TFM-M572

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ESTUDIO HISTOLÓGICO E 
INMUNOHISTOQUÍMICO DEL 
EFECTO DE LA INYECCIÓN 
SUBCONJUNTIVAL DE CÉLULAS 
MADRE MESENQUIMALES EN 
UN MODELO DE 
DEFICIENCIA DE CÉLULAS 
MADRE LIMBO-CORNEALES 
 
Autora: Beatriz Marceñido Gil. 
Directoras: Teresa Nieto Miguel y Mª Carmen Martínez García. 
 
 
 
 
 
Departamento de Biología Celular, Histología y Farmacología de la Universidad de 
Valladolid. 
Curso 2020/2021 
 
1 
 
ÍNDICE 
RESUMEN ................................................................................................................................................ 2 
1.-INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 3 
1.1.-SUPERFICIE OCULAR ................................................................................................... 3 
1.1.1.-CÓRNEA ............................................................................................................................................. 3 
EPITELIO CORNEAL ............................................................................................................................... 4 
MEMBRANA DE BOWMAN .................................................................................................................... 4 
ESTROMA CORNEAL ............................................................................................................................. 4 
MEMBRANA DE DESCEMET ................................................................................................................. 4 
ENDOTELIO CORNEAL .......................................................................................................................... 5 
1.1.2.-LIMBO .................................................................................................................................................. 5 
EPITELIO LIMBAR.................................................................................................................................... 5 
ESTROMA LIMBAR .................................................................................................................................. 6 
1.1.3.-CONJUNTIVA ..................................................................................................................................... 6 
EPITELIO CONJUNTIVAL ....................................................................................................................... 7 
ESTROMA CONJUNTIVAL ..................................................................................................................... 7 
1.2.-DEFICIENCIA DE CÉLULAS MADRE LIMBO-CORNEALES ...................................... 7 
1.2.1.-CAUSAS, SIGNOS, SINTOMAS Y ACTUAL TRATAMIENTO .................................................. 7 
1.2.2.-TRATAMIENTO CON CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES ................................................ 8 
VÍAS DE ADMINISTRACIÓN .................................................................................................................. 9 
2.-HIPÓTESIS ........................................................................................................................................ 10 
3.-OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 10 
4.-MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................. 10 
4.1.-ESTUDIO HISTOLÓGICO ............................................................................................. 10 
4.2.-INMUNOFLUORESCENCIA ......................................................................................... 11 
4.3. ANÁLISIS DE LAS IMÁGENES DE INMUNOFLOURESCENCIA .............................. 12 
4.4.-ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................................. 14 
5.-RESULTADOS ................................................................................................................................... 14 
5.1.- ANÁLISIS HISTOLÓGICO DE LOS DISTINTOS TEJIDOS ....................................... 14 
5.2.- LOCALIZACIÓN DE LAS hAT-MSCs ......................................................................... 16 
5.3.- DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE LOS MARCADORES DE 
EPITELIO CORNEAL Y LIMBAR EN LOS DISTINTOS TEJIDOS ..................................... 17 
6.-DISCUSIÓN ....................................................................................................................................... 23 
7.-CONCLUSIONES .............................................................................................................................. 26 
8.-LIMITACIONES .................................................................................................................................. 27 
9.-BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................. 27 
ANEXOS................................................................................................................................................. 31 
 
2 
 
RESUMEN 
Antecedentes: La deficiencia de células madre limbo-corneales (LSCD) es una enfermedad 
de la superficie ocular que provoca su inflamación crónica, fallo en la integridad de epitelio 
corneal, invasión de la conjuntiva en la córnea y pérdida de la visión. El objetivo principal de 
este trabajo fue estudiar el efecto de la inyección subconjuntival de células madre 
mesenquimales de tejido adiposo humano (hAT‐MSCs) en la estructura histológica y en el 
fenotipo epitelial corneal y limbar de un modelo de LSCD desarrollado en conejo. 
Materiales y métodos: Se realizó un estudio histológico mediante tinción de PAS (Periodic 
Acid-Schiff) en muestras oculares procedentes de 8 conejos New Zealand White con LSCD a 
los que se les habían inyectado subconjuntivalmente 2x106 hAT‐MSCs marcadas con 5-
bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) (n=4), o solución vehículo sin células (n=4). Mediante 
inmunofluorescencia indirecta se estudió la localización de las hAT-MSCs (BrdU+) en los 
tejidos y la expresión de distintos marcadores de epitelio corneal (citoqueratina-3 (CK3) y E-
cadherina) y limbar (citoqueratina 15 (CK15) y p63). 
Resultados: El estudio histológico reveló que los conejos con LSCD tratados con hAT-MSCs 
presentaban en el epitelio limbar y corneal menor cantidad de células caliciformes (propias de 
la conjuntiva) que los conejos no tratados. Las hAT-MSCs BrdU+ migraron hacia los tejidos 
dañados y se localizaron mayoritariamente en las zonas del estroma limbar con elevada 
presencia de infiltrados inflamatorios. Los niveles de expresión de los marcadores de epitelio 
corneal (CK3 y E-cadherina) y limbar (p63) fueron mayores en los conejos tratados con hAT-
MSC que en los conejos tratados con solución vehículo sin células. No se encontraron 
diferencias significativas en la expresión de CK15 en los tejidos de la superficie ocular de los 
dos grupos experimentales estudiados. 
Conclusión: Las hAT-MSCs inyectadas subconjuntivalmente en un modelo de LSCD 
desarrollado en conejo migran hacia los tejidos dañados de la superficie ocular con mayor 
presencia de células inflamatorias, ejercen un efecto protector frente a la conjuntivalización de 
la córnea y contribuyen al mantenimiento del fenotipo de las células del epitelio corneal y 
limbar. 
 
 
Palabras clave: deficiencia de células madre limbo-corneales; células madre mesenquimales; 
inyección subconjuntival; superficie ocular; córnea; limbo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
3 
 
1.-INTRODUCCIÓN 
1.1.-SUPERFICIE OCULAR 
La superficie ocular se define como una unidad anatómica, histológica y fisiológica que 
comprende todas las estructuras y anejos oculares que se encuentran en contacto con el 
exterior y que separael medio intraocular del entorno. Está constituida por la película lagrimal, 
los epitelios que tapizan las superficies palpebrales, la córnea, el limbo esclerocorneal y la 
conjuntiva, así como los tejidos conjuntivos subyacentes (Figura 1). Todos estos componentes 
forman un sistema de estructuras integradas con interdependencia entre ellas cuya función 
principal es permitir la visión y proporcionar protección anatómica, fisiológica e inmunológica 
(1,2). 
 
FIGURA 1: Localización anatómica de la córnea, el limbo esclero-corneal y la conjuntiva en la 
superficie ocular. 
1.1.1.-CÓRNEA 
La córnea es un tejido avascular, altamente inervado y transparente que permite la refracción 
y la transmisión de la luz a su través. Consiste en una lente convexo-cóncava con su cara 
anterior en contacto íntimo con la película lagrimal y su cara posterior bañada por el humor 
acuoso. Su espesor es de alrededor de 500 m en la zona central y 670-700 m en la zona de 
la periferia. Al ser un tejido avascular, la córnea obtiene el oxígeno y los nutrientes de la 
película lagrimal, el humor acuoso y la vasculatura peri-limbar (3). 
Histológicamente, la córnea se compone de 5 capas. De la más externa a la más interna: el 
epitelio, la membrana de Bowman, el estroma, la membrana de Descemet y el endotelio 
(Figura 2). La transparencia corneal es esencial para su función y es resultado de su 
uniformidad estructural y de la disposición espacial de las láminas de colágeno en el estroma. 
 
FIGURA 2. Esquema de un corte histológico transversal en el que se representan las capas 
histológicas que componen la córnea. Imagen tomada de la revisión de Fernández, A., et al. (4). 
 
