porcentaje viene 
dado por la presencia de lignina y de polisacáridos. En segundo lugar se sitúa la materia 
grasa, que representa entre un 7 % y un 15 % del peso seco de los residuos de uva y está 
constituida principalmente por ácidos grasos insaturados como son el ácido linoleico (75 
% del total de materia grasa) y ácidos oleicos (15 % del total de materia grasa). Además, 
los residuos generados también presentan un porcentaje importante de proteínas situado 
entre el 6 % y el 15 % del peso seco total, entre las cuales destaca la presencia de ácido 
glutámico y de ácido aspártico, mientras que el triptófano y los aminoácidos de azufre se 
encuentran en cantidades menores. Por último, y con un porcentaje entre el 3 % y el 7 % 
 
 
 Introducción 
4 Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
del peso seco total, se encuentran compuestos minoritarios como oligosacáridos o 
minerales (potasio, sulfuro, magnesio y fósforo) (6). 
Por lo tanto, la cantidad de cada uno de los compuestos presentes es muy variable, 
encontrándose en mayor o menor cantidad en función del tipo de residuo generado. De 
ahí que la composición de los residuos esté influenciada en gran medida por una serie de 
factores como son la variedad de uva a utilizar, el método de cultivo empleado, las 
condiciones del suelo de cultivo, el clima, la localización geográfica de la planta de 
producción de vino, la tecnología y las condiciones del proceso de elaboración del mismo 
(6). 
Además, los residuos generados en la elaboración del vino, y más concretamente 
el orujo de uva, contiene una gran cantidad de compuestos fenólicos derivados de una 
extracción incompleta durante las distintas etapas del proceso productivo. Los 
compuestos fenólicos son compuestos orgánicos cuya estructura molecular posee al 
menos un anillo aromático ligado a un grupo hidroxilo, conocido como grupo fenol y 
representado en la Figura 1.4. 
 
Figura 1.4: Grupo fenol. Fuente: (7) 
 
Dichos compuestos provienen principalmente de los organismos vegetales como 
frutas, vegetales y plantas, y son los responsables del color de muchas frutas y hortalizas, 
de sabor amargo de los cítricos, de la astringencia del vino y de aroma de ciertas frutas, 
como por ejemplo, de los plátanos. A su vez, los compuestos fenólicos se clasifican en 
distintas categorías en función de la estructura molecular que posean, diferenciándose los 
fenoles simples y los polifenoles, como categorías principales. La segunda categoría 
representa el grupo de compuestos mayoritarios y se pueden dividir en las dos 
subcategorías mostradas en la Figura 1.5, que en conjunto suponen más de 8.000 
compuestos identificados (8). 
 
Figura 1.5: Clasificación de compuestos fenólicos. 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 5 
 
 
Los flavonoides son aquellos polifenoles que poseen al menos dos o más 
subunidades fenólicas, como se muestra en la Figura 1.6. Dada su alta capacidad 
antioxidante, su amplio abanico de aplicaciones en otro tipo de industrias y los múltiples 
beneficios que ofrecen para la salud, los flavonoides representan los principales 
compuestos de interés presentes en los residuos de uva. A pesar de que los flavonoides 
abarcan una amplia variedad de compuestos distintos, el carácter antioxidante que le 
otorgan a los residuos de uva viene dado por el contenido total de dichos compuestos. De 
ahí que a la hora de evaluar la calidad de la extracción se decidiese cuantificar tanto el 
contenido total de polifenoles como cada uno de ellos de forma aislada. 
 
 
Figura 1.6: Estructura molecular de los flavonoides. Fuente: (9) 
 
1.2 Revalorización de los residuos 
En la actualidad, la mayor parte de los residuos generados en el proceso de 
elaboración del vino se desechan sin ser utilizados, mientras que una pequeña parte se 
destina a la obtención de destilados, a la producción de compostaje y en alimentación 
animal, bien de forma directa o como complementos en la elaboración de piensos. Sin 
embargo, existen diversos trabajos de investigación y desarrollo capaces de demostrar que 
este subproducto de la industria vitivinícola posee propiedades muy útiles y beneficiosas 
que pueden ser de interés en otro tipo de mercados como son las industrias cosmética, 
alimentaria y farmacéutica. 
El amplio abanico de aplicaciones vinculadas a los residuos de uva se relaciona 
principalmente con sus propiedades antioxidantes, sus características sensoriales y sus 
beneficios nutricionales. Las propias características fisicoquímicas de los compuestos 
fenólicos son las principales responsables de la capacidad que poseen para regular e 
interferir en la actividad de diversos enzimas y procesos metabólicos de oxidación- 
reducción, a los cuales se atribuye su capacidad antioxidante. 
Por ejemplo, en el ámbito de la cosmética, su capacidad antioxidante es capaz de 
combatir los radicales libres culpables del envejecimiento de la piel, equilibrando el pH 
de la piel sin causar alergias o irritaciones, lo cual despierta el interés de introducir este 
tipo de compuestos en la fabricación de productos cosméticos. En el caso de la industria 
alimentaria, los polifenoles son de especial interés para su uso como colorantes, 
potenciadores del sabor, conservadores de los alimentos e incluso como ingredientes 
funcionales en nutracéuticos y en la elaboración de suplementos nutricionales. Con 
respecto a la industria farmacéutica, los polifenoles presentes en dichos residuos resultan 
beneficiosos en la síntesis de medicamentos por su carácter vasodilatador, antitrombótico, 
anti-aterogénico, antiviral y antiinflamatorio, pudiendo disminuir de forma considerable 
el riesgo de padecer enfermedades degenerativas y/o metabólicas, así como el riesgo de 
sufrir algunos cánceres (8). 
 
 
 
