Metodos_inmunologicos_utilizados_en_la_i

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Revista Cubana de Higiene y Epidemiología
ISSN: 0253-1751
pmasb@infomed.sld.cu
Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y
Microbiología
Cuba
Fundora Hernández, Hermes; Puig Peña, Yamila; Chiroles Rubalcaba, Sergio; Rodríguez Bertheau,
Andrea María; Gallardo Díaz, Juan; Milián Samper, Yoslaine
Métodos inmunológicos utilizados en la identificación rápida de bacterias y protozoarios en aguas
Revista Cubana de Higiene y Epidemiología, vol. 51, núm. 1, 2013, pp. 84-96
Instituto Nacional de Higiene, Epidemiología y Microbiología
Ciudad de La Habana, Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=223227554009
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Revista Cubana de Higiene y Epidem iología. 2 0 1 3 ;5 1 ( 1 ) :8 4 - 9 6 
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ARTÍ CULO DE REVI SI ÓN 
 
Métodos inm unológicos ut ilizados en la ident ificación 
rápida de bacterias y protozoarios en aguas 
 
 
I m m unological m ethods for the quick ident ificat ion of bacter ia 
and protozoa in w ater 
 
 
MSc. Herm es Fundora Hernández, I MSc. Yam ila Puig Peña, I I MSc. Sergio 
Chiroles Rubalcaba, I MSc. Andrea María Rodríguez Bertheau, I MSc. Juan 
Gallardo Díaz, I I I MSc. Yoslaine Milián Sam per I 
I I nst ituto Nacional de Higiene, Epidem iología y Microbiología. La Habana, Cuba. 
I I I nst ituto Nacional de Nut r ición e Higiene de los Alim entos. La Habana, Cuba. 
I I I Universidad de Ciencias Médicas de La Habana. La Habana, Cuba. 
 
 
 
 
 
RESUMEN 
Entre las enfermedades relacionadas con el agua según su uso se encuent ran las 
causadas por sustancias quím icas y por agentes biológicos. Dent ro de estas 
últ im as, las ocasionadas por bacterias y protozoarios patógenos increm entan cada 
día la lista de enfermedades emergentes y reemergentes. Los métodos de ensayo 
para la determ inación de m icroorganismos patógenos en el agua no han variado 
m ucho en los últ im os años, pr incipalm ente para los indicadores bacterianos de 
contam inación fecal, y por lo general se realizan por métodos convencionales. Sin 
em bargo, existen situaciones, sobre todo en la aparición de brotes de 
enfermedades, en las que se hace necesario detectar el m icroorganismo patógeno 
en agua como posible agente causal, por lo que se ha recom endado el uso de 
métodos rápidos y confiables. Dent ro de estos se encuent ran los inm unoensayos, 
de los cuales los métodos por precipitación y aglut inación, los 
enzim oinm unoensayos, las técnicas de inmunofluorescencia directa e indirecta y la 
citomet ría de flujo son muy út iles en la detección de m icroorganism os en agua. 
Mención aparte m erece la separación inm unom agnét ica o inm unocaptura com o 
paso previo a ot ras técnicas avanzadas. Nos proponemos con este t rabajo exponer 
las ventajas y desventajas de estos m étodos, los pr incipios en los cuales se basan y 
ejemplif icar algunos de los más ut ilizados en m icrobiología de aguas, así como 
recalcar su im portancia. 
 
Palabras clave: inm unoensayos, bacterias, protozoarios, agua, m icrobiología de 
aguas, ident ificación rápida. 
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ABSTRACT 
 
Diseases related to the use of water m ay be caused by chem ical substances or 
biological agents. Am ong the lat ter, a prom inent role is played by pathogenic 
bacteria and protozoa, which constant ly add to the list of em erging and re-
em erging diseases. Assay m ethods to ident ify pathogenic m icroorganism s in water 
have not changed m uch in recent years, part icularly with respect to bacterial 
indicators of fecal contam inat ion, and tests are usually conducted by convent ional 
m ethods. However, in certain situat ions, especially when a disease outbreak occurs, 
it is necessary to determ ine what pathogenic m icroorganism is the possible causal 
agent , and quick, reliable m ethods have been recommended to achieve this aim . 
These include immunoassays, among which precipitat ion and agglut inat ion 
m ethods, enzym e im m unoassays, direct and indirect im m unofluorescence 
techniques and flow cytom et ry have proven very useful to detect m icroorganism s in 
water. Special ment ion should be made of immunomagnet ic separat ion or 
immunocapture as a step preceding other advanced techniques. The present paper 
is aim ed at present ing the advantages and disadvantages of these m ethods, as well 
as the principles on which they are based. Examples are provided of the methods 
most commonly used in water m icrobiology, highlight ing their importance. 
 