4 
 
EPITELIO CORNEAL 
El epitelio corneal humano es un epitelio escamoso estratificado no queratinizado de 
aproximadamente 50 m de espesor, que está formado por 4-6 capas de células en la zona 
central y por 8-10 capas en la zona periférica (5). Dentro del epitelio, se distinguen tres tipos 
de células. Las células de la capa basal son cilíndricas y se encuentran unidas entre sí 
mediante desmosomas, uniones estrechas y uniones comunicantes, y unidas a la membrana 
basal mediante hemidesmosomas, la cual es rica en fibras de colágeno tipo IV, laminina, 
heparina y, en menor medida, en fibronectina y fibrina. Las células basales son las células del 
epitelio metabólicamente más activas y son las que tienen capacidad de división mitótica (6,7). 
A medida que las células migran hacia la superficie, los orgánulos citoplasmáticos 
desaparecen de manera gradual, lo que indica la disminución progresiva de la actividad 
metabólica. Las dos o tres capas de células intermedias del epitelio tienen finas extensiones y 
se unen entre sí mediante desmosomas y uniones estrechas. Estas células, son las 
encargadas de reponer las capas de células más superficiales cuando éstas se descaman. 
Las dos o tres capas de células más superficiales no tienen capacidad de división, son planas, 
con morfología poligonal, y se encuentran unidas entre sí por uniones estrechas (7). 
Cada una de las capas de la córnea tiene una expresión génica específica. Estudios realizados 
sobre dicha expresión en el epitelio corneal dan un perfil en el que, entre otros, se encuentran 
expresados los genes de la citoqueratina 3 (CK3) (8), la E-cadherina (9), la citoqueratina 12 y 
la aldehído deshidrogenasa 3 (ALDH3). Este perfil génico da lugar a que las proteínas 
codificadas por estos genes se consideren marcadores de diferenciación corneal (8,10). 
MEMBRANA DE BOWMAN 
En humanos adultos, la membrana de Bowman es una capa acelular de un grosor de 8-12 µm, 
que se encuentra debajo de la membrana basal del epitelio corneal y que termina 
abruptamente en el limbo esclerocorneal (11). Está compuesta por fibras de colágeno de tipo 
I, principalmente, y de tipo III y V, entre otras, las cuales se unen formando fibrillas y éstas se 
disponen al azar formando un entramado rodeadas por proteoglicanos (5,11). La membrana 
de Bowman se encuentra en humanos y en casi todos los primates no humanos, excepto el 
lémur. También se ha observado en pollos, codornices, peces cebra, ciervos, jirafas, antílopes, 
leones marinos de California, conejillos de indias y varias otras especies, pero no se encuentra 
en perros, lobos, gatos, tigres, leones, conejos, cerdos, vacas, cabras o caballos (12). Sus 
principales funciones son actuar como una barrera frente a microorganismos y mantener la 
forma del epitelio corneal. 
ESTROMA CORNEAL 
El estroma corneal constituye el 80-90 % del espesor de la córnea, siendo su espesor de 
aproximadamente de 500 m. Está compuesto principalmente por fibras de colágeno de tipo I 
y V, cuya disposición y orientación en forma de láminas paralelas distribuidas de manera 
ortogonal es responsable de la transparencia de la córnea (3,5). Las fibras de colágeno se 
organizan en laminillas y éstas se extienden de limbo a limbo (3). Junto con las fibras de 
colágeno se pueden encontrar glucosaminoglicanos, sobre todo el queratán sulfato y 
proteoglicanos como el lumicano (5). El principal componente celular del estroma corneal son 
los queratocitos, los cuales son células de origen mesodérmico (fibroblastos modificados) 
encargadas de sintetizar y recambiar la matriz extracelular, además de participar en los 
procesos de cicatrización de heridas. Aparte de este tipo celular, en el estroma corneal se 
pueden encontrar, entre otros, linfocitos, células plasmáticas y neutrófilos (3). 
MEMBRANA DE DESCEMET 
La membrana de Descemet es la membrana basal de las células endoteliales corneales. Es 
una capa acelular y avascular de 8-12 m de grosor (5). Está compuesta por colágeno de tipo 
IV, principalmente, y de tipo VIII, fibronectina, laminina, nidógeno, vitronectina, perlecan, así 
como queratán sulfato, heparina, dermatán sulfato y proteoglicanos de sulfato de condroitina 
 
5 
 
(13,14). Es una membrana que aumenta de grosor a lo largo de la vida y ese grosor, junto con 
su elasticidad, la hacen resistente a traumatismos (3). 
ENDOTELIO CORNEAL 
El endotelio corneal es una estructura de 5 µm formada por una sola capa de células 
hexagonales y metabólicamente activas, pero sin capacidad de renovación (5). Esta capa 
celular forma un límite entre el estroma y la cámara anterior. Lo más destacable de estas 
células son las interdigitaciones laterales, que se encuentran uniendo a las células entre sí, y 
las interdigitaciones basales, las cuales ayudan y facilitan la adhesión de las células del 
endotelio a la membrana de Descemet. En las membranas de estas células se pueden 
encontrar proteínas como la ocludina y ZO-1, proteínas asociadas a las uniones estrechas y 
proteínas que participan en su adhesión al sustrato como la vinculina, la talina y distintos tipos 
de integrinas (13). Las principales funciones de esta capa de células son mantener la 
transparencia de la córnea, regulando su hidratación, y ser una barrera “permeable”, 
permitiendo el paso de nutrientes del humor acuoso a la córnea avascular (13). 
1.1.2.-LIMBO 
El limbo o unión corneoescleral es la zona de transición entre la córnea (transparente) y la 
esclero-conjuntiva (opaca) (3). Mide entre 1,5 y 2,0 mm de ancho y forma un anillo que rodea 
por completo la córnea (Figura 1). El limbo actúa como una barrera física que impide que la 
conjuntiva (translúcida y vascularizada) invada la córnea y produzca una disminución de la 
visión (3,15). En el limbo existen unas estructuras fibrovasculares en forma de crestas y valles 
denominados empalizadas de Vogt que se disponen de manera radial a la córnea y se 
caracterizan por la presencia de diferentes poblaciones celulares en distintos niveles de 
diferenciación. En la capa de células más basal se encuentran las células madre epiteliales 
limbares responsables del mantenimiento y la renovación del epitelio corneal (3,6,10) (Figura 
3). 
 
FIGURA 3: Estructura histológica del limbo. A) Imagen esquemática de las principales capas 
histológicasdel limbo y los principales linajes celulares que se encuentran en este tejido. B) Imagen a 
20X de un corte histológico trasversal del limbo humano teñido con hematoxilina -eosina. Imagen 
histológica cedida por el laboratorio de Patología Ocular del IOBA. Figura tomada de la tesis doctoral 
de Galindo S. (16). 
EPITELIO LIMBAR 
El epitelio limbar humano tiene un grosor de 10-12 capas celulares y, a diferencia de la 
conjuntiva, no contiene células calciformes (6), pero posee células de Langerhans y 
melanocitos (4,10). Las empalizadas de Vogt son el nicho de las células madre epiteliales 
limbares responsables de la constante renovación del epitelio corneal. Las células madre 
limbares son células indiferenciadas, de 5-10 m de diámetro, con un ciclo celular corto, que 
 
6 
 
residen en los valles de las empalizadas ancladas a la membrana basal mediante 
hemidesmosomas (4,10). 
En 1983, antes de que se conociera la existencia de las células madre en el limbo, Richard 
Thoft y colaboradores propusieron una hipótesis, que posteriormente fue confirmada, para 
explicar la renovación del epitelio corneal en función de 3 ejes: un eje X, consistente en la 
proliferación de las células basales, un eje Y, consistente en la proliferación y migración 
centrípeta de las células epiteliales desde el limbo hacia el centro de la córnea, y un eje Z, en 
el cual se produce la descamación y pérdida celular de la superficie corneal. Estos autores 
propusieron una ecuación para explicar la renovación y el mantenimiento del epitelio corneal: 
X+Y=Z (17) (Figura 4). 
 
FIGURA 4: Hipótesis de la renovación del epitelio corneal , propuesta por Thoft y colaboradores . 
Imagen tomada de la revisión de Fernández, A. et al. (4). 
Para identificar las células madre epiteliales limbares no existe un marcador único (18), por lo 
que se suele analizar la expresión de distintas proteínas que se conoce que se expresan de 
manera mayoritaria. Entre las proteínas que se suelen utilizar más habitualmente como 
marcadores de células madre epiteliales limbares se encuentran el factor de transcripción p63 
(4,19,20), el cual está implicado en la morfogénesis y en el mantenimiento de la población de 
células madre (18,21); la proteína transmembrana trasportadora de ATP ABCG2 y la 
citoqueratina 15 (CK15) (22). 
ESTROMA LIMBAR 
El estroma limbar es un tejido conectivo formado principalmente por fibras de colágeno de tipo 
IV y tipo VII. Es un tejido altamente inervado y vascularizado cuyo principal componente celular 
son los fibroblastos. Además, se ha demostrado que en la zona del estroma limbar más 
cercana a la membrana basal del epitelio limbar existen células madre mesenquimales (MSCs) 
capaces de generar estos fibroblastos estromales, de remplazar los queratocitos corneales, y 
de participar en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células madre epiteliales 
limbares (23). 
1.1.3.-CONJUNTIVA 
La conjuntiva es una membrana mucosa, translúcida y delgada que tapiza la superficie ocular 
desde el limbo (conjuntiva bulbar) y que cubre la superficie interna de los párpados (conjuntiva 
palpebral). Histológicamente, la conjuntiva está formada por un epitelio estratificado cilíndrico 
no queratinizado que contiene numerosas células caliciformes y por un tejido conectivo laxo 
subyacente al epitelio (3,24) (Figura 5). Las principales funciones de la conjuntiva son: actuar 
como una barrera física e inmunológica para limitar la entrada de cuerpos extraños y 
patógenos a los tejidos oculares más profundos, y secretar el componente mucínico de la 
película del lagrimal (3). 
 
7 
 
 
FIGURA 5: Estructura histológica de la conjuntiva. A) Esquema de las principales capas histológicas 
de la conjuntiva mostrando también los principales tipos celulares. B) Imagen a 20X de un corte 
histológico trasversal de la conjuntiva humana teñida con hematoxilina -eosina Imagen histológica 
cedida por el laboratorio de Patología Ocular del IOBA. Figura tomada de la tesis doctoral de Galindo 
S. (16). 
EPITELIO CONJUNTIVAL 
El epitelio conjuntival es un epitelio estratificado no queratinizado formado por 2-5 capas 
celulares (4,10), que se organizan en células basales, intermedias y superficiales. Las células 
epiteliales conjuntivales están unidas por desmosomas e interconectadas por uniones 
intercelulares. Entre las células epiteliales se intercalan las células calciformes, las cuales son 
células especializadas en proporcionar la capa de mucina a la película lagrimal y representan 
el 7% de la población celular del epitelio conjuntival (6,10). La función de las células 
caliciformes es la de formar una barrera para evitar la adhesión de patógenos, desechos y 
otras células al epitelio y favorecer la interacción entre el epitelio y la película lagrimal (3). En 
el epitelio conjuntival también hay otros tipos celulares como melanocitos y células inmunes 
residentes (3), tales como linfocitos y células de Langerhans (6). 
El epitelio conjuntival tiene un perfil génico característico que le diferencia del epitelio de la 
córnea. En este perfil se pueden destacar la expresión de las mucinas MUC4 y MUC5AC (10), 
y de las citoqueratinas características de un epitelio no queratinizado como son CK4, CK8, 
CK13 y CK19 (4). 
ESTROMA CONJUNTIVAL 
Es una capa de tejido conectivo laxo con gran cantidad de vasos sanguíneos y diferentes 
poblaciones celulares, de las cuales, la principal son los fibroblastos, aunque también hay 
presencia de linfocitos, mastocitos, células plasmáticas y neutrófilos (6). Tiene dos capas 
principales, la capa adenoide que contiene linfocitos, sobre todo los de tipo B, y una capa 
fibrosa interna. En la capa adenoide los linfocitos B mencionados se agrupan formando un 
componente esencial para el tejido linfoide de la mucosa, denominado tejido linfoide asociado 
a la conjuntiva. Este tejido juega un papel importante en la regulación de las respuestas 
inmunitarias de la superficie ocular. La capa fibrosa más profunda es en la que se encuentran 
principalmente los vasos sanguíneos y los nervios (3). 
1.2.-DEFICIENCIA DE CÉLULAS MADRE LIMBO-CORNEALES 
1.2.1.-CAUSAS, SIGNOS, SINTOMAS Y ACTUAL TRATAMIENTO 
El mantenimiento de la integridad del epitelio corneal es esencial para preservar la 
transparencia corneal y la función visual. Como se ha explicado anteriormente, de este 
 