 
 Introducción 
6 Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
Por este motivo, la demanda de compuestos polifenólicos provenientes de fuentes 
naturales presenta una tendencia creciente que hace que cada vez se preste más atención y 
se destine un mayor número de recursos a la investigacióny desarrollo de metodologías 
para la recuperación y la revalorización de residuos vegetales, como es el caso de los 
residuos vitivinícolas. 
1.3 Recuperación de compuestos de interés mediante técnicas 
de extracción 
1.3.1 Principales técnicas de extracción: revisión del estado del arte 
La extracción se define como una operación unitaria de separación por 
transferencia de materia que consiste en poner en contacto dos fases con el fin de 
transferir uno o varios componentes de una a otra. En concreto, la extracción sólido- 
líquido es una operación unitaria basada en la separación de uno o varios compuestos 
presentes en una fase sólida mediante un disolvente líquido capaz de separarlos de forma 
selectiva, bien sea mediante una simple disolución física o por una reacción química que 
libera los componentes de interés de la matriz sólida (10). 
En la actualidad existen distintas técnicas para llevar a cabo la extracción sólido 
líquido, tanto consolidadas como en desarrollo y mejora. En el caso de la recuperación de 
compuestos de valor presentes en los residuos de uva, hay una amplia variedad de 
técnicas convencionales y modernas que son aplicables, pero ninguna totalmente 
estandarizada. La capacidad y la eficiencia de la extracción dependen principalmente de 
la naturaleza y de las propiedades del disolvente a emplear, de la preparación y 
características de la matriz sólida que se desea extraer, de la estructura química de los 
compuestos fenólicos presentes, de la técnica utilizada, de la presencia de sustancias que 
puedan interferir en el proceso y de las condiciones de operación como son la 
temperatura, la relación sólido líquido y el tiempo de extracción. 
Por un lado, las técnicas convencionales de extracción incluyen la maceración, la 
extracción con disolventes orgánicos, la percolación y la extracción Soxhlet, entre otras. 
Por otro lado, las técnicas no convencionales o modernas engloban el uso de 
ultrasonidos, microondas, enzimas o alta presión para llevar a cabo la extracción (11). A 
continuación se comentan brevemente los principios de funcionamiento de las técnicas 
convencionales, basadas mayoritariamente en la extracción Soxhlet, por ser las más 
utilizadas. 
Para llevar a cabo la extracción Soxhlet se utiliza el montaje de la Figura 1.7 en la 
cual aparecen representadas las distintas partes que tiene. En primer lugar se introduce el 
disolvente a emplear en el interior del balón en una cantidad suficiente como para que 
este no quede seco y pueda provocar que la muestra se queme o una explosión del equipo 
por acumulación de vapores. De forma paralela se prepara la muestra de la cual se desean 
extraer los componentes de interés en un cartucho poroso cilíndrico con base semiesférica 
para su apoyo adecuado en la base del equipo extractor. A continuación, se conecta la 
manta térmica para incrementar la temperatura del sistema de forma progresiva y que el 
disolvente comience a evaporarse y ascender hasta un condensador de reflujo donde se 
condensa por contacto con agua de refrigeración. Una vez condensado, el disolvente cae 
por gravedad sobre el cartucho poroso que contiene la muestra y el nivel de disolvente va 
aumentando y cubriendo la muestra hasta un punto en el que se produce el reflujo que 
devuelve el extracto al balón de la base, dando por finalizado el ciclo de extracción. 
Dicho ciclo se repite tantas veces como sea necesario para que la muestra se agote y se 
 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 7 
 
 
terminen de extraer todos los compuestos de interés, los cuales quedan concentrados en el 
balón de disolvente (12). 
 
Figura 1.7: Extracción Soxhlet. Fuente: (13) 
Las técnicas de extracción convencionales se basan en la utilización de disolventes 
orgánicos como son hidrocarburos, alcoholes o agua, que, por lo general, suelen presentar 
una toxicidad considerable que los hace poco favorables para la salud y el 
medioambiente. Además, las técnicas de extracción convencionales suelen necesitar 
mucho tiempo de operación y volúmenes de disolvente elevados, ya que estos suelen ser 
bastante inestables térmicamente y poco selectivos para la separación de algunos 
compuestos de interés. Con respecto al agua, este es el disolvente más utilizado en 
industrias como la alimentaria o la cosmética, ya que sus propiedades fisicoquímicas la 
hacen menos dañina y más respetuosa para el medioambiente que otros disolventes 
tradicionales como los hidrocarburos o los alcoholes. Sin embargo, en ocasiones, el agua 
suele ser un disolvente poco selectivo y por lo tanto, poco adecuado para extraer ciertos 
compuestos (11). 
Teniendo en cuenta los inconvenientes que presentan los disolventes tradicionales, 
tanto a nivel de eficiencia de la extracción como a nivel medioambiental, en los últimos 
años surgió la necesidad de buscar disolventes alternativos que posean un rango de 
aplicación más amplio. Además, con el aumento observado en el precio de la energía y el 
objetivo “Marco europeo sobre clima y energía para 2030” de reducir al menos un 55 % 
las emisiones de gases de efecto invernadero para el año para el año 2030 fue necesario 
empezar a explorar nuevas tecnologías de extracción conocidas como “Green Extraction 
Techniques”. Dichas técnicas pretenden reducir el uso de sustancias peligrosas a través 
del diseño y estudio de procesos de extracción capaces de reducir el consumo energético 
por medio de disolventes alternativos y renovables capaces de garantizar la seguridad y 
eficiencia del proceso, así como la calidad del extracto obtenido (14). 
Con las técnicas verdes de extracción y con el objetivo de sustituir los disolventes 
volátiles tradicionales surgen los denominados “disolventes verdes”, más respetuosos con 
el medioambiente y menos dañinos para la salud humana. A lo largo del tiempo se han 
ido desarrollando y estudiando distintas alternativas, como es el caso de los 
biodisolventes obtenidos a partir de biomasa, los cuales parecían atractivos dada la 
 
 
 Introducción 
8 Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
amplia variedad de materias primas que se utilizan para su producción y la facilidad para 
combatir problemas relacionados con la generación de residuos vegetales y la ocupación 
del terreno. Sin embargo, se ha visto que para poder obtener biodisolventes que ofrezcan 
eficiencias de extracción comparables a las proporcionadas por los disolventes 
tradicionales se necesitan volúmenes muy altos que hoy en día no son compatibles con las 
necesidades de la industria. Además, algunos de ellos presentan efectos nocivos para la 
salud, como son propiedades cancerígenas y toxicidades de inhalación moderadas y 
también para el medioambiente, con niveles de emisiones muy elevados (14). 
Otra de las alternativas valoradas son los polímeros líquidos, que tienen la gran 
ventaja de no ser volátiles, y por lo tanto, de no ser peligrosos a nivel medioambiental. 
Por el contrario, son insolubles en disolventes orgánicos apolares y su solubilidad en agua 
es muy baja, lo que limita mucho su uso con ciertos disolventes y en medios acuosos. 
Además su alto punto de fusión hace que se necesiten altas temperaturas y la ayuda de 
disolventes adicionales para su uso en extracciones. La necesidad de trabajar con sistemas 
bifásicos es principal motivo por el cual la industria no contempla los polímeros líquidos 
como sustitutos de los disolventes tradicionales. Bajo la misma problemática se 
encuentran los disolventes modificados con CO2, que a pesar de reducir la dificultad de 
recuperación del disolvente y el consumo de energía, necesitan utilizar codisolventes para 
aumentar la baja polaridad que poseen, aumentando así la complejidad del sistema y, por 
lo tanto, los costes generales del proceso de extracción (14). 
Por otro lado están los conocidos como líquidos iónicos(ILs, del inglés Ionic 
Liquids) que son sales líquidas a temperaturas inferiores a los 100ºC que están 
compuestas de aniones y cationes discretos cuyas entalpías de vaporización son 
extremadamente altas, convirtiéndolos en disolventes de volatilidad despreciable y por 
ello, no peligrosos en cuanto a emisiones. Son solubles, no inflamables y muy estables 
térmica y químicamente, sin embargo sus principales desventajas se relacionan con la alta 
toxicidad que poseen y con su dificultad de síntesis. Con respecto a su preparación, se 
necesitan muchas etapas que implican preparaciones muy lentas, bajo condiciones inertes 
y con posteriores purificaciones para poder alcanzar la pureza requerida. Además, resulta 
complicado recuperarlos del proceso de forma económica y eficiente, lo cual supone una 
de las principales barreras a la hora de adoptarlos en la industria. Con relación a la 
toxicidad, ciertos líquidos iónicos suponen un peligro para el medioambiente con 
problemas como la ecotoxicidad del agua, así como un peligro para la salud humana, 
pudiendo provocar alteraciones endócrinas, toxicidad crónica, mutagenicidad, 
bioacumulación y persistencia, teratogenicidad y carcinogenicidad. A pesar de ser 
disolventes versátiles y de que se intentan sintetizar alternativas que consigan minimizar 
este tipo de impactos, no es fácil eliminarlos por completo, con lo cual los líquidos 
iónicos son una alternativa poco atractiva para la industria a la hora de sustituir los 
disolventes tradicionales (14). 
Dadas las desventajas que ofrecen los líquidos iónicos surgen los disolventes 
eutécticos (DE) que presentan propiedades favorables similares a los ILs pero con un 
menor coste asociado y una menor toxicidad (14). 
Los DE son mezclas eutécticas de dos o más componentes cuyo punto de fusión es 
más bajo que el de los componentes por separado. Su preparación se lleva a cabo por 
calentamiento y agitación de dos o más componentes (bien sean sólidos o sólidos y 
líquidos) hasta alcanzar una determinada temperatura, conocida como punto eutéctico, en 
el cual se aprecia el cambio de fase de sólido a líquido (14). El punto eutéctico aparece 
representado en la Figura 1.8 y depende de las proporciones de ambos compuestos. 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 9 
 
