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FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES 
 LABORATORIO BIOQUÍMICA 
 
Alumno: ___________________________________________ Código: _________________ 
 
Alumno: ___________________________________________ Código: _________________ 
 
 
Práctica 9: ESTUDIO CINETICO DEL ENZIM A ALFA – AMILASA: 
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN, EL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD D E UNA 
REACCIÓN ENZIMÁTICA. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1. FUNDAMENTO TEÓRICO 
Estudio cinético del enzima α-amilasa. 
Introducción a la enzimología. 
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas 
por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales 
transcurren las reacciones enzimáticas. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede 
medir: 
1 Por la cantidad de sustrato que desaparece por unidad de tiempo. 
2 Por la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo. 
En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato [S], 
del enzima [E], el pH y la temperatura (T°C) sobre la velocidad de la reacción catalizada por el 
enzima α-amilasa salival, sobre los enlaces α-1,4 del almidón. 
OBJETIVOS: 
• Reconocer y diferenciar los factores que afectan la velocidad de las reacciones catalizadas por 
enzimas. 
 • Ilustrar el mecanismo por el cual ciertos factores afectan la velocidad de las reacciones 
enzimáticas. 
 • Utilizar aquellos factores que afectan la velocidad de las reacciones enzimáticas para comprender 
cómo se regula el trabajo de las enzimas en los organismos biológicos. 
 • Discutir los efectos de las variaciones bruscas de factores como temperatura y pH en el 
funcionamiento adecuado de los organismos. 
 
 
Para ello nos basaremos en la desaparición del almidón por unidad de tiempo, mediante el 
seguimiento de la reacción de coloreada que produce el mismo, así como sus productos de 
hidrólisis, con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol). 
Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe 
tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivos productos de 
hidrólisis) con el reactivo de Lugol. 
Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la 
cinética enzimática la variación de los factores que en ella influyen: [S], [E], pH y T°C, 
fundamentalmente. 
 
2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
2.1 Normas de seguridad 
 El estudiante debe referirse al manual de normas de seguridad. 
2.2 Equipos de protección pe rsonal 
 
 Usar durante todo el desarrollo de la práctica los siguientes elementos de seguridad: 
 • Bata de laboratorio 
• Guantes de nitrilo 
• Gafas de seguridad 
Mantener los elementos personales de seguridad identificados y en buen estado. Está prohibido su 
intercambio con los demás compañeros de laboratorio. 
2.3 Manejo de Residuos químicos 
 
Tanto por razones de seguridad como por respeto al medio ambiente, es importante disponer los 
residuos generados en las prácticas del laboratorio de química en forma adecuada. Por ello el 
estudiante debe: 
1. Emplear los recipientes destinados para eliminar los residuos o desechos de laboratorio, los 
cuales están debidamente identificados según el tipo de sustancia a desechar. 
2. Verter únicamente los residuos en el recipiente correspondiente para evitar reacciones no 
controladas y potencialmente peligrosas. 
No arrojar por el desagüe los desechos o residuos químicos obtenidos durante el desarrollo de la 
práctica. Si tiene alguna inquietud al respecto comuníquela al responsable del laboratorio, quien le 
indicará la forma correcta de hacerlo. 
 
3. TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO 
CONSULTAS PREVIAS. 
1 ¿Cuáles son las características estructurales del almidón? 
2 ¿Qué tipo de enzima es la α-amilasa salival? 
3 ¿Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón? 
4 Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la 
concentración del enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura. 
5 ¿Qué tipo de reacción se debe dar entre el lugol y el almidón y de qué forma a través de ésta 
reacción se puede determinar la presencia o ausencia de almidón? 
6 ¿Cuál es el producto o productos de la reacción de degradación del almidón por el enzima? 
 
 
4. METODOLOGIA 
 
4.1 MATERIALES 
 
Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja. 
ITEM Cantidad 
Gradilla 1 
Tubos de ensayo pequeño 15 
Pipeta pasteur 5 
Vasos de precipitados de 250 mL 2 
Vaso de precipitados de 25mL 1 
Erlenmeyer de 50mL 1 
Probeta 25 mL 1 
Pipetas graduadas de 2mL, 5mL y 10mL 1 de c/u 
Pipeta graduada de 1mL 2 
Propipeta 1 
Termómetro 1 
Pinza para tubos de ensayo 1 
Cronómetro 1 
Frasco lavador 1 
Varilla de vidrio 1 
Placa de aglutinación 2 
Estufa 9 para todo el salón 
Erlenmeyer de 25mL con tapa 2 para todo el salón 
Vaso de precipitados de 250mL 1 para todo el salón 
 
 
 
 
 
 
 
 
4.2 REACTIVOS 
 
Tabla 2 . Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja. 
Reactivos Cantidad 
Lugol (en frasco ámbar con tapa gotero) 25mL 
Almidón al 0,5% 30mL 
Soluciones tampón de pH 4 2 mL 
Soluciones tampón de pH 7 2 mL 
Agua destilada 50mL 
Hielo 
 
 
 
4.4 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 
 
PREPARACIÓN DE MUESTRA DE AMILASA: 
 
Obtenga aproximadamente 1mL de amilasa salival de su boca en una probeta y 
complete hasta 20mL con agua destilada. 
 