8 
 
cometido son responsables las células madre epiteliales limbares, localizadas en la base del 
epitelio del limbo esclero-corneal, las cuales se encargan de renovar de manera constante 
todas las capas del epitelio corneal (8,25–27). La destrucción o disfunción de estas células 
madre, o de su nicho, desencadena un cuadro clínico conocido como deficiencia de células 
madre limbares (LSCD, siglas provenientes del inglés Limbal Stem Cell Deficiency), el cual 
puede ser causado por una amplia variedad de lesiones y trastornos de la superficie ocular 
tales como quemaduras químicas (causticaciones) o térmicas, cirugías oculares múltiples, 
patologías cicatriciales autoinmunes (síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide de las 
membranas mucosas…), síndrome de ojo seco severo (por ej. enfermedad de injerto contra 
huésped ocular, Síndrome de Sjögren…), infecciones, trastornos congénitos como la aniridia 
congénita, etc. El paciente que llega a esta situación se enfrenta a una disminución seria de la 
visión, acompañada de fotofobia, blefarospasmo y episodios recurrentes de dolor intenso. Ello 
se debe a una inflamación crónica de la superficie ocular, pues el epitelio corneal ya no puede 
regenerarse al ritmo rápido necesario en condiciones normales (5-7 días). Esto genera un 
epitelio corneal inestable que se ulcera con frecuencia. La conjuntiva es entonces el único 
tejido capaz de prestar apoyo a la córnea, penetrando en su superficie y llevando consigo un 
tejido que ya no es transparente y que aporta neovasos que, aunque necesarios para la 
cicatrización, conllevan también la pérdida irreversible de la transparenciacorneal y, por ello, 
de la visión (28,29). 
Los pacientes con LSCD son malos candidatos al trasplante de córnea y, de hecho, 
constituyen fracasos sistemáticos, ya que el epitelio del injerto donante, una vez agotado, no 
tiene posibilidades de regenerarse al no existir un limbo receptor sano (29). Actualmente, el 
tratamiento de elección en humanos para tratar esta patología es el trasplante de epitelio 
limbar cultivado (CLET, del inglés Cultivated Limbal Epitelial Transplantation) (19). En casos 
unilaterales (cuando sólo uno de los ojos está afectado), es posible realizar un CLET autólogo 
a partir de una pequeña biopsia obtenida del ojo contralateral sano. Sin embargo, en casos 
bilaterales, que de hecho son más frecuentes, es necesario recurrir a tejido limbar alogénico 
de donantes cadáver debido a la escasez de tejido sano en los ojos del paciente, 
transformando un trasplante autólogo en uno alogénico (19,30). 
Pese a que el CLET representa uno de los primeros y más claros éxitos de la medicina 
regenerativa, este tratamiento no está exento de limitaciones, tales como la baja disponibilidad 
de tejido limbar donante y la insuficiente tasa de éxito en los casos más severos. Por estas 
razones, numerosos grupos de investigación de todo el mundo llevan años trabajando en la 
búsqueda de nuevas y mejores soluciones terapéuticas para esta patología. Entre las 
alternativas más prometedoras que se están estudiando actualmente se encuentra el uso de 
MSCs (31,32). 
1.2.2.-TRATAMIENTO CON CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES 
Las MSCs son un tipo de células madre adultas multipotentes, autorrenovables y con 
capacidad de diferenciarse en múltiples linajes (33). Este tipo de células madre se han aislado 
con éxito de distintos tejidos como medula ósea, membrana amniótica, tejido adiposo, pulpa 
dental o sangre del cordón umbilical (34), aunque también se pueden encontrar en placenta, 
membrana sinovial, endometrio, gelatina de Wharton y tejidos oculares (33). 
Las MSCs son una población celular heterogénea, debido a lo cual, la Sociedad Internacional 
de Terapia Celular estableció los criterios mínimos que debía cumplir una población celular 
para poder definirla como una población de MSCs (35): 1) adherencia al plástico en 
condiciones de cultivo estándar; 2) capacidad de diferenciación in vitro a tejido óseo, adiposo 
y cartilaginoso; y 3) no expresar los marcadores hematopoyéticos CD45, CD34, CD14 o 
CD11b, CD79α o CD19, ni el antígeno leucocitario humano (HLA)-DR, pero sí expresar los 
marcadores CD105, CD73 y CD90 (35). Las MSCs humanas tampoco expresan las moléculas 
coestimuladoras CD80, CD86 y CD40, pero pueden expresar niveles variables de otros 
marcadores como el CD44, el CD29, el CD71 y el CD271 (33,36). La variación en la expresión 
 
9 
 
de estos marcadores puede deberse a los diferentes tejidos de las cuales se obtienen las 
células o a las distintas condiciones de los cultivos in vitro (33,36). 
Las MSCs, aparte de crear los nichos de células madre hematopoyéticas en la medula ósea, 
tienen una función inmunorreguladora, tanto en la inmunidad innata como en la adaptativa. 
Las MSCs al interactuar con las células inmunológicas pueden modular varias funciones del 
sistema inmune. Se ha visto que la administración de estas células in vivo es bien tolerada, 
que las células migran a los tejidos lesionados y que en éstos pueden regular la respuesta 
inmune (36). Además, las MSCs tienen la capacidad de modular el microentorno local del tejido 
mediante la secreción de factores solubles que no sólo son capaces de reducir la inflamación, 
la apoptosis y la fibrosis, sino también de estimular la regeneración celular de los tejidos 
activando, entre otras cosas, a las células progenitoras endógenas (37). 
En la actualidad, existen publicados numerosos estudios preclínicos en modelos animales que 
han mostrado resultados muy prometedores sobre el potencial terapéutico de las MSCs para 
la reconstrucción de la superficie ocular. Las MSCs se ha demostrado que tienen la capacidad 
de favorecer la regeneración del epitelio corneal, mejorar la transparencia de la córnea y 
acelerar en el proceso de curación de heridas corneales (31,32,38). Además, un ensayo clínico 
randomizado doble enmascarado ha demostrado que el trasplante alogénico de MSCs es tan 
seguro y eficaz como el CLET en la restauración del epitelio corneal dañado por deficiencia de 
células madre limbares (39). 
Hasta el momento, los estudios realizados para dilucidar los mecanismos que subyacen a los 
efectos beneficiosos de las MSCs sobre la superficie ocular dañada han demostrado que 
múltiples mecanismos podrían contribuir simultáneamente a su acción terapéutica. Aunque 
sigue siendo incierto si las MSCs pueden transdiferenciarse en células epiteliales corneales 
(40), se ha demostrado que estas células secretan factores tróficos y de crecimiento capaces 
de estimular a las células madre residentes y de este modo reducir la lesión tisular. Además, 
se ha comprobado que las MSCs ejercen efectos antiinflamatorios e inmunomoduladores, y 
que tienen la capacidad de migrar hacia los tejidos lesionados de la superficie ocular (15,41–
44). 
VÍAS DE ADMINISTRACIÓN 
Establecer qué vía de administración de las MSCs es la más adecuada para el tratamiento de 
la superficie ocular es uno de los principales retos por resolver para lograr que los beneficios 
terapéuticos de estas células sean los óptimos. Mientras que algunos autores apuestan por la 
administración tópica o por la administración sistémica, ya sea intravenosa o intraperitoneal, 
el uso de sustratos portadores de células, como membrana amniótica, fibrina, lentes de 
contacto, ácido poli-L-láctico o poliamida es a día de hoy la vía de administración que, con 
diferencia, es más frecuentemente utilizada (45). Sin embargo, el número de MSCs que 
pueden ser trasplantados mediante el uso de sustratos es limitado. Además, la mayoría de los 
sustratos requieren ser suturados a la superficie ocular, lo que hace que sea necesaria una 
cirugía adicional de seguimiento para quitar los puntos de sutura, haciendo que todo el proceso 
sea más tedioso, arriesgado y costoso (45,46). 
En la actualidad, la inyección subconjuntival está emergiendo con fuerza como vía de 
administración alternativa de MSCs, ya que ha demostrado varias ventajas frente a los otros 
métodos de administración (45). La principal ventaja a destacar es que es una técnica poco 
invasiva, que proporciona la posibilidad de inyectar dosis altas de células en volúmenes 
pequeños sin necesidad de una instalación quirúrgica, un quirófano. Es una vía de 
administración rápida y barata utilizada habitualmente por los oftalmólogos para administrar 
diferentes tratamientos médicos como, por ejemplo, para inyectar antimicrobianos en el 
tratamiento de la queratitis infecciosa o mitomicina C en cirugías de pterigion. Los cultivos de 
MSCs para este método de administración son relativamente cómodos en comparación con 
los pasos de cultivo celular que hay que llevar a cabo para realizar un trasplante usando un 
sustrato portador. Además, este método garantiza una mayor absorción en comparación con 
la administración por vía tópica, ya que con ella se evita la barrera epitelial (45). 
 