 
 
 
Figura 1.8: Diagrama de fases de una mezcla eutéctica. Fuente: (15) 
 
Una de las principales ventajas de trabajar con DE es que no se necesita una 
purificación adicional a la hora de formarlos, lo cual reduce considerablemente los costes 
con respecto al uso de otros disolventes y los convierte en la alternativa actual más 
sostenible y prometedora a la hora de extraer compuestos bioactivos en industrias como la 
cosmética, la alimentaria y la farmacéutica (14). 
1.3.2 Características de los disolventes eutécticos (DE) 
Los disolventes eutécticos (DE) poseen una energía de red baja, de ahí que posean 
puntos de fusión bajos. Por lo general se obtienen al combinar una especie aceptora de 
enlaces de hidrógeno (HBA, del inglés Hydrogen Bond Acceptor) con una especia dadora 
de enlaces de hidrógeno (HBD, del inglés Hydrogen Bond Donor) que provoca una 
deslocalización de carga responsable del descenso en el punto de fusión de la mezcla en 
comparación con el punto de fusión de sus componentes por separado (16). 
En la línea de los DE cabe mencionar el término NADES (del inglés Natural Deep 
Eutectic Solvents) referido únicamente a aquellos disolventes eutécticos formados a partir 
de compuestos de origen natural (11). 
Hasta el año 2015 la investigación y las publicaciones existentes estaban basadas 
en el estudio de DE con carácter únicamente hidrófilo, lo que limitaba en gran medida el 
rango de compuestos a extraer y las posibles aplicaciones industriales de estos disolventes 
(17). A partir de dicho año se empezaron a formar DE con carácter hidrófobo, con los 
cuales, una vez en equilibrio con el agua se pueden ver dos fases bien diferenciadas. A su 
vez, los DE con carácter hidrófobo se pueden dividir en dos grupos principales; por un 
lado, aquellos cuyas especies aceptora y dadora de enlaces de hidrógeno son comúnmente 
compuestos a base de terpenos (por ejemplo, el DL-Menthol) y los ácidos naturales, 
respectivamente; por otro lado se sitúan los DE que utilizan sales cuaternarias de amonio 
como especie aceptora y ácidos orgánicos o alcoholes como especie dadora de enlaces de 
enlaces de hidrógeno (18). Los DE incluidos en el primer grupo se utilizan principalmente 
para el tratamiento y purificación de aguas residuales, mientras que los DE del segundo 
grupo se aplican para la extracción de biomoléculas de especies vegetales, captura de CO2 
y desarrollo de nuevos materiales (18) (17). 
 
 
 Introducción 
10 Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
Las propiedades físicas y químicas de los DE dependen en gran medida de las 
características del dador y aceptor de enlaces de hidrógeno utilizados en su preparación, 
lo que convierte a los DE en disolventes muy versátiles cuyas propiedades se pueden 
adaptar en función de las necesidades de las aplicaciones a las que se vayan a destinar. De 
esta forma es posible obtener disolventes con solubilidades muy variables que permiten 
extraer un amplio abanico de compuestos de interés distintos en función del tipo de 
industria y de los objetivos de las extracciones a realizar. Sin embargo, la mayor parte de 
los DE poseen propiedades comunes y muy similares a las de los líquidos iónicos 
mencionados anteriormente, pues no son inflamables, presentan densidades bajas, son 
líquidos en un amplio rango de temperatura, y presentan una volatilidad despreciable, ya 
que su presión de vapor es baja. Además, los disolventes eutécticos tienen viscosidades 
altas y conductividades bajas en comparación con otros disolventes como los líquidos 
iónicos o los disolventes moleculares. Con respecto a su solubilidad, los DE llevan 
asociados valores muy altos dada su alta polaridad y su afinidad por los disolventes 
polares, lo que facilita en gran medida la reactividad entre especies (16). 
La estabilidad química y térmica de los disolventes eutécticos hace que este tipo 
de disolventes sean mucho más fáciles de obtener y manejar que otros disolventes, lo cual 
se traduce en menor tiempo y menores costes de producción que resultan de interés para 
la industria a la hora de utilizarlos en sus procesos. Desde el punto de vista 
medioambiental, poseen una alta biodegradabilidad y los compuestos de partida destacan 
por su baja toxicidad (16). Cabe mencionar que a pesar de que los componentes utilizados 
en la formación de los DE conocidos hasta el momento sí que cuentan con estudios 
toxicológicos bien definidos, para el caso de las mezclas eutécticas, es decir, de los DE, 
todavía se necesita profundizar más en este tipo de estudios, ya que su comportamiento 
podría ser distinto al de los compuestos por separado (19). De hecho, existen estudios que 
demuestran que a pesar de no ser tóxicos, algunos DE presentan una toxicidad 
ligeramente superior a la de sus componentes por separado (14). 
1.4 Justificación de la utilización de disolventes eutécticos (DE) 
Las buenas propiedades de los líquidos iónicos se mantienen con la utilización de 
DE, a lo cual hay que sumarle la ventaja de utilizar materias primas más baratas, la 
eficiencia de la preparación y la baja toxicidad que poseen tanto para la salud humana 
como para el medioambiente. Los DE poseen unas propiedades fisicoquímicas muy 
buenas que permiten un buen manejo de estas sustancias y una preparación sencilla, 
reduciendo significativamente el tiempo implicado en cada una de las etapas de 
obtención, y por lo tanto los costes de producción en comparación con otros disolventes, 
como es el caso de los líquidos iónicos. En términos de rentabilidad económica, lafacilidad de preparación no es la única ventaja que presentan estos disolventes, pues el 
hecho de que no necesiten purificaciones adicionales también se traduce en un menor 
coste de producción. Además, el hecho de que presenten una volatilidad despreciable es 
un punto a favor a la hora de reducir las emisiones contaminantes a la atmósfera y 
mejorar la calidad del aire. 
Otra de las grandes ventajas que presentan los disolventes eutécticos es la amplia 
versatilidad que ofrecen al poder modificar sus propiedades en función de las necesidades 
de extracción o de los intereses asociados a cada una de sus aplicaciones. De esta forma, 
el número de aplicaciones a las que se pueden destinar estos disolventes aumenta 
considerablemente en comparación con otros disolventes cuyas propiedades limitan 
ciertos usos. 
 