Esta solución es el EXTRACTO ENZIMÁTICO. 
 
 
Método 1: Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción 
enzimática . 
 
Procedimiento. 
 
1. Rotule 4 tubos de ensayo y agregue 2mL de almidón al 0,5% 
 
2. Encuentre la cantidad de lugol necesaria para detectar la solución de almidón 
proveída en esta práctica. Para ello tome 3 gotas de uno de los tubos preparados 
en el punto 1 y adicione 1 gota de lugol. Repita el procedimiento aumentando a 2 
y 3 gotas de lugol. Escoja la menor cantidad que de una coloración fuerte. 
 
3. Lléve los tubos preparados en el paso 1 a 37°C en baño maría y mantenga la 
temperatura constante. 
 
4. Agregue en el siguiente orden 2.9mL, 2.8mL, 2.7mL y 2.6mL de agua destilada a 
los tubos de ensayo. 
 
5. Luego en el mismo orden, adicione: 0.1mL, 0.2mL, 0.3mL y 0.4mL del extracto 
enzimático. En este momento empieza la reacción. 
 
6. En placas para ELISA, tome 3 gotas de cada reacción y agrégueles 1 gota de 
lugol (o la cantidad que usted determino apropiada). Repita este procedimiento 
cada 2 minutos durante los primeros 20 minutos de reacción. Para los 40 minutos 
restantes tome muestras cada 10 minutos. Consulte con su instructor y ajuste los 
tiempos según la velocidad de su amilasa salival (resultados varían según 
grupo). 
 
7. Asígnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consígnelos en la 
Tabla 5.1. 
 
Método 2: Efecto del tiempo y el pH sobre la velocidad de una reacción 
enzimática. 
 
Procedimiento. 
 
1. En dos tubos de ensayo agregue 2.5mL de almidón al 0.5%, rotúlelos y agregue 
1mL de buffer pH 7.0 a uno y 1mL de buffer pH 4.0 al otro. 
 
2. Incúbelos a 37°C en baño maría y mantenga la temperatura constante. 
 
3. Agregue 0.5mL del extracto enzimático a cada erlenmeyer. Aquí comienza la 
reacción. 
 
4. En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de lugol 
(o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reacción. Repita 
este procedimiento en intervalos de 2 o 5 minutos durante 30 minutos. 
 
5. Asígnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consígnelos en la 
Tabla 5.2. 
 
 
Método 3: Efecto de la concentración de sustrato sobe la actividad enzimática 
 
Procedimiento. 
 
1.Tome 4 tubos de ensayo, rotúlelos y agregue en el siguiente orden 0.5mL, 
1.0mL, 1.5mL y 2.0mL de almidón al 0,5%. Llévelos a 37°C en baño maría y 
mantenga la temperatura constante. 
 
2. Luego agrégueles a cada tubo, en el orden correspondiente: 2.0mL, 1.5mL, 
1.0mL y 0.5mL de agua destilada. 
 
3. Agregue a cada tubo 0.5mL del extracto enzimático. Aquí comienza la reacción. 
 
4. En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de lugol 
(o la cantidad que usted determino apropiada), esto para cada reacción. Repita 
este procedimiento en intervalos de 10 minutos durante 60 minutos. 
 
5. Asígnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consígnelos en la 
Tabla 5.3. 
 
 
 
Método 4: Estudio del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática 
 
Procedimiento. 
 
1. Rotule 3 tubos de ensayo, para realizar los experimentos a 4°C, temperatura 
ambiente y 50°C. 
 
2. Agregue a todos los tubos 2mL de almidón al 0,5%. 
 
3. Al primer tubo llévelo a 4°C en hielo, el segundo a temperatura ambiente y el 
tercero a 50°C en baño maría. 
 
4. Agregue a todos los tubos 0.5mL del extracto enzimático. 
 
 
5. En placas para ELISA, tome 3 gotas de la reacción y agrégueles 1 gota de lugol 
(o la cantidad apropiada), esto para cada reacción. Repita este procedimiento en 
intervalos de 2 minutos durante 10 minutos. 
 