10 
 
Pese a que los estudios hasta hora publicados muestran que la inyección subconjuntival de 
MSCs es segura y proporciona múltiples ventajas y beneficios, la disparidad de resultados 
mostrada por los distintos trabajos publicados pone de manifiesto que aún quedan múltiples 
cuestiones por resolver y que, por tanto, es necesario seguir investigando en este campo. 
Mientras que algunos trabajos han documentado que las MSCs migran desde el lugar de la 
inyección hasta el limbo o la córnea dañados, otros han demostrado que las MSCs inyectadas 
no migran hacia los tejidos daños sino que permanecen en el entorno próximo al lugar de la 
inyección (45). Por otra parte, el análisis de marcadores de células epiteliales de la córnea y 
ellimbo en las superficies oculares tratadas es una forma de estudiar el efecto de la 
administración de MSCs en la recuperación de los fenotipos celulares específicos (45). Sin 
embargo, hasta la fecha, el papel de las MSCs administradas por vía subconjuntival en la 
recuperación del fenotipo corneal y limbal aún no ha sido clarificado, por lo que es un campo 
que necesita ser investigado (45). 
2.-HIPÓTESIS 
La inyección subconjuntival de MSCs de tejido adiposo humano (hAT-MSCs) favorece la 
recuperación del epitelio corneal y limbar dañado de un modelo de LSCD desarrollado en 
conejo. 
3.-OBJETIVOS 
El objetivo general de este trabajo fue estudiar el efecto de la inyección subconjuntival de 
hAT-MSCs en la estructura histológica y en el fenotipo epitelial corneal y limbar de un modelo 
experimental de LSCD desarrollado en conejo. Para ello, se plantearon los siguientes 
objetivos específicos: 
1. Realizar un estudio histológico de los tejidos de la superficie ocular de un modelo de 
LSCD desarrollado en conejo al que le habían sido inyectadas subconjuntivalmente 
hAT-MSCs. 
2. Estudiar la localización de las hAT-MSCs inyectadas subconjuntivalmente en la córnea, 
el limbo y la conjuntiva enfermos del modelo de LSCD desarrollado en conejo. 
3. Analizar mediante inmunofluorescencia el efecto de la inyección subconjuntival de hAT-
MSCs en el fenotipo epitelial corneal y limbar del modelo de LSCD desarrollado en 
conejo. 
4.-MATERIALES Y MÉTODOS 
Las muestras histológicas utilizadas para realizar este trabajo procedían de 8 conejos adultos 
New Zealand White a los que en el globo ocular derecho se les había inducido una deficiencia 
de células madre limbo-corneales mediante desepitelización completa de la córnea con n-
heptanol, seguida de una limbectomía quirúrgica de los 360º del limbo (15). Transcurrida 1 
semana desde la realización del daño, a 4 de los conejos (n=4) se les inyectó 
subconjuntivalmente 2x106 hAT-MSCs marcadas con 5-bromo-2’-deoxiuridina (BrdU) (15,47) 
y a los 4 conejos del grupo control (n=4) solución vehículo (BSS, solución salina tamponada) 
sin células. Los ojos contralaterales fueron utilizados como ojos control sanos. Transcurrida 1 
semana desde la administración subconjuntival, los animales fueron sacrificados y se 
obtuvieron los botones esclerolimbocorneales para realizar el estudio histológico mediante 
tinción de PAS (Periodic Acid-Schiff), el análisis de localización de las hAT-MSCs mediante 
inmunofluorescencia frente a BrdU y el estudio fenotípico del epitelio corneal y limbar mediante 
inmunofluorescencia. 
4.1.-ESTUDIO HISTOLÓGICO 
Una vez extraídos, los botones esclerolimbocorneales fueron fijados con paraformaldehído al 
4% durante 4 h a 4ºC y posteriormente procesados e incluidos en parafina. Para realizar el 
estudio histológico mediante tinción de PAS, en primer lugar, se tallaron los bloques de 
 
11 
 
parafina y se realizaron cortes de un espesor de 4 µm con un microtomo. Una vez obtenidas 
las muestras en los portaobjetos, se dejaron en la estufa a 60ºC durante toda la noche y, 
transcurrido este tiempo, para acabar de desparafinar, se realizaron 3 incubaciones de 5 min 
en Xileno al 100%. Seguidamente, las muestras se incubaron en concentraciones decrecientes 
de alcoholes (100%, 96% y 80%) durante 4 min cada uno para ser rehidratadas. Para 
comenzar con la tinción, los cortes se lavaron con agua destilada y se incubaron con ácido 
peryódico al 0,5% durante 5 min. Posteriormente, se lavaron con agua destilada y se incubaron 
en oscuridad con reactivo de Schiff durante 15 min. A continuación, se lavaron los tejidos con 
agua corriente durante 10 min y con agua destilada otros 5 min, seguido de una incubación de 
5 min con hematoxilina de Mayer previamente filtrada. Por último, las muestras se lavaron con 
agua corriente, se deshidrataron, incubando con alcoholes en concentraciones crecientes 
(80%, 96% y 100%), durante 5 min en cada uno y se incubaron en Xileno al 100%, antes de 
pasar al montaje de las mismas. El montaje se realizó con medio de montaje Entellan, (Merck; 
Darmstadt, Germany) a base de Xileno. Las muestras fueron visualizadas en un microscopio 
Leica DM4000B (Leica; Wetzlar, Alemania) y se obtuvieron fotografías representativas de 
todos los tejidos. 
En cada muestra, se cuantificó el número de capas celulares existentes en el epitelio corneal 
y limbar y se evaluó la presencia de células caliciformes en el epitelio limbar y corneal, como 
signo de conjuntivalización. Además, se realizó una semi-cuantificación de la presencia de 
células inflamatorias (linfocitos) en la córnea, el limbo y la conjuntiva, siguiendo la siguiente 
escala de valoración: (•): ausencia; (*): cantidad muy baja; (**): cantidad baja; (***): cantidad 
moderada; (****): cantidad elevada; (*****): cantidad muy elevada. Todos estos análisis se 
realizaron en al menos 2 cortes tisulares procedentes de cada botón esclerolimbocorneal. 
4.2.-INMUNOFLUORESCENCIA 
Los tejidos que fueron utilizados estaban incluidos en parafina y cortados a 4 µm con un 
microtomo. Antes de comenzar la inmunofluorescencia, los tejidos fueron desparafinados, 
manteniéndolos en la estufa a 60ºC durante 30 min, e incubados 5 min en tres xilenos al 100%, 
y en alcoholes durante 4 min de concentraciones decrecientes (100%, 96% y 80%). Tras esto, 
se realizó un desenmascaramiento antigénico mediante incubación con tripsina (Sigma-
Aldrich; St Louis, MO, USA) al 0,1% en tampón fosfato salino (Phosphate Buffered Saline, 
PBS) (Gibco TM, Life Technologies; Inchinnan, UK) durante 20 min a 37ºC. Este 
desenmascaramiento se realizó para que los epítopos de los antígenos que se querían 
estudiar quedaran expuestos y se pudieran unir a ellos los anticuerpos que iban a ser 
utilizados. 
Todo el protocolo de la inmunofluorescencia se realizó en cámara húmeda. Se comenzó 
lavando los tejidos tres veces con PBS al 1X durante 5 min para eliminar los restos de tripsina. 
Tras ello, se realizó el bloqueo y la permeabilización del tejido con una solución de suero de 
burro al 5% (Sigma-Aldrich) y tritón (Sigma-Aldrich) al 0,3% en PBS al 1X durante 1 h. a 
temperatura ambiente. A continuación, las muestras se incubaron durante toda la noche a 4°C 
con el anticuerpo primario correspondiente en tampón de bloqueo (PBS 1X con suero de burro 
al 5%) a las diluciones recomendadas por la casa comercial (Tabla 1). Seguidamente, se 
realizaron tres lavados de 5 min con PBS y los tejidos fueron incubados durante 1 h. a 
temperatura ambiente y protegidos de la luz, con el anticuerpo secundario correspondiente 
(Alexa Fluor® 488 donkey anti‐mouse 1/200 en PBS o Alexa Fluor® 594 donkey anti‐sheep 
1/100 en PBS (Thermo Fisher Scientifics)). Posteriormente, tras lavar los tejidos con PBS, las 
muestras se incubaron con Vector® TrueVIEW® Autofluorescence Quenching Kit (Vector 
Laboratories; Burlingame, CA, USA) durante 3 min a temperatura ambiente para eliminar la 
autoflorescencia. Los núcleos fueron contrateñidos mediante incubación de las muestras con 
el fluoróforo nuclear Hoechst (2'-[4'-etoxifenil]-5-[4-metilpiperazin-1-il]-2,5'-bis-1h- 
benzimidazol trihidrocloruro trihidrato) (Sigma-Aldrich) a una concentración de 200 µg/ml 
durante 5 min en PBS. Por último, tras un lavado con PBS y un último lavado con agua 
 