Key w ords: im m unoassays, bacteria, protozoa, water, water m icrobiology, quick 
ident ificat ion. 
 
 
 
 
 
I NTRODUCCI ÓN 
 
Ent re las enfermedades relacionadas con el agua según su uso se encuent ran las 
causadas por sustancias quím icas y por agentes biológicos. Dentro de estas últ im as 
se hallan las causadas por bacterias y protozoarios patógenos, las cuales cada día 
increm entan la lista de enferm edades em ergentes y reem ergentes.1-3 Ent re los 
pr incipales m icroorganism os patógenos asociados a enferm edades de t ransm isión 
hídrica por ingest ión o contacto con el agua existe un im portante grupo de 
protozoarios y bacterias. Havelaar y ot ros destacan: Giardia duodenalis, 
Cryptosporidium parvum , Cyclospora cayetanensis, Entamoeba histolyt ica, 
Toxoplasm a gondii, Acantham oeba spp., Naegleria fowleri y Am ebas de vida libre. 
El m ismo grupo de t rabajo destaca ent re las bacterias a Vibr io cholerae, Salm onella 
spp., Salm onella typhi, Shigella spp., Cam pylobacter spp., Escherichia coli 
enterohem orrágica, Yersinia spp., Francisella tularensis, Helicobacter pylor i, 
Pseudom onas aeruginosa, Aerom onas spp., m icobacterias no tuberculosas, 
Burkholderia pseudom allei, Legionella pneum ophila y Leptospira spp.2 
 
Los m étodos de ensayo para la determ inación de m icroorganism os patógenos en el 
agua no han variado mucho en los últ im os años según Havelaar y ot ros, 
pr incipalm ente para los indicadores bacterianos de contam inación fecal,2 y por lo 
general se realizan por m étodos convencionales.4,5 
 
Sin em bargo, existen situaciones, sobre todo en la aparición de brotes de 
enfermedades, en las que se hace necesario detectar el m icroorganismo patógeno 
en agua como posible agente causal, por lo que se ha recom endado el uso de 
métodos más rápidos y confiables.4 
 
 
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Los métodos automat izados en m icrobiología de aguas requieren un t iempo 
reducido para la obtención de los resultados en com paración con los m étodos 
convencionales; son fáciles de usar, precisos y económ icam ente rentables.6 Dichos 
m étodos const ituyen un área dinám ica en la m icrobiología aplicada que estudia el 
desarrollo de procederes de aislam iento, caracter ización y enum eración de 
m icroorganism os y sus productos en m uest ras clínicas, de alimentos, indust r iales y 
ambientales.7 
 
Las pruebas m icrobiológicas rápidas actualmente desarrolladas ofrecen detección, 
ident ificación o enumeración de m icroorganism os en t iem pos m ás cortos y llevando 
a efecto metodologías mucho más sencillas, comparadas con las t radicionalmente 
ut ilizadas. Con este t ipo de tecnología es posible opt im izar los recursos disponibles, 
pues se requiere de mucho menos material de laboratorio y m enos núm ero de 
personal técnico, lo que t rae com o resultado una m ayor product ividad.8 
 
Las pruebas rápidas que se han desarrollado se han basado en m étodos 
bioquím icos y enzimát icos, reducción de colorantes, reconocim iento de ácido 
nucleico, inmunoensayos, filt ración por membrana e impedancia.9 El objet ivo deeste t rabajo es exponer las ventajas y desventajas de los inm unoensayos ut ilizados 
con estos fines, los pr incipios en los cuales se basan y ejem plificar algunos de los 
más ut ilizados en m icrobiología sanitar ia. 
 
VENTAJAS DE LOS MÉTODOS RÁPI DOS 
Dent ro de las ventajas de este t ipo de m étodo se encuent ran la posibilidad de 
liberar lotes rápidamente, ahorro del costo financiero, importante dism inución del 
t rabajo manual, racionalización del recurso humano, ut ilización de equipos 
sem iautomát icos o automát icos, facilidad en la ejecución de los ensayos, análisis de 
cant idades im portantes de m uest ras, gran cont r ibución en m om entos de cr isis, 
m enor uso de espacios en los depósitos o almacenes, fácil elim inación de residuos 
biológicos, aumento en la velocidad de los análisis y en la ent rega de los 
resultados, se dispone de paquetes sensibles, precisos y con buen lím ite de 
detección, y opt im ización de recursos por m iniatur ización.10 adem ás, poseen m ayor 
sensibilidad y especificidad y facilit an la determ inación de factores de virulencia, 
según experiencias de nuest ro grupo de t rabajo. 
 