 
 
Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 11 
 
 
Teniendo en cuenta lo expuesto en los puntos anteriores, los disolventes eutécticos 
siguen la tendencia mundial de la química verde, tan demandada en la actualidad. Por eso 
son una buena alternativa a los disolventes orgánicos volátiles utilizados tradicionalmente 
en los procesos industriales de extracción, de ahí que cada vez se esté prestando más 
atención y dedicando más recursos a su investigación y desarrollo con el fin de poder 
implementar su uso a gran escala. 
Por último, cabe destacar que el estudio realizado en el presente TFM contribuye 
notablemente con la economía circular y los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS), 
tan nombrados y buscados en la actualidad. La posibilidad de poder aprovechar las 
diferentes propiedades de los residuos de uva para su uso en otras industrias, como puede 
ser el sector alimentario o las industrias farmacéutica y cosmética es un importante punto 
a favor a la hora de extender el ciclo de vida del producto y minimizar la generación de 
residuos hasta hacerlos prácticamente inexistentes, que son dos de los principios básicos 
de la economía circular. Además, analizando los ODS, este estudio está relacionado con 
varios de ellos, de forma directa y/o indirecta: 
• ODS2: Hambre cero, tratando de introducir sistemas más sostenibles para 
la producción de alimentos. 
• ODS8: Trabajo decente y crecimiento económico, tratando de reducir la 
producción y el consumo excesivos. 
• ODS12: Producción y consumo responsables por medio de la conservación 
y recuperación de los recursos naturales, así como la reducción de 
residuos. 
Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2 OBJETIVOS 
 
 
El presente trabajo tiene como objetivo principal la optimización del proceso de 
extracción utilizando disolventes eutécticos y la posterior aplicación de técnicas de 
extracción asistida para intensificar la recuperación de compuestos de interés de la uva. 
Por un lado, se realiza un primer barrido de todos los disolventes eutécticos que se desean 
comparar, el cual permite seleccionar el más adecuado para el sistema en estudio. Una 
vez seleccionado, dicho disolvente se utiliza en extracciones que permiten optimizar las 
condiciones de operación por medio de ultrasonidos y microondas. Por lo tanto, dicho 
trabajo experimental engloba una serie de objetivos que se pueden desglosar de la 
siguiente forma: 
 
 
✓ Estudio preliminar de las propiedades y comportamiento de los DE 
considerados. 
✓ Preparación de los DE. 
✓ Aplicación de los DE en la extracción de compuestos de interés de la uva 
bajo condiciones de operación optimizadas utilizando un agitador orbital. 
✓ Análisis de resultados del proceso de extracción, incluyendo: 
o Efecto de la relación molar HBA:HBD 
o Efecto de los isómeros que actúan como HBD 
o Efecto de la longitud de la cadena de los HBD 
✓ Selección y justificación del DE más adecuado en comparación con 
disolventes tradicionales. 
✓ Comparación del DE seleccionado con un disolvente tradicional en 
técnicas de extracción asistida como son ultrasonidos y microondas. 
✓ Optimización de las condiciones de extracción en ultrasonidos y 
microondas. 
✓ Análisis e interpretación de los resultados obtenidos. 
 Materiales y métodos 
14 Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales (UPM) 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 MATERIALES Y MÉTODOS 
 
 
3.1 Materiales y equipos 
En este apartado se presentan todos los reactivos empleados en la 
experimentación, así como los diferentes equipos y el material de laboratorio necesarios, 
todos ellos facilitados por el departamento de Ingeniería Química Industrial y del medio 
ambiente de la Escuela Técnica Superior de Ingenieros Industriales de la Universidad 
Politécnica de Madrid. 
3.1.1 Material vegetal 
La matriz vegetal utilizada fue uva de mesa de la variedad Doña María, 
previamente desmenuzada, molida y secada a 50 ºC en una estufa durante 24 horas. Cabe 
mencionar que la preparación de dicha matriz vegetal ya se había llevado a cabo en el 
laboratorio para poder realizar experimentaciones previas. 
La uva empleada es un tipo de uva blanca originaria del territorio español cuya 
fecha de maduración se sitúa a finales de agosto y que presenta un color amarillo-verdoso 
como el de la Figura 3.1. 
 
Figura 3.1: Uva de mesa de la variedad Doña María. Fuente: (20) 
 
3.1.2 Compuestos químicos 
Por un lado para la preparación de los DE se utilizaron los siguientes compuestos, 
que actúan como dadores de enlaces de hidrógeno: 1,2-butanediol (C4H10O2), glicerol 
(C3H8O3), 1,2-propanodiol (C3H8O2) y 1,3-butanodiol (C4H10O2). De forma paralela, 
como aceptores de enlaces de hidrógeno se utilizaron los siguientes compuestos: Cloruro 
de colina (C5H14ClNO), prolina (C5H9NO2) y betaína (C5H11NO2). 
Por otro lado, para llevar a cabo los métodos que permiten valorar la calidad de 
los extractos resultantes se necesitan una serie de disoluciones, las cuales fueron 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 15 
 
 
preparadas haciendo uso de los siguientes reactivos: cloruro de aluminio (AlCl3), 
hidróxido de sodio (NaOH) carbonato de sodio (Na2CO3), nitrato de sodio (Na2NO3), 
ácido gálico (C7H6O5), 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo o DPPH (C18H12N5O6), ácido 
protocatéquico (C7H6O4), ácido 4-hidroxibenzoico (C7H6O3), ácido cafeico (C9H8O4), 
ácido cumárico (C9H8O3), ácido ferúlico (C10H10O4), quercetina (C15H10O7), ácido 
cinámico (C9H8O2) y reactivo Folin-Ciocalteu (C10H5NaO5S) 
Además de los reactivos, cabe mencionar la importancia de otros compuestos 
químicos como como son el etanol (EtOH) y el metanol (MeOH) utilizados 
principalmente en la preparación de disoluciones patrón y diluciones, así como el agua 
destilada (H2O) empleada para el mismo fin y para la limpieza del material de laboratorio, 
junto con la acetona (C3H6O). 
En la Tabla 3.1 se identifican los reactivos empleados en base a su número de 
identificación CAS, vendedor y pureza en peso. 
Tabla 3.1: Compuestos químicos. 
 