12 
 
corriente, se realizó el montaje de las muestras utilizando el medio de montaje Vectashield 
Vibrance, (Vector Laboratories). 
TABLA 1: Anticuerpos primarios. 
Nombre del 
anticuerpo 
Especificidad 
Especie de 
síntesis 
Clon Casa comercial Dilución 
Anti- BrdU 
MSCs marcadas 
con BrdU 
Oveja 
(policlonal) 
- 
Novus Biologicals 
(Littleton, CO, 
USA) 
1/100 
Anti- citoqueratina 3 
Células 
epiteliales 
corneales 
Ratón 
(monoclonal) 
AE-5 
Mp Biomedical 
(Illkirch, France) 
1/50 
Anti-citoqueratina 15 
Células madre 
epiteliales 
limbares 
Ratón 
(monoclonal) 
LHK15 
Merck (Darmstadt, 
Germany) 
1/50 
Anti-E-cadherina 
Células 
epiteliales 
corneales 
Ratón 
(monoclonal)36 
BD Biosciences 
(San Jose, CA, 
USA) 
1/100 
Anti-p63 
Células madre 
epiteliales 
limbares 
Ratón 
(monoclonal) 
4A4 
Abcam 
(Cambridge, UK) 
1/50 
Todos los tejidos fueron observados y fotografiados en un microscopio invertido de 
fluorescencia (Leica DMI6000 B). De cada botón esclerolimbocorneal se analizaron, al menos, 
dos cortes por cada marcador (CK3, CK15, E-cadherina, p63 y BrdU), para tener las muestras 
por duplicado; y en cada uno de los cortes se realizaron 7 fotografías, para obtener imágenes 
de cada zona del tejido (conjuntiva superior, limbo superior, córnea superior, córnea central, 
córnea inferior, limbo inferior y conjuntiva inferior). En todos los experimentos se incluyeron 
controles negativos en los cuales el paso de la incubación con el anticuerpo primario se realizó 
únicamente con tampón de bloqueo y permeabilización sin el anticuerpo (PBS 1X con suero 
de burro al 5% y tritón al 0,3%). 
La localización de las hAT-MSCs en los tejidos se realizó mediante inmunofluorescencia frente 
a BrdU, ya que las hAT-MSCs que habían sido inyectadas subconjuntivalmente habían sido 
marcadas previamente con BrdU (15). La BrdU es un análogo sintético de la timidina que, si 
se encuentra en el medio de cultivo, puede ser incorporado por las células a su cadena de 
ADN durante la fase S del ciclo celular. En este tipo de inmunofluorescencia, tras desparafinar 
los tejidos se realizó un paso previo de desnaturalización de ADN para permitir que el 
anticuerpo primario pudiera unirse a la BrdU incorporada en la cadena de ADN de las hAT-
MSCs. Para ello, las muestras se lavaron con PBS y posteriormente se incubaron con ácido 
clorhídrico 2 N durante 30 min a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, se neutralizó el 
ácido clorhídrico con una solución de borato sódico 0,1 M a pH 8,5, realizando 3 lavados de 
10 min a temperatura ambiente. Por último, las muestras se lavaron con PBS y se procedió a 
desenmascarar con tripsina y a continuar con el protocolo de inmunofluorescencia descrito 
anteriormente. 
Para analizar la cantidad de hAT-MSCs presentes en las muestras, se realizó una 
semicuantificación subjetiva de la cantidad de células positivas para BrdU que se encontraban 
en cada uno de los tejidos, utilizando la siguiente escala de valoración: (•): ausencia; (+): 
cantidad muy baja; (+-): cantidad baja; (++): cantidad moderada; (+++): cantidad elevada. 
4.3. ANÁLISIS DE LAS IMÁGENES DE INMUNOFLOURESCENCIA 
El análisis de las imágenes de inmunofluorescencia se realizó con el programa de análisis de 
imagen ImageJ. El software del microscopio de fluorescencia Leica utilizado para adquirir las 
imágenes guarda las mismas en un formato específico denominado LIF, “Leica Image Format”. 
Por ello, para poder abrir las imágenes en el programa ImageJ, se utilizó el “plugin” para abrir 
bio-formatos, “bio-formats importer”. Una vez abiertas las imágenes, se separaron en distintos 
 
13 
 
canales para poder aislar el canal en el cual se veía el marcador de la proteína analizada del 
canal en el que se veía el colorante nuclear. Una vez separados los canales, con la opción de 
“Polygon selection” de la barra de tareas principal de ImageJ, se seleccionó la zona en la cual 
se observaba expresión del marcador analizado (Figura 6). 
 
FIGURA 6: Análisis de una imagen de inmunofluorescencia utilizando el programa ImageJ. 
Selección de la zona de tejido en la cual se puede observar la expresión del marcado (en verde) frente 
al cual se ha realizado la inmunofluorescencia. 
Las imágenes fueron tomadas en escala de grises y guardadas por defecto en 12 bits, 
indicándonos que en cada imagen existían 4096 niveles de tonalidades de grises. Cuando se 
realizaron las medidas, lo que se quería conocer era el máximo y el mínimo de estos valores 
para poder establecer si nuestra imagen se encontraba dentro del rango de grises de una 
imagen a 12 bits, el área de la zona seleccionada y la media de los valores de grises dentro 
de esta área. Por ello, dentro de las opciones que se querían obtener en la ventana de los 
resultados del programa ImageJ se seleccionaron los siguientes parámetros: “Area”, “Min & 
max gray value”, “Integrated density”, “Mean gray value” y “Display label”. Finalmente, se 
procedió con el análisis del área seleccionada utilizando el comando “Analyze/Measure”, 
apareciendo una nueva ventana “Results” con las opciones que habíamos seleccionado 
anteriormente junto con RawIntDen, que es la suma de los valores de píxeles en la selección 
y IntDen que es la suma de los valores de píxeles en la selección multiplicado por el área de 
un píxel. De toda esta información, la que se utilizó para realizar el análisis fue la media de los 
valores de grises (“Mean”) y el área de la zona seleccionada (“Area”), lo demás eran datos 
útiles para saber si la imagen estaba bien tomada (Figura 7). 
Todos estos análisis se realizaron en cada una de las imágenes obtenidas de, al menos, dos 
cortes histológicos de todas las muestras tisulares en estudio. De cada corte se realizaron y 
analizaron 7 imágenes, una por cada zona de tejido (conjuntiva, limbo y córnea superior, 
córnea central y córnea, limbo y conjuntiva inferior). 
 
FIGURA 7: Recuadro de "Results" del programa de análisis de imagen ImageJ. Recuadro en el 
cual aparecen los resultados de las medidas de fluorescencia realizadas para un determinado marcador 
en una imagen de inmunofluorescencia. 
 
 
14 
 
4.4.-ANÁLISIS ESTADÍSTICO 
El análisis estadístico de las medidas obtenidas en los análisis de las imágenes de 
inmunofluorescencia se efectuó con el programa GraphPad Prism 8 realizando un test ANOVA 
de una vía y representando la media de los datos normalizados al dato con el valor más 
pequeño ± la desviación típica. Los valores de p≤0,05 fueron considerados estadísticamente 
significativos (*p ≤0,05, **p ≤0,01). 
5.-RESULTADOS 
5.1.- ANÁLISIS HISTOLÓGICO DE LOS DISTINTOS TEJIDOS 
Mediante la tinción de PAS se estudió el efecto de la inyección subconjuntival de hAT-MSCs 
en la estructura histológica de los tejidos de la superficie ocular del modelo de LSCD 
desarrollado en conejo. El efecto de la administración celular se comparó con la inyección de 
solución vehículo sin células y con la estructura de tejidos control sanos. Transcurrida una 
semana desde la administración del tratamiento, se estudiaron los tejidos conjuntivales, 
limbares y corneales siendo diferenciados éstos en zona superior e inferior y, en el caso de la 
córnea, también en zona central. 
La tinción de PAS permite observar en color rosa fucsia las células caliciformes, propias de la 
conjuntiva, ya que tiñe las mucinas que contienen en su interior. En color azul/morado se 
pueden observar los núcleos celulares, con lo que esta tinción permite identificar la presencia 
de células inflamatorias en los tejidos. Con la tinción de PAS también se pueden observar los 
cambios estructurales de los distintos tejidos, así como la aparición de neovasos o la presencia 
de defectos epiteliales. 
En los tejidos control sanos se observaron 3-4 capas de células epiteliales en el tejido corneal, 
sin encontrarse diferencias entre el número de capas celulares observadas en el epitelio 
corneal superior, central e inferior (Figura 8). En cambio, en los tejidos procedentes de los 
conejos con LSCD se apreció un engrosamiento tanto en el epitelio corneal superior, como en 
epitelio corneal inferior, observándose alrededor de 5-6 capas de células epiteliales, pero sin 
observarse diferencias entre el grupo tratado con solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y 
el grupo tratado con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs) (Figura 8). En el epitelio corneal central 
no se observaron cambios en el número de capas de células epiteliales en ninguno de los 
grupos experimentales en comparación con el número de capas observadas en los tejidos 
control sanos. Por otra parte, a diferencia de lo observado en los tejidos sanos, en los tejidos 
de los conejos con LSCD (LSCD+BSS y LSCD+hAT-MSCs)se observó presencia de vasos 
sanguíneos en el estroma corneal en las zonas más próximas al limbo superior e inferior 
(Figura 8). 
Con respecto a los tejidos limbares, se observaron las empalizadas de Vogt solo en los tejidos 
sanos, mientras que en la mayoría de los tejidos procedentes de los conejos con LSCD, como 
era de esperar, no se observó la presencia de las mismas (Figura 8). No obstante, en aquellos 
tejidos en los cuales sí se apreciaban las empalizadas, se observó un aumento en el número 
de capas celulares en el epitelio limbar, siendo éste similar entre los conejos del grupo 
LSCD+BSS y del grupo LSCD+hAT-MSCs. Además, tanto en los conejos del grupo 
LSCD+BSS, como del grupo LSCD+hAT-MSCs, se observó que el estroma limbar se 
encontraba bastante desestructurado y que había presencia de células caliciformes (signo 
conjuntivalización) en el epitelio limbar, siendo mayor el número células caliciformes 
encontrado en aquellos conejos que fueron inyectados con solución vehículo sin células 
(Figura 8). 
El grado de inflamación de los tejidos se estudió en base a la cantidad de células inflamatorias 
que se observaron en cada uno de los tejidos analizados. Las células inflamatorias (linfocitos) 
son células pequeñas cuyo núcleo se tiñe de color azul/morado con la tinción de PAS. 
 