DESVENTAJAS DE LOS MÉTODOS RÁPI DOS 
 
Dent ro de las desventajas de estos m étodos se puede m encionar que aún son 
ut ilizados para confirmar los resultados posit ivos de m icroorganismos patógenos, la 
necesidad de enriquecer el analito que se busca antes de detectarlo, no siem pre se 
t rata de métodos flexibles, la falta de disponibilidad regular de los paquetes en el 
m ercado y que algunos de estos métodos también detectan los m icroorganismos 
m uertos.10 A t ravés de estos m étodos no se obt ienen aislam ientos para estudios 
posteriores. En ocasiones estos no son los que se encuent ran recogidos en las 
normas internacionales. Las concent raciones de ant ígenos en las m uest ras no 
siem pre son detectables. Se t rata por lo general de métodos cualitat ivos, por lo que 
no es posible correlacionar el resultado con la intensidad de la contam inación. En el 
caso de las técnicas de fluorescencia hay sust ratos del medio ambiente que pueden 
em it ir fluorescencia, según experiencias de nuest ro grupo de t rabajo. En estos 
casos es preciso definir la morfología del m icroorganismo, lo cual depende de la 
experiencia del operador. 
 
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MÉTODOS DE I NMUNOENSAYOS 
 
Los inm unoensayos se definen com o aquellas técnicas cuyo principio se basa en la 
interacción ant ígeno (Ag) ant icuerpo (Ac) . La unión Ag-Ac es un proceso reversible 
en el que están involucradas interacciones no covalentes.11,12 Dent ro de los 
inm unoensayos de im portancia en la detección de m icroorganism os en aguas se 
encuent ran los métodos de interacción secundaria: precipitación y aglut inación; y 
los métodos de interacción primaria: los enzimoinmunoensayos, las técnicas de 
inmunofluorescencia directa e indirecta y la citomet ría de flujo.7 Si bien la 
interacción primaria Ag-Ac no siem pre es visible, existen dist intos m étodos que 
hacen posible visualizarla.11,12 La est rategia consiste en m arcar el Ac o el Ag 
mediante la unión covalente (conjugación) de determ inadas moléculas, tales como 
fluorocromos, isótopos radiact ivos y enzimas, o sencillam ente part ículas inertes 
com o el látex, para poder hacer visible esa primera interacción. Dependiendo del 
m arcador que se em plee, la técnica inm unológica recibe un determ inado nom bre y 
ut iliza un sistema de detección diferente. Estas técnicas son muy sensibles, por lo 
que son capaces de detectar bajas concent raciones de ant ígenos o ant icuerpos.11,12 
 
Existen inmunoensayos de uso m ás rut inario como son: precipitación, los métodos 
de aglut inación y los m étodos de látex. Por ot ra parte, se encuent ran técnicas m ás 
sensibles, específicas y con posibilidad de autom at ización y uso de equipos: 
inmunoensayos ligados a enzimas (ELI SA) , inmunofluorescencia y citom et ría de 
flujo.11 En la tabla se pueden apreciar algunas característ icas de los inm unoensayos 
m ás frecuentem ente ut ilizados en los estudios m icrobiológicos. 
 
Los ELI SA ut ilizan com o m arcador una enzima y el espect rofotómetro como sistema 
de detección devenido lector de m icroplacas.13 Por su parte, las técnicas de 
inmunofluorescencia ut ilizan como marcador un fluorocromo y necesitan como 
sistem a de detección el m icroscopio de fluorescencia.14 La citom et ría de flujo es una 
técnica de análisis celular que implica medir las característ icas de dispersión de luz 
y fluorescencia que poseen las células conform e se les hace pasar a t ravés de un 
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rayo de luz. Para su análisis, las células deben encont rarse individualm ente en 
suspensión en un fluido. Al at ravesar el rayo de luz, las células interaccionan con 
este y causan dispersión de la luz. Basándose en la difracción de la luz en sent ido 
frontal, se puede evaluar el tamaño de las células que pasan y al m edir la reflexión 
de la luz de manera lateral se evalúa la granularidad o complej idad de estas. 
 
Además de la dispersión de la luz, si previamente a su análisis se colocan las 
células en presencia de ant icuerpos monoclonales marcados con moléculas 
fluorescentes, se pueden evaluar cuáles células poseen los ant ígenos 
complementarios a los ant icuerpos monoclonales usados. Se usa como sistem a de 
detección el citóm et ro de flujo. El uso de m oléculas fluorescentes diferentes con 
dist intos colores perm ite analizar la presencia de varios marcadores de manera 
simultánea.15 
 
Los métodos inmunológicos son ampliamente ut ilizados en la detección de 
patógenos en áreas clínicas, agrícolas y am bientales. Según experiencias de 
nuest ro grupo de t rabajo, un diagnóst ico inequívoco depende de la afinidad y 
especificidad del Ac ut ilizado, lo que perm ite realizar la detección de bajas 
concent raciones de un patógeno. 
 