Compuesto Nº CAS Vendedor Pureza en peso 
1,2-butanediol 584-03-2 Sigma-Aldrich 98% 
Glicerol 56-81-5 Sigma-Aldrich 99% 
1,2-propanodiol 57-55-6 Sigma-Aldrich 99,5% 
1,3-butanodiol 107-88-0 Sigma-Aldrich 99% 
Cloruro de colina 67-48-1 Sigma-Aldrich 99% 
Prolina 147-85-3 Sigma-Aldrich 99% 
Betaína 107-43-7 Sigma-Aldrich 98% 
Cloruro de aluminio 7446-70-0 Sigma-Aldrich 98% 
Hidróxido de sodio 1310-73-2 J.T. Baker 99% 
Carbonato de sodio 497-19-8 Labkem 99,5% 
Nitrato de sodio 7631-99-4 Sigma-Aldrich 99,5% 
Ácido gálico 149-91-7 Sigma-Aldrich 97,5% 
DPPH 1898-66-4 Sigma-Aldrich 98% 
Ácido protocatéquico 99-50-3 Sigma-Aldrich 97% 
Ácido 4-hidroxibenzoico 99-96-7 Sigma-Aldrich 99% 
Ácido cafeico 331-39-5 Sigma-Aldrich 98% 
Ácido cumárico 501-98-4 Sigma-Aldrich 98% 
Ácido ferúlico 537-98-4 Sigma-Aldrich 99% 
Quercetina 117-39-5 Sigma-Aldrich95% 
Ácido cinámico 140-10-3 Sigma-Aldrich 99% 
Etanol 64-17-5 Sigma-Aldrich 99% 
Metanol 67-56-1 Sigma-Aldrich 99% 
 
 
3.1.3 Instrumentación de laboratorio 
Para llevar a cabo el presente trabajo experimental ha sido necesaria la utilización 
de material básico de laboratorio como vasos de precipitado, espátulas de acero 
inoxidable, pipetas Pasteur y pipetas graduadas de 10 mL, pipeteadores, cubeta con 
glicerina, atrapa imanes e imanes de diferentes tamaños para agitación magnética, pinzas 
y soportes, probetas, frascos lavadores con agua destilada, matraces aforados de 250 mL, 
100 mL, 50 m y 25 mL, así como frascos con tapón para poder guardar las muestras. 
Además, para poder evaluar la calidad de las extracciones en base a diferentes métodos se 
utilizaron tubos con tapón, tubos de polipropileno de 15 mL aptos para centrífuga, viales 
de 1,5 mL adecuados para HPLC y micropipetas de volumen variable con sus respectivas 
 
 
 Materiales y métodos 
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puntas de plástico desechables: P100 (10-100 μl), P1000 (100-1000 μl) y P5000 (0,5-5 
mL). 
En la preparación de los DE y de las muestras a extraer ha sido necesario utilizar 
balanzas de precisión como son la balanza Amiga TXB y la balanza Sartorius M-POWER 
AZ124, ambas mostradas en la Figura 3.2. 
 
Figura 3.2: Balanza Amiga TXB y balanza Sartorius M-POWER AZ124. 
 
A la hora de preparar los DE y las disoluciones patrón de partida para hacer las 
rectas de calibrado y evaluar la calidad de las extracciones, además del material básico de 
laboratorio mencionado anteriormente también se utilizaron agitadores de diferentes 
modelos: el agitador de la marca DLAB modelo MS-M-S10, el agitador magnético digital 
con calefacción LBX H03D y el agitador Vórtex LBX V05 con control de velocidad, 
todos ellos mostrados por orden en la Figura 3.3. 
 
Figura 3.3: De izquierda a derecha: Agitador DLAB modelo MS-M-S10, agitador LBX H03D y agitador 
Vórtex LBX V05. 
 
Otro de los equipos fundamentales en la experimentación fue el agitador orbital de 
la Figura 3.4, empleado para llevar a cabo las extracciones y cuya separación de fases se 
ve facilitada tras introducir las muestras varios minutos en el equipo de centrifugación 
Orto Alresa modelo Unicen 21 de la Figura 3.5. 
 
 
Figura 3.4: Agitador orbital y tubo de polipropileno. 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 17 
 
 
 
 
 
Figura 3.5: Equipo de centrifugación Orto Alresa modelo Unicen 21. 
Una vez realizadas las extracciones se llevaron a cabo una serie de métodos 
experimentales para cuantificar una serie de parámetros que permiten evaluar la calidad 
del extracto y por tanto el funcionamiento de los DE utilizados. Para ello, se utilizó un 
espectrofotómetro UV-Visible V-730 de la marca JASCO como el de la Figura 3.6, con 
sus respectivas cubetas de cuarzo para introducir la muestra. Con él se puedo medir la 
absorbancia de cada uno de los extractos de uva a diferentes longitudes de onda, en 
función de la propiedad o parámetro a evaluar. 
 
Figura 3.6: Espectrofotómetro UV-Visible V-730 y cubeta de cuarzo. 
 
Además, el sistema de cromatografía HPLC cuaternario con inyector, detector, 
horno para columna y software de la marca JASCO mostrado en la Figura 3.7 hizo 
posible determinar, en base a un método de análisis de referencia, la cantidad total de 
compuestos fenólicos presentes en el extracto de uva. 
 
Figura 3.7: Sistema de cromatografía HPLC marca JASCO y viales de 1,5 mL. 
 
A la hora de optimizar las condiciones de extracción se emplearon dos técnicas de 
extracción distintas como son la extracción asistida por ultrasonidos y la extracción 
asistida por microondas. Para ello se necesitaron el homogeneizador ultrasónico manual 
modelo UP200Ht (200W, 26kHz) de la Figura 3.8 y reactor de microondas Anton Paar 
 
 
 Materiales y métodos 
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modelo Monowave 400 de la Figura 3.9. Además, para medir la temperatura del extracto 
resultante del ultrasonidos fue necesario utilizar un termómetro termopar con sonda 
inoxidable de 130 mm como el de la Figura 3.10. 
 
Figura 3.8: Homogeneizador ultrasónico manual. 
 