 
15 
 
 
 
 SANO LSCD + BSS LSCD + hAT-MSCs 
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16 
 
FIGURA 8: Estudio histológico. Fotografías representativas de cortes histológicos teñidos con PAS 
procedentes de ojos control sanos (n=4), ojos con deficiencia de células madre limbares (LSCD) de 
una semana de evolución inyectados subconjuntivalmente con solución vehículo sin células : 
LSCD+BSS (n=4), y ojos con LSCD de una semana de evolución inyectados subconjuntivalmente con 
células madre mesenquimales de tejido adiposo humano (hAT-MSCs): LSCD+hAT-MSCs (n=4). Los 
tejidos fueron obtenidos una semana tras la realización de la inyección subconjuntival. En color rosa 
fucsia se pueden observar las células caliciformes en el epitelio y en color azul/morado los núcleos 
celulares de las células inflamatorias (cúmulos de linfocitos) en el estroma. Imágenes realizadas a 20X. 
Barra de escala: 100 µm. 
En los tejidos sanos, este tipo de células se encontraron en muy baja cantidad en comparación 
con aquellos tejidos procedentes de conejos con LSCD (Figura 8). En el estroma limbar de los 
conejos con LSCD, la presencia de células inflamatorias observada fue moderada o baja, salvo 
en el limbo superior de los conejos tratados con hAT-MSCs donde la presencia de infiltrados 
inflamatorios fue elevada (Figura 8 y Tabla 2). En el estroma de la córnea central e inferior del 
grupo de conejos LSCD+BSS no se observó presencia de infiltrados inflamatorios. En cambio, 
en el grupo de conejos tratados con hAT-MSCs se pudo llegar a observar una pequeña 
presencia de células inflamatorias en el estroma de estos conejos (Tabla 2). En el estroma 
conjuntival se observó una presencia baja o moderada células inflamatorias, siendo mayor la 
cantidad en las zonas de la conjuntiva que habían comenzado a invadir el limbo y/o la córnea 
(Figura 8, Tabla 2). 
En general, se observó mayor presencia de células inflamatorias en todos los tejidos 
procedentes de los animales con LSCD tratados con la inyección subconjuntival de hAT-MSCs 
que en aquellos que solo habían sido tratados con la solución vehículo, excepto en el limbo 
inferior donde la cantidad de células inflamatorias observada fue moderada en el caso de los 
conejos tratados con solución vehículo y baja en los tratados con hAT-MSCs (Tabla 2). 
TABLA 2: Presencia de infiltrados inflamatorios en los distintos tejidos de la superficie ocular. 
 Conjuntiva 
superior 
Limbo 
superior 
Córnea 
superior 
Córnea 
central 
Córnea 
inferior 
Limbo 
inferior 
Conjuntiva 
inferior 
LSCD + BSS ** ** *** • • *** ** 
LSCD + hAT-MSCs *** **** ** * * ** *** 
Los datos de la presencia de infiltrados inflamatorios se representan con (•): ausencia; (*): cantidad muy baja; (**): 
cantidad baja; (***): cantidad moderada; (****): cantidad elevada. LSCD: deficiencia de células madre de limbo; 
BSS: solución salina balanceada; hAT-MSCs: células madre mesenquimales de tejido adiposo humano. 
5.2.- LOCALIZACIÓN DE LAS hAT-MSCs 
La localización de las hAT-MSCs en los tejidos de la superficie ocular del modelo de LSCD se 
determinó gracias a que éstas, antes de ser inyectadas subconjuntivalmente, fueron 
cultivadas, y por tanto marcadas, con BrdU. Se observó una baja o muy baja cantidad de 
células positivas para BrdU en toda la superficie ocular, siendo la menor cantidad observada 
en la conjuntiva superior, tanto en el epitelio como en el estroma, y en el epitelio del limbo y la 
córnea superior. Esta cantidad fue ligeramente mayor en la zona inferior de la conjuntiva, el 
limbo y la córnea, tanto en epitelio como en el estroma. En el caso de la córnea central se 
observó mayor cantidad hAT-MSCs marcadas con BrdU en el epitelio que en el estroma, al 
contrario de lo observado en la córnea y limbo inferior, cuya mayor cantidad se encontró en el 
estroma (Figura 9, Tabla 3). No obstante, en varios de los conejos analizados se pudieron 
observar grandes acúmulos de células positivas para BrdU en el estroma del limbo tanto 
superior como inferior. 
 
 
 
 
17 
 
 
 A B 
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FIGURA 9: Localización de las hAT-MSCs marcadas con BrdU en los tejidos de la superficie 
ocular del modelo de defciencia de células madre limbocorneales. Imágenes representativas de la 
localización de las hAT-MSCS BrdU+ en la córnea, el limbo y la conjuntiva de los conejos con 
deficiencia de células madre limbares inyectados subconjuntivalmente . Imágenes de microscopía de 
fluorescencia realizadas a 20X (A) y a 40X (B). En ellas se pueden observar en rojo las células madre 
mesenquimales BrdU+, en color azul los núcleos teñidos con el flouróforo nuclear Hoechst y en la 
tercera imagen se puede ver la superposición de las imágenes anteriores. La barra de escala 
representa 50 µm. 
TABLA 3: Cantidad de células madre mesenquimales marcadas con BrdU. 
Los datos de la presencia de células madre BrdU positivas se representan con (•): ausencia; (+): cantidad muy 
baja; (+-): cantidad baja; (++): cantidad moderada. 
5.3.- DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN DE LOS 
MARCADORES DE EPITELIO CORNEAL Y LIMBAR 
Para determinar si existían cambios de expresión de los marcadores de epitelio corneal (CK3 
y E-cadherina) y limbar (CK15 y p63) en los tejidos oculares de conejo procedentes de los 
distintos grupos experimentales, se realizaron inmunofluorescencias indirectas y se estudiaron 
los niveles de expresión de cada marcador mediante el análisis de las imágenes de 
microscopía de fluorescencia. 
En primer lugar, se analizó la expresión del marcador de epitelio corneal diferenciado CK3. 
Observamos que la expresión de este marcador se veía fundamentalmente en el citoplasma 
de las capas celulares superiores del epitelio corneal y limbar de los ojos sanos. En los tejidos 
 Conjuntiva 
superior 
Limbo 
superior 
Córnea 
superior 
Córnea 
central 
Córnea 
inferior 
Limbo 
inferior 
Conjuntiva 
inferior 
Epitelio + + + +- +- +- +- 
Estroma + +- +- + +- +- +- 
 
18 
 
procedentes de los conejos con LSCD tratados con solución vehículo sin células (LSCD+BSS) 
los niveles de expresión de este marcador fueron muy similares a los de los ojos sanos. No 
obstante, se observaron diferencias significativas en la expresión de este marcador entre el 
limbo y las distintas zonas corneales de este grupo experimental. En los tejidos procedentes 
de los conejos con LSCD tratados conhAT-MSCs se observó un aumento en la expresión de 
este marcador, en comparación con los tejidos del grupo control sano y el grupo tratado con 
solución vehículo (LSCD + BSS), aunque estas diferencias sólo fueron estadísticamente 
significativas en limbo superior, tanto en comparación con los controles sanos como con el 
grupo de conejos con LSCD tratados con BSS (Figuras 10, S1 y 11). 
Los resultados obtenidos del análisis de la expresión del marcador de epitelio corneal E-
cadherina indicaron que los tejidos de los conejos con LSCD inyectados con solución vehículo 
sin células mostraron una expresión uniforme y similar de este marcador a la mostrada por los 
tejidos del grupo control de sanos (Figuras 12, S2 y 13). En los tejidos de los conejos con 
LSCD tratados con las hAT-MSCs se observó un aumento significativo de la expresión de esta 
proteína en córnea superior y central en comparación con los niveles de expresión de los 
tejidos control sanos y de los tejidos de los conejos con LSCD tratados con BSS. Por otra 
parte, se observó que la expresión de este marcador en todos los tejidos de cada grupo 
experimental fue uniforme, sin verse diferencias entre las distintas capas de células epiteliales 
(Figuras 12, S2 y 13). 
 
FIGURA 10: Imágenes de inmunofluorescencia de la expresion del marcador de células de 
epitelio corneal citoqueratina-3 (CK3). Imágenes representativas de los tejidos la superficie ocular 
de los tres grupos experimentales analizados: tejidos oculares sanos (control sano), tejidos 
procedentes de conejos con deficiencia de células madre limbares (LSCD) inyectados 
subconjuntivalmente con solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y tejidos de conejos con LSCD 
inyectados subconjuntivalmente con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs). En las imágenes se pueden 
diferenciar en azul los núcleos teñidos con el colorante nuclear Hoechst y en verde la proteína CK3. 
Imágenes tomadas con microscopio invertido de fluorescencia a 40X aumentos. B arra de escala= 50 
µM. 
 Limbo superior Córnea superior Córnea central Córnea inferior Limbo inferior 
C
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A
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L
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SUPERIOR
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SUPERIOR
CÓRNEA
CENTRAL
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LIMBO
INFERIOR
CONTROL
SANO
LSCD + BSS
LSCD +
hAT-MSCs
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✱✱
✱
✱
✱
 
FIGURA 11 Análisis de los niveles de expresión relativa del marcador de epitelio corneal 
citoqueratina 3 (CK3). Representación de los niveles relativos de expresión (media ± desviación 
típica) de la proteína CK3. El análisis se realizó a partir de las imágenes de inmunofluorescencia de 
los tejidos de la superficie ocular de los tres grupos experimentales analizados: tejidos oculares sanos 
(control sano), tejidos procedentes de conejos con deficiencia de células madre limbares (LSCD) 
inyectados subconjuntivalmente con solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y tejidos de conejos 
con LSCD inyectados subconjuntivalmente con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs). *p ≤0,05; **p≤0,01. 
FIGURA 12: Imágenes de imunofuorescencia de la expresión del marcador de células de epitelio 
corneal E-cadherina. Imágenes representativas de los tejidos de la superficie ocular de los tres grupos 
experimentales analizados: tejidos oculares sanos (control sano), tejidos procedentes de conejos con 
deficiencia de células madre limbares (LSCD) inyectados subconjuntivalmente con solución vehículo 
sin células (LSCD+BSS) y tejidos de conejos con LSCD inyectados subconjuntivalmente con hAT -MSCs 
(LSCD+hAT-MSCs). En las imágenes se pueden observar en azul los núcleos teñidos con el colorante 
nuclear Hoechst y en verde la proteína E-cadherina. Imágenes tomadas con microscopio invertido de 
fluorescencia a 40X aumentos. Barra de escala= 50 µM. 
 Limbo superior Córnea superior Córnea central Córnea inferior Limbo inferior 
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SUPERIOR
CÓRNEA
SUPERIOR
CÓRNEA
CENTRAL
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LIMBO
INFERIOR
CONTROL
SANO
LSCD + BSS
LSCD +
hAT-MSCs
✱✱✱
✱✱
 