 
MÉTODO POR PRECIPI TACI ÓN 
 
Al m ezclar cant idades suficientes de un ant ígeno soluble con ant icuerpos 
específicos, la interacción Ag-Ac puede dar lugar a una red capaz de ser visualizada 
com o un precipitado. Esta estará const ituida por grandes com plejos inm unes 
form ados por la interacción Ag-Ac. Cuando se agregan concent raciones crecientes 
de ant ígeno soluble a una cant idad fij a de suero que cont iene ant icuerpos 
específicos, a m edida que la cant idad de ant ígeno agregado aum enta, la cant idad 
de precipitado se incrementa hasta alcanzar un máximo, luego del cual declina.16 
 
En un ext remo de la curva de precipitación, cuando se agregan pequeñas 
cant idades de ant ígeno, los com plejos inmunes se form an en exceso de Ac. En el 
ot ro ext remo, al agregar grandes cant idades de Ag, los com plejos inm unes se 
form an en exceso de Ag, son pequeños y probablem ente están const ituidos por una 
m olécula de Ac y dos de Ag. Ent re estas dos situaciones ext rem as se encuent ra la 
zona de equivalencia, en donde la relación Ag-Ac perm ite la formación de grandes 
redes de complejos inmunes que precipitan.16 
 
Estos m étodos pueden ser desarrollados en medios líquidos o en geles y han 
dem ost rado una notable eficacia para individualizar y purificar los ant ígenos 
dotados de diferencias part iculares. La unión Ag-Ac se t raduce por la formación de 
un precipitado insoluble con la condición de que los react ivos se encuent ren a 
concent ración equivalente.16 
 
No contam os con experiencia en la ident ificación de bacterias y protozoarios en 
agua por métodos de precipitación; sin embargo, com entam os los pr incipios en que 
se basan por su im portancia al int roducir los métodos de aglut inación. 
 
 
MÉTODOS POR AGLUTINACI ÓN 
 
Las reacciones de aglut inación involucran una interacción ent re el Ag y el Ac que 
llevará a la aparición de un aglut inado que se visualiza com o grum os, gránulos de 
aglut inado o agregado; consisten enhacer reaccionar cant idades equivalentes de 
los reactantes (Ag y Ac) . Los principios fisicoquím icos que gobiernan la formación 
de estos aglut inados son los m ism os que r igen la de un precipitado.17 
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La gran diferencia ent re las reacciones de precipitación y las reacciones de 
aglut inación radica en las característ icas del Ag: m ient ras que en las reacciones de 
precipitación se emplean ant ígenos solubles, en las reacciones de aglut inación el Ag 
es part iculado. Con un Ag soluble, tam bién es posible diseñar una reacción de 
aglut inación gracias a que es posible ut ilizar dist intas part ículas (part ículas inertes, 
ejemplo: látex) y realizar un pegado quím ico o fisicoquím ico del Ag soluble a dichas 
part ículas, para generar un "Ag part iculado" út il para fines de ident ificación.17 
 
Las reacciones de aglut inación desde el punto de vista de su ut ilidad en el 
laborator io t ienen la ventaja de ser muy sencillas de realizar, no requieren de 
ningún equipam iento para su lectura, son rápidas y fáciles de im plem entar.17 
Además, presentan una mayor sensibilidad que las reacciones de precipitación, por 
lo que las han sust ituido en m uchos casos. Sin embargo, cabe mencionar que las 
reacciones de aglut inación presentan una menor sensibilidad que ot ras reacciones, 
tales como ELI SA e inmunofluorescencia indirecta; son m enos específicas, pues 
t ienen la desventaja de depender grandemente de los factores físico - quím icos, 
tales com o concent ración de elect rolitos, pH, tem peratura y t iempo de reacción. No 
obstante, las ventajas enum eradas hacen de estas una valiosa herram ienta para la 
detección de ant ígenos en colonias bacterianas obtenidas a part ir de m uest ras de 
agua.17 
 
 
 
Aglut inación por m étodo del látex 
 
Está basado en la prueba de aglut inación. Los ant icuerpos son adheridos a 
part ículas de látex. Al enfrentarse el látex sensibilizado con el Ag específico se 
produce la agregación ent re estas esferas y los ant ígenos. Esta prueba ha sido 
usada principalmente en bacteriología y en virología.17 En nuest ro grupo de t rabajo 
se han desarrollado con éxito métodos por aglut inación de látex para Salm onella 
spp., Vibrio cholerae y E. coli. 
 