Figura 3.9: Reactor de microondas Anton Paar modelo Monowave 400. 
 
Figura 3.10: Termómetro termopar con sonda inoxidable de 130 mm. 
 
Finalmente, cabe mencionar que todos los residuos resultantes de los trabajos 
experimentales en el laboratorio fueron depositados en bidones etiquetados y 
diferenciados para su correcta clasificación y posterior tratamiento. 
 
 
 
 
 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
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3.2 Preparación de los DE 
3.2.1 DE a preparar 
Los disolventes eutécticos objeto de estudio en el presente trabajo fueron 
preparados cambiando el compuesto que actúa como dador de enlaces de hidrógeno y el 
compuesto que actúa como aceptor de dichos enlaces. De esta forma, se tuvieron en 
cuenta cuatro dadores diferentes (1,2-butanediol, glicerol, 1,2-propandiol y 1,3- 
butanodiol) probando a su vez cada uno de ellos con tres aceptores distintos (cloruro de 
colina, prolina y betaína). Dado que una misma combinación dador-aceptor se probó en 
dos relaciones molares distintas, se estudiaron un total de quince DE, recogidos en la 
Tabla 3.2 junto a la relación molar utilizada, el dador y el aceptor. 
Tabla 3.2: DE prepararados en este TFM. 
 
DE 
Compuesto aceptor Compuesto dador Relación 
molar 
ClCh:1,2-butanediol [1:3] Cloruro de colina 
Prolina 
Betaína 
1,2-butanediol [1:3] 
Prolina:1,2-butanediol [1:3] 
Betaína:1,2-butanediol [1:3] 
ClCh:1,2-butanediol [1:4] Cloruro de colina 
Prolina 
Betaína 
 [1:4] 
Prolina:1,2-butanediol [1:4] 
Betaína:1,2-butanediol [1:4] 
ClCh:glicerol [1:4] Cloruro de colina 
Prolina 
Betaína 
Glicerol [1:4] 
Prolina:glicerol [1:4] 
Betaína:glicerol [1:4] 
ClCh:1,2-propanodiol [1:4] Cloruro de colina 
Prolina 
Betaína 
1,2-propanodiol [1:4] 
Prolina:1,2-propanodiol [1:4] 
Betaína:1,2-propanodiol [1:4] 
ClCh:1,3-butanodiol [1:4] Cloruro de colina 
Prolina 
Betaína 
1,3-butanodiol [1:4] 
Prolina:1,3-butanodiol [1:4] 
Betaína:1,3-butanodiol [1:4] 
 
En la parte izquierda de la Figura 3.11 se muestran las estructuras químicas de 
cada uno de los dadores y en la parte derecha de la misma las de cada uno de los 
aceptores que constituyen los distintos DE a preparar, las cuales ofrecen una idea más 
clara de cómo son los enlaces e interacciones que se dan entre ellas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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Figura 3.11: Estructuras químicas de los reactivos. Fuente: (21-26) 
 
3.2.2 Propiedades físicas 
En la Tabla 3.3 se recogen las propiedades físicas más relevantes de cada uno de los 
reactivos utilizados en la preparación de los DE mencionados anteriormente, todas ellas 
recogidas en sus respectivas fichas de seguridad de acuerdo con el Reglamento REACH. 
Tabla 3.3. Propiedades físicas de los reactivos. 
 
 Peso 
molecular 
(g/mol) 
 ρ a 20ºC Solubilidad en 
(kg/m3) agua a 25ºC 
(g/L) 
Tf (ºC) Teb (ºC) 
Compuesto 
1,2-butanediol 90,12 1.006 1000 - 192 
Glicerol 92,10 1.257 miscible 20 182 
1,2-propanodiol 76,09 1.036 miscible -60 185-189 
1,3-butanodiol 90,12 1.006 500 57 207 
Cloruro de colina 139,62 - 140 302-305 300 
Prolina 115,13 - 100 228 - 
Betaína 117,15 - 160 301-305 - 
3.2.3 Estudio previo 
En primer lugar, para tener una idea de las condiciones que favorecen la 
formación de los disolventes eutécticos, se llevó a cabo una revisión bibliográfica sobre la 
formación de DE utilizando reactivos similares. En ella se pudo ver que la mayor parte de 
DE con características similaressuelen formarse a partir de relaciones molares 
aceptor:dador 1:3 o 1:4 (27). Además, diversos ensayos demuestran que para la correcta 
formación de los disolventes es preferible utilizar temperaturas que no sean 
excesivamente altas y agitar de forma lenta y continuada durante un tiempo largo de entre 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 21 
 
 
4 horas y 6 horas (28). Cabe mencionar, que la temperatura de formación se fue 
controlando con el tiempo en función del estado y el aspecto del DE, teniendo en cuenta 
en todo momento las temperaturas de fusión y ebullición de los reactivos a emplear en 
cada caso. 
De forma paralela, se realizaron los cálculos previos que se requieren para poder 
determinar las cantidades exactas de cada uno de los componentes a emplear en la 
preparación de cada uno de los DE, de acuerdo con las relaciones molares establecidas. 
Para ello, y teniendo en cuenta de forma estimada la cantidad de disolvente necesaria en 
cada extracción, se partió de una cantidad másica inicial de aceptor que fuese suficiente 
para llevar a cabo las extracciones necesarias. 
En la Tabla A1 del anexo se recogen las cantidades de dador y aceptor que se pesaron 
para la formación de cada uno de los disolventes eutécticos deseados. 
4.1.1 Método de preparación 
Una vez conocida la cantidad de compuesto requerida para la formación de cada 
uno de los disolventes, se procedió a su preparación, la cual sigue el mismo método para 
todos los casos. En primer lugar se tara un vaso de precipitados en una de las dos balanzas 
disponibles en el laboratorio (balanza Amiga TXB o balanza Sartorius M-POWER 
AZ124) y con una espátula se añade la cantidad másica necesaria del compuesto aceptor 
correspondiente. En segundo lugar se tara de nuevo la balanza y se mide el volumen de 
dador con una probeta o con una pipeta graduada de 10 mL, comprobando que la masa de 
dicho compuesto se corresponde con el valor calculado y ajustándola con la cantidad 
pertinente de compuesto aceptor en caso de que fuese necesario. 
A continuación, se introduce un imán de tamaño mediano en el interior del vaso 
de precipitados y se coloca el vaso en un baño de glicerina colocado sobre un agitador 
magnético con calefacción LBX H03D, tratando de sujetar bien el vaso de precipitados 
por medio de un soporte con pinzas como el de la Figura 3.12. Con el montaje bien sujeto 
se ajustan las revoluciones y la temperatura del agitador magnético y se deja entre 4 y 6 
horas dependiendo de la velocidad de formación del DE y ajustando la temperatura y las 
revoluciones de agitación, en caso de que fuese necesario. 
 