FIGURA 13: Análisis de los niveles de expresión relativa del marcador de epitelio corneal E -
cadherina. Representación de los niveles relativos de expresión (media ± la desviación típica) de la 
expresión de la proteína E-cadherina en cada tejido. El análisis se realizó a partir de las imágenes de 
inmunofluorescencia de los tejidos de la superficie ocular de los tres grupos experimentales analizados: 
tejidos oculares sanos (control sano), tejidos procedentes de conejos co n deficiencia de células madre 
limbares (LSCD) inyectados subconjuntivalmente con solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y 
tejidos de conejos con LSCD inyectados subconjuntivalmente con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs). 
*p≤0,05; **p≤0,01. 
El análisis de la expresión del marcador de células epiteliales limbares CK15, como era de 
esperar, mostró un mayor nivel de expresión en los tejidos limbares de los conejos sanos, tanto 
en el limbo superior como en el inferior (Figura 14 y S3), en comparación con los tejidos 
corneales sanos. También se pudo observar que la expresión de este marcador era más 
elevada en el tejido limbar sano que en los tejidos limbares de los otros grupos experimentales 
(LSCD+BSS y LSCD+hAT-MSCs), aunque sin observaron diferencias significativas (Figura 
15). En los conejos con LSCD se observó que la expresión de CK15 era prácticamente 
uniforme por toda la superficie ocular, salvo en la córnea central y en la córnea inferior donde 
la expresión fue significativamente mayor en los conejos tratados con la solución vehículo sin 
células que en el grupo de tejidos control sanos (Figura 15). Por otra parte, también se pudo 
observar que la expresión de este marcador en tejidos sanos tenía lugar principalmente en las 
capas más basales del epitelio limbar y que, sin embargo, en los tejidos con LSCD se observó 
que la expresión de este marcador era más homogénea sin aparentes diferencias entre las 
células de las distintas capas epiteliales (Figura 14 y S3). 
Como era de esperar, en tejidos oculares sanos, la mayor expresión del marcador de células 
madre limbares p63 se observó en los tejidos limbares, superior e inferior, existiendo una baja 
expresión en la córnea, destacando la córnea superior (Figuras 16, S4 y 17). En los tejidos de 
los conejos con LSCD tratados con solución vehículo sin células y tratados con hAT-MSCs se 
observó una expresión de p63 elevada en las células del epitelio corneal, observándose 
diferencias significativas entre los tejidos sanos y los del grupo LSCD+BSS en córnea central 
e inferior, y entre los tejidos corneales superior y central de los tejidos del grupo LSCD+hAT-
MSCs y los controles sanos. No se observaron diferencias estadísticamente significativas en 
la expresión de p63 entre ambos tipos de conejos con LSCD (LSCD+BSS y LSCD+hAT-
MSCs), aunque se puedo apreciar un aparente aumento de expresión en la córnea superior 
en los ojos tratados con hAT-MSCs (Figura 17). En las figuras 16 y S4 se puede observar que 
las células marcadas con p63 se encontraban fundamentalmente en las capas epiteliales más 
basales de los tejidos limbares y corneales. 
 
21 
 
FIGURA 14: Imágenes de inmunofluorescencia de la expresion del marcador de células de 
epitelio limbar citoqueratina-15 (CK15). Imágenes representativas de los tejidos de la superficie 
ocular de los tres grupos experimentales analizados: tejidos oculares sanos (control sano), tejidos de 
conejos con deficiencia de células madre limbares (LSCD) inyectados subconjuntivalmente con 
solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y tejidos de conejos con LSCD inyectados 
subconjuntivalmente con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs). En las imágenes se pueden observar en azul 
los núcleos teñidos con el colorante nuclear Hoechst y en verde laproteína CK15. Imágenes tomadas 
con microscopio invertido de fluorescencia a 40X aumentos. Barra de escala= 50 µm. 
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SANO
LSCD + BSS
LSCD +
hAT-MSCs
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FIGURA 15: Análisis de los niveles de expresión relativa del marcador de epitelio limbar 
citoqueratina-15 (CK15). Representación de los niveles de expresión relativos (media ± la desviación 
típica) de la proteína CK15. El análisis se realizó a partir de las imágenes de inmunofluorescencia de 
los tejidos de la superficie ocular de los tres grupos experimentales analizados: tejidos oculares sanos 
(control sano), tejidos procedentes de conejos con deficiencia de células madre limbares (LSCD) 
inyectados subconjuntivalmente con solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y tejidos de conejos 
con LSCD inyectados subconjuntivalmente con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs). *p ≤0,05, **p≤0,01. 
 
 Limbo superior Córnea superior Córnea central Córnea inferior Limbo inferior 
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FIGURA 16: Imágenes de inmunofluorescencia de la expresión del marcador de células madre 
epiteliales limbares p63. Imágenes representativas de los tejidos de la superficie ocular de los tres 
grupos experimentales analizados: tejidos oculares sanos (control sano) , tejidos procedentes de 
conejos con deficiencia de células madre limbares (LSCD) inyectados subconjuntivalme nte con 
solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y tejidos de conejos con LSCD inyectados 
subconjuntivalmente con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs). En las imágenes se pueden apreciar de azul 
los núcleos teñidos con el colorante nuclear Hoechst y en verde el factor de transcripción nuclear p63. 
Imágenes realizadas con un microscopio invertido de fluorescencia a 40X. Barra de escala=50 µm. 
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CONTROL
SANO
LSCD + BSS
LSCD +
hAT-MSCs
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FIGURA 17: Análisis de los niveles de expresión relativa del marcador de células madre 
epiteliales limbares p63. Representación de los niveles relativos de expresión (media ± desviación 
típica) del factor de transcripción p63 a partir de las imágenes de inmunofluorescencia de los tejidos 
la superficie ocular de los tres grupos experimentales analizados: tejidos oculares sanos (control sano), 
tejidos procedentes de conejos con deficiencia de células madre limba res (LSCD) inyectados 
subconjuntivalmente con solución vehículo sin células (LSCD+BSS) y tejidos de conejos con LSCD 
inyectados subconjuntivalmente con hAT-MSCs (LSCD+hAT-MSCs).*p ≤0,05. 
 
 Limbo superior Córnea superior Córnea central Córnea inferior Limbo inferior 
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6.-DISCUSIÓN 
Numerosos estudios preclínicos in vitro e in vivo realizados hasta la fecha han demostrado que 
las MSCs son una fuente de células madre muy prometedora para el tratamiento de 
enfermedades de la superficie ocular tales como la deficiencia de células madre limbo-
corneales (31,32). Incluso un ensayo clínico recientemente publicado ha confirmado que este 
tipo de células madre es seguro y eficaz para el tratamiento de pacientes afectados por esta 
patología (39). No obstante, pese a que los efectos beneficiosos de las MSCs sobre la 
superficie ocular dañada ya han sido evidenciados, a día de hoy aún se desconoce cuál es la 
vía de administración más adecuada para que sus efectos terapéuticos sean los óptimos. 
Actualmente, la inyección subconjuntival está emergiendo con fuerza como vía de 
administración de MSCs para el tratamiento del fracaso de la superficie ocular por LSCD, ya 
que ha demostrado múltiples ventajas y beneficios frente a otras vías de administración (45). 
A pesar de que los trabajos publicados hasta el momento han demostrado que la inyección 
subconjuntival de MSCs es segura (45), aún quedan numerosas incógnitas por resolver que 
ponen de manifiesto la necesidad de seguir investigando en este campo. Por ello, el objetivo 
principal de este trabajo fue estudiar el efecto de la inyección subconjuntival de hAT-MSCs en 
la estructura histológica y en el fenotipo epitelial corneal y limbar utilizando para ello un modelo 
de LSCD desarrollado en conejo. 
Se eligió el conejo como modelo para este estudio porque su globo ocular tiene grandes 
similitudes con el globo ocular con el humano, razón por la cual es uno de los animales más 
utilizados para desarrollar modelos preclínicos en oftalmología. Además, es el modelo animal 
más empleado para el estudio de la LSCD (48,49). En la bibliografía se pueden encontrar 
diferentes formas de inducir la LSCD mediante la realización de un daño en la superficie ocular 
de los conejos (48,49). En nuestro trabajo, la lesión en la superficie ocular fue realizada 
mediante una desepitelización de la córnea con n-heptanol seguida de una limbectomia 
quirúrgica de los 360º del limbo de manera similar a la descrita previamente por Galindo et al. 
(15). 
El estudio histológico de los tejidos oculares con LSCD mostró que, transcurridas dos semanas 
desde la inducción del daño, se producía un aumento en el número de capas del epitelio 
corneal en las zonas más próxima al limbo, pero sin observarse diferencias entre los tejidos 
de los animales tratados con hAT-MSCs y los tejidos de los animales tratados con solución 
vehículo sin células. Estos resultados indican que el engrosamiento observado en el epitelio 
corneal cercano al limbo fue consecuencia del efecto de la inducción de la lesión y no del 
tratamiento. Nuestros resultados concuerdan con los publicados por Ma et al. donde 
observaron que el limbo también sufría un engrosamiento del epitelio en un modelo de LSCD 
mediante quemadura química desarrollado en rata (50). Además, el estudio histológico 
también reveló que en la zona limbar de los tejidos oculares que habían sufrido el daño había 
presencia de células caliciformes, evidenciando que la conjuntiva había comenzado a invadir 
la zona del limbo, siendo esto un signo propio y característico de la LSCD (51). Pese a que en 
nuestro modelo los tiempos de evolución desde la inducción del daño hasta la aplicación del 
tratamiento y desde la aplicación del tratamiento hasta el sacrificio de los animales fueron de 
tan solo una semana, nuestras observaciones confirman los resultados de estudios previos 
donde también se observó la presencia de células caliciformes comenzando a invadir la córnea 
en conejos con LSCD tras cuatro semanas de evolución (52). Por otra parte, algo que cabe 
destacar de nuestros resultados es la presencia de una menor cantidad de células calciformes 
en la zona limbar de los tejidos con LSCD tratados con las hAT-MSCs, en comparación con la 
cantidad de estas células observada en los tejidos tratados con solución vehículo sin células. 
Nuestros resultados sugieren, por tanto, que la inyección subconjuntival de hAT-MSCs podría 
prevenir en cierta medida la conjuntivalización. Aunque para confirmar esta hipótesis sería 
necesario realizar estudios adicionales incrementando el tamaño muestral y efectuando una 
valoración semicuantitativa de la presencia de células caliciformes, nuestros resultados 
concordarían con los previamente observados por García-Vázquez et al. (53), en donde 
 