 
 
ENZI MOI NMUNOENSAYOS 
Los inm unoensayos han sido usados por varias décadas en la detección y 
caracterización de m icroorganism os y sus componentes en m icrobiología. El m étodo 
m ás popular es el ELI SA. Su principal ventaja consiste en el corto período de 
t iempo que se necesita para ident ificar al agente patógeno.7,8 
 
La técnica de ELI SA ut iliza ant icuerpos m arcados con una enzim a (generalmente la 
peroxidasa) para visualizar la reacción Ag-Ac, la cual es ut ilizada tanto para la 
determ inación de ant ígenos com o de ant icuerpos.14 En el caso que nos ocupa 
( ident ificación de m icroorganismos) se ut iliza para la determ inación de ant ígenos. 
Este t ipo de sistema perm ite tanto la detección de bacterias patogénicas com o de 
toxinas en m uest ras ambientales, con una sensibilidad 1-5 UFC/ 25 m L de m uest ra 
y una especificidad de 95 - 99 % , lo cual ofrece resultados en t iem pos m ás cortos 
que los métodos t radicionales.7,8 
 
 
 
Determ inación de ant ígenos por ELI SA 
La modalidad más frecuente del método ELI SA para la determ inación de ant ígenos 
es el m odelo ELI SA "sandwich" directo. En este m odelo, el Ac específico para el Ag 
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de interés se encuent ra adsorbido en un soporte sólido sobre el cual se añadirá la 
muest ra biológica. En el caso de que en dicha muest ra se encuent re el Ag, quedará 
capturado en la placa y será puesto en evidencia t ras la adición de ot ro Ac 
específico conjugado con la enzim a. Por últ im o, se añade el sust rato incoloro que, 
por acción de la enzim a, dará un producto coloreado que producirá un color 
observable a sim ple vista y cuant ificable mediante un espect rofotómetro.14 
 
Se han desarrollado varios paquetes diagnóst icos basados en este t ipo de m étodo 
para la ident ificación de patógenos y toxinas tales com o Salm onella spp., 
Escherichia coli, enterotoxinas estafilocóccicas, ent re ot ros. El sistem a VI DAS 
(bioMerieux, Hazelwood, MO) consiste en un sistem a autom at izado que se basa en 
la técnica de ELI SA. El ensayo t ranscurre ent re 45 m inutos y dos horas. A t ravés de 
esta tecnología se pueden ident ificar patógenos como: Lister ia m onocytogenes, 
Salm onella spp. , E. coli O157, enterotoxina estafilocóccica y Cam pylobacter spp.18 
 
Ot ro método novedoso es aquel en el cual se combina la inmunocaptura y el 
crecim iento del patógeno con el método de ELI SA. Un ejemplo de este método es el 
paquete BioCont rol 1-2 Test (BioCont rol, Bellevue, WA) para la detección de 
Salm onella spp. La m uest ra que ha sido incubada durante la noche es int roducida 
en una cámara que cont iene m edio de crecimiento. Si este patógeno está presente 
m igrará. Los ant icuerpos ant i-H en la segunda cám ara reaccionan con la bacteria, y 
se form a una inm unobanda visible, la cual evidencia la presencia de Salm onella 
spp. en la m uest ra.7 
 
Se han desarrollado m étodos de ELI SA para determ inación de ant ígenos de 
Entam oeba histolyt ica, cianobacterias tales com o Microcyst is aeruginosa, 
verotoxinas de Escherichia coli, Giardia lam blia y Cryptosporidium parvum .6,7 
 
 
 
I NMUNOFLUORESCENCI A 
 
La presencia del Ac conjugado con el flourocrom o no necesita de ninguna reacción 
quím ica para hacerse evidente. Los fluorocromos em iten luz de una determ inada 
longitud de onda luego de ser exitados por un haz de luz de longitud de onda 
menor .19 Cada fluorocrom o es capaz de em it ir luz dent ro de un determ inado 
espect ro de longitud de onda. Por ejem plo, el fluorocromo denom inado 
isot iocianato de fluoresceina (FI TC, siglas en inglés) em ite en la gama del verde, 
m ient ras que la ficoer it r ina em ite en la gam a del rojo. El hecho de que existan 
dist intos fluorocomos capaces de em it ir a diferentes longitudes de onda, perm ite 
que puedan detectarse ant ígenos diferentes en un m ism o m icroorganism o.14,19 La 
visualización de la reacción puede realizarse ut ilizando un m icroscopio de 
fluorescencia (para colonias de m icroorganism os fijadas en portaobjetos) o por 
citom et ría de flujo (para m icroorganism os en suspensión) .14 
 
 
 
I nm unofluorescencia en la detección de bacterias 
 Legionella pneum ophila. 
 