Figura 3.12: Montaje para la preparación de los DE. 
 
 
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Una vez formado, el DE debe presentar un aspecto totalmente transparente y sin 
ninguna partícula en suspensión, con lo cual se quita el vaso de precipitados del soporte 
de la Figura 3.12 y se deja enfriar unos minutos para retirar el imán de su interior con la 
ayuda de un atrapa imanes. Por último, se traspasa el contenido del vaso de precipitados a 
un frasco debidamente rotulado, cerrándolo y dejándolo reposar a temperatura ambiente 
hasta el día siguiente, momento en el cual se puede apreciar o no la aparición de cristales 
y evaluar si es válido o no para su uso en extracción. 
3.3 Método de extracción 
3.3.1 Preparación de las muestras 
Para llevar a cabo las extracciones con los diferentes DE formados se siguió el 
mismo procedimiento en todos los casos, empezando por preparar la muestra de uva con 
el disolvente que se desea probar en una relación gramos de uva: mL de disolvente de uva 
de 1:10, ya que al aumentar la cantidad de soluto se promueven las interacciones entre la 
matriz vegetal y el disolvente, aumentando la velocidad de extracción de compuestos 
hasta alcanzar el equilibrio entre ambas fases y aumentando también el contenido total de 
compuestos fenólicos presentes en el extracto resultante (28). Para ello se taró un tubo de 
polipropileno de 15 mL como el de la Figura 3.4 en una balanza Sartorius M-POWER 
AZ124 como la de la Figura 3.2 y se pesaron 0,5 g de uva molida con la ayuda de una 
espátula. Una vez pesada la cantidad de uva, y con la ayuda de una micropipeta de 
volumen variable y su respectiva punta de plástico se añadieron 5 mL de disolvente 
(previamente diluido con un 30 % de agua) al tubo de polipropileno, el cual se cierra con 
un tapón de plástico a medida. 
3.3.2 Condiciones de extracción 
Las extracciones se llevaron a cabo en el agitador orbital de la Figura 3.4 bajo las 
condiciones de la Tabla 3.4. Se decidió aplicar una temperatura y un tiempo de extracción 
que permitiesen aumentar la solubilidad y los coeficientes de difusión de los compuestos 
polifenólicos presentes en la uva, tratando de reducir la tensión superficial y la viscosidad 
del disolvente lo máximo posible para favorecer la transferencia de materia del sistema. 
De acuerdo con la bibliografía, trabajar con temperaturas de extracción mayores pueden 
causar la degradación de los compuestos fenólicos a extraer por la aparición de reacciones 
redox, polimerizaciones o hidrólisis, por lo tanto se fijó el límite en 60ºC para llevar a 
cabo todas las extracciones (28). 
Tabla 3.4: Condiciones de extracción. 
 
Parámetro Valor 
m uva (g) 0,5 
V disolvente (mL) 5 
T (ºC) 60 
t (min) 99,5 
Agitación (rpm) 900 
 
3.3.3 Condiciones de centrifugación 
Una vez transcurrido el tiempo de extracción, se retiraron los tubos de 
polipropileno del agitador orbital para introducirlos en el equipo de centrifugación Orto 
Alresa modelo Unicen 21 de la Figura 3.5 bajo las condiciones de la Tabla 3.5, todas ellas 
 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 23 
 
 
optimizadas previamente según la bibliografía consultada para asegurar la completa 
separación de ambas fases (28). 
Tabla 3.5: Condiciones de centrifugación. 
 
Parámetro Valor 
t (min) 10 
Agitación (rpm) 4.200 
 
3.4 Rectas de calibrado 
3.4.1 Fundamentos 
En este apartado se presenta el procedimiento llevado a cabo para poder trazar las 
rectas de calibrado que permiten cuantificar los parámetros y propiedades que determinan 
la calidad de las extracciones. Todas ellas llevan asociadas la preparación previa de una 
disolución madre de partida a partir de la cual se prepararon diferentes diluciones para 
establecer los puntos de las distintas rectas en función del parámetro a medir en cada uno 
de los casos. 
En primer lugar se preparó la disolución madre con el compuesto o compuestos a 
cuantificar, cuya concentración (C1) debe ser recalculada en función de la masa de soluto 
pesada para poder asegurar la mayor exactitud posible en las medidas. A partir de dicha 
disolución madre y en tubos debidamente rotulados se prepararon distintas diluciones de 
concentraciones conocidas, cuyos volúmenes a medir de disolución madre (V2) vienen 
dados por la ecuación [3.1]: 
 
C1 · V1 = C2 · V2 [3.1] 
Siendo, 
C1 la concentración inicial de disolución madre en mg/L. 
V1 el volumen a medir de disolución madre en µL. 
C2 la concentración de dilución en mg/L. 
V2 el volumen total de dilución en µL, cuyo valor es igual a 1000 µL para todos 
los casos. 
Dado que las diluciones se realizaron con agua y tanto el volumen total de 
dilución (V2) como el volumen necesario de disolución madre (V1) se conocen, se 
determinó el volumen necesario de agua destilada por diferencia, de acuerdo con la 
siguiente ecuación: 
 
VH2O = V2 − V1 [3.2] 
Siendo, 
VH2O el volumen a medir de agua destilada en µL. 
Finalmente, para trazar las rectas de calibrado fue necesario relacionar un 
parámetro fácilmente medible con la concentración del compuesto objetivo en cada uno 
de los casos. Para ello, partiendode las distintas diluciones de concentración conocida se 
midió la absorbancia de cada una de ellas por medio del espectrofotómetro UV-Visible V- 
730 de la Figura 3.6 a la longitud de onda requerida en cada caso. De esta forma, fue 
 
 
 Materiales y métodos 
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posible relacionar de forma sencilla la concentración del compuesto a cuantificar con el 
valor de absorbancia medida por medio de una regresión lineal que se ajusta a la ecuación 
[3.3]: 
 
y = ax + b [3.3] 
Siendo, 
y la absorbancia medida 
a la pendiente de la recta 
x la concentración del compuesto en mg/L 
b la ordenada en el origen 
Por lo tanto en términos de concentración y absorbancia, la recta de calibrado 
tiene la siguiente forma: 
 
Abs = aCw + b [3.4] 
En el caso del HPLC, el fundamento es el mismo, la única diferencia es que en 
lugar de la absorbancia lo que se mide es el área de pico observada para cada compuesto 
de acuerdo con la siguiente ecuación: 
 
Área pico = aCw + b [3.5] 
 
3.4.2 Método Folin-Ciocalteau (FC) 
Con el fin de trazar la recta de calibrado que permite calcular el contenido de 
compuestos fenólicos totales de cada extracto en base al método Folin-Ciocalteau, el 
primer paso, de acuerdo con el procedimiento descrito en el punto 3.4.1.Fundamentos, 
fue preparar una disolución madre de ácido gálico de 100 mg/L, pesando 0,010 g de ácido 
gálico y enrasando con agua destilada en un matraz aforado de 100 mL. Para poder 
garantizar la mayor exactitud posible, se recalculó la concentración inicial de la 
disolución madre por pesada teniendo en cuenta la cantidad exacta de ácido gálico 
considerada y de acuerdo con la Tabla 3.6. 
Tabla 3.6: Concentración inicial de disolución madre de ácido gálico. 
 