24 
 
demostraron que el trasplante de hAT-MSCs sobre membrana amniótica prevenía la 
conjuntivalización a las 6-8 semanas de evolución post-tratamiento (53). Además, la 
observación de las muestras histológicas a nivel del estroma evidenció la presencia de 
neovasos en las zonas de la córnea más cercanas al limbo dañado, confirmando que el modelo 
de LSCD utilizado era adecuado ya que presentabaotro de los signos característicos de esta 
patología como es la vascularización de la córnea (51). Estos resultados confirman los 
mostrados por otros estudios en modelos de LSCD en conejos en los cuales también se 
observó mediante análisis histológicos la vascularización de la córnea a una semana de 
evolución de la enfermedad (54). No obstante, nuestros resultados no han podido demostrar 
ningún efecto de la inyección subconjuntival de hAT-MSCs sobre la vascularización corneal. 
Estudios a tiempos de evolución post-tratamiento más prolongados donde, además de a nivel 
histológico, se estudie la superficie ocular de los animales a nivel clínico, serían necesarios 
para corroborar los resultados de otros autores que han demostrado que la inyección 
subconjuntival de MSCs disminuye la neovascularización corneal en conejos con LSCD 
(55,56). 
Uno de los signos típicos de la LSCD es la inflamación crónica de la superficie ocular, la cual 
puede ser evidenciada por la presencia de infiltrados inflamatorios en los distintos tejidos. 
Diferentes estudios han demostrado que la inyección subconjuntival de MSCs en modelos de 
LSCD disminuye la cantidad de infiltrados inflamatorios en los tejidos dañados de la superficie 
ocular (57–60). Sin embargo, nuestros resultados muestran que la inyección subconjuntival de 
hAT-MSCs en nuestro modelo de LSCD no sólo no disminuye, sino que incluso induce un leve 
incremento en la cantidad de infiltrados inflamatorios observados en los distintos tejidos de la 
superficie ocular analizados. La discrepancia entre nuestros resultados y los previamente 
publicados pudiera deberse a diferencias en los modelos de LSCD utilizados, al tipo y a la 
dosis de MSCs administradas, o a los tiempos de evolución post-tratamiento a los que se 
realizaron los análisis. En este sentido, existen estudios similares al nuestro dónde sí que se 
observó el efecto antiinflamatorio de las MSCs. Sin embargo, en estos trabajos, los tiempos 
de evolución desde la inducción del daño hasta la aplicación del tratamiento fueron menores 
(61). Es por esto, y porque estudios a tiempos superiores post-tratamiento muestran una 
bajada del grado de inflamación en tejidos oculares tratados con este tipo de células (61,62), 
que se podría deducir que, a una semana de evolución, el efecto antiinflamatorio de las células 
inyectadas de manera subconjuntival pueda apreciarse levemente (61). Por otra parte, el 
análisis de la localización de las hAT-MSCs mediante inmunofluorescencia frente a BrdU puso 
de manifiesto que la cantidad de células BrdU+ presente en los distintos tejidos de nuestro 
estudio era en general bastante baja, por lo que la reducida presencia de hAT-MSCs en los 
tejidos dañados podría ser otra de las razones por las que no se apreció ningún efecto reductor 
en la cantidad de infiltrados inflamatorios. 
Numerosos trabajos han puesto de manifiesto que las MSCs tienden a migrar hacia los tejidos 
dañados y a zonas con alto grado de inflamación (31,63). Sin embargo, los estudios hasta 
ahora publicados en los que se ha analizado la localización de las MSCs administradas 
mediante inyección subconjuntival en distintos modelos de daño corneal arrojan resultados 
muy dispares. Mientras que algunos autores sostienen que las MSCs migran desde el lugar 
de la inyección hasta los tejidos limbares y corneales dañados (46,56,57,60), otros han 
evidenciado que las MSCs no migran y permanecen en las zonas cercanas al lugar de la 
inyección (58,61,64). En este sentido, nuestros resultados concuerdan con los estudios que 
sostienen que las MSCs migran hacia los tejidos oculares dañados, ya que observamos que 
las hAT-MSCs inyectadas subconjuntivalmente en nuestro modelo de LSCD migraron hacia 
los distintos tejidos de la superficie ocular analizados. Aunque la cantidad de células BrdU+ 
observada fue en general bastante baja, pudimos apreciar que la cantidad de hAT-MSCs era 
ligeramente mayor en el estroma limbar y conjuntival, donde además pudimos observar 
grandes cúmulos de estas células en el estroma limbar de algunos de los tejidos analizados. 
La discrepancia entre los resultados obtenidos en los distintos trabajos, además de por 
diferencias en los modelos de LSCD utilizados y en el tipo y la dosis de MSCs administradas, 
podría deberse a discrepancias entre el tiempo transcurrido desde la inducción del daño y la 
 
25 
 
inyección subconjuntival de las MSCs. En este sentido, un retraso en la administración de las 
MSCs podría inducir una disminución de la capacidad migratoria de las mismas como 
consecuencia de una disminución de las señales liberadas por los tejidos dañados (45). 
Para analizar el efecto de la inyección subconjuntival de las hAT-MSCs en el fenotipo epitelial 
corneal y limbar de nuestro modelo de LSCD, se realizó un estudio inmunohistoquímico 
mediante el cual se analizó la expresión de los marcadores de epitelio corneal CK3 y E-
cadherina y de los marcadores del epitelio limbar CK15 y el factor de transcripción p63. 
Con respecto a la CK3, aunque se ha demostrado que es un marcador específico del epitelio 
corneal (8) y que es un marcador adecuado para ser utilizado en modelos de conejo (15,65), 
también se ha visto que en algunas ocasiones este marcador se expresa en el epitelio del 
limbo de conejo sano en las capas suprabasales (52), tal y como nosotros hemos observado. 
En nuestro estudio, hemos comprobado que la inyección subconjuntival de hAT-MSCs produce 
un aumento de la expresión de CK3 tanto en la córnea como en el limbo de los conejos con 
LSCD, indicando que las MSCs estarían ejerciendo un efecto inductor de la recuperación del 
fenotipo epitelial. Aunque a día de hoy no hay trabajos publicados en los que se haya estudiado 
el efecto de la inyección subconjuntival de MSCs en la expresión de este marcador, nuestros 
resultados concuerdan con los publicados por Galindo et al. donde demostraron que el 
trasplante de hAT-MSCs sobre membrana amniótica en un modelo de LSCD en conejo inducía 
un aumento de la expresión de CK3 en el epitelio corneal y limbar transcurridas 8 semanas 
desde la administración del tratamiento (15). El aumento exacerbado de CK3 observado en el 
limbo superior podría deberse a que en esta zona el grado de inflamación encontrado fue 
mayor y que, por tanto, la elevada cantidad de infiltrados inflamatorios pudiera haber 
provocado una alteración en los niveles de expresión de este marcador. 
En cuanto al análisis de los niveles de expresión de E-cadherina, observamos que la inyección 
subconjuntival de hAT-MSCs inducía un incremento en la expresión de este marcador en el 
epitelio corneal, indicando que las células administradas podrían estar favoreciendo el 
mantenimiento y/o la recuperación del fenotipo característico de las células del epitelio corneal. 
Estas observaciones concuerdan con las mostradas en estudios previos con tiempos de 
evolución más prolongados donde se observó que el trasplante de hAT-MSCs provocaba un 
aumento de la expresión de E-caherina no sólo en el epitelio corneal, sino también en el epitelio 
limbar (15). No obstante, nuestros resultados difieren de los publicados por Li et al., en los 
cuales no observaron variaciones en los niveles de expresión de este marcador en conejos 
con LSCD inyectados subconjuntivalmente con MSCs limbares o de médula ósea (66). Sin 
embargo, la dosis de MSCs utilizada por estos autores fue mucho menor que la concentración 
celular utilizada en nuestro caso, por lo que quizás sea necesario utilizar dosis celulares 
similares a la nuestra para poder observar efectos terapéuticos y/o cambios significativos en 
los niveles de expresión de los marcadores analizados. 
La expresión de la CK15 en los tejidos oculares sanos, como era de esperar, fue más elevada 
en la zona del limbo que de la córnea, ya que es un marcador específico del epitelio limbar 
(22) que se ha observado que también se expresa en el epitelio limbar de conejo sano (15,67). 
En los ojos con LSCD tratados con hAT-MSCs