6. Asígnele valores cualitativos a cada tubo en cada tiempo y consígnelos en la 
Tabla 5.4. 
 
5. RESULTADOS Y ANÁLISIS PRELIMINAR DE RESULTADOS. 
Método 1: Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacc ión enzimática 
Tabla 5.1 Estudio del efecto de la [E] sobre la velocidad de la reacción enzimática 
 
 
1. Con los datos obtenidos construya una tabla tomando como concentración del 
enzima el volumen de la solución de extracto enzimático utilizado en cada tubo. 
2. Con estos datos construya un gráfico de [E] en el eje ordenado contra velocidad 
de reacción (1/t) en el eje abscisas. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de 
reacción el inverso del tiempo? 
3. Describa qué características estructurales del almidón permiten su identificación 
mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los 
enlaces del almidón. Plantee las conclusiones que se pueden obtener de los 
resultados del experimento. 
4. Resuma las dificultades encontradas en el ensayo. 
 
 
Método 2: Efecto del tiempo y el pH sobre la velocidad de una rea cción enzimática 
 
Tabla 5.2 Resultados del efecto del tiempo y el pH sobre la actividad enzimática 
Tiempo de reacción 
(Minutos) 
Observación 
pH 7.0 pH 4.0 
0 
3 
5 
8 
10 
15 
20 
25 
30 
 
Tiempo de reacción 
 (Minutos) 
Observación 
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 
0 
10 
20 
30 
40 
50 
60 
Anote si la reacción en cada tubo es positiva o negativa y anote el tiempo en que se 
agota el almidón. Llene con sus resultados la tabla 4.2. 
1. ¿Qué efecto tendría la utilización del medio con pH muy ácido o muy básico en la 
realización de este ensayo? 
2. Si hubo diferencia en los tiempos de reacción, ¿cómo explicaría esta diferencia? 
 
 
Método 3: Estudio del efecto de la [S] sobre la velocidad de la reacc ión enzimática 
 
Tabla 5.3. Efecto de la concentración de sustrato sobe la actividad enzimática 
 
 
1. Con los datos obtenidos construya una tabla, tomando como valor de [S] el del 
mismo volumen de sustrato medido en cada tubo. 
2. Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción 
(volumen/tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de 
abscisas (que representa concentración de sustrato creciente en nuestro 
experimento). ¿Por qué en este caso para calcular la velocidad de la reacción 
es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo? 
3. Analice el gráfico y plantee las conclusiones a las que puede llegar en este caso. 
4. Describa las dificultades presentadas en este ensayo. 
 
Método 4: Estudio del efecto de la temperatura sobre la velocidad de la reacción enzimática 
 
 
Tabla 5.4 Resultados del efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática. 
 
 
1. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la Tabla 4.4. 
2. Plantee las conclusiones que obtuvo en este ensayo. 
Tiempo de reacción 
 (Minutos) 
Observación 
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 
0 
10 
20 
30 
40 
50 
60 
Tiempo de reacción 
(minutos) 
Observación 
4°C Temperatur a ambiente 50°C 
0 
2 
4 
6 
8 
10 
Preguntas 
 
1. Consulte con los demás grupos de trabajo, las velocidades de actividad de cada 
amilasa salival y compare la suya con la de ellos, identificando la amilasa 
aparentemente más rápida y la más lenta, y dando una posible explicación para 
la variabilidad (si la hay). 
2. Ofrezca una explicación a la variación de la actividad de la enzima a diferentes 
pHs y diferentes temperaturas. 
3. Ofrezca una explicación de por qué no podemos digerir a otro polisacárido de 
glucosas como la celulosa . Para esto, mire los tipos de enlace que ocurren en el 
almidón y los de la celulosa. 
4. Consulte sobre el gen de la amilasa salival en humanos comparado con el de 
otros primates, y de una explicación de por qué la capacidad de degradar 
almidón en la saliva pudo haber sido un factor importante en el desarrollo de las 
civilizaciones humanas. 
http://www.unav.es/acienciacierta/salud/amilasa.html, 
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2377015/, y 
http://blogs.scientificamerican.com/guest-blog/2012/07/23/human-ancestors-
were-nearly-all-vegetarians/). 
https://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.unav.es%2facienciacierta%2fsalud%2familasa.html
https://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fwww.ncbi.nlm.nih.gov%2fpmc%2farticles%2fPMC2377015%2f
https://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fblogs.scientificamerican.com%2fguest-blog%2f2012%2f07%2f23%2fhuman-ancestors-were-nearly-all-vegetarians%2f
https://owa.icesi.edu.co/owa/redir.aspx?C=dc2f2689826c405abd4ff3a5cde2ec9e&URL=http%3a%2f%2fblogs.scientificamerican.com%2fguest-blog%2f2012%2f07%2f23%2fhuman-ancestors-were-nearly-all-vegetarians%2f
	2.1 Normas de seguridad
	2.2 Equipos de protección personal
	2.3 Manejo de Residuos químicos