Parámetro Valor 
m ácido gálico (g) 0,0142 
V H2O (mL) 100 
C1 (mg/L) 142 
 
Una vez preparada la disolución madre de ácido gálico se realizaron diluciones a 
concentraciones conocidas, cuyos volúmenes de disolución madre y agua a medir para su 
preparación se muestran en la Tabla A2 del anexo, junto a la concentración real 
recalculada teniendo en cuenta la concentración real de la disolución de partida. 
Aplicando la metodología descrita en el apartado 3.5.1.Cuantificación del 
contenido total de polifenoles (TPC) por el método Folin-Ciocalteu (FC) y midiendo la 
absorbancia de cada una de las diluciones de concentración conocida se obtuvo la recta de 
calibrado del método. 
 
 
 
 
 Aplicación de extracción asistida por US y MW a la recuperación de biomoléculas 
Paloma Méndez Silva 25 
 
 
3.4.3 Flavonoides totales 
Con el fin de trazar la recta de calibrado que permite calcular en contenido de 
flavonoides de cada extracto, el primer paso, de acuerdo con el procedimiento descrito en 
el punto 3.4.1.Fundamentos, fue preparar una disolución madre de quercetina de 100 
mg/L, pesando 0,010 g de quercetina y enrasando con agua destilada en un matraz 
aforado de 100 mL. Para poder garantizar la mayor exactitud posible, se recalculó la 
concentración inicial de la disolución madre por pesada teniendo en cuenta la cantidad 
exacta de quercetina considerada y de acuerdo con la Tabla 3.7. 
Tabla 3.7: Concentración inicial de disolución madre de quercetina. 
 
Parámetro Valor 
m quercetina (g) 0,0106 
V H2O (mL) 100 
 C1 (mg/L) 106 
 
 
Una vez preparada la disolución madre de quercetina se realizaron diluciones a 
concentraciones conocidas, cuyos volúmenes de disolución madre y agua a medir para su 
preparación se muestran en la Tabla A3 del anexo, junto a la concentración real 
recalculada teniendo en cuenta la concentración real de la disolución de partida. 
Aplicando la metodología descrita en el apartado 3.5.2.Cuantificación del 
contenido total de flavonoides y midiendo la absorbancia de cada una de las diluciones 
de concentración conocida se obtuvo la recta de calibrado del método. 
3.4.4 HPLC 
Para poder cuantificar la cantidad de cada uno de los compuestos fenólicos de 
interés que hay en los extractos por el método HPLC fue necesario trazar una recta de 
calibrado reflejando el área de pico observada en función de la concentración de cada 
compuesto, la cual se ajusta linealmente a una recta como la de la ecuación [3.5]. Para la 
mayor parte de compuestos ya existen longitudes de onda de referencia procedentes de 
otros métodos utilizados anteriormente en el laboratorio, excepto dos: el ácido cumárico y 
el ácido ferúlico, de ahí que hubiese que preparar una disolución que los contuviera. A 
continuación, se introdujo dicha disolución en el HPLC para comprobar que los picos 
observados para ambos compuestos no se solapaban y que se podían medir con claridad. 
Por lo tanto, para determinar las rectas de calibrado del HPLC se prepararon las 
siguientes disoluciones de partida, todas ellas de concentración conocida: 
• Una disolución de metanol (CH3OH) y agua destilada al 50 % en volumen, 
midiendo 60 mL de cada uno de ellos. 
• Una disolución de ácido cumárico y ácido ferúlico de 100 mg/L, pesando 
0,01 g de ácido cumárico (C9H8O3) y 0,01 g de ácido ferúlico (C10H10O4) 
y enrasando con agua destilada en un matraz aforado de 100 mL. 
• Una disolución madre con todos los compuestos a medir, pesando 0,01 g 
de cada uno de ellos y enrasando con la disolución de agua destilada y 
metanol (CH3OH) preparada anteriormente en un matraz aforado de 100 
mL. 
Para poder garantizar la mayor exactitud posible, se recalculó la concentración 
inicial de ambas disoluciones, tanto de la de ácido cumárico y ferúlico como de la 
disolución madre, teniendo en cuenta la cantidad exacta de cada compuesto. En la Tabla 
 
 
 Materiales y métodos 
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A4 del anexo se recoge la concentración inicial de la disolución de ácido cumárico y 
ácido ferúlico y en la Tabla A5 del mismo se muestra la concentración inicial de la 
disolución madre con todos los compuestos a medir. 
Una vez preparada la disolución madre con todos los compuestos se realizaron 
diluciones a concentraciones conocidas, cuyos volúmenes de disolución madre y agua a 
medir para su preparación se muestran en la Tabla A6 del anexo, junto a la concentración 
real recalculada teniendo en cuenta la concentración real de la disolución de partida. 
Pinchando las muestras en el HPLC y dejándolo analizar hasta el día siguiente, se 
integraron en pantalla las áreas de los picos correspondientes a cada una de las diluciones 
de concentración conocida. De esta forma se obtuvo la recta de calibrado del método para 
cada compuesto, a partir de la cual es posible calcular la concentración en mg/L, en 
función del valor de área de pico medida para cada muestra. 
3.5 Métodos para cuantificar la calidad de la extracción 
3.5.1 Cuantificación del contenido total de polifenoles (TPC) por el 
método Folin-Ciocalteu (FC) 
Con el fin de cuantificar el contenido total de polifenoles (TPC) presentes en cada 
extracto se siguió el método Folin-Ciocalteu (FC), para el cual se necesitan dos únicos 
reactivos: por un lado el reactivo Folin-Ciocalteu (C10H5NaO5S) que ya viene envasado 
para su uso directo, y por otro lado una disolución al 2 % en peso de Na2CO3 que se 
preparó pesando 2 g de Na2CO3 y enrasando con agua destilada en un matraz aforado de 
100 mL. 
El método Folin-Ciocalteu se basa principalmente en la reacción redox a pH 
básico de los compuestos fenólicos totales presentes en un extracto con el reactivo Folin- 
Ciocalteu, el cual tras ser reducido por los grupos fenólicos pasa de una coloración 
amarilla a un color azul cuya intensidad depende de la cantidad total de polifenoles. 
Para la puesta en marcha de dicho método se rotulan de forma clara y ordenada los 
tubos en los que se realizan las medidas, cuyo número es igual al doble del número de 
extractos a medir, teniendo en cuenta las medidas de los blancos de los disolventes