La m icroscopía directa con ant icuerpos fluorescentes ( inmunofluorescencia 
directa) es un m étodo rápido y fue el pr im er m étodo diagnóst ico usado para 
detectar Legionella pneum ophila en tej ido pulm onar y secreciones 
respirator ias.20 Asim ismo, es de gran ut ilidad en la ident ificación de colonias 
obtenidas por cult ivo a part ir de muest ras de agua. La inm unofluorescencia 
directa es un procedim iento de t inción que perm ite detectar con rapidez la 
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presencia de Legionella pneum ophila en muest ras clínicas. Se realiza con 
react ivos polivalentes, algunos de los cuales están disponibles 
com ercialm ente. Estos react ivos cont ienen ant icuerpos m onoclonales 
capaces de reconocer todos los serogrupos de Legionella pneum ophila. Los 
ant icuerpos, m arcados con fluoresceína se unen a los ant ígenos de la pared 
del m icroorganismo. Un posterior lavado elim ina los ant icuerpos no fijados y 
al exam inar la extensión con un m icroscopio de fluorescencia se puede 
observar la fluorescencia en la pared de estas bacterias.21 
 
La ident ificación de Legionella pneum ophila a t ravés de estos métodos 
dem ora unas t res horas, aunque el m étodo descrito t iene la lim itante de que 
parte del aislam iento. La ident ificación de Legionella pneum ophila a t ravés 
de los métodosconvencionales dem ora ent re 15 y 21 días según 
experiencias de nuest ro grupo de t rabajo. La sensibilidad del método oscila 
ent re el 25 y el 75 % y la especificidad es del 95 % . Es un método que debe 
interpretarse con cautela: un resultado negat ivo no excluye la posibilidad de 
que estemos en presencia de Legionella pneum ophila y un resultado posit ivo 
debe considerarse com o un diagnóst ico presunt ivo.21 
 
 Vibrio cholerae O1 y Vibrio cholerae O139. 
Vibrio cholerae m uest ra una gran diversidad serológica en base a su Ag 
somát ico O, y se conocen al m enos 200 serogrupos.22 De estos, solo el O1 y, 
más recientemente, el O139 han causado epidem ias de cólera.23 Estudios 
del m edio acuát ico han m ost rado que Vibrio cholerae, incluyendo los 
serot ipos O1 y O139, forma parte de la m icrobiota normal de superficies 
acuát icas, sobrevive y se mult iplica en asociación con el zooplancton y 
fitoplancton, independientemente de la aparición de infecciones humanas.24 
 
La New Horizons Diagnost ics Corporat ion, USA ha desarrollado un paquete 
para la detección rápida de Vibrio cholerae O1 en m uest ras de agua y heces. 
Este ut iliza un Ac monoclonal específico del Ag A del lipopolisacár ido O1 de 
la membrana externa del m icroorganismo, el cual ha sido conjugado con 
FI CT para la detección rápida y sim ple de Vibrio cholerae O1 en agua y 
heces.25 El paquete está conform ado por el Ac m onoclonal específico de 
Vibrio cholerae O1 conjugado a FI TC (Cholera DFA) y dos react ivos de 
cont rol (posit ivo y negat ivo) . Las muest ras de agua son previam ente 
concent radas y luego se depositan sobre el portaobjetos. Posteriorm ente las 
muest ras a analizar y los cont roles son incubados junto al react ivo Cholera 
DFA. Si la m uest ra cont iene Vibrio cholerae O1, el Ac monoclonal conjugado 
a FI TC se une a Vibrio cholerae O1. Después de las etapas de lavado la 
lám ina es exam inada usando el m icroscopio de fluorescencia.25 
 
La New Horizons Diagnost ics Corporat ion, USA ha desarrollado adem ás un 
paquete para la detección rápida de Vibrio cholerae O139 en m uest ras de 
agua y heces. El paquete está conform ado por el Ac m onoclonal específico 
de Vibrio cholerae O139 conjugado a FI TC (Bengal DFA) y dos react ivos de 
cont rol (posit ivo y negat ivo) . Las muest ras de agua son previam ente 
concent radas y luego se depositan sobre el portaobjetos. Posteriorm ente las 
m uest ras a analizar y los cont roles son incubados junto al react ivo DFA. Si la 
m uest ra cont iene Vibrio cholerae O139, el Ac m onoclonal conjugado a FI TC 
se une a Vibrio cholerae O139. Concluidas las etapas de lavado la lám ina es 
exam inada mediante el m icroscopio de fluorescencia.26 
 
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La ident ificación de Vibrio cholerae a t ravés de estos m étodos dem ora unas 
dos horas y t reinta m inutos, lo cual ofrece una gran ventaja en cuanto al 
t iem po para la tom a de decisiones por las autoridades de Salud Pública, 
sobre todo en situaciones de epidem ia. La ident ificación de Vibr io cholerae a 
t ravés de los m étodos convencionales demora ent re cinco y siete días según 
experiencias de nuest ro grupo de t rabajo. 
 
I nm unofluorescencia en la detección de protozoarios 
La detección de ooquistes se realiza m ediante m icroscopia de fluorescencia 
ut ilizando ant icuerpos monoclonales o policlonales marcados con FI TC, lo que 
perm ite increm entar la capacidad de visualizar los ooquistes y diferenciarlos de 
m ateriales inespecíficos y algas m icroscópicas (m icroalgas) presentes en am bientes 
acuát icos.27 
 
La m icroscopia de inmunofluorescencia es el m étodo estándar para la detección de 
Cryptosporidium parvum y Giardia lam blia en aguas, tanto para el método 
1622/ 1623 en los EE. UU. com o para el Protocolo Operacional Estándar en Aust ralia 
y el Reino Unido. En este método se ut ilizan ant icuerpos monoclonales o 
policlonales conjugados con FI TC. Sin embargo, se ha determ inado que existen 
diferencias significat ivas en cuanto a la avidez y especificidad de los ant icuerpos 
disponibles comercialm ente.28 Diversos estudios han dem ost rado que la detección 
de Cryptosporidium parvum y Giardia lam blia en aguas es más eficiente cuando se 
em plean ant icuerpos m onoclonales de t ipo I gG1, los cuales poseen mayor avidez y 
especificidad que los ant icuerpos policlonales u ot ras clases de ant icuerpos 
m onoclonales com o I gG3 e I gM. Estas observaciones fueron confirm adas en 
muest ras de agua ut ilizando dos clases diferentes de ant icuerpos monoclonales 
( I gG1 e I gM) marcados con FI TC.28 La aplicación del Ac monoclonal I gG1 
(EasyStain, BTF Precise Microbiology, Aust ralia) produjo mucho menos 
fluorescencia de t rasfondo y la unión del Ac a los ooquistes fue m ás específica que 
con el Ac I gM (Waterborne I nc, New Orleans, EE. UU.) . La dist inción fue m ás 
evidente en m uest ras de agua que contenían altos niveles de m icroalgas y 
part ículas m inerales.27,28 
 
 
CI TOMETRÍA DE FLUJO 
La citom et ría de flujo es un procedim iento altamente eficiente para caracterizar 
poblaciones celulares (m icroorganismos) que se encuent ren en suspensión.29 En un 
principio, se ut ilizaba fundamentalmente para ident ificar el fenot ipo celular, es 
decir, la expresión diferencial de ant ígenos en la m em brana plasm át ica; pero 
actualmente son muchos los parám etros est ructurales y funcionales que se pueden 
m edir por citom etría de flujo. Ent re las m uchas ventajas que presenta en relación 
con la m icroscopía de fluorescencia se encuent ran la posibilidad de analizar un 
número muy elevado de células (m icroorganism os) en pocos segundos y la 
posibilidad de cuant ificar la intensidad de fluorescencia. La principal desventaja 
radica en el alto costo de la adquisición del citómet ro de flujo y su mantenim iento.30 
 
En Aust ralia fue desarrollado un método para la detección y enumeración select iva 
de ooquistes de Cryptosporidium parvum que aplica citom et ría de flujo con 
act ivadores fluorescentes capaces de clasificar las células según la fluorescencia y 
el tam año. Este m étodo m ejora sustancialmente el proceso de detección, 
especialmente cuando se ut ilizan ant icuerpos monoclonales de t ipo I gG1 
conjugados con FI TC y ficoerit r ina. Los ant icuerpos m onoclonales conjugados con 
estos fluorocrom os dism inuyen la fluorescencia inespecífica, por lo que facilitan la 
visualización de muest ras am bientales bajo el m icroscopio.31 
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En la citomet ría de flujo los m icroorganism os se hacen fluir uno a uno a t ravés de 
un rayo láser. Esto hace posible la determ inación de múlt iples m edidas de m anera 
simultánea (alrededor de seis parámet ros) . Este método perm ite además la 
ident ificación de m icroorganism os a part ir de m uest ras ambientales, por lo que 
brinda un diagnóst ico presunt ivo que puede posteriormente ser confirmado por 
ot ras técnicas.30-32 
 
Un aspecto de gran valor en la citom etría de flujo es su capacidad de análisis 
rápido. El análisis por sí solo puede ser com pletado de t res a cinco m inutos. Este es 
un aspecto que hace a esta técnica m uy út il en el m onitoreo de rut ina de 
m icroorganism os de interés que incluyen una variedad de indicadores o 
m icroorganism os patógenos y en ocasiones de bacterias viables pero no cult ivables. 
La aplicación de la citomet ría de flujo es muy amplia; sin embargo, su aplicación 
para el m onitoreo de agua de consumo hum ano es lim itada.30-32 
 
El inst rumento básico necesario es el citóm et ro de flujo, el cual requiere de un 
operador m uy bien ent renado. El react ivo m ás im portante en orden de costos es el 
Ac monoclonal pr imario. Por tanto, una de las lim itaciones del uso de esta 
tecnología es su alto costo. El gran número y la variedad de react ivos de laboratorio 
específicosque deben ser usados es ot ra lim itación del sistema. Además, muchos 
de los m icroorganism os patógenos a ser determ inados se encuent ran en aguas de 
consum o a concent raciones m uy bajas. Esto dificulta el alcance de los niveles de 
sensibilidad requeridos.30-32 
 
 
SEPARACI ÓN I NMUNOMAGNÉTI CA (SI M) O I NMUNOCAPTURA 
La técnica de SI M directa se basa en la incubación de esferas m agnét icas que están 
recubiertas con ant icuerpos específicos para determ inado m icroorganism o en un 
m edio de células suspendidas. Después de dicha incubación y la mezcla efect iva de 
las part ículas con la muest ra, las células objeto de estudio se unen a las esferas 
m agnét icas. Las part ículas así form adas pueden entonces ser separadas del resto 
de la suspensión con la ayuda del separador de part ículas magnét icas y los lavados 
correspondientes.6,7 
 
Los métodos de inmunoafinidad en combinación con la SI M han sido usados para el 
aislam iento de un núm ero de diferentes m icroorganism os a part ir de m uest ras de 
agua; por ejem plo, virus de la hepat it is A, rotavirus del grupo A, Pseudom onas spp, 
E. coli O157: H7 y Cryptosporidium parvum . El aislam iento de bacterias de m uest ras 
de agua se puede realizar ut ilizando medios de enriquecim iento seguido de SI M y 
siem bra en agar select ivo. Estos ensayos son fáciles de realizar; solo necesitan 
pocas horas. Adem ás, estos paquetes existen para un am plio grupo de 
m icroorganismos. Es una técnica simple y rápida. La eficiencia de la reacción 
depende de la especificidad y la afinidad de los ant icuerpos monoclonales 
em pleados y de la turbidez de la m uest ra de agua.6,7 
 
Los m étodos de inm unocaptura pueden ser usados com o base para ot ras técnicas 
de detección como son la reacción en cadena de la polim erasa (RCP) , reacción en 
cadena de la polim erasa- reverso t ranscriptasa (RCP-RT) , citom et ría de flujo y la 
hibr idación fluorescente in situ (FI SH) .33 
 
 
 
Revista Cubana de Higiene y Epidem iología. 2 0 1 3 ;5 1 ( 1 ) :8 4 - 9 6 
 94 
 
CONSI DERACI ONES FI NALES 
Los inmunoensayos const ituyen herram ientas de gran ut ilidad en la ident ificación 
rápida de bacterias y protozoarios en m uest ras de agua. La int roducción de estos 
m étodos dent ro de los protocolos de los laboratorios de m icrobiología de aguas 
debe realizarse bajo un est r icto análisis de las ventajas y desventajas que estos 
aportan. Se avizora un desarrollo paulat ino de estos m étodos los cuales se irán 
autom at izando en la m edida en que el desarrollo de estas técnicas lo perm ita.34-40 
La m ayor divisa de estos la const ituye el acortam iento del t iem po en el cual se 
puede dar un resultado sum am ente confiable que perm ita la oportuna tom a de 
decisiones por parte de las autoridades sanitar ias. 
 
 
 
 
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Recibido: 7 de m ayo de 2012. 
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MSc. Herm es Fundora Hernández. I nst ituto Nacional de Higiene Epidem iología y 
Microbiología. Calle I nfanta No. 1158 e/ Llinás y Clavel, Cent ro Habana. Zona postal 
10300. La Habana, Cuba. Correo elect rónico: herm es.fundora@infom ed.sld.cu